Manual sobre Técnicas Moleculares - Centro Jardín Botánico de ...

Las dos regiones ITS se distinguen, a su vez, como región ITS1, la que separa los genes
18S y 5.8S, y región ITS2, la que separa los genes 5.8S y 25-28S. Los genes ribosomales de
la región cistrónica son secuencias altamente conservadas, cuya tasa de mutación es muy
baja en las angiospermas, dada la elevada uniformidad de los ARN ribosomales que forman
los ribosomas de las plantas con flores. Estas secuencias escasamente variables resultan
únicamente informativas en los estudios de linajes lejanamente emparentados entre sí o en
grupos jerárquicos superiores. Por el contrario, las regiones espaciadoras (ETS e ITSs), no
sujetas a presión selectiva, experimentan una tasa de mutación más elevada, y resultan por
tanto informativas a niveles jerárquicos inferiores. Tanto las regiones génicas (18S, 5.8S,
25-28S) como las regiones espaciadoras (ETS, ITSs) del cistrón nucleolar están sujetas a
evolución concertada, mientras que la región no cistrónica o espaciador intergénico (IGS)
no lo está.
El tamaño de la región espaciadora ETS es de unos 400 nucleótidos, mientras que los
espaciadores ITS tienen aproximadamente 200 nucleótidos cada uno. Las regiones ITS han
sido ampliamente estudiadas debido a la facilidad en el diseño de cebadores universales en
las regiones flanqueantes conservadas del gen 18S (cebador directo) y del gen 25-28S
(cebador reverso) y a la amplificación única del fragmento ITS1-5.8S-ITS2, de tamaño
relativamente pequeño (600-700 pb), y su posterior secuenciación con los cebadores
externos, utilizados en la amplificación, o con cebadores externos e internos (‘nested
primers’). La región ETS, al no disponer de dos regiones flanqueantes conservadas, no
permite el diseño de cebadores universales en ambos extremos (únicamente se puede
diseñar un cebador universal reverso en el extremo anterior del gen 18S), lo que implica la
búsqueda de cebadores directos específicos para cada especie, así como dificultades
ulteriores en la secuenciación, al no existir tampoco cebadores internos universales. El
ingente número de secuencias ITS obtenidas hasta la fecha en las angiospermas está
depositado y puede ser consultado en los bancos generales de genes (p.e. GenBank) o de
secuencias y reconstrucciones evolutivas (TreeBase).
Un ejemplo de la utilidad de las secuencias génicas conservadas de los genes NOR, a
niveles jerárquicos elevados, es la reconstrucción de la filogenia de los principales linajes
de las angiospermas basado en la secuencia del gen ribosomal 18S (Soltis et al. 1997; Soltis
et al., 1998). Al examinar la secuencia del gen 18S en las angiospermas estudiadas se
comprobó la existencia de regiones más conservadas y regiones más variables, que están
relacionadas, a su vez, con la estructura secundaria de la molécula. Son las regiones
variables del gen 18S, que corresponden a zonas más inestables del plegamiento del ARN
ribosomal, las que proporcionan el mayor número de caracteres informativos para la
reconstrucción evolutiva de este grupo de plantas.
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