Manual sobre Técnicas Moleculares - Centro Jardín Botánico de ...

actualmente al haber sido ampliamente superados por otros más exactos basados en análisis
completos de secuencias genómicas.
Entre los primeros estudios filogenéticos moleculares desarrollados con distintos grupos
organismos se encuentran los basados en caracteres RFLP. Algunos de estos estudios se
utilizaron en programas de conservación de especies o de taxones endémicos y
amenazados. La utilidad que los análisis filogenéticos pueden llegar a tener en programas
de conservación de especies se ejemplariza bastante bien en el caso del gorrión oscuro de la
costa Este Norteamericana (Ammodramus maritimus subsp. nigrescens) (Li & Graur,
1991), que demuestra que un conocimiento previo de la filogenia de los taxones puede
llegar a ser crucial a la hora de planificar los programas de recuperación de taxones en
peligro de extinción.
Los análisis RFLP presentan como ventaja la capacidad de explorar distintas regiones
genómicas, incrementándose esta exploración cuanto mayor sea el número de
combinaciones de sondas/enzimas ensayadas; estos análisis proporcionan, por lo general,
caracteres totalmente independientes, que son óptimos para los análisis filogenéticos. Sin
embargo, presentan como desventajas sus mayores costos en trabajo y reactivos, razones
por las cuales han sido sustituídos por otro tipo de marcadores moleculares,
fundamentalmente los basados en las amplificaciones y las secuenciaciones del ADN.
PCR
La amplificación del ADN se basa en la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa
o PCR (en su abreviación inglesa). Esta reacción de la ADN polimerasa consigue crear del
orden de millones de copias de una determinada region genó mica, que es la región
amplificada.
Los principios en los que se fundamenta la técnica PCR son la estructura secundaria del
ADN y el proceso de polimerización conducido por la actividad replicatoria de la enzima
ADN polimerasa (Mullis, 1990). Las dos cadenas complementarias y antiparalelas de la
doble hélice del ADN se aparean mediante enlaces por puentes de hidrógeno establecidos
entre los pares de bases nitrogenadas A/T y G/C. Estos enlaces del ADN pueden destruirse
al elevar la temperatura a 92-94C, produciendo hebras separadas o monocatenarias. La
ADN polimerasa es la enzima responsable de la replicación de esta molécula, y es capaz de
sintetizar nuevas hebras complementarias a las existentes, que actúan como moldes, a partir
de unos fragmentos denominados cebadores. La síntesis de las nuevas hebras
complementarias, apareadas con sus respectivas hebras moldes, origina dos copias idénticas
de la molécula de ADN inicial, que experimenta así su primera amplificación. Si el proceso
se repite en sucesivos ciclos repetitivos se logra finalmente una amplificación exponencial,
tras la que se logran millones de copias de la molécula de ADN original.
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