Manual sobre Técnicas Moleculares - Centro Jardín Botánico de ...

Los cromatogramas de las dos lecturas (directa y reversa) de la misma muestra se
confrontan y se elabora con ellas la secuencia consenso. Una vez obtenidas todas las
secuencias confrontadas de las muestras en estudio se procede al alinemiento de las
mismas. El alineamiento de las secuencias nos va a permitir detectar los cambios habido s
en unas secuencias con respecto a otras tanto en su longitud como en la naturaleza de sus
nucleótidos. El alineamiento de las secuencias puede hacerse de forma manual o con la
ayuda de programas específicos de alineamiento (Clustal, Malign).
Una vez alineadas las secuencias se obtiene una secuencia de longitud consenso para todas
ellas, que se toma como secuencia de referencia para el estudio comparativo entre
secuencias. En esa matriz de secuencias alineadas se pueden detectar mutaciones de
longitud de las secuencias, debidas a delecciones o inserciones, y mutaciones de
sustituciones de nucleótidos. Esas mutaciones constituyen caracteres de mutación de
secuencia que pueden ser utilizados con distintos fines sistemáticos.
Marcadores específicos de las secuencias a nivel de taxón pueden servir para caracterizar
molecularmente a ciertas plantas, para detectar el origen híbrido de otras (si están en el
genoma nuclear), o para conocer el progenitor materno de un híbrido (si están en el genoma
cloroplástico). El uso mayoritario que tienen las mutaciones informativas de las secuencias
del ADN es su empleo en los estudios filogenéticos de los distintos grupos de plantas
terrestres.
MICROSATÉLITES
Los microsatélites son marcadores hipervariables codominantes del genoma nuclear que
aportan marcadores específicos a nivel individual y que se heredan de forma mendeliana,
por lo que son utilizados en estudios genético poblacionales de plantas.
La fuente de datos de los microsatélites son las regiones de ADN altamente repetitivo del
núcleo que, al presentar una alta tasa de mutación, proporcionan ciertos marcadores
polimórficos característicos de los individuos. El poder resolutivo de los microsatélites se
da a nivel específico e infraespecífico, no pudiendo ser utilizados a niveles taxonómicos
mayores.
La técnica de análisis del genoma mediante microsatélites es un proceso complejo que
implica, en primer lugar, el diseño de cebadores específicos que permitan amplificar
posteriormente determinadas regiones microsatélites, fuentes de datos alélicos. La serie de
pasos conducentes al diseño de los cebadores consisten en restricciones enzimáticas del
ADN total (nuclear) y clonación de los fragmentos que muestran un tamaño medio (hasta
0.7 Kpb), cribaje de los fragmentos clonados con sondas especiales que contienen motivos
de repetición específicos en sus secuencias (p.e. GAT, CG, etc.), secuenciación de los
fragmentos cribados, análisis de las secuencias y diseño de cebadores en regiones
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