Manual sobre Técnicas Moleculares - Centro Jardín Botánico de ...

Anexo VI: REACCIÓN DE SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA (PCR)
- Fórmula de la mezcla:
Tampón……………………………… 2ul
Mezcla de reactivos………………… 2ul
Cebador (10 uM)…………………… 1ul
ADN + H2O………………………… 5ul
____
Total………………………………... 10ul
- Programa de Secuenciación:
28 ciclos de:
95ºC - 30 sg.
50ºC - 15 sg.
60ºC - 4 min.
Purificación de productos secuenciados:
1- Utilice tubos Eppendorf de 1,5 ml, numérelos correlativamente.
2- Añada a cada tubo 1 ul acetato sódico 3 M (una gota en el lateral de cada tubo).
3- Añada 25 ul 95% etanol (lavando la gota previa de acetato sódico)
4- Transfiera el producto secuenciado a cada tubo y coloque los tubos en hielo (10 min., no más)
5- Centrifugue a 13.000 rpm, 20 min.
6- Pipetee el sobrenadante (desde el lado opuesto al del 'pellet') y descártelo.
7- Añada 100 ul 70% Etanol .
8- Agite en vort ex durante 1 sg (o menos).
9- Centrifugue a 13.000 rpm, 10 min.
10- Pipetee y elimine el sobrenadante (desde el lado opuesto al 'pellet').
11- Centrifugue al vacío durante 2–5 min. (a temperatura media).
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