Manual sobre Técnicas Moleculares - Centro Jardín Botánico de ...

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TÉCNICAS MOLECULARES En este Capítulo se van a revisar los principios básicos y las aplicaciones taxonómicas de las principales técnicas moleculares desarrolladas en los estudios de plantas superiores. Las técnicas que van a ser tratadas son las siguientes: 1- Estudios de proteínas: • Isoenzimas 2- Estudios de ADN: • Preparación de muestras y extracción de ADN • Restricciones enzimáticas e hibridación de ADN: RFLP • Amplificación de ADN : PCR – RAPD • Secuenciación de ADN • Microsatélites ISOENZIMAS Las isoenzimas son las distintas variantes alélicas de una misma enzima que pueden ser detectadas mediante electroforesis en geles no desnaturalizantes. Las isoenzimas constituyen marcadores moleculares alélicos codominantes, resultado de la expresión de los genes nucleares, por lo que son empleadas en estudios genético-poblacionales de vegetales y en estudios de caracterización taxonómica de plantas próximamente emparentadas entre sí. Las enzimas son proteínas que participan en las reacciones metabólicas celulares como catalizadores biológicos. La función de estos catalizadores consiste en transformar una molécula -sustrato inicial- en otra molécula -producto final-, recuperándose intacta la enzima. Las principales vías metabólicas de la célula consisten en una serie de reacciones enzimáticas concatenadas, en las que el producto resultante de una reacción, actúa como sustrato de la siguiente, hasta generar un último producto en esa cadena. Cada una de las reacciones que tiene lugar en una vía enzimática concreta está catalizada por una enzima distinta, si bien una misma actividad catalítica puede presentarse en vías diferentes. En las células vegetales los principales procesos metabólicos tienen lugar en los compartimentos citosólico y organulares, y en las membranas de esas células. Las vías metabólicas que transcurren en los compartimentos celulares están catalizadas por enzimas solubles, que son las más fácilmente extraíbles de las células, y por ello han sido las más extensamente estudiadas con fines taxonómicos. El citoplasma es el compartimento mayor 40
de la célula, y el lugar donde tienen lugar un mayor número de rutas metabólicas catalizadas por enzimas solubles, aunque éstas también se producen en el interior de orgánulos tales como los cloroplastos, las mitocondrias, y los peroxisomas (o glioxisomas). Las isoenzimas o aloenzimas constituyen variantes alélicas de una misma enzima, ya que catalizan la misma reacción metabólica. Las isoenzimas poseen idéntico centro de reacción, lo que les permite transformar a un mismo sustrato en un mismo producto resultante, difiriendo, sin embargo, en la composición de alguno de sus aminoácidos, lo que provoca que tengan una distinta carga eléctrica o peso molecular y, por ello, una diferente migración electroforética. Las isoenzimas constituyen marcadores codominantes, puesto que distintos alelos pueden expresarse por igual en condiciones de heterozigosis. Los genes isozímicos de una particular enzima pueden encontrarse en un solo locus o en dos o más loci. Puesto que la mayoría de los sistemas enzimáticos estudiados son universales, sus genes suelen hallarse en dos o más loci, y esos genes codifican a isozimas que actúan en distintos compartimentos celulares (p.e. enzima citosólica y enzima cloroplástica). A la hora de estudiar los genotipos, se codifican separadamente los alelos de cada gen. El estudio isoenzimático de las plantas requiere, básicamente, los siguientes pasos: - Extracción de las proteínas - Electroforesis - Revelado de los patrones isozímicos (zimogramas) - Interpretación de los zimogramas y codificación de los genotipos - Análisis taxonómicos o genético-poblacionales Los sistemas de revelado o de detección isoenzimática requieren que las enzimas estén biológicamente activas, por ello todos los pasos que deben darse durante los procesos de extracción de isoenzimas y de separación mediante electroforesis han de hacerse en unas condiciones adecuadas de frío que eviten la desnaturalización de las enzimas. Los protocolos utilizados en cada uno de los pasos de extracción, electroforesis, y detección enzimática se adjuntan en el Anexo I. Extracción de proteínas El material de partida debe ser material fresco, colectado en el mismo estadío de desarrollo de la planta en todas las muestras. Preferentemente se seleccionan hojas jóvenes de plantas crecidas en jardín o invernadero o de plantas del campo; en éste último caso las muestras deben transportarse refrigeradas hasta el laboratorio, y la extracción debe hacerse lo más rápidamente posible, para evitar la degradación de las enzimas. Para la extracción de las proteínas se utiliza un tampón de extracción, que contiene sales y agentes reductores (Wendel & Weeden, 1989). La extracción se lleva a cabo a bajas temperaturas, triturando las muestras en presencia del tampón, en un mortero previamente refrigerado y en frio (hielo o nitrógeno líquido), con el fin de evitar la desnaturalización que podrían sufrir las proteínas al aumentar la temperatura por la fricción creada durante la 41
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