Manual sobre Técnicas Moleculares - Centro Jardín Botánico de ...

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PCR (Amplificados para posterior secuenciación): Fórmula de la reacción (ul): Las fórmulas pueden modificarse; por ejemplo, con una Taq de muy alta calidad pudiese agregarse solo 0,25 ul en lugar de 1 ul; puede jugarse en general con todos los parámetros buscando la combinación que en la práctica nos de los mejores resultados con nuestro grupo de estudio. En cualquier caso, la cantidad total de mezcla se mantiene ajustando la cantidad de agua. La cantidad de ADN está en función de su concentración y calidad, pudiendo agregarse más de 1ul si es necesario. ndhF ITS trnL-F 10x buffer 5 5 5 MgCl2 (25 nM) 3 3 3 dNTP (10 mM) 4 2,5 4 ddH2O 31 32,5 31 Cebador 1 (10 mM) 2,5 2,5 2,5 Cebador 2 (10 mM) 2,5 2,5 2,5 Taq 1 1 1 __________________________________________ TOTAL: 49ul 49ul 49ul ADN 1ul 1ul 1ul Programas de PCR: ndhF: 94ºC por 3 min al principio, seguido de 35 ciclos de lo siguiente: 92ºC - 1 min (desnaturalización) 45ºC - 1 min (anillamiento o apareamiento) 72ºC - 1,5 min (extensión) entonces: 72ºC - 7 min 4ºC…(para mantener las muestras frias) 82
ITS: 94ºC por 5 min al principio, seguido de 39 ciclos de lo siguiente: 94ºC - 1 min 58ºC - 1 min 72ºC - 2 min entonces: 72ºC - 8 min 4ºC…(para mantener las muestras frias) trnL-F: 94ºC por 1 min al prin cipio, seguido de: 35 ciclos de lo siguiente: 92ºC - 1 min 52ºC - 1 min 72ºC - 2 min entonces: 72ºC - 7 min 4ºC…(para mantener las muestras frias) Anexo V: RAPD - Fórmula de la reacción: 10x tampón de PCR……………. 1,0ul MgCl12 50mM…………………. 0,2ul dNTPs 10mM………………...…. 0,2ul Cebador (28 -36 ng/ul)………….. .0,5ul ddH2O…………………………… 6,9ul Taq polimerasa…………………... 0,2ul ______ Total…………………………...... 9,0ul ADN…………………………..... 1,0ul - Programa de PCR: 1 ciclo 91 ºC 1 min 10 ciclos 91 ºC 20 sg 42 ºC 30 sg 71 ºC 1 min 40 ciclos 91 ºC 20 sg 42 ºC 15 sg 71 ºC 1 min 1 ciclo 71 ºC 3 min 83
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