Manual sobre Técnicas Moleculares - Centro Jardín Botánico de ...
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en cada ciclo. Las reacciones de PCR se desarrollan en un termociclador, aparato que consta de una placa térmica capaz de cambiar su temperatura mediante un sistema de programación de pasos. Las programaciones de reacciones PCR más utilizadas en las amplificaciones de regiones genómicas nucleares y organulares de plantas se adjuntan en el Anexo IV. Transcurrida la reacción de PCR, los productos amplificados de las muestras se someten a electroforesis en gel de agarosa y se detectan mediante tinción con bromuro de etidio. Si la reacción ha tenido éxito, cada muestra amplificada mostrará una única banda de un peso molecular determinado, correspondiente al de la región amplificada. La reacción PCR convencional permite amplificar fragmentos de hasta ca. 5 kpb, excepcionalmente se pueden amplificar fragmentos mayores de este peso molecular utilizando enzimas polimerasas altamente eficaces (p.e AmpliTaq). Al examinar los productos PCR aparecen casos problemáticos, como los errores en la amplificación, la obtención de escaso producto amplificado, la presencia de bandas no deseadas, y la presencia de contaminaciones. Los errores en la amplificación pueden ser debidos a la falta de homología de los cebadores con sus regiones de apareamiento, o a fallos en los reactivos de la reacción o en la programación de los ciclos PCR; en el primer caso habría que diseñar nuevos cebadores para la región genómica y el grupo de organismos en estudio, mientras que en el segundo deberían ser revisados los parámetros de reacción y programación hasta encontrar el sistema adecuado. La región crítica de apareamiento de los cebadores es su extremo 3’, puesto que esa es la zona donde se producirá la elongación (adición de nuevos nucleótidos); en esa zona la homología con la región complementaria debe ser total, lográndose así un apareamiento fuerte y estable, que asegure la correcta elongación. La obtención de escaso producto amplificado puede deberse a la no homología total de los cebadores con sus regiones complementarias de apareamiento (idealmente debería ser del 100%), y puede subsanarse en ciertos casos revisando los parámetros de reacción y de programación hasta optimizar los resultados, o diseñando cebadores homólogos. La presencia de bandas no deseadas suele deberse a amplificaciones secundarias de otras regiones genómicas distintas de la región diana, en las que los cebadores encuentran secuencias flanqueantes pseudocomplementarias, con una cierta homología; en general estas bandas no deseadas suelen eliminarse aumentando la temperatura de apareamiento de los cebadores y evitando así los pseudoapareamientos con regiones distintas a la de la región diana. Las contaminaciones pueden ser endógenas o exógenas. Las contaminaciones endógenas son debidas a la presencia de organismos patógenos o simbióticos en el interior de la planta; estas contaminaciones no pueden evitarse, aunque suele lograrse en la mayoría de los casos una separación de los fragmentos amplificados de uno y otro organismo por presentar distinto peso molecular. Las contaminaciones exógenas pueden evitarse limpiando cuidadosamente el material vegetal que va a emplearse en el estudio antes de la desecación o de la extracción del ADN. La principal aplicación que tienen actualmente los productos PCR es la de proporcionar material adecuado y en suficiente concentración para ser utilizado con posterioridad en procesos de secuenciación, de restricción enzimática, o de clonación. Desde el punto de vista taxonómico, algunos productos amplificados pueden servir como marcadores moleculares de taxones si los distintos amplificados de una misma molécula en un grupo de 60
plantas muestran diferencias polimórficas en su peso molecular (debidos a delecciones o inserciones en la región diana amplificada). RAPD La técnica RAPD de amplificación aleatoria del ADN ("Random Amplified Polymorphic DNA") consiste en amplificaciones no dirigidas de fragmentos genómicos, y suponen una variación de la técnica de amplificación convencional por PCR. Estas amplificaciones al azar del ADN total de las células afectan fundamentalmente al ADN nuclear que es el genoma mayor de las plantas. Las bandas amplificadas resultantes constituyen alelos dominantes que se heredan de forma mendeliana. Los marcadores RAPD se caracterizan por ser alelos hipervariables del genoma del núcleo, por lo que han sido utilizados preferentemente en la caracterización molecular de especies próximamente emparentadas entre sí, en estudios de genética poblacional, y en estudios filogenéticos de plantas recientemente evolucionadas. Los alelos RAPD también se utilizan extensivamente en programas de mejora genética vegetal para la selección de individuos en las progenies, la detección de resistencias a agentes patógenos, y en el mapado cromosómico de caracteres cuantitativos. Los principios de la técnica RAPD consisten en la amplificación del ADN de las muestras en estudio utilizando un solo cebador; este cebador de secuencia muy corta actúa tanto de cebador directo como reverso y amplifica todos aquellos fragmentos genómicos que queden entre dos regiones de apareamiento directa y reversa que tengan entre ellas un tamaño igual o inferior a 5 Kpb. Como resultado de estos apareamientos en cada muestra se pueden amplificar varios fragmentos genómicos distintos, por lo que el patrón de bandas RAPD observadas tras la electroforesis suele ser múltiple. 61
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plantas muestran diferencias polimórficas en su peso molecular (<strong>de</strong>bidos a <strong>de</strong>lecciones o<br />
inserciones en la región diana amplificada).<br />
RAPD<br />
La técnica RAPD <strong>de</strong> amplificación aleatoria <strong>de</strong>l ADN ("Random Amplified Polymorphic<br />
DNA") consiste en amplificaciones no dirigidas <strong>de</strong> fragmentos genómicos, y suponen una<br />
variación <strong>de</strong> la técnica <strong>de</strong> amplificación convencional por PCR. Estas amplificaciones al<br />
azar <strong>de</strong>l ADN total <strong>de</strong> las células afectan fundamentalmente al ADN nuclear que es el<br />
genoma mayor <strong>de</strong> las plantas. Las bandas amplificadas resultantes constituyen alelos<br />
dominantes que se heredan <strong>de</strong> forma men<strong>de</strong>liana.<br />
Los marcadores RAPD se caracterizan por ser alelos hipervariables <strong>de</strong>l genoma <strong>de</strong>l núcleo,<br />
por lo que han sido utilizados preferentemente en la caracterización molecular <strong>de</strong> especies<br />
próximamente emparentadas entre sí, en estudios <strong>de</strong> genética poblacional, y en estudios<br />
filogenéticos <strong>de</strong> plantas recientemente evolucionadas. Los alelos RAPD también se utilizan<br />
extensivamente en programas <strong>de</strong> mejora genética vegetal para la selección <strong>de</strong> individuos en<br />
las progenies, la <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> resistencias a agentes patógenos, y en el mapado<br />
cromosómico <strong>de</strong> caracteres cuantitativos.<br />
Los principios <strong>de</strong> la técnica RAPD consisten en la amplificación <strong>de</strong>l ADN <strong>de</strong> las muestras<br />
en estudio utilizando un solo cebador; este cebador <strong>de</strong> secuencia muy corta actúa tanto <strong>de</strong><br />
cebador directo como reverso y amplifica todos aquellos fragmentos genómicos que que<strong>de</strong>n<br />
entre dos regiones <strong>de</strong> apareamiento directa y reversa que tengan entre ellas un tamaño igual<br />
o inferior a 5 Kpb. Como resultado <strong>de</strong> estos apareamientos en cada muestra se pue<strong>de</strong>n<br />
amplificar varios fragmentos genómicos distintos, por lo que el patrón <strong>de</strong> bandas RAPD<br />
observadas tras la electroforesis suele ser múltiple.<br />
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