Manual sobre Técnicas Moleculares - Centro Jardín Botánico de ...

trituración. Cuando el número de muestras a extraer es elevado se utilizan placas de
trituración con numerosos pocillos y un mango acoplado a taladro. Al romperse las células
y los orgánulos celulares en el proceso del triturado, las enzimas solubles pasan a la
solución del tampón.
Electroforesis
La separación de las isoenzimas se realiza mediante electroforesis en gel. Aunque existen
distintos tipos de soporte de gel (almidón, poliacrilamida, acetato), el gel de almidón es uno
de los más ampliamente utilizados por su facilidad de manejo, eficaz poder de resolución, y
bajo coste. La confección de los geles de almidón se explica en el protocolo del Anexo I.
La electroforesis transcurre en un medio tamponado, cuya composición puede variar
dependiendo de los sistemas enzimáticos que se vayan a resolver con posterioridad
(Wendel & Weeden, 1989; Anexo I); en general los tres tipos de tampones más
comúnmente utilizados en las electroforesis de isoenzimas vegetales son Borato de Litio,
Tris-Borato, y Citrato de morfolina. Las muestras se aplican en un extremo superior del gel,
y consisten en pequeños fragmentos de papel Watmann que previamente han sido
humedecidos en la solución de extracción de cada muestra.
El desarrollo electroforético debe transcurrir igualmente en condiciones de frío, para evitar
que el calentamiento de la conducción eléctrica pudiese desnaturalizar a las isoenzimas. Un
sistema de refrigeración mantiene a 4C los geles durante la electroforesis. Una vez
completada ésta (3-4 horas) los geles se sacan de las cubetas y se cortan en capas finas,
cada una de las cuales servirá para el revelado de un tipo de enzima.
Revelado
Los sistemas de revelado enzimático consisten en reacciones redox acopladas que permiten
visualizar la posición de migración de las isoenzimas por la precipitación sobre el gel de un
compuesto coloreado, el formazán. Los tampones de revelado son específicos para cada
enzima ya que deben contener el sustrato específico que modifica la enzima, el coenzima
redox que necesita la enzima, y los compuestos PMS (metasulfato de fenazida) y MTT
(Tetrazolium). La tinción se produce por la concatenación de las siguientes reacciones de
óxido reducción:
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