Manual sobre Técnicas Moleculares - Centro Jardín Botánico de ...

EXTRACCIÓN DE ADN
La colección de material vegetal que va a ser utilizado para la extracción del ADN es más
sencilla que en el caso del utilizado para la extracción de isoenzimas ya que no debe
mantenerse en frío hasta la extracción de la molécula. El material colectado deberá ser,
preferiblemente, fresco; las hojas jóvenes proporcionan una buena fuente de ADN. Si el
material no va a utilizarse inmediatamente para el aislamiento del ADN, puede almacenerse
por tiempo indefinido, previa desecación de los tejidos. Esto se consigue mediante la
liofilización o mediante el secado con gel de sílice. El ADN puede extraerse también a
partir de material de herbario, siempre que éste no provenga de colecciones antiguas y se
halle bien preservado. El material de herbario que fue únicamente prensado y secado, sin
recibir ningún otro tipo de tratamiento, puede ser utilizado para el aislamiento de ADN de
buena calidad; sin embargo, algunos tratamientos empleados durante la preparación de los
ejemplares de herbario pueden precipitar y degradar el ADN, como en el caso de empleo de
alcoholes u otros compuestos fijadores, o de venenos (p.e. las sales de mercurio).
Actualmente existen lotes de reactivos especiales para la extracción de ADN de ejemplares
de herbario. Los métodos de colecta del material y su preservación para la posterior
extracción del ADN vienen explicados en el Anexo II.
El aislamiento del ADN se consigue mediante una serie de procesos de extracción de la
molécula de las células, utilizando soluciones tampón ricas en sales, y de precipitación, con
alcoholes. El protocolo seguido para la extracción de ADN en minipreparaciones de
muestras se adjunta en el Anexo II; este protocolo sirve para la extracción del ADN total, es
decir el ADN de los genomas nuclear, cloroplástico y mitocondrial. Si se quiere conseguir
una extracción diferencial de los distintos genomas vegetales, las células han de ser
sometidas a diferentes procesos de centrifugación diferencial para separar los orgánulos y
proceder con posterioridad al aislamiento y precipitación del ADN de cada uno de esos
orgánulos. La mayoría de las técnicas de análisis de los genomas que van a ser utilizadas
después no necesitan un aislamiento separado de los distintos ADN genómicos y pueden
utilizar el ADN total. Por su menor complicación, casi todos los protocolos de extracción
de ADN son para ADN total.
Previamente a la extracción del ADN, el material seco o liofilizado puede molerse en
nitrógeno líquido hasta conseguir un polvo muy fino, o bien puede utilizarse directamente
el material fresco para el aislamiento del ácido nucleico. La molienda o la trituración de las
muestras en mortero provoca la rotura de las células y de los compartimentos subcelulares,
permitiendo la extracción de los ADN de los distintos genomas. El tampón de extracción
del ADN contiene sales de amonio (CTAB) y sodio que al poseer cationes positivos forman
enlaces por atracción eléctrica con los aniones negativos de los radicales fosfato del ADN,
conduciendo así a la extracción de esta molécula. Al extraer el ADN se extraen también
otros metabolitos celulares, por ello los pasos siguientes del protocolo tratan de purificar el
extracto inicial eliminando compuestos apolares lipídicos (con cloroformo y alcohol
isoamílico) y proteínas (con formol).
La precipitación de los ácidos nucleicos se consigue con alcoholes (isopropanol, etanol);
concretamente el isopropanol produce una gran eficiencia en el precipitado. Este
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