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Controllo Qualità Differenze nella processazione del tessuto e nelle tecniche in uso presso il laboratorio dell’utente possono produrre una discrepanza significativa nei risultati, rendendo necessaria la regolare esecuzione di controlli interni, in aggiunta alle procedure descritte di seguito. I controlli devono essere costituiti da campioni biologici freschi autoptici/bioptici/chirurgici e devono essere il più rapidamente possibile fissati in formalina, processati ed inclusi in paraffina, allo stesso modo dei campioni biologici ottenuti dal paziente. Controllo Positivo Del Tessuto È usato per indicare tessuti correttamente preparati e tecniche di colorazione appropriate. Per ogni gruppo di condizioni del test e ogni volta che viene eseguita la colorazione, deve essere incluso un controllo positivo del tessuto. Un tessuto a debole colorazione positiva è più adatto di uno a colorazione positiva intensa per un ottimale controllo qualità e per mettere in evidenza anche minimi livelli di degradazione del reagente. 2 Il tessuto raccomandato per il controllo positivo è la tonsilla. Se il controllo positivo del tessuto non dimostra colorazione positiva, i risultati con i campioni biologici del test vanno considerati non validi. Controllo Negativo Del Tessuto Va esaminato dopo il controllo positivo, per verificare la specificità nei confronti dell’antigene bersaglio da parte dell’anticorpo primario. Il tessuto raccomandato per il controllo negativo è il muscolo scheletrico. In alternativa, la varietà dei tipi cellulari presenti nella maggior parte delle sezioni tissutali offre spesso siti di controllo negativo, ma questo va verificato dall’utente. La colorazione aspecifica, se presente, assume di solito aspetto diffuso. La colorazione sporadica del tessuto connettivo può anche manifestarsi in seguito ad iperfissazione di sezioni di tessuto in formalina. Per l’interpretazione dei risultati della colorazione, usare cellule intatte. Le cellule necrotiche o degenerate si colorano spesso in maniera aspecifica3 . Si possono osservare risultati falsamente positivi, dovuti a legame non immunologico delle proteine o a prodotti di reazione del substrato. Tali falsi positivi possono essere anche causati da enzimi endogeni quali la pseudoperossidasi (eritrociti), la perossidasi endogena (citocromo C) o la biotina endogena (es. fegato, mammella, cervello, rene), a seconda del tipo di immunocolorazione usato. Per differenziare l’attività enzimatica endogena o il legame enzimatico aspecifico dall’immunoreattività specifica, possono essere colorati ulteriori tessuti del paziente esclusivamente con substrato cromogeno o con complessi enzimatici (avidina-biotina, streptavidina, polimero marcato) e substrato cromogeno. Se nel controllo negativo del tessuto compare una colorazione specifica, i risultati sui campioni biologici ottenuti dal paziente devono essere considerati non validi. Controllo Negativo Del Reagente Usare un controllo negativo aspecifico del reagente in luogo dell’anticorpo primario, con una sezione di ogni campione biologico del paziente, per valutare la colorazione aspecifica e per consentire una migliore interpretazione della colorazione specifica in corrispondenza del sito antigenico. Tessuto Del Paziente Successivamente, esaminare i campioni biologici del paziente colorati con NCL-L-IgM. L’intensità della colorazione positiva va analizzata nel contesto di qualsiasi colorazione aspecifica di fondo del controllo negativo del reagente. Come per tutti gli altri test immunoistochimici, un risultato negativo significa che l’antigene non è stato determinato, ma non necessariamente che fosse assente dalle cellule o dal tessuto esaminato. Se necessario, usare un pannello di anticorpi per identificare reazioni falsamente negative. Risultati Attesi Tessuti normali Il clone 8H6 ha messo in evidenza la proteina IgM nel citoplasma e sulla membrana cellulare di cellule della linea B. Oltre che nei linfociti B degli infiltrati, la proteina IgM è stata messa in evidenza in una varietà di tessuti, comprendenti ghiandola surrenale, mucosa dell’intestino tenue, mucosa del colon, mucosa dello stomaco, fegato, cuore, pancreas, ghiandola salivare, elementi nervosi nella sostanza bianca del cervelletto, ipofisi, polmone, ovaio, prostata, timo e cellule di Leydig del testicolo (n=142). Tessuti tumorali Il clone 8H6 ha messo in evidenza la proteina IgM in 18/46 neoplasie maligne ematologiche valutate, comprendenti 7/10 linfomi diffusi a grandi cellule B, 3/7 linfomi follicolari, 5/7 linfomi a cellule mantellari, 2/3 linfomi anaplastici a grandi cellule, 1/3 MALTomi, 0/6 linfomi periferici a cellule T, 0/5 linfomi di Hodgkin, 0/1 linfoma maligno, 0/1 linfoma a cellule B ricco in cellule T, 0/1 linfoma a cellule NK/T, 0/1 linfoma di Burkitt e 0/1 neoplasia intestinale a cellule B. A parte i linfociti degli infiltrati, l’IgM è stata messa in evidenza anche in 11/69 neoplasie non linfoidi, comprendenti 1/7 sarcomi, 1/5 tumori mammari, 4/4 tumori renali, 1/4 tumori neuroendocrini, 1/3 tumori a cellule germinali, 1/3 tumori endometriali, 1/2 tumori gastrici e 1/2 tumori pancreatici. Si raccomanda l’uso di NCL-L-IgM come parte di un pannello anticorpale nella classificazione delle neoplasie di origine B cellulare. Limitazioni Generali L’immunoistochimica è un procedimento diagnostico a più passi (multistep) che richiede un’esperienza specifica nella selezione dei reagenti appropriati, nella selezione, fissazione e processazione dei tessuti, nella preparazione di vetrini IHC e nell’interpretazione dei risultati della colorazione. La colorazione del tessuto dipende dalle modalità di manipolazione e di processazione del tessuto stesso, adottate prima della colorazione. La fissazione, il congelamento, lo scongelamento, il lavaggio, l’asciugatura, il riscaldamento o la sezione condotti in modo non corretto, o la contaminazione con altri tessuti o liquidi, possono produrre artefatti, intrappolamento (trapping) anticorpale o risultati falsi negativi. Risultati incompatibili possono essere dovuti a modifiche dei metodi di fissazione e di inclusione o ad irregolarità intrinseche al tessuto. 4 Una controcolorazione eccessiva o incompleta può compromettere la corretta interpretazione dei risultati. 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L’interpretazione clinica di ogni colorazione o della sua assenza va integrata da studi morfologici che utilizzino i controlli appropriati e deve essere valutata da un patologo qualificato, nel contesto della storia clinica del paziente e delle altre metodiche diagnostiche adoperate. Gli anticorpi di <strong>Leica</strong> <strong>Biosystems</strong> Newcastle Ltd. sono destinati all’uso, quando indicato, su sezioni congelate o incluse in paraffina, con specifici requisiti di fissazione. Un’espressione antigenica inattesa può manifestarsi in particolare nelle neoplasie. L’interpretazione clinica di ogni sezione tissutale colorata deve includere l’analisi morfologica e la valutazione dei controlli appropriati. Riferimenti Bibliografici Di Base 1. National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Protection of laboratory workers from infectious diseases transmitted by blood and tissue; proposed guideline. Villanova, P.A. 1991; 7(9). Order code M29-P. 2. Battifora H. Diagnostic uses of antibodies to keratins: a review and immunohistochemical comparison of seven monoclonal and three polyclonal antibodies. Progress in Surgical Pathology. 6:1–15. eds. Fenoglio-Preiser C, Wolff CM, Rilke F. Field & Wood, Inc., Philadelphia. 3. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase, part I: the techniques and pitfalls. Laboratory Medicine. 1983; 14:767. 4. Omata M, Liew CT, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: a possible source of error in immunohistochemistry. American Journal of Clinical Pathology. 1980; 73:626. 5. Geisberger R, Lamers M and Achatz G. The riddle of the dual expression of IgM and IgD. Immunology 2006; 118: 429–437. 6. Carsetti R, Rosado M and Wardemann H. Peripheral development of B cells in mouse and man. Immunological Reviews 2004; 197: 179-191. 7. Schaffer A, Rosenwald A and Staudt L. Lymphoid malignancies: the dark side of B cell differentiation. Nature Reviews: immunology. 2002; 2: 1–13. 8. Melchers F, Boekel E, Seidl T et al. Repertoire selection by pre-B-cell receptors and B-cell receptors, and genetic control of B-cell development from immature to mature B cells. Immunological Reviews 2000; 175: 33–46. 9. Bell S and Goodnow C. A selective defect in IgM antigen receptor synthesis and transport causes loss of cell surface IgM expression on tolerant B lymphocytes. The EMBO Journal. 1994; 13(4): 816–826. Modifiche Alla Pubblicazione Precedente Non applicabile. Data Di Pubblicazione 05 febbraio 2013 NCL-L-IgM Page 12
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