Manual sobre Técnicas Moleculares - Centro Jardín Botánico de ...

dideoxinucleótidos terminales. Los productos finales de esas secuenciaciones se separan
por electroforesis vertical en un gel de poliacrilamida y se detectan mediante
autorradiografías. La lectura saltatoria de las bandas presentes, en grado ascendente, en las
cuatro calles, nos dará la secuencia completa de nucleótidos de ese fragmento genómico.
Las secuenciación completa de un fragmento genómico requiere de dos lectura s, directa y
reversa; ambas hebras molde de una región genómica deben ser secuenciadas, en una
dirección y en otra, y contrastadas entre sí para obtener la secuencia consenso. Las dos
secuencias deben ser complementarias si la secuenciación ha sido correcta en ambos casos.
Las lecturas directa y reversa de la misma secuencia permiten la detección de errores que
puedan haberse cometido en uno u otro caso y la confirmación de la existencia de
polimorfismos para ciertas posiciones de la secuencia (que deben aparecer en ambas
lecturas). En la secuenciación manual de fragmentos genómicos pueden aparecer ciertos
problemas relacionados con la homología parcial de los cebadores y con las compresiones
debidas a estructuras secundarias de la hebra molde. Estos últimos pueden superarse
aumentando la temperatura del proceso. Las homologías de los cebadores pueden mejorarse
mediante el rediseño de éstos. No obstante, la secuenciación de las regiones genómicas, al
igual que la amplificación del ADN de esas regiones, únicamente puede darse si se dispone
de cebadores universales de otras plantas que funcionan bien en los materiales en estudio.
A partir de las primeras secuencias obtenidas de los materiales en estudio pueden diseñarse
nuevos cebadores que permiten la exploración de otras regiones genómicas próximas
desconocidas.
La secuenciación automática representa un avance metodológico respecto a la
secuenciación manual, al disminuir notablemente el tiempo requerido para la secuenciación
de los fragmentos y al automatizar el registro de los datos. La secuenciación automática
utiliza también dideoxinucleótidos terminales, pero en este caso la reacción de
secuenciación se hace mediante una reacción de PCR en un solo tubo, y cada ddNTP está
marcado con un fluorocromo distinto. La separación por electroforesis de los fragmentos
requiere de una única calle en el gel, en lugar de cuatro, o de una única carga en el capilar.
La lectura de los fragmentos marcados se realiza con un dispositivo de impresión por rayo
láser quedando registrados los picos de emisión en un cromatograma. Los protocolos de la
reacción de PCR de secuenciación y de la programación de este proceso se adjuntan en el
Anexo VI.
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