Manual sobre Técnicas Moleculares - Centro Jardín Botánico de ...

en cada ciclo. Las reacciones de PCR se desarrollan en un termociclador, aparato que
consta de una placa térmica capaz de cambiar su temperatura mediante un sistema de
programación de pasos. Las programaciones de reacciones PCR más utilizadas en las
amplificaciones de regiones genómicas nucleares y organulares de plantas se adjuntan en el
Anexo IV.
Transcurrida la reacción de PCR, los productos amplificados de las muestras se someten a
electroforesis en gel de agarosa y se detectan mediante tinción con bromuro de etidio. Si la
reacción ha tenido éxito, cada muestra amplificada mostrará una única banda de un peso
molecular determinado, correspondiente al de la región amplificada. La reacción PCR
convencional permite amplificar fragmentos de hasta ca. 5 kpb, excepcionalmente se
pueden amplificar fragmentos mayores de este peso molecular utilizando enzimas
polimerasas altamente eficaces (p.e AmpliTaq).
Al examinar los productos PCR aparecen casos problemáticos, como los errores en la
amplificación, la obtención de escaso producto amplificado, la presencia de bandas no
deseadas, y la presencia de contaminaciones. Los errores en la amplificación pueden ser
debidos a la falta de homología de los cebadores con sus regiones de apareamiento, o a
fallos en los reactivos de la reacción o en la programación de los ciclos PCR; en el primer
caso habría que diseñar nuevos cebadores para la región genómica y el grupo de
organismos en estudio, mientras que en el segundo deberían ser revisados los parámetros de
reacción y programación hasta encontrar el sistema adecuado. La región crítica de
apareamiento de los cebadores es su extremo 3’, puesto que esa es la zona donde se
producirá la elongación (adición de nuevos nucleótidos); en esa zona la homología con la
región complementaria debe ser total, lográndose así un apareamiento fuerte y estable, que
asegure la correcta elongación. La obtención de escaso producto amplificado puede
deberse a la no homología total de los cebadores con sus regiones complementarias de
apareamiento (idealmente debería ser del 100%), y puede subsanarse en ciertos casos
revisando los parámetros de reacción y de programación hasta optimizar los resultados, o
diseñando cebadores homólogos. La presencia de bandas no deseadas suele deberse a
amplificaciones secundarias de otras regiones genómicas distintas de la región diana, en las
que los cebadores encuentran secuencias flanqueantes pseudocomplementarias, con una
cierta homología; en general estas bandas no deseadas suelen eliminarse aumentando la
temperatura de apareamiento de los cebadores y evitando así los pseudoapareamientos con
regiones distintas a la de la región diana. Las contaminaciones pueden ser endógenas o
exógenas. Las contaminaciones endógenas son debidas a la presencia de organismos
patógenos o simbióticos en el interior de la planta; estas contaminaciones no pueden
evitarse, aunque suele lograrse en la mayoría de los casos una separación de los fragmentos
amplificados de uno y otro organismo por presentar distinto peso molecular. Las
contaminaciones exógenas pueden evitarse limpiando cuidadosamente el material vegetal
que va a emplearse en el estudio antes de la desecación o de la extracción del ADN.
La principal aplicación que tienen actualmente los productos PCR es la de proporcionar
material adecuado y en suficiente concentración para ser utilizado con posterioridad en
procesos de secuenciación, de restricción enzimática, o de clonación. Desde el punto de
vista taxonómico, algunos productos amplificados pueden servir como marcadores
moleculares de taxones si los distintos amplificados de una misma molécula en un grupo de
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