Manual sobre Técnicas Moleculares - Centro Jardín Botánico de ...

de la célula, y el lugar donde tienen lugar un mayor número de rutas metabólicas
catalizadas por enzimas solubles, aunque éstas también se producen en el interior de
orgánulos tales como los cloroplastos, las mitocondrias, y los peroxisomas (o glioxisomas).
Las isoenzimas o aloenzimas constituyen variantes alélicas de una misma enzima, ya que
catalizan la misma reacción metabólica. Las isoenzimas poseen idéntico centro de reacción,
lo que les permite transformar a un mismo sustrato en un mismo producto resultante,
difiriendo, sin embargo, en la composición de alguno de sus aminoácidos, lo que provoca
que tengan una distinta carga eléctrica o peso molecular y, por ello, una diferente migración
electroforética.
Las isoenzimas constituyen marcadores codominantes, puesto que distintos alelos pueden
expresarse por igual en condiciones de heterozigosis. Los genes isozímicos de una
particular enzima pueden encontrarse en un solo locus o en dos o más loci. Puesto que la
mayoría de los sistemas enzimáticos estudiados son universales, sus genes suelen hallarse
en dos o más loci, y esos genes codifican a isozimas que actúan en distintos
compartimentos celulares (p.e. enzima citosólica y enzima cloroplástica). A la hora de
estudiar los genotipos, se codifican separadamente los alelos de cada gen.
El estudio isoenzimático de las plantas requiere, básicamente, los siguientes pasos:
- Extracción de las proteínas
- Electroforesis
- Revelado de los patrones isozímicos (zimogramas)
- Interpretación de los zimogramas y codificación de los genotipos
- Análisis taxonómicos o genético-poblacionales
Los sistemas de revelado o de detección isoenzimática requieren que las enzimas estén
biológicamente activas, por ello todos los pasos que deben darse durante los procesos de
extracción de isoenzimas y de separación mediante electroforesis han de hacerse en unas
condiciones adecuadas de frío que eviten la desnaturalización de las enzimas.
Los protocolos utilizados en cada uno de los pasos de extracción, electroforesis, y detección
enzimática se adjuntan en el Anexo I.
Extracción de proteínas
El material de partida debe ser material fresco, colectado en el mismo estadío de desarrollo
de la planta en todas las muestras. Preferentemente se seleccionan hojas jóvenes de plantas
crecidas en jardín o invernadero o de plantas del campo; en éste último caso las muestras
deben transportarse refrigeradas hasta el laboratorio, y la extracción debe hacerse lo más
rápidamente posible, para evitar la degradación de las enzimas.
Para la extracción de las proteínas se utiliza un tampón de extracción, que contiene sales y
agentes reductores (Wendel & Weeden, 1989). La extracción se lleva a cabo a bajas
temperaturas, triturando las muestras en presencia del tampón, en un mortero previamente
refrigerado y en frio (hielo o nitrógeno líquido), con el fin de evitar la desnaturalización que
podrían sufrir las proteínas al aumentar la temperatura por la fricción creada durante la
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