Manual sobre Técnicas Moleculares - Centro Jardín Botánico de ...

precipitado se lava con una solución de etanol y sales amónicas y se diluye en agua
ultrapurificada o en una solución tampón muy diluída. Los métodos de extracción de ADN
(micropreparaciones) vienen explicados en el Anexo III.
La solución diluída final contiene tanto ADN como ARNs, ya que el protocolo sirve para
precipitar los dos tipos de ácidos nucleicos. Los ARNs no suelen interferir en la mayoría de
las manipulaciones y análisis a los que se somete al ADN, por lo que no es necesario
eliminarlos; sin embargo sí que suelen distorsionar las cuantificaciones de las
concentraciones de ADN total, si se hacen por espectrofotometría. Si se quiere obtener una
solución purificada de ADN, sin ARNs, el extracto inicial se trata con ARNasa, enzima que
degrada los ARN, obteniéndose así una solución que contiene únicamente ADN. La
concentración del ADN total aislado en cada muestra se calcula por espectrofotometría o
por fluorometría. La calidad de ese ADN total se comprueba en un gel de agarosa; si el
ADN es de buena calidad se observa una banda de alto peso molecular, no degradada, en la
parte superior de la calle del gel, si el ADN está degradado se observa una mancha de fondo
a lo largo de la calle.
RFLP
La técnica de los Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP en
siglas inglesas, “Restriction Fragment Length Polymorphisms”) fue una de las técnicas
pioneras de análisis de los genomas. Los RFLP se basan en la restricción, o corte del ADN
de los genomas, mediante unas enzimas específicas, llamadas enzimas de restricción, y la
posterior hibridación de algunos de los fragmentos resultantes con determinadas sondas
complementarias (fragmentos de ADN monocatenarios).
Con la técnica de RFLP pueden examinarse polimorfismos genómicos de cualquier tipo de
genoma vegetal (nuclear, cloroplástico o mitocondrial). Esos polimorfismos son alelos
codominantes, que pueden corresponder a distintos tipos de ADN (copia simple o baja
copia, moderadamente repetitivo, o altamente repetitivo).
Los RFLP se han utilizado como marcadores genómicos del genoma nuclear, del genoma
cloroplástico, y del genoma mitocondrial, y en estudios filogenéticos, utilizando como
caracteres las mutaciones en los sitios de restricción y basándose en el empleo de distintas
combinaciones de sondas y enzimas. Los RFLP nucleares se heredan de forma mendeliana,
y han sido empleados en estudios genético-poblacionales, en selección de progenies y en
detección de híbridos; también han servido para el mapeo genómico de caracteres de interés
en la mejora genética de vegetales cultivados.
El primer paso del estudio consiste en el corte del ADN de las muestras mediante enzimas
de restricción. Las enzimas de restricción son enzimas endonucleasas, que cortan el ADN
bicatenario internamente, en unos lugares específicos (para cada enzima) denominados
sitios de restricción. Los sitios de restricción son secuencias cortas de nucleótidos (de 4, 5,
ó 6 pares de bases) palindrómicas, reconocidos por las enzimas a lo largo del genoma, y en
donde producen el corte. La restricción puede producir extremos cohesivos, si los extremos
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