Manual sobre Técnicas Moleculares - Centro Jardín Botánico de ...

SECUENCIACIÓN DEL ADN
La técnica de secuenciación del ADN consiste en conocer la composición específica de
nucleótidos de una región particular de un genoma. El resultado de ese proceso es la
obtención de una secuencia nucleotídica donde se conocen la naturaleza y el orden de los
nucleótidos y la longitud de esa molécula. La técnica de secuenciación del ADN
proporciona la mayor fuente de información de caracteres moleculares conocida hasta la
fecha, ya que cada posición de esa secuencia corresponde, a priori, a un carácter distinto.
Así la secuenciación de un fragmento de ADN de 1000 nucleótidos podría llegar a
proporcionar hasta un máximo de 1000 caracteres; habitualmente el número de caracteres
obtenidos es mucho menor ya que una gran parte de las posiciones secuenciadas en los
distintos taxones son invariables y no aportan por lo tanto ninguna información.
Únicamente aquellas posiciones de las secuencias comparadas que son variables son las que
proporcionan marcadores moleculares potencialmente útiles para fines taxonómicos.
Las primeras secuenciaciones de genomas se realizaron mediante mapados superpuestos de
lugares de restricción enzimática, un proceso largo y complejo que llevó a un conocimiento
mayor de los genomas hasta entonces inexistente. Un avance notable en la técnica fue el
desarrollo de la reacción manual de Sanger de secuenciación del ADN con
dideoxinucleótidos terminales. Esta técnica de secuenciación, base de la actual
secuenciación automática, consiste en la producción de fragmentos monocatenarios de
longitudes correlativamente superiores en un nucleótido, que se separan por electroforesis
en geles de poliacrilamida y se revelan por autorradiografiado.
La secuenciación manual de Sanger requiere de una hebra molde monocatenaria de ADN
que va a ser secuenciada, de un cebador complementario, de unas concentraciones
determinadas de deoxynucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) para la elongación de la
cadena, de dideoxinucleótidos (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) para la terminalización de
cada fragmento de la secuencia, y de una enzima ADN polimerasa altamente procesativa
(secuenasa). La secuenciación manual se inicia en un único tubo para cada muestra, donde
se produce el apareamiento de la hebra molde con el cebador, y se continúa en cuatro tubos
distintos para cada muestra, en cada uno de los cuales se añaden la enzima polimerasa, los 4
deoxinucleótidos, y un solo tipo de dideoxinucleótido terminal (siendo registrados como
tubos “A” (ddATP), “C” (ddCTP), “G” (ddGTP), y “T” (ddTPP)). En un tubo determinado
(p.e. el tubo “T”, que contiene el dideoxinucleótido ddTTP), la reacción de polimerización
de la enzima comienza hasta que encuentra un resto de adenina (A) en la hebra molde, en
esa posición puede incorporar tanto un nucleótido dTTP como un dideoxinucleóido ddTTP,
si se incorpora el primero el proceso de elongación continúa, si lo hace el segundo la
elongación termina allí; un cierto número de fragmentos finalizarán allí su elongación y el
resto la continuarán hasta la siguiente posición de la hebra molde donde aparezca otro resto
de adenina (A), donde volverá a ocurrir lo propio. Por cada resto de adenina que vaya
apareciendo en la hebra molde una serie de fragmentos complementarios irán finalizando
sus elongaciones al haber incorporado restos de ddTTP. Al igual que ocurre en el tubo “T”
procesos parecidos están teniendo lugar en los tubos “A”, “C”, y “G”, con finalizaciones de
las elongaciones de los fragmentos complementarios con sus respectivos
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