Manual sobre Técnicas Moleculares - Centro Jardín Botánico de ...

5- Cargue las muestras (verificación de obtención de ADN, RAPD, PCR, etc) en los pocillos del gel (a cada
muestra a correr en el gel se le debe añadir 2 ul de solución de azul de bromofenol, mezclando bien los
dos componentes). Las muestras se preparan con antelación y se cargan lo más rápidamente en el gel para
evitar que difundan en él.
6- Asegúrese de que la orientación del gel y las muestras es la apropiada para la dirección de la
electroforesis (las muestras deben desplazarse desde el cátodo – polo negativo – hacia el ánodo – polo
positivo – ya que el ADN tiene carga negativa), colocar los cables en los polos adecuados, y enchufar la
corriente eléctrica al voltaje adecuado (éste está en función de lo que se esté haciendo, 100 volts. si se
quiere una migración rápida simplemente para revisar si existe ADN luego de una extracción o
comprobar la ocurrencia de amplificación en una PCR; 25-45 volts. si lo que se están corriendo son
muestras RAPD, aunque aquí el voltaje se correlaciona con el tiempo que se esté dispuesto a dejar
corriendo la electroforesis y el número de bandas que normalmente se expresen en el material de estudio,
ya que en RAPD la clave está en lograr una adecuada separación en el patrón de bandas).
7- Espere el tiempo correspondiente (va desde 30 min o menos en un gel pequeño a 100 volts para revisar
presencia de ADN o amplificación de PCR, hasta 8 horas en un RAPD a 25-30 volts. en muestras con
numerosas bandas muy cercanas entre si).
8- Una vez transcurrida la electroforesis examine los resultados en un transiluminador de rayos ultravioleta
o en un analizador de imágenes.
NOTA: Se usan siempre guantes en todo el procedimiento, pero hay que quitárselos para manipular el
teclado, pantalla, etc. del ordenador y los CDs. ¡Evitar las contaminaciones!.
Anexo IV: REACCIONES DE PCR
1- La Reacción en cadena de la Polimerasa se emplea como base de distintas técnicas moleculares, bien
sean los RAPD , la secuenciación , etc. En todo caso lo que varía es la fórmula específica del conjunto de
reactivos y los programas de amplificación empleados.
2- Por lo sensible de la reacción es necesario tomar todas las precauciones para evitar contaminaciones y por
supuesto emplear guantes en todo momento.
3- Debido a que la enzima se activa con el calor, es necesario realizar todo el trabajo en frío para evitar que
la enzima comience a actuar antes de colocar los tubos con la mezcla de reacción completa en el
termociclador. Una forma de hacerlo es colocar los tubos en una lámina de anime delgada colocada a su
vez sobre hielo.
4- Es recomendable agregar en primer lugar el agua doble destilada, a fin de que en la medida que se
agreguen el resto de componentes de la fórmula mantengan la concentración adecuada.
5- Es necesario garantizar una buena mezcla de todos los componentes de la reacción, especialmente en el
caso de la enzima Taq polimerasa, ya que ésta es pesada y se va al fondo del tubo.
6- Las fórmulas que se dan más abajo hacen referencia a las cantidades necesarias para una sola reacción en
tubo de PCR de 0,2 ml. Lo que se hace es preparar la cantidad necesaria para el número total de muestras
a amplificar en un tubo de 0,5 o 1,5 , agitar bien y luego repartir las alícuotas establecidas para cada tubo
de PCR (un tubo por muestra a amplificar). Finalmente se agrega la cantidad establecida del ADN de
cada muestra en su tubo de 0,2 correspondiente.
7- Si el termociclador no tiene tapa térmica, añadir a cada tubo una gota de aceite mineral (10 ul); tapar bien
los tubos (deben estar herméticamente cerrados), y colocarlos en el termociclador.
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