Manual sobre Técnicas Moleculares - Centro Jardín Botánico de ...
Manual sobre Técnicas Moleculares - Centro Jardín Botánico de ... Manual sobre Técnicas Moleculares - Centro Jardín Botánico de ...
precipitado se lava con una solución de etanol y sales amónicas y se diluye en agua ultrapurificada o en una solución tampón muy diluída. Los métodos de extracción de ADN (micropreparaciones) vienen explicados en el Anexo III. La solución diluída final contiene tanto ADN como ARNs, ya que el protocolo sirve para precipitar los dos tipos de ácidos nucleicos. Los ARNs no suelen interferir en la mayoría de las manipulaciones y análisis a los que se somete al ADN, por lo que no es necesario eliminarlos; sin embargo sí que suelen distorsionar las cuantificaciones de las concentraciones de ADN total, si se hacen por espectrofotometría. Si se quiere obtener una solución purificada de ADN, sin ARNs, el extracto inicial se trata con ARNasa, enzima que degrada los ARN, obteniéndose así una solución que contiene únicamente ADN. La concentración del ADN total aislado en cada muestra se calcula por espectrofotometría o por fluorometría. La calidad de ese ADN total se comprueba en un gel de agarosa; si el ADN es de buena calidad se observa una banda de alto peso molecular, no degradada, en la parte superior de la calle del gel, si el ADN está degradado se observa una mancha de fondo a lo largo de la calle. RFLP La técnica de los Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP en siglas inglesas, “Restriction Fragment Length Polymorphisms”) fue una de las técnicas pioneras de análisis de los genomas. Los RFLP se basan en la restricción, o corte del ADN de los genomas, mediante unas enzimas específicas, llamadas enzimas de restricción, y la posterior hibridación de algunos de los fragmentos resultantes con determinadas sondas complementarias (fragmentos de ADN monocatenarios). Con la técnica de RFLP pueden examinarse polimorfismos genómicos de cualquier tipo de genoma vegetal (nuclear, cloroplástico o mitocondrial). Esos polimorfismos son alelos codominantes, que pueden corresponder a distintos tipos de ADN (copia simple o baja copia, moderadamente repetitivo, o altamente repetitivo). Los RFLP se han utilizado como marcadores genómicos del genoma nuclear, del genoma cloroplástico, y del genoma mitocondrial, y en estudios filogenéticos, utilizando como caracteres las mutaciones en los sitios de restricción y basándose en el empleo de distintas combinaciones de sondas y enzimas. Los RFLP nucleares se heredan de forma mendeliana, y han sido empleados en estudios genético-poblacionales, en selección de progenies y en detección de híbridos; también han servido para el mapeo genómico de caracteres de interés en la mejora genética de vegetales cultivados. El primer paso del estudio consiste en el corte del ADN de las muestras mediante enzimas de restricción. Las enzimas de restricción son enzimas endonucleasas, que cortan el ADN bicatenario internamente, en unos lugares específicos (para cada enzima) denominados sitios de restricción. Los sitios de restricción son secuencias cortas de nucleótidos (de 4, 5, ó 6 pares de bases) palindrómicas, reconocidos por las enzimas a lo largo del genoma, y en donde producen el corte. La restricción puede producir extremos cohesivos, si los extremos 50
de las dos hebras del ADN tienen distintos nucleótidos, o romos, si tienen el mismo número y están apareados. Todas las enzimas de restricción proceden de organismos procariotas y reciben su nombre de la bacteria de la que fueron aisladas (p.e., Bam HI, procede de Bacillus amyloliquefaciens, cepa H, descubierta en primer lugar (I), su sitio de restricción es G/GATCC; Eco RI procede de Escherichia coli, cepa RY, descubierta en primer lugar (I), su sitio de restricción es A/GATCT; Hind III procede de Haemophilus influenzae cepa Rd descubierta en tercer lugar (III), su sitio de restricción es A/AGCTT; etc.). Las enzimas se clasifican por su frecuencia de corte, relacionada con la longitud del sitio de restricción; así hay enzimas con lugares de restricción mayores (6 pb) que cortan menos frecuentemente, enzimas con lugares de restricción intermedios (5 pb) que cortan con relativa frecuencia, y enzimas con lugares de restricción menores (4 pb) que cortan con mucha frecuencia. Para la restricción enzimática se prepara una solución que contine el ADN de la muestra y la enzima en un medio tamponado adecuado a 37C durante 2-8 horas. Una vez finalizada la restricción, los fragmentos obtenidos del corte enzimático del ADN de la muestra se separan por electroforesis en gel de agarosa. Si el genoma es de pequeño tamaño y la enzima dispone de escasos lugares de restricción, se obtendrán pocos fragmentos, que podrán visualizarse fácilmente. Sin embargo, si se está sometiendo al ADN total a la acción enzimática, se obtendrán numerosos fragmentos de distintos tamaños como resultado de ese corte que no podrán visualizarse fácilmente al teñir el gel. 51
- Page 1 and 2: CURSO DE POSTGRADO: TÉCNICAS MOLEC
- Page 3 and 4: CRÉDITOS Las materias comprendidas
- Page 5 and 6: ÍNDICE - Marcadores moleculares y
- Page 7 and 8: hemos indicado anteriormente, los m
- Page 9 and 10: nucleótido opuesto de la otra cade
- Page 11 and 12: por genes; en muchos eucariotas só
- Page 14 and 15: Las dos regiones duplicadas e inver
- Page 16 and 17: Otras regiones génicas del genoma
- Page 18 and 19: continente muestran distintos haplo
- Page 21 and 22: Una de las escasas regiones del gen
- Page 23 and 24: ADN contiene secuencias codificador
- Page 25 and 26: Uno de los problemas adicionales qu
- Page 27 and 28: epetitivas del tándem. Cada unidad
- Page 30 and 31: El árbol filogenético resultante
- Page 32 and 33: Este mismo gen ribosomal 18S ha ser
- Page 34 and 35: La región espaciadora no está som
- Page 36 and 37: Minisatélites Los minisatélites s
- Page 38 and 39: La contrastación de las reconstruc
- Page 40 and 41: TÉCNICAS MOLECULARES En este Capí
- Page 42 and 43: trituración. Cuando el número de
- Page 44 and 45: Sin embargo, los individuos heteroc
- Page 47 and 48: Los resultados de los análisis iso
- Page 49: EXTRACCIÓN DE ADN La colección de
- Page 53 and 54: Las sondas se utilizan en las hibri
- Page 55 and 56: Los fragmentos de restricción son
- Page 57 and 58: La técnica de PCR convencional es
- Page 59 and 60: Los protocolos de las reacciones de
- Page 61 and 62: plantas muestran diferencias polim
- Page 63 and 64: La técnica RAPD presenta como vent
- Page 65 and 66: SECUENCIACIÓN DEL ADN La técnica
- Page 67 and 68: Los cromatogramas de las dos lectur
- Page 69 and 70: CONSERVACIÓN DE LA FLORA ENDÉMICA
- Page 71 and 72: Anexo I : Protocolos para el estudi
- Page 73 and 74: SISTEMAS ENZIMÁTICOS: Aspartato am
- Page 75 and 76: Indicaciones específicas: Mezclar
- Page 77 and 78: Indicaciones específicas: Mezclar
- Page 79 and 80: Anexos II-VI : Protocolos para los
- Page 81 and 82: 5- Cargue las muestras (verificaci
- Page 83 and 84: ITS: 94ºC por 5 min al principio,
<strong>de</strong> las dos hebras <strong>de</strong>l ADN tienen distintos nucleótidos, o romos, si tienen el mismo número<br />
y están apareados.<br />
Todas las enzimas <strong>de</strong> restricción proce<strong>de</strong>n <strong>de</strong> organismos procariotas y reciben su nombre<br />
<strong>de</strong> la bacteria <strong>de</strong> la que fueron aisladas (p.e., Bam HI, proce<strong>de</strong> <strong>de</strong> Bacillus<br />
amyloliquefaciens, cepa H, <strong>de</strong>scubierta en primer lugar (I), su sitio <strong>de</strong> restricción es<br />
G/GATCC; Eco RI proce<strong>de</strong> <strong>de</strong> Escherichia coli, cepa RY, <strong>de</strong>scubierta en primer lugar (I),<br />
su sitio <strong>de</strong> restricción es A/GATCT; Hind III proce<strong>de</strong> <strong>de</strong> Haemophilus influenzae cepa Rd<br />
<strong>de</strong>scubierta en tercer lugar (III), su sitio <strong>de</strong> restricción es A/AGCTT; etc.). Las enzimas se<br />
clasifican por su frecuencia <strong>de</strong> corte, relacionada con la longitud <strong>de</strong>l sitio <strong>de</strong> restricción; así<br />
hay enzimas con lugares <strong>de</strong> restricción mayores (6 pb) que cortan menos frecuentemente,<br />
enzimas con lugares <strong>de</strong> restricción intermedios (5 pb) que cortan con relativa frecuencia, y<br />
enzimas con lugares <strong>de</strong> restricción menores (4 pb) que cortan con mucha frecuencia.<br />
Para la restricción enzimática se prepara una solución que contine el ADN <strong>de</strong> la muestra y<br />
la enzima en un medio tamponado a<strong>de</strong>cuado a 37C durante 2-8 horas. Una vez finalizada la<br />
restricción, los fragmentos obtenidos <strong>de</strong>l corte enzimático <strong>de</strong>l ADN <strong>de</strong> la muestra se<br />
separan por electroforesis en gel <strong>de</strong> agarosa. Si el genoma es <strong>de</strong> pequeño tamaño y la<br />
enzima dispone <strong>de</strong> escasos lugares <strong>de</strong> restricción, se obtendrán pocos fragmentos, que<br />
podrán visualizarse fácilmente. Sin embargo, si se está sometiendo al ADN total a la acción<br />
enzimática, se obtendrán numerosos fragmentos <strong>de</strong> distintos tamaños como resultado <strong>de</strong> ese<br />
corte que no podrán visualizarse fácilmente al teñir el gel.<br />
51
Change language