Manual sobre Técnicas Moleculares - Centro Jardín Botánico de ...

La transferencia de los fragmentos de restricción separados en el gel a la membrana tiene
lugar mediante la técnica de Southern blot. Previamente a ello, el gel debe desnaturalizarse
con una solución salina para producir hebras monocatenarias. La transferencia de esas
hebras a la membrana se produce rápidamente en condiciones de vacío. Una vez
transferidas a la membrana, los fragmentos monocatenarios se fijan a ella mediante una
radiación breve con luz UV (‘cross-linking’). De esta manera las membranas que contienen
los fragmentos fijados puede n guardarse hasta ser utilizadas en la hibridación con las
sondas (y pueden ser reutilizadas para hibridaciones con más de una sonda).
Las sondas utilizadas en los RFLPs consisten en distintos fragmentos monocatenarios de un
genoma, cuya naturaleza suele ser conocida, que son marcados con un reactivo
(radioisótopo, o producto quimioluminiscente) y utilizados en la detección de sus
fragmentos complementarios resultantes de la digestión enzimática del ADN de las
muestras. Las sondas se preparan a partir de fragmentos de restricción clonados de un
genoma particular, que son guardados en librerías genómicas. Así existen sondas para el
genoma cloroplástico, para el genoma mitocondrial, y para ciertas regiones del genoma
nuclear. Los genomas de menor tamaño disponen de sondas solapadas que cubren toda su
extensión, por ejemplo en el genoma cloroplástico, y que, al tratarse de un genoma
conservado, resultan universales para grandes grupos de plantas. Con ellas se puede lograr
el mapado de los lugares de restricción de diversas enzimas en todo el cromosoma
cloroplástico de los taxones en estudio. El genoma nuclear, mucho más voluminoso y
variable, puede disponer de distintos tipos de sondas; algunas de ellas son de naturaleza
desconocida y no tienen un carácter universal, sino que son específicas para un determinado
grupo de plantas.
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