Manual sobre Técnicas Moleculares - Centro Jardín Botánico de ...

ul de tampón 0,1 x TE. Agitar cada 2 min hasta disolver el 'pellet' y transferir la solución de ADN a un
tubo Eppendorf de 0,5 ml.
14- Guardar la solución de ADN a – 20 ºC.
15- cuantificar la concentración de ADN, bien sea con fluorómetro/espectrofotómetro, o por comparación con
un marcador de concentración conocida.
TAMPÓN CTAB DE EXTRACCIÓN DE ADN (500 ml):
10 x CTAB………………………………...100,00ml
1 M Tris -HCl pH 8,0………………………50,00ml
0,25 M EDTA……………………………….40,00ml
NaCl………………………………………….43,50g
ddH2O……………………………………...310,00ml
Solución de lavado de ADN: 76% Etanol , 10mM Acetato amónico.
PREPARACIÓN DE GEL DE AGAROSA:
La concentración a la que se hace el gel depende del uso que se le vaya a dar al mismo. Mientras más
concentrado esté el gel, menores serán sus poros y ofrecerá una mayor selectividad a la migración de
fragmentos de distinto peso molecular. Para revisar simplemente la presencia o no de ADN (total,
amplificados, etc) bastará un gel de 1% o incluso 0,8 %; para RAPDs puede ser necesario un gel de 1,5 o 2 %.
Protocolo para gel de 1%:
- Añada 1 gr. de agarosa a 100 ml de tampón 0,5 x TBE (= 1% de agarosa), dispuestos en matraz
Erlenmeyer de 500 m
- Añada 7 ul de Bromuro de etidio por cada 100 ml de gel.
PRECAUCIÓN: EL BROMURO DE ETIDIO ES CANCERÍGENO !! UTILIZAR SIEMPRE
GUANTES
- Caliente en el horno microondas hasta que la agarosa se disuelva totalmente y el gel sea líquido (¡tener
cuidado de que, si hierve, la solución no se desparrame por el microondas! ).
Nota: los geles con bromuro de etidio no se reciclan; se desechan en un contenedor propio.
MONTAJE DEL GEL Y DESARROLLO DE LA ELECTROFORESIS.
1- Tape con doble tira de tirro los laterales abiertos de la bandeja del gel, cuidando de que quede totalmente
sellado, y colocar los peines correspondientes.
2- Vierta el gel de agarosa líquido en la bandeja, en una superficie plana, y dejar que se solidifique al aire o
en la nevera (¡ en ese caso taparlo con plástico para evitar contaminaciones!!!). El gel debe tener un
grosor mínimo de 3 mm).
3- Llene la cubeta de electroforesis con tampón 0,5 TBE.
4- Una vez solidificado el gel, quite el tirro de la bandeja y los peines, y colocar la bandeja en la cubeta de
electroforesis de tal forma que el gel quede cubierto por el tampón, sobrepasándolo unos 2 mm.
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