Manual sobre Técnicas Moleculares - Centro Jardín Botánico de ...

Anexos II-VI : Protocolos para los estudios del ADN
Pedro Torrecilla López y Pilar Catalán Rodríguez (Universidad de Zaragoza)
Anexo II: COLECTA Y CONSERVACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL:
1- Colectar hojas jóvenes.
2- Conservarlas a – 80 ºC, liofilizarlas o secarlas con gel de sílice (si se quieren utilizar en fecha posterior a
la de la colecta).
3- Recortar las nervaduras de las hojas.
4- Agregar N2 líquido a un mortero (preferiblemente enfriado también en N2 líquido o en refrigerador a –
20ºC o menos), añadir las hojas previamente cortadas en trozos pequeños, esperar a que actúe el N2, y en
el momento en que éste se termina de evaporar, macerar vigorosamente la muestra hasta obtener un polvo
fino.
5- Transferir el polvo a un tubo Eppendorf (1.5ml) y utilizarlo para la extracción inmediata del ADN. El
polvo vegetal puede guardarse a –20 ºC para posteriores extracciones, aunque se corre el riesgo de
degradación del ADN.
Anexo III: EXTRACCIÓN DEL ADN (MINIPREPARACIONES):
1- Pesar 150 mg de polvo vegetal.
2- Colocar el polvo en un tubo Eppendorf de 1,5 ml con 700 ul de tampón de extracción CTAB
precalentado a 60ºC, 1,4 ul de mercaptoetanol (¡producto cancerígeno!), y una 'pizca' de PVPP (Polivinil
polipirrolidona ). La mezcla resultante debe quedar parcialmente fluida, no demasiado espesa, a fin de
facilitar la acción del tampón en la extracción del ADN, así que de ser necesario (dependiendo de la
consistencia del material vegetal sobretodo) debe reducirse la cantidad de polvo vegetal a utilizar.
3- Colocar el tubo en baño de María (60 ºC) durante media hora agitándolo suavemente cada 5 min.
4- Añadir al tubo 700 ul de cloroformo / alcohol isoamílico (24:1) y mezclar las soluciones, suavemente,
durante 2 min.
5- Centrifugar el tubo a 3.500 rpm durante 5 min.
6- Pipetear el sobrenadante (con micropipeta regulada a 150 ul) y transferirlo a un nuevo tubo (prestar
atención para no pipetear nada de la interfase blanca ni de la fase inferior).
7- Repetir el paso 4.
8- Repetir el paso 5.
9- Repetir el paso 6.
10- Añadir al nuevo tubo 450 ul de isopropanol a – 20ºC (precipita el ADN).
11- Mezclar suavemente y observar si se forman flocos (madeja flotante de ADN).
12.1- Si hubiera floculación, pescar los flocos con pipeta Pasteur de cristal (o una punta de micropipeta fina) y
transferirlos a un tubo nuevo con 500 ul de solución de lavado , dejando que se laven durante 20 min y
agitando suavemente el tubo cada 5 min.
12.2- Si no hubiera floculación , centrifugar a 10.000 rpm durante 10 min, eliminar con cuidado el
sobrenadante para que no se pierda el 'pellet' que se forma en el fondo del tubo, dejar que se seque el
'pellet' y añadir al tubo 500 ul de solución de lavado. Dejar que se lave el 'pellet' durante 20 min en la
solución, agitando suavemente el tubo cada 5 min.
13.1- Pescar nuevamente los flocos con la misma pipeta Pasteur de cristal (o punta de micropipeta fina) y
mantener el floco en el aire hasta que se seque. Disolverlo en 100 ul de tampón 0,1 x TE añadido a un
tubo Eppendorf de 0,5 ml.
13.2- Centrifugar a 4.000 rpm durante 5 min, eliminar el sobrenadante con cuidado para no perder el 'pellet' ,
dejar que se seque completamente el tubo colocándolo boca abajo sobre papel absorbente, y añadir 100
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