Manual sobre Técnicas Moleculares - Centro Jardín Botánico de ...

CURSO DE POSTGRADO:
TÉCNICAS MOLECULARES APLICADAS A
ESTUDIOS TAXONÓMICOS Y EVOLUTIVOS
DE PLANTAS SUPERIORES
PROFESORA:
PILAR CATALAN RODRIGUEZ
UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA (ESPAÑA)
UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES (VENEZUELA)
Septiembre 2001

Objetivos
El objetivo de este curso es el de presentar una visión actualizada de las técnicas
moleculares que son más comunmente empleadas en el estudio de la taxonomía y de la
evolución de las plantas superiores, incidiendo en los métodos de análisis de los genomas
vegetales como fuentes de nuevos datos taxonómicos y en la aplicación de dichos datos a
los estudios sistemáticos y de conservación de las angiospermas.
La primera parte del curso trata sobre las características de las moléculas primarias que han
sido aisladas en las plantas y sobre el desarrollo de las distintas técnicas moleculares
empleadas en el análisis de esas moléculas, explicando los fundamentos teóricos y prácticos
inherentes a cada técnica, y sus potenciales aplicaciones a estudios desarrollados a distintos
niveles sistemáticos. En la segunda parte del curso se abordan los métodos de análisis de las
distintas bases de datos moleculares enfocados a una caracterización taxonómica molecular
de las plantas en estudio, al estudio de la varibilidad y divergencia genéticas poblacionales,
y a la reconstrucción de las relaciones de parentesco evolutivo entre determinados grupos
de plantas. De todas las fuentes de datos moleculares estudiadas hasta la fecha ha cobrado
especial relevancia en los últimos años la secuenciación de regiones del ADN y el empleo
de los datos obtenidos de las secuencias en las reconstrucciones filogenéticas de la práctica
totalidad de los grupos vegetales presentes en el planeta.
En este curso se revisarán los estudios comparativos de secuencias de ADN, las bases
conceptuales de las reconstrucciones filogenéticas a través de distintos métodos u
aproximaciones, y las implicaciones que dichos resultados evolutivos están teniendo en la
sistemática actual de las angiospermas.
Marco de colaboración interuniversitaria
El presente curso se enmarca dentro de las actividades académicas programadas en los
convenios interuniversitarios firmados entre la Universidad de Zaragoza (UZ, Zaragoza,
España) y las Universidades venezolanas Universidad Central de Venezuela (UCV,
Maracay/Caracas, Venezuela) y Universidad de Los Andes (ULA, Mérida, Venezuela).
El curso forma parte de los actuales programas de postgrado de la Cátedra de Botánica
Sistemática de la Escuela Superior de Agricultura de la UCV (Maracay, Venezuela) y de la
Cátedra de Botánica de la Facultad de Ciencias Biológicas de la ULA (Mérida, Venezuela).
Zaragoza, 17 de Septiembre de 2001
2

CRÉDITOS
Las materias comprendidas en este temario se dividen en dos bloques Técnicas
Moleculares y Análisis Filogenéticos, y han sido elaborados por la autora contando con la
colaboración de otros profesores e investigadores en diversos aspectos conceptuales y
técnicos. El bloque temático Análisis Filogenéticos corresponde al temario del Curso de
Doctorado Reconstrucciones Filogenéticas basadas en análisis del ADN impartido por la
autora en la Universidad de Zaragoza.
Colaboradores:
Fuertes Aguilar, J. (Real Jardín Botánico, CSIC, Madrid, España)
– Aspectos técnicos y conceptuales sobre estudios del ADN.
Gonzalez Candelas F. (Universidad de Valencia, España)
– Aspectos conceptuales sobre análisis filogenéticos basados en distancias genéticas y en máxima
verosimilitud.
Nickrent, D. E. (University of Illinois, Carbondale, USA)
– Zimogramas y referencias bibliográficas extraídos de su página de internet.
Nieto Feliner, G. (Real Jardín Botánico, CSIC, Madrid, España)
– Aspectos conceptuales sobre Cladismo.
Olmstead, R. G. (University of Washington, Seattle, USA)
– Protocolos de estudios de ADN. Aspectos conceptuales sobre reconstrucciones filogenéticas.
Segarra Moragues, J.G. (Universidad de Zaragoza, España)
– Protocolos de estudios isoenzimáticos. Ejercicios de isoenzimas.
Torrecilla López, P. (Universidad de Zaragoza, España – UCV, Venezuela)
– Protocolos de estudios de ADN.
Otras figuras y conceptos utilizados en los temarios han sido tomados de diversas
publicaciones científicas. Quiero expresar mi agradecimiento a todos los autores y
colaboradores que directa o indirectamente han participado en la elaboración de estas
materias.
Pilar Catalán Rodríguez (pcatalan@posta.unizar.es)
3

TÉCNICAS MOLECULARES
4

ÍNDICE
- Marcadores moleculares y su aplicación a la taxonomía de las plantas 6
- Biomoléculas 7
- Análisis del genoma 8
- El genoma cloroplástico 12
- El genoma mitocondrial 19
- El genoma nuclear 22
- Valor informativo de distintas regiones genómicas en estudios
filogenéticos de angiospermas 37
- Biogeografía y conservación 38
- Técnicas moleculares 40
- Isoenzimas 40
- Estudio del genoma (ADN) 48
- RFLP 50
- PCR 56
- RAPD 61
- Secuenciación del ADN 65
- Microsatélites 67
- Conservación de la flora endémica y amenazada 69
- Páginas de interés de Internet 70
- Bibliografía recomendada 70
- Anexo I: Protocolos para el estudio isoenzimático 71
- Anexos II-VI: Protocolos para los estudios del ADN 79
5

Marcadores moleculares y su aplicación a la taxonomía de las plantas
Una de las primeras preguntas que podemos hacernos al emprender el estudio de las
tecnologías moleculares es ¿Qué son los marcadores moleculares?
Varias respuestas podrían contestar a esta cuestión:
- Los marcadores moleculares son huellas genómicas específicas de un taxón originadas
por mutaciones en su ADN
- Los marcadores moleculares permiten calcular la variabilidad genética de las
poblaciones y estimar su dinamismo genético
- Diferentes regiones del genoma proporcionan distintos tipos de marcadores útiles para
la identificación de taxones que no pueden ser caracterizados por métodos
convencionales (p.e. morfológicos)
- La historia evolutiva de grupos de taxones, el origen de los linajes, y sus relaciones de
parentesco se reconstruyen mayoritariamente a partir de distintos tipos de marcadores
moleculares.
Antes de introducirnos en el mundo de las tecnologías moleculares es preciso indicar que
estas técnicas modernas constituyen una herramienta más a emplear en los estudios
sistemáticos de las plantas, siendo complementarias a otras más clásicas, tales como las
basadas en la morfología, la cariología, la fisiología, o la biología del desarrollo. Por sus
especiales propiedades analíticas las técnicas moleculares pueden proporcionar un alto
número de caracteres, ampliando así notablemente la base de datos sobre la que se
fundamenta el estudio del grupo de plantas de nuestro interés. Es especialmente importante
la información previa que el taxónomo tenga sobre el grupo en estudio en cuestión; cuanto
mayor sea ese conocimiento más fácil le resultará la selección de la molécula y de la
técnica adecuadas para su estudio molecula r y más correctamente podrá interpretar los
resultados de sus análisis.
Los problemas sistemáticos con que se enfrentan los taxónomos que estudian las plantas
son de diversa índole. Uno de los principales consiste en establecer la identidad y los
límites jerárquicos de los taxones, especialmente a nivel específico e infraespecífico
(especies, subespecies, variedades, formas, u ecotipos), para esta finalidad han sido
empleados distintos tipos de marcadores moleculares. Otros eventos que han
experimentado las plantas, que dificultan su estudio taxonómico y evolutivo, son los
relativos a los fenómenos de hibridación e introgresión (reticulación), a la aparición de
razas o de nuevos taxones poliploides, al mantenimiento de microespecies mediante
sistemas de reproducción asexual, y a distintos casos de plasticidad fenotípica como
respuesta o adaptación a distintos factores abióticos. Para algunos de estos casos los
marcadores moleculares aportan también una extensa fuente de datos que puede ayudar a
resolver el tratamiento taxonómico de los elementos implicados. Por último, como ya
6

hemos indicado anteriormente, los marcadores moleculares obtenidos de los estudios
comparativos de las secuencias de ADN constituyen la base de datos principal sobre la que
se apoyan las reconstrucciones filogenéticas actuales de la práctica totalidad de los grupos
vegetales.
Dada la importancia creciente que los estudios de conservación de las floras autóctonas
están teniendo en la mayoría de los países, los marcadores moleculares presentan una
vertiente aplicada, como fuente de apoyo a tales estudios de conservación. Los marcadores
moleculares aportan un contingente de datos importante para el conocimiento de la
biodiversidad vegetal, en especial en lo referente a endemismos locales, en relación con sus
parientes evolutivos más próximos, y en especies raras y amenazadas, examinadas desde un
contexto global y particular. Además de contribuir a la caracterización taxonómica y a los
estudios filogenéticos de estas especies, los marcadores moleculares proporcionan las
mejores fuentes de datos fenotípicos y genotípicos sobre los que se sustentan los cálculos
de los parámetros genético-poblacionales que permiten establecer estimaciones sobre la
variabilidad genética y el flujo génico actual de las poblaciones y su potencial dinamismo
genético poblacional en el futuro. Estos índices genéticos conforman una base empírica
esencial sobre la que se basan las medidas a adoptar en la protección de las plantas
endémicas o amenazadas comprendidas en lo s distintos programas conservacionistas .
Biomoléculas
Las moléculas objeto de estudio en las investigaciones de biología molecular de plantas son
los denominados metabolitos primarios, es decir, los ácidos nucleicos (ADN, ARN) y sus
productos de expresión primaria (proteínas). Los ácidos nucleicos son las moléculas que
contienen la información genética codificada en su secuencia de nucleótidos (ADN) o que
sirven de transmisores de dicha información para la síntesis de las proteínas (ARN
mensajeros, con la participación de ARN ribosomales y de ARN transferentes). Las
proteínas son el resultado de la expresión de determinados genes a lo largo, o en
determinados momentos, de la vida de las plantas.
El orden cronológico de estudio de estas moléculas, en su aspecto taxonómico y evolutivo,
comienza con las proteínas, en particular con las formas o variantes de aquellas proteínas
que son catalizadores biológicos, conocidas como isoenzimas o, más propiamente llamadas,
aloenzimas. Los estudios isoenzimáticos adquirieron un gran auge en la década de los años
60, tanto por su utilidad como marcadores moleculares identificadores de taxones, como
por los estudios genético-poblacionales que se desarrollaron con estas variantes alélicas en
determinadas especies vegetales. Su utilización persiste hasta hoy día, especialmente en lo
relativo a su aplicación a los estudios genéticos de las poblaciones. Estas moléculas serán
explicadas con más detalle en un capítulo siguiente.
El segundo tipo de metabolito primario en ser estudiado con fines taxonómicos fue el ARN.
Los ácidos ribonucleicos, más concretamente los ARN mensajeros que transmiten
codificada la información genética en su secuencia de nucleótidos desde el ADN a las
7

proteínas, fueron empleados como fuente de datos moleculares en la década de los 70. No
obstante su estudio fue limitado y decayó rápidamente debido al auge que alcanzó el
estudio posterior del ADN. La escasa información proporcionada por el ARN, en
comparación con el ADN, y las dificultades técnicas de su aislamiento y secuenciación, por
la menor estabilidad y más rápida degradación de esta hebra sencilla, la convirtieron en una
molécula inadecuada para los estudios moleculares exhaustivos de las plantas. Debido a la
práctica inexistencia de trabajos sistemáticos actuales basados en el ARN, no trataremos
sobre ella.
El tercer tipo de molécula en ser estudiado con fines sistemáticos en plantas, y cuyo estudio
ha sobrepasado en amplitud al de los otros dos metabolitos primarios ya comentados, es el
ADN o ácido desoxirribonucleico. Los estudios taxonómicos y evolutivos basados en los
análisis del ADN de vegetales despuntaron en la década de los 80, aunque el mayor
incremento tuvo lugar en la década de los 90, y prosigue en el presente siglo. El ADN
presenta varias ventajas tanto funcionales como técnicas sobre las otras moléculas
primarias (ARN y proteínas), lo que explica la preeminencia que su estudio ha tenido en los
análisis moleculares de las plantas. En primer lugar, el ADN es la fuente de informació n
genética primigenia, puesto que esa información se halla codificada en los genes,
dispuestos a lo largo de su molécula, por ello resulta más apropiado examinar la fuente de
información hereditaria original que no sus derivados (ARNs o proteínas). En segundo
lugar, el ADN contiene, además de las regiones génicas, otras regiones no codificadoras
que también proporcionan marcadores moleculares útiles en taxonomía, por lo que las
probabilidades de obtener datos informativos son mayores en esta molécula que en los otros
metabolitos primarios. En tercer lugar, la molécula de ADN no se ve afectada por
fenómenos de activación o represión relacionados con cambios ontogénicos del individuo o
por cambios ambientales, a diferencia de lo que puede ocurrir con el ARN y las proteínas,
lo que permite su estudio en cualquier individuo de cualquier edad. En cuarto lugar, el
ADN, por ser una doble hélice y por no necesitar hallarse biológicamente activo para su
estudio, es más estable y más fácilmente manipulable que los ARNs, hebras sencillas
inestables, o que las proteínas enzimáticas, alterables por desnaturalización, lo que ha
favorecido el desarrollo de un elevado número de técnicas moleculares encaminadas al
análisis de esta molécula. Este conjunto de factores ha determinado el enorme auge de los
estudios moleculares del ADN y lo ha convertido en la molécula óptima para la búsqueda
de marcadores moleculares aplicados a la sistemática vegetal.
Análisis del genoma
Los genomas de todos los seres vivos, procariotas y eucariotas, están formados por ADN.
La estructura del ácido desoxirribonucleico consiste en una doble hélice formada por dos
hebras complementarias y antiparalelas, cada una de las cuales está formada por una
sucesión de nucleótidos unidos entre sí por enlaces fosfoester; el apareamiento de las dos
hebras tiene lugar mediante enlaces por puentes de hidrógeno entre nucleótidos de las
hebras opuestas que tienen bases nitrogenadas complementarias. Así, el nucleótido de una
cadena con base purínica Adenina (A) forma 2 enlaces de puentes de hidrógeno con el
8

nucleótido opuesto de la otra cadena que posee la base pirimidínica Timina (T), y el
nucleótido de una cadena con base purínica Guanina (G) forma 3 enlaces de puentes de
hidrógeno con el nucleótido opuesto de la otra cadena que posee la base pirimidínica
Citosina (C). Los genomas de los seres vivos están formados por una sucesión de
desoxinucleótidos complementarios, en un número determinado, en una y otra hebra de la
doble hélice.
Los genomas de los organismos consisten en largas moléculas de ADN, de tamaño
variable, que contienen a lo largo de su secuencia los genes, regiones concretas de la
molécula que poseen información genética codificada para la síntesis de otras moléculas
(ARNs, proteínas). Esa codificación consiste en un orden secuencial específico de sus
nucleótidos. Los genomas también contienen regiones no génicas, desprovistas de
información genética, en las cuales la secuencia de los nucleótidos no codifica ninguna otra
molécula. Tanto las regiones génicas como las no génicas son fuentes potenciales de
marcadores moleculares.
Los genomas de los procariotas son más sencillos que los de los eucariotas. Las bacterias
carecen de núcleo; su ADN se dispone en un cromosoma circular, que forma el genoma
principal, pudiendo presentar también otras estructuras circulares menores llamadas
plásmidos. Estos genomas son genomas haploides (sólo hay un tipo de ellos) aunque
puedan existir varias copias repetidas de los mismos tipos, y se hallan en el compartimento
único, citosólico, de las bacterias. Tanto el genoma cromosómico bacteriano como los
plásmidos están constituídos mayoritariamente por ADN copia simple o baja copia,
llamado así porque cada región genómica está presente una sóla vez, o unas pocas veces, en
toda la molécula.
Los eucariotas, a diferencia de los procariotas, presentan más de un genoma. Estos
organismos poseen un genoma nuclear, voluminoso y complejo, que ocupa el interior del
núcleo, y una serie de genomas organulares, más simples, que son de tipo bacteriano. Los
9

eucariotas aeróbicos poseen mitocondrias, orgánulos responsables de la respiración
oxidativa y de supuesto origen procariota endosimbiótico, que contienen en su
compartimento interno, la matriz mitocondrial, un genoma de naturaleza procariota . Los
eucariotas fotosintéticos, por su parte, poseen cloroplastos, orgánulos responsables de la
fotosíntesis e igualmente de supuesto origen procariota endosimbiótico, que contienen en su
cavidad interior, el estroma, un genoma simple de tipo bacteriano.
Estudios cuantitativos de la cantidad de ADN presente en los genomas (mediante técnicas
de absorciones de radiaciones UV y de densitometría) permitieron calcular los tamaños del
ADN de los genomas de distintos organismos. Al analizar esos valores se observó que los
organismos más simples poseían los genomas más pequeños, y que los tamaños de esos
genomas iban aumentando según aumentaba el grado de complejidad de dichos organismos
(virus → bacterias → hongos → anélidos → insectos), tal como era esperable. Sin embargo
también se observó que, en eucariotas superiores (animales y plantas) e incluso en algún
eucariota inferior (amebas), organismos aparentemente menos complejos (p.e. anfibios:
Triturus) tenían un genoma más grande que organismos aparentemente más complejos (p.e.
mamíferos: Homo) (en este caso de hasta dos órdenes de magnitud mayor). Algo parecido
ocurría en plantas superiores, donde, además, el nivel de ploidía contribuye a aumentar los
tamaños genómicos. Especies de las familas Asteraceae (p.e. Chrysanthemum, 4x), Poaceae
(p.e. Triticum aestivum, 6x), y Liliaceae (p.e. Trillium) poseían genomas desde 3x hasta
varios órdenes de magnitud superiores a los de los humanos. Esta aparente contradicción se
explica por el hecho de que el genoma nuclear de los eucariotas es estructuralmente más
complejo que el de los procariotas y, a diferencia de éste último, no está todo él ocupado
10

por genes; en muchos eucariotas sólo una pequeña proporción de él posee genes. De allí
que organismos menos complejos puedan presentar genomas mayores que organismos más
complejos sin que ello implique que posean un mayor número de genes. Los actuales
resultados de las secuenciaciones de los genomas de distintos seres vivos (entre otros el de
los humanos) están demostrando estas peculiaridades del genoma nuclear de los eucariotas.
La complejidad genómica del genoma nuclear eucariota estriba en su estructuración; el
ADN que lo constituye no es homogéneo, como el de las bacterias, que es
mayoritariamente copia simple o baja copia, sino que está formado también por ADN
repetitivo (moderadamente repetitivo y altamente repetitivo). Este ADN repetitivo es el
causante de los elevados tamaños genómicos de ciertas especies eucariotas. En especies con
genomas de tamaños pequeños la mayor parte de éste suele ser ADN no repetitivo (p.e
bacterias, insectos, Arabidopsis thaliana), sin embargo las especies que presentan genomas
de tamaños grandes poseen un mayor porcentaje de ADN repetitivo (p.e. Triturus, Triticum
aestivum).
Las plantas superiores, como organismos eucariotas respiratorios y fotosintéticos que son,
poseen tres tipos de genomas en sus células, el genoma nuclear (ADNn), y los genomas
organulares: el genoma mitocondrial (ADNmt), y el genoma cloroplástico (ADNcp). Las
características generales de cada uno de esos genomas se muestran en la Tabla siguiente. El
genoma cloroplástico (ADNcp), es un genoma de tipo bacteriano dispuesto en un
cromosoma principal, no recombinante, y su tamaño oscila alrededor de 150 x 10 3 pb; entre
sus características se cuentan el ser un genoma haploide (aunque con numerosas copias del
mismo tipo), formado por ADN mayoritariamente copia simple o baja copia, ser un genoma
moderadamente conservado, y heredarse generalmente por vía materna. El genoma
mitocondrial (ADNmt) es también un genoma de tipo bacteriano dispuesto en un
cromosoma principal y sus anillos recombinantes, con un tamaño que oscila entre 200-2400
x 10 3 pb, tratándose también de un genoma haploide (con varias copias del mismo tipo),
formado por ADN fundamentalmente copia simple o baja copia, en plantas es un genoma
relativamente conservado (en animales y hongos es más variable), y con herencia
predominantemente materna. El genoma nuclear (ADNn) forma parte de la cromatina
nuclear interfásica que se condensa a cromosomas en las divisiones mitótica o meiótica; es
un genoma complejo, estructurado en regiones de ADN no repetitivo (ADN copia simple o
baja copia) y en regiones de ADN repetitivo (moderadamente repetitivo y altamente
repetitivo), cuyo tamaño varía dependiendo de la especie (desde 0.2 pg hasta 46 pg (1.2-
44(200) x 10 9 pb)); entre sus propiedades están el tratarse de un genoma diploide o
poliploide, el contar con regiones altamente conservadas, regiones moderadamente
variables, y regiones altamente variables (satélites), y el heredarse por vía biparental.
Debido a las distintas propiedades que presentan cada uno de los tres tipos de genomas
presentes en las plantas, cada uno de ellos actúa como fuente de diferentes tipos de
marcadores moleculares para estudios sistemáticos y de genética poblacional.
11

CARACTERÍSTICAS DE LOS GENOMAS DE ANGIOSPERMAS
TAMAÑO PROPIEDADES
CLOROPLÁSTICO cromosoma circular relativamente conservado
ADNcp 120-217 x 10 3 pb cromosoma único, haploide
maternalmente heredado
MITOCONDRIAL cromosoma(s) circular(es) altamente conservado (Plantae)/
ADNmt 200-2400 x 10 3 pb (Plantae)/ variable (Fungi)
18-121 x 10 3 pb (Fungi) cromosoma único / recombinante,
haploide / bajo nº copias
maternalmente heredado
NUCLEAR cromatina interfásica/ regiones conservadas/variables/
ADNn cromosomas hipervariables
1.2-44(200) x 10 9 pb diploide / poliploide
(homozigosis / heterozigosis)
biparentalmente heredado
El genoma cloroplástico (ADNcp)
El genoma cloroplástico o genoma plastidial se halla presente en el interior de los
plastidios, concretamente en la cavidad interna o estroma. Tal como ha señalado antes es un
genoma de tipo bacteriano, haploide, del que cada cloroplasto dispone de varias copias
asociadas en grupos o ‘nucleoides’. Cada copia está formada por un cromosoma circular,
no recombinante, por lo que la estructura general de esta molécula y el orden o disposición
que tienen sus genes es bastante universal en los principales grupos de plantas. Se han
secuenciado los genomas cloroplásticos completos de, al menos, 5 plantas, 1 briófito
(Marchantia), 1 gimnosperma (Pinus), y 3 angiospermas (Nicotiana, Oryza, Epifagus), y
actualmente se está procediendo a la secuenciación del genoma cloroplástico de más de un
centenar de representantes de los principales grupos de angiospermas. La estructura de la
figura siguiente corresponde al mapa genómico del cromosoma del tabaco, que sirve de
modelo para los de la mayoría de las plantas vasculares y de los briófitos. Este genoma
consta de dos regiones duplicadas e invertidas (en trazos más gruesos), que separan a dos
regiones de ADN copia simple, la región copia simple mayor (parte superior) y la menor
(parte inferior). El genoma cloroplástico del tabaco contiene 113 genes, de los cuales 4
codifican a ARNs ribosomales (16S, 23S, 4.5S, 5S), 30 codifican a ARNs tranferentes, y 79
codifican proteínas; de estos últimos genes 19 codifican proteínas tilacoidales y 28
codifican proteínas estromáticas, habiendo un número cada vez menor de fragmentos de
lectura abierta (ORF), que codifican proteínas cuya función aún no es conocida (24 o
menos).
12

Las dos regiones duplicadas e invertidas del genoma cloroplástico son las regiones más
conservadas de esta molécula, lo que implica que la tasa de mutación en esta región es muy
baja (una mutación tarda un tiempo muy largo en quedar fijada). Esta región duplicada
incluye a todos los genes que codifican a los ARNs ribosomales. Su alto grado de
conservación la hace idónea para buscar marcadores moleculares que permitan estudios
sistemáticos a niveles jerárquicos superiores (p.e. subclase, orden). La pérdida de una de las
dos copias repetidas ha tenido lugar, de forma aparentemente independiente, en linajes
evolutivos muy divergentes entre sí, tales como el de las gimnospermas y en varias
Fabaceae.
Otras regiones del genoma cloroplástico son moderadamente conservadas, por lo que su
tasa de mutación es algo más elevada; suelen corresponder a regiones codificadoras de
proteínas. Los genes cloroplásticos que han sido más estudiados en análisis filogenéticos de
plantas son el gen rbcL (codificador de la subunidad mayor de Rubisco) y el gen atpb
(codificador de la subunidad B de la ATPasa sintasa), localizados en la región copia simple
mayor, y el gen ndhF (codificador de la subunidad F de una NADH reductasa), localizado
en la región copia simple menor.
Los trabajos pioneros en la sistemática molecular de las angiospermas y de las plantas
terrestres se basaron en secuencias del gen cloroplástico rbcL, que ha sido el más
ampliamente secuenciado de todos ellos; las reconstrucciones filogenéticas obtenidas con
dicha molécula permitieron obtener el árbol evolutivo de los principales linajes de las
plantas con flores (Chase et al., 1993) y de las criptógamas y fanerógamas continentales
(Lewis et al., 1997). Las secuencias rbcL, así como las de otros genes cloroplásticos, se
encuentran depositadas y pueden ser consultadas en los bancos generales de genes (p.e
GenBank).
En el estudio evolutivo de las angiospermas (Chase et al., 1993) uno de los hallazgos más
relevantes consistió en la constatación de la monofilia de las Monocotiledóneas y de su
emplazamiento dentro del clado basal de las Dicotiledóneas, demostrando además la
parafilia de estas últimas. Las Monocotiledóneas aparecen como un grupo hermano dentro
del clado de dicotiledóneas primitivas. Este posicionamiento se sigue manteniendo
actualmente, al ampliar el muestreo a un mayor número de grupos, y ha sido confirmado
por otras moléculas no cloroplásticas.
14

El análisis de las secuencias cloroplásticas rbcL también ha sido utilizado para reconstruir
el árbol filogenético de las plantas terrestres (Lewis et al., 1997). El estudio filogenético de
este grupo concluyó que las hepáticas formaban un clado hermano al resto de las plantas de
tierra firme (musgos, antocerotes, helechos, gimnospermas y angiospermas), si bien esta
resolución topológica no concuerda con la obtenida de otras moléculas.
15

Otras regiones génicas del genoma cloroplástico muestran una tasa de mutación algo mayor
que el gen rbcL. Tal es el caso del gen ndhF, situado en la región copia simple pequeña y
que codifica a una NADH deshidrogenasa. La mayor tasa de variabilidad de este gen se
concentra en su mitad 3’. Las mutaciones halladas en esta región del gen son
suficientemente resolutivas como para clarificar la filogenia a nivel de tribu y género, y, en
ciertos casos, a nivel de especie. Un ejemplo de ello lo tenemos en la filogenia de la
subfamilia Pooideae de las gramíneas (Catalán et al., 1997) donde los análisis basados en la
región 3’ terminal del gen ndhF permiten resolver las pautas evolutivas de las 12 tribus
consideradas y de algunos de los géneros y especies muestreados (p.e. Brachypodium).
Un análisis comparativo de las tasas de variabilidad y del poder informativo de los genes
comentados, rbcL y ndhF, en representantes de las familias Solanaceae, Lamiae, y
Scrophulariaceae (Olmstead et al., 1998) puso de manifiesto que si bien la tasa de mutación
era mayor en el gen ndhF que en el gen rbcL, tomando en consideración el número de
posiciones variables de las secuencias alineadas, la capacidad resolutiva de ambos se
igualaba al considerar únicamente aquellas posicio nes variables que eran filogenéticamente
informativas. Tanto en un gen como en otro, el mayor porcentaje de mutaciones aparecían
en las terceras posiciones de los codones, sin que se diera con ello un cambio en la
naturaleza de los aminoácidos codificados (mutaciones silenciosas o sin sentido).
Las regiones más variables del genoma cloroplástico son, al igual que en los otros genomas
vegetales, aquellas regiones no codificadoras, que no contienen genes, es decir, las regiones
espaciadoras y las regiones intrónicas. Las regiones espaciadoras son fragmentos del ADN
que separan unos genes de otros, mientras que las regiones intrónicas (o intrones) son
fragmentos no codificadores del ADN que se encuentran intercalados entre los fragmentos
codificadores (o exones) de los genes. Los genes cloroplásticos, pese a ser de origen
bacteriano, y a diferencia de los genes mitocondriales y los de las bacterias, contienen
16

intrones, al igual que ocurre con los genes nucleares. Estas regiones no génicas permiten la
acumulación de un mayor número de mutaciones por sustitución de nucleótidos y por
delección, ya que estos procesos no afectan a ningún producto final. Las regiones
espaciadoras e intrónicas se reparten a lo largo del genoma cloroplástico, varias de ellas han
sido estudiadas con fines evolutivos.
La región espaciadora que separa los genes rbcL y atpB, la región espaciadora de los genes
trnL –trnF, y la región intrónica del gen trnL, localizadas en la región copia simple mayor,
se cuentan entre los fragmentos del genoma cloroplástico más frecuentemente secuenciados
entre las angiospermas en la búsqueda de posiciones informativas de grupos próximamente
emparentados entre sí.
Estudios más generalistas del genoma cloroplástico implican la búsqueda de marcadores en
distintas partes del cromosoma, o en todo él. Pese a que el genoma cloroplástico es un
genoma haploide que se transmite íntegro a la descendencia, como una unidad de
ligamiento génico, estas aproximaciones presentan la ventaja, sobre la secuenciación de una
única molécula cloroplástica, de explorar diversas fuentes de datos a lo largo del
cromosoma, facilitando la detección de un mayor número de caracteres informativos. Los
estudios generalistas del genoma cloroplástico incluyen la secuenciación de diversas
regiones del cromosoma o el mapeo de lugares de restricción enzimática. Con esta última
técnica se han logrado detectar mutaciones a nivel específico e infraespecífico. Estudios de
mapeo de sitios de restricción conducidos en poblaciones de Plantago mayor
(Plantaginaceae) europeas han permitido distinguir distintos haplotipos poblacionales;
mientras la mayor parte de las poblaciones del centro y norte de Europa presentan el mismo
haplotipo (expandido tras la colonización postglacial), las poblaciones del sur del
17

continente muestran distintos haplotipos según el área geográfica en la que habitan como
consecuencia de su aislamiento en refugios templados durante los periodos glaciales.
Aunque el genoma cloroplástico se considera, en términos generales, re lativamente
conservado, existen también regiones altamente variables. Estas regiones corresponden a
fragmentos de ADN repetitivo -microsatélites cloroplásticos- cuyo estudio permite obtener
marcadores moleculares a nivel poblacional, e incluso, individual. El origen de los
microsatélites, relacionado con errores de replicación, por deslizamientos, de la ADN
polimerasa, permite acumular una serie diferente de unidades de repetición en distintos
individuos o poblaciones. Un ejemplo del empleo de los microsatélites cloroplásticos lo
tenemos en los estudios genético-poblacionales en Pinus (Provan et al., 1999).
El estudio del genoma cloroplástico, heredado en la mayoría de las plantas por vía materna,
puede causar errores de interpretación de las filogenias de grupos hibridógenos en los que
son frecuentes los fenómenos de reticulación. En la figura siguiente se muestra un ejemplo
de las distintas reconstrucciones evolutivas que se obtendrían de un hipotético grupo de
cinco especies (A, B, C, D, E), cuya filogenia real fuese la representada a la izquierda de la
figura, y donde el linaje A hubiese participado en el pasado como donante del genoma
cloroplástico de E. Mientras la reconstrucción basada en marcadores del genoma nuclear
(heredado biparentalmente) permitiría la obtención de la reconstrucción real, la
reconstrucción basada en marcadores cloroplásticos falsearía las relaciones, al aparecer la
especie E más proximamente emparentada a A.
Pese a ello, otros autores consideran que las filogenias basadas en el genoma cloroplástico
son más fiables que las reconstrucciones basadas en genes nucleares, ya que el genoma
cloroplástico es haploide, no recombinante, y se hereda unilinealmente, mientras que los
genes nucleares disponen de dos o más copias, han podido sufrir los efectos de la
recombinación, y se heredan por dos vías. La comparación entre las filogenias obtenidas
del genoma cloroplástico y las obtenidas del genoma nuclear permite distinguir en ciertos
18

casos eventos de reticulación pretérita. Los linajes híbridos aparecen más próximos a sus
donantes maternos, en el caso de las reconstrucciones cloroplásticas, y en una posición
topológica intermedia entre la de sus progenitores materno y paterno en el caso de las
reconstrucciones nucleares.
El genoma mitocondrial (ADNmt)
El genoma mitocondrial se halla presente en el interior de las mitocondrias, los orgánulos
responsables de la respiración aeróbica, y concretamente en su cavidad interna o matriz
mitocondrial. Este genoma, al igual que el cloroplástico, es un genoma de tipo bacteriano,
haploide, existiendo varias copias del mismo en cada orgánulo, asociadas en ‘nucleoides’.
Cada copia original está formada por un cromosoma circular, si bien este cromosoma, a
diferencia del cloroplástico, es capaz de recombinarse y dar origen a otros cromosomas
circulares de menor tamaño (cuya suma de pesos moleculares es igual al peso molecular del
cromosoma incial). El hecho de que el genoma mitocondrial sea un genoma recombinante,
unido a su tamaño, que en las plantas supera al del genoma cloroplástico (en los animales y
hongos, por el contrario, es de tamaño considerablemente inferior), ha hecho más difícil su
estudio en los vegetales. Al no existir una estructura universal, en cuanto al orden y
disposición de los genes, en el genoma mitocondrial de las plantas, y al haber acumulado
este genoma un elevado número de pseudogenes de origen cloroplástico (lo que ha
contribuído al aumento de su tamaño con material genómico foráneo), no se han podido
confeccionar librerías genómicas de sondas universales que permitan el estudio de los
lugares de restricción de varios grupos, ni diseñar cebadores universales para un apreciable
número de regiones que pudiesen ser secuenciadas de forma comparativa en tales grupos.
Hasta la fecha solamente se conocen las secuencias completas del genoma mitocondrial de
una planta (1 briófito (Marchantia ). La estructura de la figura siguiente corresponde al
mapa genómico del cromosoma del maíz (Zea mays), en la que se muestran algunos de los
anillos menores producidos tras distintas recombinaciones. En el genoma mitocondrial del
Marchantia se conocen 90 genes, de los cuales 3 codifican a ARNs ribosomales (18-19S,
5S, 26S), 27 codifican a ARNs tranferentes, y 60 codifican proteínas; de estos últimos
genes algunos codifican proteínas transmembrana de las crestas mitocondriales (COB:
citocromo b; COXI y COXII: citocromo oxidasa; ATPA: ATPasa sintasa) y otros codifican
proteínas solubles matriciales, involucradas todas ellas en las rutas metabólicas de la
respiración oxidativa.
19

Una de las escasas regiones del genoma mitocondrial que ha sido ampliamente estudiada en
un elevado número de plantas es la región codificadora de los genes ribosomales. Con el
estudio comparativo de las secuencias de esta molécula (19S) se ha logrado obtener la
reconstrucción evolutiva de las plantas terrestres (Duff & Nickrent, 1999).
Como puede observarse, los resultados filogenéticos basados en los genes ribosomales de la
mitocondria (19S) indican que las hepáticas son el grupo de plantas más primitivo, seguido
de la diversificación de los antocerotes, y de los musgos, divergiendo con posterioridad los
licopodios, los helechos, y apareciendo como grupos más recientemente evolucionados las
gimnospermas y las plantas con flores. En este caso la reconstrucción evolutiva de las
plantas terrestres basada en los genes ribosomales mitocondriales difiere de la basada en el
gen rbcL cloroplástico y en la obtenida del gen ribosomal nuclear 18S.
21

En los hongos (al igual que en los animales), el genoma mitocondrial es de menor tamaño y
está homogéneamente estructurado; razones por las cuales su estudio ha avanzado
considerablemente, siendo la fuente de información genómica citoplasmática equivalente
al cloroplasto de las plantas.
El genoma nuclear (ADNn)
El genoma nuclear de las plantas está formado por el ADN contenido en el interior del
núcleo, uno de los orgánulos de mayor tamaño de la célula. Este ADN está unido a
proteínas histónicas y forma la cromatina nuclear, que se puede observar tanto en el núcleo
interfásico, cuando la célula no está en división, como en su forma más concentrada –
cromosomas- cuando la célula se halla experimentando la división mitótica o meiótica.
El genoma nuclear se caracteriza por ser de mayor tamaño y de estructura más compleja
que los genomas organulares de tipo bacteriano; su tamaño puede superar en varios órdenes
de magnitud al de los genomas cloroplástico y mitocondrial, y, a diferencia de éstos, que
son más sencillos y que consisten principalmente en ADN copia simple, el genoma nuclear
es más complejo. En el genoma nuclear se pueden diferenciar tres tipos de ADN, en cuanto
a su nivel de complejidad, que se relacionan con distintas regiones del nucleo interfásico: 1)
el ADN copia simple o baja copia, que corresponde mayoritariamente a las zonas de
eucromatina, menos condensadas; 2) el ADN moderadamente repetitivo, que corresponde
mayoritariamente a la región del nucleolo, de condensación media; y 3) el ADN altamente
repetitivo, que corresponde mayoritariamente a las regiones de heterocromatina, más
condensadas.
La diferencia estructural de estas tres regiones del ADN nuclear eucariota se refiere al
número de copias que presentan. El ADN copia simple o baja copia consiste en regiones de
ADN únicas en todo el genoma o repetidas muy pocas veces (2, 3, o hasta 5 veces). Este
22

ADN contiene secuencias codificadoras de proteínas, por lo tanto esos genes se transcriben
a ARN mensajeros. El ADN moderadamente repetitivo consiste en regiones de ADN que se
hallan repetidas del orden de miles de veces (10 3 ) en general en un número determinado de
loci. Este ADN contiene los genes ribosomales del organizador nucleolar (que se
transcriben a ARN ribosomales 18S, 5.8S y 25-28S en el nucleolo) , los genes ribosomales
5S (que se transcriben a ARN ribosomales 5S fuera del nucleolo), y los genes trn (que se
transcriben a ARN transferentes). El ADN altamente repetitivo consiste, por su parte, en
regiones de ADN que se hallan repetidas del orden de millones de veces (10 6 ) tanto en un
único locus, como en unos poco loci, como en un alto número de ellos a los largo del
genoma. El ADN altamente repetitivo, a diferencia de los anteriores, no contiene genes, y
por lo tanto no tiene ningún tipo de información codificada en sus secuencias. Este ADN se
clasifica en distintos grupos o familias de regiones satélites, de longitud y número de copias
de repetición variables.
ADN nuclear copia simple o baja copia
El ADN nuclear copia simple o baja copia es un ADN funcional, que contiene genes que se
expresan a proteínas. Los recientes estudios de secuenciación de genomas de organismos
eucariotas han puesto de manifiesto que el número total de genes codificadores de proteínas
oscila entre 15.000 y 30.000. La estructura de un gen y de sus regiones flanqueantes se
muestra en la figura siguiente. La región génica comienza en la posición +1, que marca el
inicio de la transcripción, y termina en una secuencia específica (AATAATAAA) que
señala el final de la transcripción (ambas posic iones indican a la RNA polimerasa los sitios
de comienzo y final de la transcripción; algunas posiciones corriente arriba de la posición
+1 se encuentran los promotores, cortas secuencias específicas de nucleótidos que orientan
a la RNA polimerasa hacia la posición +1).
La región codificadora del gen comienza en el codon iniciador (ATG) y termina en alguno
de los posibles codones finalizadores o stop (p.e. TAA). La corta secuencia de nucleótidos
que hay entre la posición +1 y el codon iniciador corresponden a la región del ARN
mensajero de unión al ribosoma. No toda la región génica se traducirá finalmente a
aminoácidos, ya que la mayoría de los genes nucleares muestran una sucesión de regiones
codificadoras (exones), compuestas por tripletes codificadores de aminoácidos (codones),
alternantes con regiones no codificadoras (intrones), que no presentan señal codificadora, y
que aunque son inicialmente transcritos al ARN mensajero, serán eliminados después
durante la maduración de éste por el proceso de ayus te o splicing.
23

Las regiones exónicas e intrónicas de los genes tienen distinto valor y potencial
informativo, a nivel sistemático, debido a sus diferencias en función y tasa de mutación.
Las regiones exónicas son más conservadas (dependiendo del tipo de proteína que
codifiquen pueden ser extremadamente conservadas), y por lo tanto aportan un menor
número de mutaciones informativas a niveles jerárquicos menores (especie e infra). Dentro
de estas regiones exónicas, la tasa de mutación cambia según la posición del codon; las dos
primeras posiciones de cada triplete son muy conservadas, puesto que una mutación por
sustitución del nucleótido implica siempre (posición 2) o casi siempre (posición 1) un
cambio en el aminoácido que codifican; sin embargo la tercera posición es más variable, ya
que en la mayoría de los casos una mutación por sustitución del nucleótido no conlleva un
cambio en el aminoácido que codifica (mutaciones silenciosas o sin sentido).
Desde el punto de vista evolutivo, y dependiendo del tipo de proteína codificada, las
mutaciones en las primeras posiciones del codon son más relevantes, pero su tasa de
mutación es a veces tan baja que únicamente son informativas a niveles jerárquicos
mayores (familia y supra) y no proporcionan información a niveles menores (genero,
especie). Por el contrario, las mutaciones en las terceras posiciones del codon, pese a
presentar el inconveniente de los posibles enmascaramientos producidos por saturación,
presentan la ventaja de tener una tasa de sustitución más elevada, y ser por tanto resolutivas
a niveles jerárquicos menores.
En contraste con el relativo grado de conservadurismo que presentan las regiones exónicas,
las regiones intrónicas son mucho más variables, presentando una tasa de mutación por
sustitución de nucleótidos considerablemente más alta. Ello es debido a su falta de
funcionalidad, ya que son regiones no-codificadoras, y en las que pueden acumularse un
alto número de mutaciones sin que ello implique consecuencias adaptativas negativas para
el individuo. Los intrones han resultado ser, hasta la fecha, una de las principales fuentes de
caracteres informativos del genoma nuclear en grupos de taxones de niveles jerárquicos
inferiores (especie e infra) o próximamente emparentados entre sí.
24

Uno de los problemas adicionales que presenta el estudio de las regiones intrónicas de los
genes nucleares es que éstos suelen hallarse en unas cuantas copias en el núcleo, y sus
secuencias exónicas suelen ser parecidas, por lo que resulta difícil diseñar cebadores
específicos que amplifiquen las regiones intrónicas de una particular copia del gen y no de
las otras copias. Para evitar los problemas de paralogía, o heterología, que invalidarían
cualquier análisis que se pretendiese hacer con secuencias génicas no homólogas, el estudio
de las regiones intrónicas de genes nucleares debe hacerse mediante clonación, asegurando
que las regiones clonadas de las muestras en estudio proceden todas ellas de la misma copia
del gen. Para algunas plantas, especialmente las cultivadas, se han confeccionado genotecas
o librerías genómicas de distintas regiones de sus genomas. La dificultad técnica que
implica la selección y clonación de regiones intrónicas homólogas de genes nucleares es la
causa principal del reducido número de trabajos de taxonomía molecular desarrollados
hasta la fecha en estas regiones genómicas, si los comparamos con los de otras regiones
nucleares más ampliamente estudiadas.
Entre las regiones nucleares de ADN copia simple y baja copia que han sido estudiadas con
fines taxonómicos y evolutivos en las plantas superiores se encuentran diversas regiones
intrónicas de los genes adh (alcohol deshidrogenasa), tpi (triosa fosfato isomerasa), y GS
(Glutamina sintetasa). Un ejemplo de la utilidad de estas regiones en las reconstrucciones
evolutivas de taxones próximamente emparentados entre sí es el estudio del género
Gossypium (Randall et al., 1998). Con los caracteres obtenidos de las secuencias de los
intrones 4 y 5 de una misma copia génica de adhC citoplasmática, los autores pudieron
determinar el origen biogeográfico de las especies del género distribuídas en el Viejo y en
el Nuevo Mundo
25

ADN nuclear moderadamente repetitivo
El ADN nuclear moderadamente repetitivo es un ADN génico, cuyos genes se transcriben a
ARN ribosomales y a ARN transferentes. Se caracteriza por la presencia de un número
repetitivo de copias (x 10 3 ) en determinadas regiones del núcleo (varios loci). En estas
regiones repetitivas las unidades de repetición están dispuestas en tándem y contienen
tanto fragmentos codificadores (de ARN ribosomales o transferentes) como fragmentos
espaciadores. El número de copias por locus puede variar (múltiplos de mil), así como su
posición en los mapas cromosómicos. Las regiones de ADN moderadamente repetitivo más
estudiadas en la sistemática vegetal han sido la región del organizador nucleolar (genes del
NOR, codificadores de los ADN ribosomales 18S, 5.8S, y 25-28S) y la región codificadora
del ARN ribosomal 5S.
La región del organizador nucleolar (genes NOR) constituye la región genómica nuclear
más extensamente estudiada en las plantas superiores, con cuyas secuencias se han
reconstruido las filogenias de la casi totalidad de los principales linajes de las
angiospermas. Este amplio uso de esta región genómica se debe a la facilidad de su
amplificación y secuenciación, así como a otra característica importante - la evolución
concertada de las secuencias repetitivas- que asegura la homología de los caracteres
comparados.
Los genes del NOR forman el nucleolo de la célula interfásica; un conjunto de tres genes
ribosomales (18S, 5.8S, y 25-28S) separados por regiones espaciadoras forman las unidades
26

epetitivas del tándem. Cada unidad de repetición tiene un tamaño aproximado de unos 10
kpb (kilopares de bases), y a su vez se puede diferenciar en dos regiones, la región que se
transcribe, que contiene los genes mencionados, y la región que no se transcribe, o región
espaciadora IGS (“Inter Generic Spacer”), espaciador inter-génico (entre una unidad
repetitiva y la siguiente). El tamaño del espaciador IGS suele oscilar entre 4-5 kpb.
La región génica es una unidad cistrónica, cuyos tres genes se transcriben a un único ARN
heterogéneo, que posteriormente se escinde en los tres tipos de ARN ribosomales. Toda
esta región génica experimenta el fenómeno de la evolución concertada; es decir, la
mutación en un nucleótido de una unidad de repetición se extiende al resto de las unidades
de repetición del tándem, en un tiempo evolutivo determinado, al cabo del cual todas
presentan la misma mutación en la misma posición de la secuencia. Esta concertación de
las mutaciones se produce por un fenómeno aún no completamente probado, cuya causa
probable sea la conversión génica. El fenómeno de la evolución concertada tiene
importantes implicaciones filogenéticas en el estudio comparado de secuencias, puesto que
asume que todas las unidades de repetición del tandem son iguales en un individuo, y
asume también que dichas secuencias son homólogas entre distintos individuo s y, por lo
tanto, comparables. Pese a la aceptación general de este principio, se dan circunstancias en
las cuales se presentan casos de paralogía (p.e. distintas familias NOR en un mismo
individuo, debido a la aparición de pseudogenes o a un origen híbrido del taxon).
El tamaño de la región cistrónica oscila entre 5-6 kpb, y en ella se localizan los genes
ribosomales y los espaciadores que los separan. El orden consecutivo de los genes (5’- 3’)
es el siguiente: el gen ribosomal 18S (ca. 2000 nucleótidos), el gen ribosomal 5.8 S (ca. 180
nucleótidos), y el gen ribosomal 25-28S (ca. 4200 nucleótidos). Entre la posición +1 del
inicio de la transcripción hasta el primer nucleótido del gen ribosomal 18S se encuentra la
región espaciadora externa ETS (“Externa l Transcriber Spacer”), y entre los genes
ribosomales 18S – 5.8S – 25-28S las regiones espaciadoras internas ITS (“Inter-Transcriber
Spacer”).
27

Las dos regiones ITS se distinguen, a su vez, como región ITS1, la que separa los genes
18S y 5.8S, y región ITS2, la que separa los genes 5.8S y 25-28S. Los genes ribosomales de
la región cistrónica son secuencias altamente conservadas, cuya tasa de mutación es muy
baja en las angiospermas, dada la elevada uniformidad de los ARN ribosomales que forman
los ribosomas de las plantas con flores. Estas secuencias escasamente variables resultan
únicamente informativas en los estudios de linajes lejanamente emparentados entre sí o en
grupos jerárquicos superiores. Por el contrario, las regiones espaciadoras (ETS e ITSs), no
sujetas a presión selectiva, experimentan una tasa de mutación más elevada, y resultan por
tanto informativas a niveles jerárquicos inferiores. Tanto las regiones génicas (18S, 5.8S,
25-28S) como las regiones espaciadoras (ETS, ITSs) del cistrón nucleolar están sujetas a
evolución concertada, mientras que la región no cistrónica o espaciador intergénico (IGS)
no lo está.
El tamaño de la región espaciadora ETS es de unos 400 nucleótidos, mientras que los
espaciadores ITS tienen aproximadamente 200 nucleótidos cada uno. Las regiones ITS han
sido ampliamente estudiadas debido a la facilidad en el diseño de cebadores universales en
las regiones flanqueantes conservadas del gen 18S (cebador directo) y del gen 25-28S
(cebador reverso) y a la amplificación única del fragmento ITS1-5.8S-ITS2, de tamaño
relativamente pequeño (600-700 pb), y su posterior secuenciación con los cebadores
externos, utilizados en la amplificación, o con cebadores externos e internos (‘nested
primers’). La región ETS, al no disponer de dos regiones flanqueantes conservadas, no
permite el diseño de cebadores universales en ambos extremos (únicamente se puede
diseñar un cebador universal reverso en el extremo anterior del gen 18S), lo que implica la
búsqueda de cebadores directos específicos para cada especie, así como dificultades
ulteriores en la secuenciación, al no existir tampoco cebadores internos universales. El
ingente número de secuencias ITS obtenidas hasta la fecha en las angiospermas está
depositado y puede ser consultado en los bancos generales de genes (p.e. GenBank) o de
secuencias y reconstrucciones evolutivas (TreeBase).
Un ejemplo de la utilidad de las secuencias génicas conservadas de los genes NOR, a
niveles jerárquicos elevados, es la reconstrucción de la filogenia de los principales linajes
de las angiospermas basado en la secuencia del gen ribosomal 18S (Soltis et al. 1997; Soltis
et al., 1998). Al examinar la secuencia del gen 18S en las angiospermas estudiadas se
comprobó la existencia de regiones más conservadas y regiones más variables, que están
relacionadas, a su vez, con la estructura secundaria de la molécula. Son las regiones
variables del gen 18S, que corresponden a zonas más inestables del plegamiento del ARN
ribosomal, las que proporcionan el mayor número de caracteres informativos para la
reconstrucción evolutiva de este grupo de plantas.
28

El árbol filogenético resultante del análisis de estas secuencias distingue, dentro de las
angiospermas, unos linajes parafiléticos basales de plantas con polen monocolpado y un
grupo monofilético más reciente de plantas con polen tricolpado o derivado
(eudicotiledóneas). Entre las angiospermas más primitivas se encuentran Amborella,
Nymphaeales y el grupo ITA (Illiciliales, Austrobaileya), denominadas también
paleohierbas. La monocotiledóneas son monofiléticas y se emplazan en un linaje
intermedio de las monocolpadas. Las angiospermas más recientemente evolucionadas
comprenden los clados de Rósidas/Dillénidas y Astéridas.
30

Con el gen de la subunidad menor ribosomal (18S) también se ha reconstruido la filogenia
de las plantas terrestres (Hederson et al., 1996). El árbol resultante muestra a los
antocerotales como el linaje de briófitos presumiblemente más antiguo, hermano al resto de
las plantas terrestres. Según esta hipótesis las hepáticas y los musgos habrían evolucionado
más tardíamente.
31

Este mismo gen ribosomal 18S ha servido como fuente de caracteres para reconstruir la
filogenia de las angiospermas parásitas, y para conocer su emplazamiento en el seno del
árbol general de las plantas con flores (Nickrent, 1998; Nickrent, 2001). Han sido
reconocidos al menos diez linajes distintos de plantas parásitas, que muestran su grado de
parentesco, más o menos sustentado, con diversos linajes de plantas no parásitas.
32

Las regiones espaciadores ITS han sido ampliamente utilizadas en las reconstrucciones
evolutivas a niveles jerárquicos inferiores, permitiendo discernir las relaciones de
parentesco intertribales, intergenéricas, e interespecíficas. Como ejemplo de los estudios
realizados a nivel de familia, los estudios ITS de las gramíneas (Hsiao et al., 1999)
establecieron un origen más primitivo de las Bambusoideas herbáceas, seguido de una
divergencia más reciente de los grupos hermanos Oryzoideae/Bambusoideae y del clado
formado por gramíneas templadas Pooideae y por gramíneas tropicales del grupo PACC
(Panicoideae, Arundinoideae, Chloridoideae, Centhotecoideae).
A nivel tribal y subtribal, los estudios ITS desarrollados en el género Festuca y otros
géneros afines (Torrecilla & Catalán, 2001) han puesto de manifiesto la parafilia de las
festucas, y el estrecho parentesco existente entre ciertas Festuca de hojas anchas (subgen.
Schedonorus) y el género Lolium, que aparecen emplazadas en el mismo clado
monofilético, y ciertas Festuca de hojas finas (Subgen. Festuca) y el género Vulpia, que
comparten igualmente el mismo ancestro común a todas ellas. Estos resultados evolutivos
corroboran los datos e hibridaciones espontáneas observadas entre representantes de los
respectivos grupos.
La región repetitiva de los genes del organizador nucleolar (NOR) puede aportar también
información a niveles jerárquicos menores (especie, subespecie, población), cuando se
examinan zonas altamente variables de esta región del nucleolo. Así los espaciadores
intergénicos IGS, que no están sometidos a evolución concertada, pueden acumular
mutaciones exclusivas que pueden transmitirse a los individuos de una población o especie,
diferenciándolos de los de otras. Esta región ha sido fuente de marcadores RFLP, que han
sido utilizados para caracterizar a especies diploides y tetraploides del género Holcus de las
gramíneas (Richard et al.) y para identificar a estos progenitores en el origen de una raza
pentaploide de Holcus mollis.
Otra de las regiones de ADN nuclear moderadamente repetitivo es la región de los genes
ribosomales 5S, genes que se hallan situados en una zona distinta del núcleo, fuera del
nucleolo. Los genes 5S forman también una serie de unidades de repetición dispuestas en
tándem (en miles de copias), y presentan un tamaño considerablemente inferior (ca. 500
pb). Cada unidad de repetición consta de una región codificadora del gen ribosomal 5S (de
aproximadamente 300 bp) y de una región espaciadora intergénica (de aproximadamente
ca. 200 pb).
33

La región espaciadora no está sometida a evolución concertada, al no ser transcrita a ARN;
razón por la cual no se puede asegurar la homología de los distintos espaciadores de cada
tándem, ni a nivel individual ni a nivel específico. La región génica 5S es fácilmente
amplificable, al haberse diseñado cebadores universales en sus regiones flanqueantes
conservadas (del mismo gen 5S) y tener un pequeño tamaño. Las secuencias del gen y del
espaciador 5S se han utilizado en algunas reconstrucciones evolutivas de angiospermas,
como en el caso de los géneros de la tribu Triticeae, de gramíneas (Kellogg & Manson).
Algunos resultados discordantes se han observado entre los árboles reconstruidos a partir de
familias de genes 5S de distinta longitud. Los árboles ITS y 5S inferidos para el mismo
grupo de tritíceas con estas moléculas muestran topologías distintas, pese al origen nuclear
de ambas fuentes de datos.
ADN nuclear altamente repetitivo
El ADN nuclear altamente repetitivo es ADN no génico, que no contiene por tanto ninguna
región codificadora que se transcriba a ARN. El ADN altamente repetitivo lo forman un
conjunto de familias satélites, constituídos cada uno de ellos por una serie de motivos de
repetición diferentes, que constan de un altísimo número de unidades de repetición
(múltiplos de 10 6 ). Estas familias satélites se hallan distintamente distribuídas a lo largo del
núcleo, pudiendo disponerse de forma alternante con regiones copia simple o baja copia, en
forma de tándem, o bien en disposición alterna entre ellas mismas.
34

El ADN altamente repetitivo, pese a no ser funcional ni codificador, llega a ser el ADN
predominante en el genoma nuclear de muchos eucariotas. En algunas angiospermas, cuyo
tamaño nuclear es elevado (p.e. Liliaceae) o en taxones poliploides (p.e. Triticum
aestivum), un alto porcentaje del ADN del núcleo (hasta el 80% o más) es ADN altamente
repetitivo. El ADN altamente repetitivo, pese a no cumplir ninguna función génica, y no
contener información codificada en su secuencia, cumple algunos papeles citológicos
importantes en las divisiones celulares. Este ADN repetitivo forma la heterocromatina
interfásica del núcleo que da lugar a las regiones teloméricas y centroméricas de los
cromosomas que aseguran el apareamiento de los cromosomas homólogos y la unión de los
cromosomas al huso mitótico.
El ADN altamente repetitivo es un ADN hipervariable, ya que al no ser codificador, y no
estar sometido por tanto a ningún tipo de presión selectiva, presenta las tasas de mutación
más elevadas de todos los tipos de ADN nuclear (10 -4 nts/sitio/año). Entre los tipos de ADN
altamente repetitivo se distinguen dos tipos de ADN satélite, si atendemos a la longitud de
la unidad de repetición, los minisatélites y los microsatélites.
35

Minisatélites
Los minisatélites son aquellas regiones repetitivas en las que la unidad de repetición tiene
un tamaño que oscila entre los 7 y los 16 nucleótidos. El origen de los minisatélites se
relaciona con mutaciones por sustitución de nucleótidos, acompañadas de replicaciones
saltatorias de estas unidades, debidas a fenómenos de sobrecruzamiento desigual de
cromátidas homólogas. Los minisatélites se han utilizado para determinar la huella
genómica o ‘fingerprinting’ de individuos, tanto en la especie humana y otros animales
como en las plantas. Estas regiones minisatélites sujetas a una elevada tasa de sustitución
nucleotídica proporcionan marcadores individuales que constituyen la identidad genética de
cada individuo o clon. Los minisatélites han sido utilizados igualmente en la identificación
de progenitores desconocidos, ya que se heredan de forma mendeliana, y en los estudios de
caracterización de híbridos.
Microsatélites
Los microsatélites son las regiones repetitivas en las que la unidad de repetición está
formada por muy pocos nucleótidos (de 2 a 4). En una región microsatélite determinada el
motivo de repetición (p.e. GAC) puede hallarse flanqueado por regiones de ADN copia
simple conservadas, constituyendo así una región microsatélite de locus único, o puede
hallarse disperso en el genoma entre otras regiones repetitivas, formando entonces una
región microsatélite de múltiples loci. El origen de los microsatélites se atribuye a los fallos
por deslizamiento de la ADN polimerasa durante la replicación del ADN, que crea bucles
con motivos replicados en una hebra o en la otra. Las tasas de error de la ADN polimerasa
que quedan sin corregir son lo suficientemente elevadas como para dar lugar a la aparición
de nuevas “mutaciones” en número de copias de repetición a nivel individual. Debido al
valor identificativo, a nivel individual, de estos marcadores del genoma nuclear, a constituir
alelos codominantes, y a ser heredados de forma mendeliana, los microsatélites estan
siendo ampliamente utilizados en estudios de genética poblacional de especies vegetales.
36

Valor informativo de distintas regiones genómicas en estudios
filogenéticos de angiospermas
Cuando se emprende un estudio evolutivo de un determinado grupo de plantas es
recomendable que las filogenias que vayan a reconstruirse se basen, en lo posible, en
distintas moléculas, preferiblemente en moléculas procedentes de genomas distintos. Con el
fin de evitar los errores que puedan derivarse de las “filogenias génicas” vs. “filogenias
organísticas”, cuando se presentan situaciones de coalescencia, se seleccionan moléculas
independientes, cuyo análisis permita confrontar las historias evolutivas del mismo grupo
de taxones reconstruidas con cada una de ellas. Si la s moléculas seleccionadas reconstruyen
fidedignamente la filogenia del grupo en estudio, todas ellas producirán el mismo árbol
filogenético y por tanto las topologías serán iguales o muy similares. Si los representantes
del grupo en estudio son el resultado de linajes que experimentaron en el pasado distintos
fenómenos biológicos (p.e. reticulación, poliploidía), las filogenias resultantes de distintas
moléculas genómicas no tienen por qué ser iguales, aunque las reconstrucciones sean
correctas; en estos casos la interpretación de tales reconstrucciones puede permitir discernir
los eventos que tuvieron lugar durante el pasado.
Un estudio comparativo del valor informativo aportado por las secuencias de ADN de
distintas regiones genómicas en el género Gossyp ium (Malvaceae) (Randall et al., 1998),
sirve para conocer, a modo orientativo, las diferentes tasas de evolución de esas moléculas.
Así, mientras el porcentaje de mutaciones es muy bajo en algunas regiones génicas e
intrónicas del genoma cloroplástico: ndhA, rpoC, las tasas son más altas en ciertas regiones
espaciadoras de este genoma (trnL-F), aumentando ligeramente en el caso de los
espaciadores nucleares ITS de los genes ribosomales, y alcanzando los mayores niveles de
variabilidad detectados en los intrones de genes nucleares (adhC-D). Estos resultados, pese
a circunscribirse a los taxones de Gossypium, pueden ser extrapolados a otras
angiospermas.
37

La contrastación de las reconstrucciones filogenéticas obtenidas con distintas moléculas
puede conducir a resultados parejos o dispares. En general, los árboles generados a partir de
datos de secuencias del genoma cloroplástico suelen ser congruentes, ya que este genoma
es haploide y se comporta como una unidad de ligamiento; como es el caso de las filogenias
de angiospermas obtenidas con los genes rbcL y atpB. Sin embargo, se observan mayores
confrontaciones cuando se contrastan los árboles obtenidos a partir de secuencias
cloroplásticas ( rbcL) y de secuencias nucleares (18S) para estas mismas plantas; pese a ello,
las bases de datos de una y otra molécula recuperan una misma historia evolutiva para un
amplio número de grupos, por lo que posiblemente puedan ser combinables y utilizadas en
la búsqueda de la filogenia común.
Biogeografía y conservación
El valor informativo de las distintas moléculas en estudio, para un determinado grupo de
taxones, tiene también aplicaciones en los trabajos biogeográficos y de conservación de
especies endémicas o amenazadas. A modo de ejemplo, en la Comunidad Autó noma de
Aragón (España) se ha desarrollado un proyecto de estudio y conservación del género
endémico Petrocoptis (Caryophyllaceae, Sileneae), distribuido en los Pirineos y en la
Cordillera Cantábrica. Se han reconstruido las relaciones de parentesco evolutivo entre los
doce taxones específicos y subespecíficos reconocidos para el género utilizando secuencias
cloroplásticas de las regiones espaciadora e intrónica trnL-F y secuencias nucleares de
regiones intrónicas del gen tpi, y se ha obtenido un árbol congruente con ambas bases de
datos a partir del análisis combinado de los datos. En dicho árbol se observa la presencia de
dos clados divergentes que corresponden, biogeográficamente, al grupo de las especies
38

orientales de la península ibérica y Pirineos y al grupo de las especies occidentales
peninsulares. Estos resultados indican una temprana separación de los linajes ancestrales de
ambos grupos de taxones. En una situación intermedia entre ambos clados, aunque más
próxima al grupo de los taxones orientales, se halla un taxon endémico de área muy
restringida y objeto de un plan de conservación en Aragón (Petrocoptis pseudoviscosa ),
cuyo emplazamiento topológico pudiera apoyar la hipótesis, basada en caracteres
morfológicos, de su supuesto origen híbrido.
39

TÉCNICAS MOLECULARES
En este Capítulo se van a revisar los principios básicos y las aplicaciones taxonómicas de
las principales técnicas moleculares desarrolladas en los estudios de plantas superiores.
Las técnicas que van a ser tratadas son las siguientes:
1- Estudios de proteínas:
• Isoenzimas
2- Estudios de ADN:
• Preparación de muestras y extracción de ADN
• Restricciones enzimáticas e hibridación de ADN: RFLP
• Amplificación de ADN : PCR – RAPD
• Secuenciación de ADN
• Microsatélites
ISOENZIMAS
Las isoenzimas son las distintas variantes alélicas de una misma enzima que pueden ser
detectadas mediante electroforesis en geles no desnaturalizantes. Las isoenzimas
constituyen marcadores moleculares alélicos codominantes, resultado de la expresión de los
genes nucleares, por lo que son empleadas en estudios genético-poblacionales de vegetales
y en estudios de caracterización taxonómica de plantas próximamente emparentadas entre
sí.
Las enzimas son proteínas que participan en las reacciones metabólicas celulares como
catalizadores biológicos. La función de estos catalizadores consiste en transformar una
molécula -sustrato inicial- en otra molécula -producto final-, recuperándose intacta la
enzima. Las principales vías metabólicas de la célula consisten en una serie de reacciones
enzimáticas concatenadas, en las que el producto resultante de una reacción, actúa como
sustrato de la siguiente, hasta generar un último producto en esa cadena. Cada una de las
reacciones que tiene lugar en una vía enzimática concreta está catalizada por una enzima
distinta, si bien una misma actividad catalítica puede presentarse en vías diferentes.
En las células vegetales los principales procesos metabólicos tienen lugar en los
compartimentos citosólico y organulares, y en las membranas de esas células. Las vías
metabólicas que transcurren en los compartimentos celulares están catalizadas por enzimas
solubles, que son las más fácilmente extraíbles de las células, y por ello han sido las más
extensamente estudiadas con fines taxonómicos. El citoplasma es el compartimento mayor
40

de la célula, y el lugar donde tienen lugar un mayor número de rutas metabólicas
catalizadas por enzimas solubles, aunque éstas también se producen en el interior de
orgánulos tales como los cloroplastos, las mitocondrias, y los peroxisomas (o glioxisomas).
Las isoenzimas o aloenzimas constituyen variantes alélicas de una misma enzima, ya que
catalizan la misma reacción metabólica. Las isoenzimas poseen idéntico centro de reacción,
lo que les permite transformar a un mismo sustrato en un mismo producto resultante,
difiriendo, sin embargo, en la composición de alguno de sus aminoácidos, lo que provoca
que tengan una distinta carga eléctrica o peso molecular y, por ello, una diferente migración
electroforética.
Las isoenzimas constituyen marcadores codominantes, puesto que distintos alelos pueden
expresarse por igual en condiciones de heterozigosis. Los genes isozímicos de una
particular enzima pueden encontrarse en un solo locus o en dos o más loci. Puesto que la
mayoría de los sistemas enzimáticos estudiados son universales, sus genes suelen hallarse
en dos o más loci, y esos genes codifican a isozimas que actúan en distintos
compartimentos celulares (p.e. enzima citosólica y enzima cloroplástica). A la hora de
estudiar los genotipos, se codifican separadamente los alelos de cada gen.
El estudio isoenzimático de las plantas requiere, básicamente, los siguientes pasos:
- Extracción de las proteínas
- Electroforesis
- Revelado de los patrones isozímicos (zimogramas)
- Interpretación de los zimogramas y codificación de los genotipos
- Análisis taxonómicos o genético-poblacionales
Los sistemas de revelado o de detección isoenzimática requieren que las enzimas estén
biológicamente activas, por ello todos los pasos que deben darse durante los procesos de
extracción de isoenzimas y de separación mediante electroforesis han de hacerse en unas
condiciones adecuadas de frío que eviten la desnaturalización de las enzimas.
Los protocolos utilizados en cada uno de los pasos de extracción, electroforesis, y detección
enzimática se adjuntan en el Anexo I.
Extracción de proteínas
El material de partida debe ser material fresco, colectado en el mismo estadío de desarrollo
de la planta en todas las muestras. Preferentemente se seleccionan hojas jóvenes de plantas
crecidas en jardín o invernadero o de plantas del campo; en éste último caso las muestras
deben transportarse refrigeradas hasta el laboratorio, y la extracción debe hacerse lo más
rápidamente posible, para evitar la degradación de las enzimas.
Para la extracción de las proteínas se utiliza un tampón de extracción, que contiene sales y
agentes reductores (Wendel & Weeden, 1989). La extracción se lleva a cabo a bajas
temperaturas, triturando las muestras en presencia del tampón, en un mortero previamente
refrigerado y en frio (hielo o nitrógeno líquido), con el fin de evitar la desnaturalización que
podrían sufrir las proteínas al aumentar la temperatura por la fricción creada durante la
41

trituración. Cuando el número de muestras a extraer es elevado se utilizan placas de
trituración con numerosos pocillos y un mango acoplado a taladro. Al romperse las células
y los orgánulos celulares en el proceso del triturado, las enzimas solubles pasan a la
solución del tampón.
Electroforesis
La separación de las isoenzimas se realiza mediante electroforesis en gel. Aunque existen
distintos tipos de soporte de gel (almidón, poliacrilamida, acetato), el gel de almidón es uno
de los más ampliamente utilizados por su facilidad de manejo, eficaz poder de resolución, y
bajo coste. La confección de los geles de almidón se explica en el protocolo del Anexo I.
La electroforesis transcurre en un medio tamponado, cuya composición puede variar
dependiendo de los sistemas enzimáticos que se vayan a resolver con posterioridad
(Wendel & Weeden, 1989; Anexo I); en general los tres tipos de tampones más
comúnmente utilizados en las electroforesis de isoenzimas vegetales son Borato de Litio,
Tris-Borato, y Citrato de morfolina. Las muestras se aplican en un extremo superior del gel,
y consisten en pequeños fragmentos de papel Watmann que previamente han sido
humedecidos en la solución de extracción de cada muestra.
El desarrollo electroforético debe transcurrir igualmente en condiciones de frío, para evitar
que el calentamiento de la conducción eléctrica pudiese desnaturalizar a las isoenzimas. Un
sistema de refrigeración mantiene a 4C los geles durante la electroforesis. Una vez
completada ésta (3-4 horas) los geles se sacan de las cubetas y se cortan en capas finas,
cada una de las cuales servirá para el revelado de un tipo de enzima.
Revelado
Los sistemas de revelado enzimático consisten en reacciones redox acopladas que permiten
visualizar la posición de migración de las isoenzimas por la precipitación sobre el gel de un
compuesto coloreado, el formazán. Los tampones de revelado son específicos para cada
enzima ya que deben contener el sustrato específico que modifica la enzima, el coenzima
redox que necesita la enzima, y los compuestos PMS (metasulfato de fenazida) y MTT
(Tetrazolium). La tinción se produce por la concatenación de las siguientes reacciones de
óxido reducción:
42

Al exponerse todo el gel al tampón de tincción, durante un tiempo breve (máximo 1 h), la
precipitación tendrá lugar en aquellos lugares a los que hayan emigrado las formas alélicas
de esa particular enzima, dando un patrón de bandas particular. Al patrón de bandas
resultante del revelado de cada isozima se le denomina zimograma.
Interpretación de zimogramas
La interpretación de los patrones isozímicos requiere una observación detallada del
zimograma, para saber el número de locus/loci expresados, y un conocimiento previo de la
estructura cuaternaria de la enzima, para poder codificar los genotipos individ uales. El
número de locus/loci involucrados en el patrón de bandas observado puede deducirse, en
general, a partir de las distancias que separan tales bandas. Si las bandas están muy
próximas entre sí, corresponden a diferentes formas alélicas del mismo locus, si están más
distanciadas, corresponden a formas alélicas de distintos loci. Para cada uno de esos loci se
deben codificar sus genotipos independientemente. La estructura cuaternaria de las enzimas
puede ser monomérica, cuando presenta una sóla cadena proteínica, dimérica, cuando
presenta dos, tetramérica, cuando presenta cuatro, y hexamérica, cuando presenta seis. En
plantas son conocidas las estructuras cuaternarias que poseen las enzimas más comúnmente
estudiadas (Weeden & Wendel, 1989).
La estructura cuaternaria de la enzima va a determinar el patrón de bandas isozímicas que
presenten los individuos heterocigotos. Suponiendo que se trata de individuos diploides, las
bandas obtenidas para las formas alélicas de un gen (p.e. A y B) mostrarán una distinta
migración, y se resolverán como una única banda en los individuos homocigotos (banda 1 =
AA) (banda 2 = BB), independientemente de la estructura cuaternaria que tenga la enzima.
43

Sin embargo, los individuos heterocigotos para esas dos formas alélicas (AB), darán
distintos patrones de bandas según sea la estructura cuaternaria de la enzima (2 bandas si es
monomérica, 3 bandas si es dimérica, 5 bandas si es tetramérica).
El número de bandas detectadas en los heterocigotos está relacionado con las distintas
combinaciones de cadenas proteínicas que puedan darse para formar la estructura
cuaternaria de la enzima. Por ejemplo, si se trata de una enzima dimérica, cada alelo génico
(A, B) codifica a una cadena proteínica (a, b). Una vez sintetizadas, las cadenas a y b
pueden unirse entre ellas de todas las formas posibles (aa, ab, bb), puesto que a y b migran
a distintas alturas en el gel, las bandas aa y bb quedarán separadas entre sí, y las bandas
mixtas ab (heterodímeros) se situarán en posición inter media entre ambas, de ahí el patrón
de tres bandas detectado en estos casos. Puesto que se sintetizan, aproximadamente, el
mismo número de copias de cadenas a y de cadenas b, al combinarse en las tres formas
posibles, habrá un doble número de combinaciones heterodímeras ab (1/2), frente a 1/4 de
combinaciones homodímeras aa y bb. Por ello la intensidad de la banda intermedia
heteromórfica es el doble que la de las bandas homomórficas.
44

Una vez obtenidos los zimogramas, y conociendo las estructuras cuaternarias de las
enzimas, se procede a la codificación los genotipos de las muestras. En las figuras
siguientes se muestran ejemplos de codificaciones de genotipos para distintos zimogramas.
45

Los resultados de los análisis isoenzimáticos pueden servir tanto con fines taxonómicos
como genéticos. Uno de esos fines es la detección de marcadores isozímicos específicos
que sirvan para la caracterización genética de taxones; las isoenzimas han demostrado ser
resolutivas en la caracterización de taxones específicos e infraespecíficos. Igualmente se
han utilizado para la identificación genética de taxones híbridos, cuyos progenitores
presentan distintos marcadores alélicos.
El uso más extendido que han tenido las isoenzimas es su aplicación a los estudios de
genética poblacional. Pese a ser un método relativamente antiguo, los estudios
isoenzimáticos siguen vigentes hoy en día debido a la rapidez y sencillez de la técnica, y a
su alto poder resolutivo. Los estudios genético poblacionales conducidos con isoenzimas
muestrean un elevado número de individuos por población, en una serie de poblaciones de
la misma especie o de especies próximamente emparentadas entre sí. Los estudios
isoenzimáticos comparativos sólo pueden darse entre taxones evolutivamente cercanos y,
preferiblemente, diploides. A partir de las frecuencias alélicas detectadas en las poblaciones
se pueden calcular los parámetros genéticos poblacionales, entre ellos la variabilidad
genética intrapoblacional e interpoblacional, basadas en las frecuencias alélicas y en los
índices de heterozigosidad, y las distancias genéticas que separan a estas poblaciones.
Ejemplos de estudios genético poblacionales y taxonómicos desarrollados con isoenzimas
son los de los géneros Linaria y Antirrhinum (Scrophulariaceae) en la región levantina
española (Mateu & Segarra, 2000), y los del género endémico Borderea (Dioscoreaceae) en
el Pirineo central (Segarra & Catalán, 2001). Mientras las especies mediterráneas de
Linaria muestran unas altas tasas de variabilidad genética isozímica, que permiten construir
fenogramas y calcular los tiempos de divergencia entre ellas, las especies paleoendémicas
de Borderea muestran una escasísima tasa de variabilidad, que pueden ser indicativos de
cuellos de botella genéticos sufridos por las poblaciones durante los periodos glaciales.
47

ESTUDIO DEL GENOMA (ADN)
Las técnicas moleculares de estudio del genoma en plantas que más se han desarrollado han
sido las restricciones enzimáticas del ADN y su posterior hibridación con sondas (RFLP),
las amplificaciones de ADN (PCR – RAPD), y la secuenciación de nucleótidos de regiones
genómicas. Otras técnicas resultantes de la combinación de las anteriores (AFLP,
microsatélites) han tenido un auge más reciente.
Un resumen de las características principales de las tres primeras técnicas se expone en el
cuadro siguiente:
48

EXTRACCIÓN DE ADN
La colección de material vegetal que va a ser utilizado para la extracción del ADN es más
sencilla que en el caso del utilizado para la extracción de isoenzimas ya que no debe
mantenerse en frío hasta la extracción de la molécula. El material colectado deberá ser,
preferiblemente, fresco; las hojas jóvenes proporcionan una buena fuente de ADN. Si el
material no va a utilizarse inmediatamente para el aislamiento del ADN, puede almacenerse
por tiempo indefinido, previa desecación de los tejidos. Esto se consigue mediante la
liofilización o mediante el secado con gel de sílice. El ADN puede extraerse también a
partir de material de herbario, siempre que éste no provenga de colecciones antiguas y se
halle bien preservado. El material de herbario que fue únicamente prensado y secado, sin
recibir ningún otro tipo de tratamiento, puede ser utilizado para el aislamiento de ADN de
buena calidad; sin embargo, algunos tratamientos empleados durante la preparación de los
ejemplares de herbario pueden precipitar y degradar el ADN, como en el caso de empleo de
alcoholes u otros compuestos fijadores, o de venenos (p.e. las sales de mercurio).
Actualmente existen lotes de reactivos especiales para la extracción de ADN de ejemplares
de herbario. Los métodos de colecta del material y su preservación para la posterior
extracción del ADN vienen explicados en el Anexo II.
El aislamiento del ADN se consigue mediante una serie de procesos de extracción de la
molécula de las células, utilizando soluciones tampón ricas en sales, y de precipitación, con
alcoholes. El protocolo seguido para la extracción de ADN en minipreparaciones de
muestras se adjunta en el Anexo II; este protocolo sirve para la extracción del ADN total, es
decir el ADN de los genomas nuclear, cloroplástico y mitocondrial. Si se quiere conseguir
una extracción diferencial de los distintos genomas vegetales, las células han de ser
sometidas a diferentes procesos de centrifugación diferencial para separar los orgánulos y
proceder con posterioridad al aislamiento y precipitación del ADN de cada uno de esos
orgánulos. La mayoría de las técnicas de análisis de los genomas que van a ser utilizadas
después no necesitan un aislamiento separado de los distintos ADN genómicos y pueden
utilizar el ADN total. Por su menor complicación, casi todos los protocolos de extracción
de ADN son para ADN total.
Previamente a la extracción del ADN, el material seco o liofilizado puede molerse en
nitrógeno líquido hasta conseguir un polvo muy fino, o bien puede utilizarse directamente
el material fresco para el aislamiento del ácido nucleico. La molienda o la trituración de las
muestras en mortero provoca la rotura de las células y de los compartimentos subcelulares,
permitiendo la extracción de los ADN de los distintos genomas. El tampón de extracción
del ADN contiene sales de amonio (CTAB) y sodio que al poseer cationes positivos forman
enlaces por atracción eléctrica con los aniones negativos de los radicales fosfato del ADN,
conduciendo así a la extracción de esta molécula. Al extraer el ADN se extraen también
otros metabolitos celulares, por ello los pasos siguientes del protocolo tratan de purificar el
extracto inicial eliminando compuestos apolares lipídicos (con cloroformo y alcohol
isoamílico) y proteínas (con formol).
La precipitación de los ácidos nucleicos se consigue con alcoholes (isopropanol, etanol);
concretamente el isopropanol produce una gran eficiencia en el precipitado. Este
49

precipitado se lava con una solución de etanol y sales amónicas y se diluye en agua
ultrapurificada o en una solución tampón muy diluída. Los métodos de extracción de ADN
(micropreparaciones) vienen explicados en el Anexo III.
La solución diluída final contiene tanto ADN como ARNs, ya que el protocolo sirve para
precipitar los dos tipos de ácidos nucleicos. Los ARNs no suelen interferir en la mayoría de
las manipulaciones y análisis a los que se somete al ADN, por lo que no es necesario
eliminarlos; sin embargo sí que suelen distorsionar las cuantificaciones de las
concentraciones de ADN total, si se hacen por espectrofotometría. Si se quiere obtener una
solución purificada de ADN, sin ARNs, el extracto inicial se trata con ARNasa, enzima que
degrada los ARN, obteniéndose así una solución que contiene únicamente ADN. La
concentración del ADN total aislado en cada muestra se calcula por espectrofotometría o
por fluorometría. La calidad de ese ADN total se comprueba en un gel de agarosa; si el
ADN es de buena calidad se observa una banda de alto peso molecular, no degradada, en la
parte superior de la calle del gel, si el ADN está degradado se observa una mancha de fondo
a lo largo de la calle.
RFLP
La técnica de los Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP en
siglas inglesas, “Restriction Fragment Length Polymorphisms”) fue una de las técnicas
pioneras de análisis de los genomas. Los RFLP se basan en la restricción, o corte del ADN
de los genomas, mediante unas enzimas específicas, llamadas enzimas de restricción, y la
posterior hibridación de algunos de los fragmentos resultantes con determinadas sondas
complementarias (fragmentos de ADN monocatenarios).
Con la técnica de RFLP pueden examinarse polimorfismos genómicos de cualquier tipo de
genoma vegetal (nuclear, cloroplástico o mitocondrial). Esos polimorfismos son alelos
codominantes, que pueden corresponder a distintos tipos de ADN (copia simple o baja
copia, moderadamente repetitivo, o altamente repetitivo).
Los RFLP se han utilizado como marcadores genómicos del genoma nuclear, del genoma
cloroplástico, y del genoma mitocondrial, y en estudios filogenéticos, utilizando como
caracteres las mutaciones en los sitios de restricción y basándose en el empleo de distintas
combinaciones de sondas y enzimas. Los RFLP nucleares se heredan de forma mendeliana,
y han sido empleados en estudios genético-poblacionales, en selección de progenies y en
detección de híbridos; también han servido para el mapeo genómico de caracteres de interés
en la mejora genética de vegetales cultivados.
El primer paso del estudio consiste en el corte del ADN de las muestras mediante enzimas
de restricción. Las enzimas de restricción son enzimas endonucleasas, que cortan el ADN
bicatenario internamente, en unos lugares específicos (para cada enzima) denominados
sitios de restricción. Los sitios de restricción son secuencias cortas de nucleótidos (de 4, 5,
ó 6 pares de bases) palindrómicas, reconocidos por las enzimas a lo largo del genoma, y en
donde producen el corte. La restricción puede producir extremos cohesivos, si los extremos
50

de las dos hebras del ADN tienen distintos nucleótidos, o romos, si tienen el mismo número
y están apareados.
Todas las enzimas de restricción proceden de organismos procariotas y reciben su nombre
de la bacteria de la que fueron aisladas (p.e., Bam HI, procede de Bacillus
amyloliquefaciens, cepa H, descubierta en primer lugar (I), su sitio de restricción es
G/GATCC; Eco RI procede de Escherichia coli, cepa RY, descubierta en primer lugar (I),
su sitio de restricción es A/GATCT; Hind III procede de Haemophilus influenzae cepa Rd
descubierta en tercer lugar (III), su sitio de restricción es A/AGCTT; etc.). Las enzimas se
clasifican por su frecuencia de corte, relacionada con la longitud del sitio de restricción; así
hay enzimas con lugares de restricción mayores (6 pb) que cortan menos frecuentemente,
enzimas con lugares de restricción intermedios (5 pb) que cortan con relativa frecuencia, y
enzimas con lugares de restricción menores (4 pb) que cortan con mucha frecuencia.
Para la restricción enzimática se prepara una solución que contine el ADN de la muestra y
la enzima en un medio tamponado adecuado a 37C durante 2-8 horas. Una vez finalizada la
restricción, los fragmentos obtenidos del corte enzimático del ADN de la muestra se
separan por electroforesis en gel de agarosa. Si el genoma es de pequeño tamaño y la
enzima dispone de escasos lugares de restricción, se obtendrán pocos fragmentos, que
podrán visualizarse fácilmente. Sin embargo, si se está sometiendo al ADN total a la acción
enzimática, se obtendrán numerosos fragmentos de distintos tamaños como resultado de ese
corte que no podrán visualizarse fácilmente al teñir el gel.
51

La transferencia de los fragmentos de restricción separados en el gel a la membrana tiene
lugar mediante la técnica de Southern blot. Previamente a ello, el gel debe desnaturalizarse
con una solución salina para producir hebras monocatenarias. La transferencia de esas
hebras a la membrana se produce rápidamente en condiciones de vacío. Una vez
transferidas a la membrana, los fragmentos monocatenarios se fijan a ella mediante una
radiación breve con luz UV (‘cross-linking’). De esta manera las membranas que contienen
los fragmentos fijados puede n guardarse hasta ser utilizadas en la hibridación con las
sondas (y pueden ser reutilizadas para hibridaciones con más de una sonda).
Las sondas utilizadas en los RFLPs consisten en distintos fragmentos monocatenarios de un
genoma, cuya naturaleza suele ser conocida, que son marcados con un reactivo
(radioisótopo, o producto quimioluminiscente) y utilizados en la detección de sus
fragmentos complementarios resultantes de la digestión enzimática del ADN de las
muestras. Las sondas se preparan a partir de fragmentos de restricción clonados de un
genoma particular, que son guardados en librerías genómicas. Así existen sondas para el
genoma cloroplástico, para el genoma mitocondrial, y para ciertas regiones del genoma
nuclear. Los genomas de menor tamaño disponen de sondas solapadas que cubren toda su
extensión, por ejemplo en el genoma cloroplástico, y que, al tratarse de un genoma
conservado, resultan universales para grandes grupos de plantas. Con ellas se puede lograr
el mapado de los lugares de restricción de diversas enzimas en todo el cromosoma
cloroplástico de los taxones en estudio. El genoma nuclear, mucho más voluminoso y
variable, puede disponer de distintos tipos de sondas; algunas de ellas son de naturaleza
desconocida y no tienen un carácter universal, sino que son específicas para un determinado
grupo de plantas.
52

Las sondas se utilizan en las hibridaciones con fragmentos complementarios de ADN
(apareamiento de regiones complementarias monocatenarias), para ello tanto la sonda como
los fragmentos potencialmente apareantes deben hallarse en forma monocatenaria. Antes de
la hibridación, los fragmentos digeridos de las muestras deben de transferirse a una
membrana en forma monocatenaria (Southern Blot); una vez fijados en la membrana son
puestos en contacto con una solución que contiene la sonda monocatenaria dándose
entonces la hibridación ADN-ADN de la sonda con sus fragmentos complementarios.
La hibridación de las membranas con una sonda específica tiene lugar en unas condiciones
especiales de temperatura (65C) y de concentración de sales (1xSSPE), durante un tiempo
determinado (ca. 12 h), en un horno de hibridación. Se baña la membrana con la solución
que contine la sonda monocatenaria marcada y, una vez trancurrido el proceso, se lava la
membrana, eliminando el exceso de sonda, y se procede al revelado de los fragmentos
hibridados por autorradiografía, quimioluminiscencia, o fluorescencia. El resultado del
revelado muestra un patrón de bandas de hibridación en las muestras que son los RFLPs.
53

La cartografía de los sitios de restricción de determinados genomas o regiones genómicas
se consigue mediante las dobles restricciones enzimáticas.
Las restricciones sencillas indican el número de fragmentos distintos que produce cada
enzima individualmente mientras que las dobles restricciones permiten localizar sobre el
mapa de dicho genoma las posiciones relativas de los sitios de restricción de una enzima
respecto a los de otra. El conjunto de las dobles combinaciones posibles de varias enzimas
conduce a la obtención de mapa completo de sus sitios de restricción.
54

Los fragmentos de restricción son alelos codominantes, ya que la ausencia de un sitio de
restricción en un determinado genoma con respecto a la presencia de ese sitio en otro causa
la aparición de un fragmento mayor en el primer caso, equivalente a la suma en tamaño de
los dos fragmentos que se obtienen como consecuencia de esa restricción en el segundo. En
un individuo que poseyeran ambas dotaciones genómicas (heterocigoto) se observaría un
patrón mixto de ambos tipos de fragmentos.
La desaparición de un sitio de restricción suele ser un evento más común que la aparición
de un nuevo sitio, ya que para que se de el primer caso sólo se requiere una mutación de
cualquiera de los nucleótidos que forman el sitio de restricción de esa enzima, mientras que
para que tuviera lugar el segundo serían necesarias, en general, varias mutaciones
coincidentes, hecho bastante más improbable.
Los polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción constituyen por tanto alelos
codominantes que pueden ser empleados en la caracterización taxonómica de plantas, en la
detección de especies híbridas, y en estudios genético poblacionales. Han sido también
utilizados en programas de mejora genética de plantas cultivadas, para favorecer la
selección de cultivares en la progenie, para la detección de resistencias a agentes patógenos,
y para el mapado de caracteres cuantitativos.
Los RFLP han servido también como fuente de caracteres para los estudios filogenéticos.
En los estudios basados en parsimonia se codifican como caracteres binarios las presencias
o ausencias de los sitios de restricción, en los basados en distancias genéticas se utilizaron
algoritmos que estimaban la probabilidad de que se dieran mutaciones en alguno de los
nucleótidos de los sitios de restricción; éstos últimos análisis no tienen vigencia
55

actualmente al haber sido ampliamente superados por otros más exactos basados en análisis
completos de secuencias genómicas.
Entre los primeros estudios filogenéticos moleculares desarrollados con distintos grupos
organismos se encuentran los basados en caracteres RFLP. Algunos de estos estudios se
utilizaron en programas de conservación de especies o de taxones endémicos y
amenazados. La utilidad que los análisis filogenéticos pueden llegar a tener en programas
de conservación de especies se ejemplariza bastante bien en el caso del gorrión oscuro de la
costa Este Norteamericana (Ammodramus maritimus subsp. nigrescens) (Li & Graur,
1991), que demuestra que un conocimiento previo de la filogenia de los taxones puede
llegar a ser crucial a la hora de planificar los programas de recuperación de taxones en
peligro de extinción.
Los análisis RFLP presentan como ventaja la capacidad de explorar distintas regiones
genómicas, incrementándose esta exploración cuanto mayor sea el número de
combinaciones de sondas/enzimas ensayadas; estos análisis proporcionan, por lo general,
caracteres totalmente independientes, que son óptimos para los análisis filogenéticos. Sin
embargo, presentan como desventajas sus mayores costos en trabajo y reactivos, razones
por las cuales han sido sustituídos por otro tipo de marcadores moleculares,
fundamentalmente los basados en las amplificaciones y las secuenciaciones del ADN.
PCR
La amplificación del ADN se basa en la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa
o PCR (en su abreviación inglesa). Esta reacción de la ADN polimerasa consigue crear del
orden de millones de copias de una determinada region genó mica, que es la región
amplificada.
Los principios en los que se fundamenta la técnica PCR son la estructura secundaria del
ADN y el proceso de polimerización conducido por la actividad replicatoria de la enzima
ADN polimerasa (Mullis, 1990). Las dos cadenas complementarias y antiparalelas de la
doble hélice del ADN se aparean mediante enlaces por puentes de hidrógeno establecidos
entre los pares de bases nitrogenadas A/T y G/C. Estos enlaces del ADN pueden destruirse
al elevar la temperatura a 92-94C, produciendo hebras separadas o monocatenarias. La
ADN polimerasa es la enzima responsable de la replicación de esta molécula, y es capaz de
sintetizar nuevas hebras complementarias a las existentes, que actúan como moldes, a partir
de unos fragmentos denominados cebadores. La síntesis de las nuevas hebras
complementarias, apareadas con sus respectivas hebras moldes, origina dos copias idénticas
de la molécula de ADN inicial, que experimenta así su primera amplificación. Si el proceso
se repite en sucesivos ciclos repetitivos se logra finalmente una amplificación exponencial,
tras la que se logran millones de copias de la molécula de ADN original.
56

La técnica de PCR convencional es una amplificación dirigida de una particular región
genómica del genoma nuc lear o de los genomas organulares. Como resultado de esa
amplificación se obtiene un solo fragmento amplificado, del cual se han producido millones
de copias. Para conducir esa amplificación dirigida se necesita disponer de un par de
cebadores, directo y reverso, complementarios a las regiones flanqueantes de la región
genómica que se quiera amplificar. Los cebadores son cortos segmentos monocatenarios
(de 16 a 25 nucleótidos), uno de los cuales se aparea con una de las hebras del ADN, en una
región flanqueante, y el otro se aparea con la hebra opuesta, en la otra región flanqueante;
los cebadores deben ser complementarios y antiparalelos a las hebras con las cuales se
57

aparean, y se mantienen fuertemente unidos a su hebra complementaria por su extremo 3’, a
partir de cual se producirá la reacción de polimerización o elongación. Las reacciones de
polimerización en el ADN siempre se producen en dirección 5’-3’.
El desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa consiste en una serie de ciclos
repetitivos (de 30 a 40) en los que se dan tres pasos: la desnaturalización de las dos hebras
del ADN (a una temperatura elevada, entre 92-95C), el apareamiento de los cebadores con
sus respectivas hebras complementarias (a una temperatura menor, que depende de la
longitud y naturaleza de los cebadores, y que suele oscilar entre 50-60C), y la elongación o
síntesis de las nuevas cadenas complementarias (a la temperatura óptima de actividad de la
ADN polimerasa, que suele ser 72C). En el primer ciclo, y durante el primer paso de
desnaturalización, las dos hebras complementarias de ADN se separan al elevar la
temperatura, en el segundo paso los cebadores se aparean con sus regiones
complementarias de cada hebra al disminuir la temperatura, en el tercer paso la ADN
polimerasa produce la elongación o síntesis de las nuevas cadenas complementarias al
elevar de nuevo la temperatura de reacción a su óptimo, lográndose al final del ciclo la
producción de dos copias de la región amplificada. En el segundo ciclo cada una de estas
copias experimentará los mismos procesos en cada uno de los pasos de desnaturalización,
apareamiento de cebadores, y elongación, por lo que al final del ciclo se dispondrá de
cuatro copias de la región amplificada. Y así sucesivamente hasta el final del último ciclo.
Al tratarse de una reacción exponencial, se obtendrán cientos de millones de copias de la
región diana tras los 30-40 ciclos de la PCR.
58

Los protocolos de las reacciones de amplificación del ADN se adjuntan en el Anexo IV.
Las reacciones de PCR deben prepararse en condiciones de esterilidad, para evitar
problemas de contaminaciones de las muestras. En la mezcla de la reacción se deben
agregar concentraciones precisas de ADN total, cebadores, nucleótidos, enzima ADN
polimerasa, y tampón de reacción. La enzima polimerasa más comúnmente empleada en las
reacciones de PCR es Taq polimerasa, denominada así por obtenerse a partir de la bacteria
termófila Thermus aquaticus, resistente a las altas temperaturas de las fuentes termales
donde vive. Taq polimerasa soporta temperaturas elevadas sin desnaturalizarse y su
temperatura óptima de trabajo son 72C. Además de esta enzima, se han obtenido otras
ADN polimerasas de otros organismos cuyo funcionamiento y características son similares
a los de Taq. Entre los componentes del tampón de reacción se encuentra la sal cloruro de
magnesio, que actúa como estabilizante de las cadenas bicatenarias que se están formando
59

en cada ciclo. Las reacciones de PCR se desarrollan en un termociclador, aparato que
consta de una placa térmica capaz de cambiar su temperatura mediante un sistema de
programación de pasos. Las programaciones de reacciones PCR más utilizadas en las
amplificaciones de regiones genómicas nucleares y organulares de plantas se adjuntan en el
Anexo IV.
Transcurrida la reacción de PCR, los productos amplificados de las muestras se someten a
electroforesis en gel de agarosa y se detectan mediante tinción con bromuro de etidio. Si la
reacción ha tenido éxito, cada muestra amplificada mostrará una única banda de un peso
molecular determinado, correspondiente al de la región amplificada. La reacción PCR
convencional permite amplificar fragmentos de hasta ca. 5 kpb, excepcionalmente se
pueden amplificar fragmentos mayores de este peso molecular utilizando enzimas
polimerasas altamente eficaces (p.e AmpliTaq).
Al examinar los productos PCR aparecen casos problemáticos, como los errores en la
amplificación, la obtención de escaso producto amplificado, la presencia de bandas no
deseadas, y la presencia de contaminaciones. Los errores en la amplificación pueden ser
debidos a la falta de homología de los cebadores con sus regiones de apareamiento, o a
fallos en los reactivos de la reacción o en la programación de los ciclos PCR; en el primer
caso habría que diseñar nuevos cebadores para la región genómica y el grupo de
organismos en estudio, mientras que en el segundo deberían ser revisados los parámetros de
reacción y programación hasta encontrar el sistema adecuado. La región crítica de
apareamiento de los cebadores es su extremo 3’, puesto que esa es la zona donde se
producirá la elongación (adición de nuevos nucleótidos); en esa zona la homología con la
región complementaria debe ser total, lográndose así un apareamiento fuerte y estable, que
asegure la correcta elongación. La obtención de escaso producto amplificado puede
deberse a la no homología total de los cebadores con sus regiones complementarias de
apareamiento (idealmente debería ser del 100%), y puede subsanarse en ciertos casos
revisando los parámetros de reacción y de programación hasta optimizar los resultados, o
diseñando cebadores homólogos. La presencia de bandas no deseadas suele deberse a
amplificaciones secundarias de otras regiones genómicas distintas de la región diana, en las
que los cebadores encuentran secuencias flanqueantes pseudocomplementarias, con una
cierta homología; en general estas bandas no deseadas suelen eliminarse aumentando la
temperatura de apareamiento de los cebadores y evitando así los pseudoapareamientos con
regiones distintas a la de la región diana. Las contaminaciones pueden ser endógenas o
exógenas. Las contaminaciones endógenas son debidas a la presencia de organismos
patógenos o simbióticos en el interior de la planta; estas contaminaciones no pueden
evitarse, aunque suele lograrse en la mayoría de los casos una separación de los fragmentos
amplificados de uno y otro organismo por presentar distinto peso molecular. Las
contaminaciones exógenas pueden evitarse limpiando cuidadosamente el material vegetal
que va a emplearse en el estudio antes de la desecación o de la extracción del ADN.
La principal aplicación que tienen actualmente los productos PCR es la de proporcionar
material adecuado y en suficiente concentración para ser utilizado con posterioridad en
procesos de secuenciación, de restricción enzimática, o de clonación. Desde el punto de
vista taxonómico, algunos productos amplificados pueden servir como marcadores
moleculares de taxones si los distintos amplificados de una misma molécula en un grupo de
60

plantas muestran diferencias polimórficas en su peso molecular (debidos a delecciones o
inserciones en la región diana amplificada).
RAPD
La técnica RAPD de amplificación aleatoria del ADN ("Random Amplified Polymorphic
DNA") consiste en amplificaciones no dirigidas de fragmentos genómicos, y suponen una
variación de la técnica de amplificación convencional por PCR. Estas amplificaciones al
azar del ADN total de las células afectan fundamentalmente al ADN nuclear que es el
genoma mayor de las plantas. Las bandas amplificadas resultantes constituyen alelos
dominantes que se heredan de forma mendeliana.
Los marcadores RAPD se caracterizan por ser alelos hipervariables del genoma del núcleo,
por lo que han sido utilizados preferentemente en la caracterización molecular de especies
próximamente emparentadas entre sí, en estudios de genética poblacional, y en estudios
filogenéticos de plantas recientemente evolucionadas. Los alelos RAPD también se utilizan
extensivamente en programas de mejora genética vegetal para la selección de individuos en
las progenies, la detección de resistencias a agentes patógenos, y en el mapado
cromosómico de caracteres cuantitativos.
Los principios de la técnica RAPD consisten en la amplificación del ADN de las muestras
en estudio utilizando un solo cebador; este cebador de secuencia muy corta actúa tanto de
cebador directo como reverso y amplifica todos aquellos fragmentos genómicos que queden
entre dos regiones de apareamiento directa y reversa que tengan entre ellas un tamaño igual
o inferior a 5 Kpb. Como resultado de estos apareamientos en cada muestra se pueden
amplificar varios fragmentos genómicos distintos, por lo que el patrón de bandas RAPD
observadas tras la electroforesis suele ser múltiple.
61

Los cebadores RAPD se caracterizan por ser oligómeros decámeros (10 nucleótidos), con
una composición en G+C igual o superior al 60% y con una secuencia de nucleótidos no
palindrómica. Su pequeño tamaño los convierte en cebadores inespecíficos, que pueden
encontrar fácilmente distintos lugares de apareamiento a lo largo de las hebras de ADN.
Esto los distingue de los cebadores PCR convencionales, que son más largos y específicos,
y que han sido diseñados para aparearse con una única región genómica.
La capacidad de los oligómeros RAPD de encontrar diversos lugares de apareamiento en
las hebras del ADN hace que puedan amplificar regiones tanto de ADN copia simple o baja
copia, como regiones de ADN repetitivo. Estas últimas regiones, al ser altamente variables,
proporcionan alelos RAPD hipervariables que pueden llegar a ser característicos de
población e incluso de individuo.
Los protocolos de preparación de las reacciones RAPD y la programación de los ciclos de
amplificación se adjuntan en el Anexo V. Las mezclas de reactivos de las reacciones RAPD
son similares a los de las reacciones PCR convencionales, con la salvedad de que utilizan
un solo cebador en lugar de dos. Los parámetros de amplificación de los ciclos presentan
temperaturas de apareamiento inferiores, al tratarse de oligómeros de secuencia muy corta,
y ésta ronda los 40C. Los productos de la amplificación RAPD se resuelven por
electroforesis en geles de agarosa y se detectan con tinción de bromuro de etidio en un
transiluminador de luz ultravioleta.
Los marcadores RAPD son alelos dominantes del genoma nuclear ya que la presencia de
una banda se debe a la existencia de dos lugares de apareamiento (directa y reversa) del
cebador en una determinada región del genoma nuclear; la desaparición de uno cualquiera
de esos dos lugares de apareamiento evita la amplificación de ese fragmento genómico y
causa por lo tanto la ausencia de la banda correspondiente. La dominancia se debe al hecho
de que el fenotipo dominante (presencia de una banda) impide distinguir el genotipo del
individuo, que podría ser tanto homocigoto como heterocigoto. El carácter dominante de
los alelos RAPD hace necesario un mayor tamaño muestral de las poblaciones para poder
obtener parámetros genético poblacionales consistentes, equivalentes en cuanto a su
fiabilidad a los conseguidos con alelos codominantes en esas mismas poblaciones con un
menor tamaño de muestra.
62

La técnica RAPD presenta como ventajas su sencillez y su rapidez, pero tiene serios
inconvenientes en lo que se refiere a la repetibilidad de los resultados y a la homología de
los fragmentos obtenidos. Las reacciones de amplificación RAPD deben repetirse, como
mínimo, un par de veces, para asegurar la constancia del patrón de bandas obtenido. Errores
en la repetibilidad de esos patrones pueden ser debidos a fallos en la estandarización de los
protocolos y en los parámetros de amplificación, o a una competencia del cebador por sitios
de apareamiento, que rinde amplificaciones desiguales en distintas repeticiones. Los
apareamientos incorrectos de los cebadores son también la causa de esas amplificaciones
desiguales en distintas repeticiones; al tratarse de oligómeros inespecíficos, los errores de
apareamiento son superiores que en el caso de cebadores específicos. Es recomendable
estandarizar las condiciones de amplificación RAPD antes de conducir los análisis de las
muestras y seleccionar únicamente aquellas bandas RAPD que se amplifiquen nítidamente
y de forma repetida todas las veces.
63

Los problemas relacionados con la homología de los alelos RAPD son debidos a la
comigración de bandas correspondientes a fragmentos heterólogos de distintos taxones. A
priori se asume que las bandas RAPD procedentes de muestras distintas que emigran a una
misma altura del gel, y tienen por tanto el mismo peso molecular, corresponden a
fragmentos amplificados que son homólogos. Sin embargo, puesto que los alelos RAPD
son inespecíficos y se desconoce su procedencia, pudiera llegar a ocurrir que distintas
regiones genómicas de muestras diferentes produjesen bandas amplificadas del mismo peso
molecular que emigrarían a la misma altura del gel sin ser homólogas. Esta circunstancia
convertiría en inservibles a estos marcadores. La heterología de fragmentos comigrantes es
muy poco frecuente cuando se trata de poblaciones de la misma especie o de especies
próximamente emparentadas entre sí, puesto que presentan genomas más similares, sin
embargo su proporción aumenta cuanto menos emparentados están los taxones en estudio,
ya que, al poseer genomas menos parecidos, aumenta la probabilidad de que se den
amplificaciones heterólogas del mismo peso molecular. En general, el uso de los alelos
RAPD se restringe a niveles taxonómicos de especie e infraespecie, y se desaconseja su uso
a nivel genérico o superior.
Un problema añadido de la técnica RAPD es su mayor facilidad en sufrir los efectos de la
contaminación y en que esta contaminación pueda pasar desapercibida. Al tratarse de
fragmentos inespecíficos, las bandas contaminantes que pudieran aparecer entre los
productos finales de la amplificación, cuyo origen no correspondiese al genoma en estudio,
no podrían separarse de las bandas propias de ese organismo. Para evitar esto, se
recomienda trabajar en condiciones de esterilidad máxima a la hora de preparar las
reacciones RAPD. Además, cuando se analizan los alelos RAPD en muestras de ADN total
de los individuos, parte de esos fragmentos amplificados pueden corresponder a los
genomas cloroplástico o mitocondrial de los individuos, si bien sus porcentajes siempre
serán significativamente menores que los de los alelos del genoma nuclear,
considerablemente más voluminoso y por tanto probabilísticamente mayoritariamente
amplificado. El porcentaje de alelos RAPD organulares amplificados se desprecia por
nimio, por ello las bandas RAPD se atribuyen generalmente a fragmentos del genoma
nuclear y se considera que se heredan biparentalmente de forma mendeliana.
Pese a los inconvenientes de la tecnología RAPD, estos marcadores se han utilizado
extensivamente en estudios taxonómicos y genético poblacionales de plantas, y en análisis
filogenéticos de algunos grupos de taxones recientemente evolucionados. En los estudios
cladísticos, los marcadores RAPD se codifican como caracteres binarios por su
presencia/ausencia. Los fenotipos RAPD han servido para desarrollar distintos estudios de
caracterización genética de especies, como marcadores específicos o a través de análisis
multivariantes y de reconstrucción de fenogramas. Han sido igualmente empleados para la
detección de taxones de origen híbrido.
Ejemplos de estudios de marcadores RAPD en la caracterización genética de especies y en
análisis genético poblacionales se han desarrollado en el género Borderea (Dioscoreaceae).
Los alelos RAPD han servido también para la reconstrucción de la filoge nia de las especies
del género Brachypodium (Poaceae) y para la detección de híbridos interespecíficos en el
género Festuca (Poaceae).
64

SECUENCIACIÓN DEL ADN
La técnica de secuenciación del ADN consiste en conocer la composición específica de
nucleótidos de una región particular de un genoma. El resultado de ese proceso es la
obtención de una secuencia nucleotídica donde se conocen la naturaleza y el orden de los
nucleótidos y la longitud de esa molécula. La técnica de secuenciación del ADN
proporciona la mayor fuente de información de caracteres moleculares conocida hasta la
fecha, ya que cada posición de esa secuencia corresponde, a priori, a un carácter distinto.
Así la secuenciación de un fragmento de ADN de 1000 nucleótidos podría llegar a
proporcionar hasta un máximo de 1000 caracteres; habitualmente el número de caracteres
obtenidos es mucho menor ya que una gran parte de las posiciones secuenciadas en los
distintos taxones son invariables y no aportan por lo tanto ninguna información.
Únicamente aquellas posiciones de las secuencias comparadas que son variables son las que
proporcionan marcadores moleculares potencialmente útiles para fines taxonómicos.
Las primeras secuenciaciones de genomas se realizaron mediante mapados superpuestos de
lugares de restricción enzimática, un proceso largo y complejo que llevó a un conocimiento
mayor de los genomas hasta entonces inexistente. Un avance notable en la técnica fue el
desarrollo de la reacción manual de Sanger de secuenciación del ADN con
dideoxinucleótidos terminales. Esta técnica de secuenciación, base de la actual
secuenciación automática, consiste en la producción de fragmentos monocatenarios de
longitudes correlativamente superiores en un nucleótido, que se separan por electroforesis
en geles de poliacrilamida y se revelan por autorradiografiado.
La secuenciación manual de Sanger requiere de una hebra molde monocatenaria de ADN
que va a ser secuenciada, de un cebador complementario, de unas concentraciones
determinadas de deoxynucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) para la elongación de la
cadena, de dideoxinucleótidos (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) para la terminalización de
cada fragmento de la secuencia, y de una enzima ADN polimerasa altamente procesativa
(secuenasa). La secuenciación manual se inicia en un único tubo para cada muestra, donde
se produce el apareamiento de la hebra molde con el cebador, y se continúa en cuatro tubos
distintos para cada muestra, en cada uno de los cuales se añaden la enzima polimerasa, los 4
deoxinucleótidos, y un solo tipo de dideoxinucleótido terminal (siendo registrados como
tubos “A” (ddATP), “C” (ddCTP), “G” (ddGTP), y “T” (ddTPP)). En un tubo determinado
(p.e. el tubo “T”, que contiene el dideoxinucleótido ddTTP), la reacción de polimerización
de la enzima comienza hasta que encuentra un resto de adenina (A) en la hebra molde, en
esa posición puede incorporar tanto un nucleótido dTTP como un dideoxinucleóido ddTTP,
si se incorpora el primero el proceso de elongación continúa, si lo hace el segundo la
elongación termina allí; un cierto número de fragmentos finalizarán allí su elongación y el
resto la continuarán hasta la siguiente posición de la hebra molde donde aparezca otro resto
de adenina (A), donde volverá a ocurrir lo propio. Por cada resto de adenina que vaya
apareciendo en la hebra molde una serie de fragmentos complementarios irán finalizando
sus elongaciones al haber incorporado restos de ddTTP. Al igual que ocurre en el tubo “T”
procesos parecidos están teniendo lugar en los tubos “A”, “C”, y “G”, con finalizaciones de
las elongaciones de los fragmentos complementarios con sus respectivos
65

dideoxinucleótidos terminales. Los productos finales de esas secuenciaciones se separan
por electroforesis vertical en un gel de poliacrilamida y se detectan mediante
autorradiografías. La lectura saltatoria de las bandas presentes, en grado ascendente, en las
cuatro calles, nos dará la secuencia completa de nucleótidos de ese fragmento genómico.
Las secuenciación completa de un fragmento genómico requiere de dos lectura s, directa y
reversa; ambas hebras molde de una región genómica deben ser secuenciadas, en una
dirección y en otra, y contrastadas entre sí para obtener la secuencia consenso. Las dos
secuencias deben ser complementarias si la secuenciación ha sido correcta en ambos casos.
Las lecturas directa y reversa de la misma secuencia permiten la detección de errores que
puedan haberse cometido en uno u otro caso y la confirmación de la existencia de
polimorfismos para ciertas posiciones de la secuencia (que deben aparecer en ambas
lecturas). En la secuenciación manual de fragmentos genómicos pueden aparecer ciertos
problemas relacionados con la homología parcial de los cebadores y con las compresiones
debidas a estructuras secundarias de la hebra molde. Estos últimos pueden superarse
aumentando la temperatura del proceso. Las homologías de los cebadores pueden mejorarse
mediante el rediseño de éstos. No obstante, la secuenciación de las regiones genómicas, al
igual que la amplificación del ADN de esas regiones, únicamente puede darse si se dispone
de cebadores universales de otras plantas que funcionan bien en los materiales en estudio.
A partir de las primeras secuencias obtenidas de los materiales en estudio pueden diseñarse
nuevos cebadores que permiten la exploración de otras regiones genómicas próximas
desconocidas.
La secuenciación automática representa un avance metodológico respecto a la
secuenciación manual, al disminuir notablemente el tiempo requerido para la secuenciación
de los fragmentos y al automatizar el registro de los datos. La secuenciación automática
utiliza también dideoxinucleótidos terminales, pero en este caso la reacción de
secuenciación se hace mediante una reacción de PCR en un solo tubo, y cada ddNTP está
marcado con un fluorocromo distinto. La separación por electroforesis de los fragmentos
requiere de una única calle en el gel, en lugar de cuatro, o de una única carga en el capilar.
La lectura de los fragmentos marcados se realiza con un dispositivo de impresión por rayo
láser quedando registrados los picos de emisión en un cromatograma. Los protocolos de la
reacción de PCR de secuenciación y de la programación de este proceso se adjuntan en el
Anexo VI.
66

Los cromatogramas de las dos lecturas (directa y reversa) de la misma muestra se
confrontan y se elabora con ellas la secuencia consenso. Una vez obtenidas todas las
secuencias confrontadas de las muestras en estudio se procede al alinemiento de las
mismas. El alineamiento de las secuencias nos va a permitir detectar los cambios habido s
en unas secuencias con respecto a otras tanto en su longitud como en la naturaleza de sus
nucleótidos. El alineamiento de las secuencias puede hacerse de forma manual o con la
ayuda de programas específicos de alineamiento (Clustal, Malign).
Una vez alineadas las secuencias se obtiene una secuencia de longitud consenso para todas
ellas, que se toma como secuencia de referencia para el estudio comparativo entre
secuencias. En esa matriz de secuencias alineadas se pueden detectar mutaciones de
longitud de las secuencias, debidas a delecciones o inserciones, y mutaciones de
sustituciones de nucleótidos. Esas mutaciones constituyen caracteres de mutación de
secuencia que pueden ser utilizados con distintos fines sistemáticos.
Marcadores específicos de las secuencias a nivel de taxón pueden servir para caracterizar
molecularmente a ciertas plantas, para detectar el origen híbrido de otras (si están en el
genoma nuclear), o para conocer el progenitor materno de un híbrido (si están en el genoma
cloroplástico). El uso mayoritario que tienen las mutaciones informativas de las secuencias
del ADN es su empleo en los estudios filogenéticos de los distintos grupos de plantas
terrestres.
MICROSATÉLITES
Los microsatélites son marcadores hipervariables codominantes del genoma nuclear que
aportan marcadores específicos a nivel individual y que se heredan de forma mendeliana,
por lo que son utilizados en estudios genético poblacionales de plantas.
La fuente de datos de los microsatélites son las regiones de ADN altamente repetitivo del
núcleo que, al presentar una alta tasa de mutación, proporcionan ciertos marcadores
polimórficos característicos de los individuos. El poder resolutivo de los microsatélites se
da a nivel específico e infraespecífico, no pudiendo ser utilizados a niveles taxonómicos
mayores.
La técnica de análisis del genoma mediante microsatélites es un proceso complejo que
implica, en primer lugar, el diseño de cebadores específicos que permitan amplificar
posteriormente determinadas regiones microsatélites, fuentes de datos alélicos. La serie de
pasos conducentes al diseño de los cebadores consisten en restricciones enzimáticas del
ADN total (nuclear) y clonación de los fragmentos que muestran un tamaño medio (hasta
0.7 Kpb), cribaje de los fragmentos clonados con sondas especiales que contienen motivos
de repetición específicos en sus secuencias (p.e. GAT, CG, etc.), secuenciación de los
fragmentos cribados, análisis de las secuencias y diseño de cebadores en regiones
67

conservadas que sean flanqueantes de las zonas repetitivas, y prueba de los cebadores
diseñados mediante amplificaciones por PCR de una selección de muestras en estudio.
Cada zona de microsatélites para la cual se diseñan los pares de cebadores PCR directo y
reverso es un locus único del genoma nuclear que puede contener distintas unidades de
repetición entre las regiones flanqueantes conservadas. Los distintos alelos que pueda
presentar cada una de esas regiones microsatélites van a consistir en un número diferente de
la misma unidad de repetición, lo que les conferirá una distinta movilidad electroforética en
el gel de poliacrilamida (o capilar). Los individuos homocigotos para un determinado alelo
mostrarán una única banda amplificada, mientras que los heterocigotos mostrarán dos
bandas (en taxones diploides), por tratarse de marcadores codominantes. El muestreo de los
individuos representantes de la población permitirá conocer los genotipos presentes en la
población, la variabilidad alélica de cada locus, y las frecuencias poblacionales de esos
alelos.
La técnica de los microsatélites presenta la ventaja de proporcionar alelos codominantes y
de ser altamente fiable. Al tratarse de alelos genómicos del ADN repetitivo no se ven
alterados por efectos transcripcionales, como las isoenzimas, ni están aparentemente
afectados por presiones selectivas. Ello los convierte en marcadores neutros altamente
resolutivos. Si bien su empleo es muy eficaz en estudio de genética poblacional de
poblaciones actuales, no se recomienda su utilización en estudios filogenéticos, ya que la
misma tasa de variabilidad mutacional tan elevada que presentan los hace impropios para
reconstrucciones evolutivas históricas.
Entre los ejemplos de estudios genético poblacionales llevados acabo con microsatélites
nucleares están los desarrollados en los grupos ibéricos endémicos del género Limonium
(Plumbaginaceae) y Borderea (Dioscoreaceae).
68

CONSERVACIÓN DE LA FLORA ENDÉMICA Y AMENAZADA
Todas las técnicas moleculares de análisis de los genomas vegetales comentadas
anteriormente pueden ser aplicadas a los estudios genéticos de plantas endémicas y
amenazadas de distintas regiones florísticas.
Las reconstrucciones filogenéticas basadas en secuencias de nucleótidos del ADN son una
de las herramientas más empleadas en la clasificación evolutiva (y también sistemática) de
las angiospermas. El emplazamiento filogenético de muchos taxones amenazados puede
servir para conocer a sus co-taxones o poblaciones no amenazadas más próximos, que
pueden actuar como fuente de reclutamiento de individuos en programas de reintroducción
o de reforzamiento de poblaciones.
Los estudios genético poblacionales conducidos mediante análisis de marcadores
moleculares permiten conocer los niveles de variabilidad genética actual de las poblaciones
de especies amenazadas o endémicas, deducir eventos que tuvieron lugar en su historia
pretérita, y predecir algunos efectos del futuro dinamismo genético. El conocimiento de los
parámetros genético poblacionales y de la estructura poblacional permiten establecer
estrategias de protección de plantas en grave riesgo de extinción así como seleccionar a los
individuos potencialmente más idóneos para experimentos de cruzamientos dirigidos.
69

PÁGINAS DE INTERNET DE INTERÉS
- Felsenstein, J. - Phylogeny Programs
Recopilación amplia de programas filogenéticos (incluidos métodos de alineamiento
de secuencias de ADN) y de estudios genético-poblacionales
(http://evolution.genetics.washington.edu/phylip/software.html#methods)
- GenBank - National Center for Biotechnology Information
Base de datos de secuencias de ADN
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank
- Nickrent, D. E. - Techniques in Plant Molecular Biology
Página sobre técnicas moleculares aplicadas a la taxonomía vegetal
(http://www.science.siu.edu/plant-biology/nickrent/PLB420/Index.LabTechniques.html)
- TreeBase - A database of phylogenetic knowledge
Base de datos de matrices de secuencias de ADN y de reconstrucciones
filogenéticas
(http://eew228.leidenuniv.nl/treebase)
BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA:
Hillis DM, C Moritz, BK Mable. 1996. Molecular Systematics, second edition. Sinauer Inc.
Sunderland, MA, USA.
Hollingsworth, PM, RM Bateman, RJ Gornall. 1999. Molecular Systematics and Plant Evolution.
Taylor & Francis. London and New York.
Maniatis, T., E. F. Fritsch, J. Sambrook. 1982. Molecular cloning, a laboratory manual. Cold
Spring Harbor Laboratory Publ., New York.
Sambrook, J., E.F. Fritsch, T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold
Spring Harbor Laboratory Press.
Soltis DE, PS Soltis. 1989. Isozymes in Plant Biology. Chapman and Hill. London, UK.
Soltis DE, PS Soltis, JJ Doyle. 1998. Molecular Systematics of Plants II. DNA sequencing. Kluwer.
Boston, USA.
(Para otras referencias bibliográficas de interés véase
http://www.science.siu.edu/nickrent/PLB420/DNA.Techniques/DNA.Refs.html)
70

Anexo I : Protocolos para el estudio isoenzimático
Tampón de extracción:
Jose Gabriel Segarra Moragues (Universidad de Zaragoza)
Solución madre 100 ml (guardar en nevera):
A preparar en el momento de la extracción:
Tampones de electroforesis:
1. Borato de Litio (Ashton & Braden)
Tampón de electrodos:
1.12 gr/l LiOH
11.8 gr/l Ácido Bórico
Tampón de gel:
1.75 gr/l Ácido Cítrico anhidro
6.2 gr/l Tris
2.42 gr/100 ml Tris
2.42 gr/100 ml Metabisulfito sódico
2 ml/100 ml MgCl2 1M
0.1 gr/100 ml EDTA
Ajustar a Ph 7.5 con HCl 1 M
5 ml. solución madre
0.2 gr. PVP (Polivinilpirrolidona)
20 μl Mercaptoetanol
Preparación: Mezclar 225 ml del tampón de gel con 25 ml. de tampón de electrodos y cocer el gel
(10%) con 25 gr. de almidón.
71

2. Tris-Borato Ph 8.6
Tampón de electrodos:
Tampón de gel:
21.78 gr/l Tris
1.49 gr/l EDTA
3. Citrato de Morfolina Ph 6.1
Ajustar a Ph 8.6 con ácido Bórico en polvo (Aprox. 8.5 gr/l)
Mezclar una parte del tampón de electrodos (62.5 ml) con tres partes de agua destilada
(187.5 ml).
Preparación: Preparar el gel con la mezcla anterior del tampón de gel y cocer el gel (10%)
con 25 gr. de almidón.
Tampón de electrodos:
Tampón de gel:
3. Citrato de Histidina Ph 5.7-7
8.41 gr/l Ácido citrico monohidrato
Ajustar a Ph 6.1 con N-(3-aminopropil)morfolina. (Aprox. 10 ml/l)
Mezclar una parte del tampón de electrodos (12.5 ml) con diecinueve partes de agua
destilada (237.5 ml).
Preparación: Preparar el gel con la mezcla anterior del tampón de gel y cocer el gel (10%)
con 25 gr. de almidón.
Tampón de electrodos:
Tampón de gel:
16.35 gr/l Tris
9.4 gr/l Ácido citrico anhidro
Ajustar a Ph 5.7 o 7 con ácido citrico anhidro en polvo.
0.349 gr/ 250 ml DL-Histidina. Ajustar a Ph 5.7 o 7 con ácido citrico anhidro 0.3M.
Preparación: Preparar el gel con la mezcla anterior del tampón de gel y cocer el gel (10%)
con 25 gr. de almidón.
Protocolos de tinción: Los productos señalados con un asterisco son extremadamente sensibles a la luz y por
lo tanto deben añadirse en el último momento.
72

SISTEMAS ENZIMÁTICOS:
Aspartato amino transferasa (AAT=GOT) Cantidad
Tris -HCl 0.8 M 10 ml
Agua destilada 40 ml
Ácido α-cetoglutarico 100 mg
Ácido aspártico 200 mg
EDTA (opcional) 100 mg
PVP (opcional) 100 mg
Fast Blue BB salt* 100 mg
Indicaciones específicas: El Ph de la solución debe ser ajustado a 8.0 después de añadir los substratos. La
adición de cantidades variables de EDTA y PVP pueden mejorar el resultado. Mezclar el resto de ingredientes
e incubar en oscuridad a temperatura ambiente hasta la aparición de bandas verdes sobre matiz roja. Después,
eliminar el tampón de tinción, lavar y fijar.
Configuración del enzima: Dimérico
Núme ro de isozimas: 2
Tampón de electroforesis recomendado: 2
Aconitasa (ACO) Cantidad
Tris -HCl 0.1 M Ph 8 50 ml
Ácido cis -aconítico 150 mg
MgCl2 1M 1 ml
Isocitrato deshidrogenasa 0.5 ml
NADP* (10 mg/ml) 1 ml
MTT* (20 mg/ml) 0.5 ml
PMS* (4 mg/ml) 0.5 ml
Indicaciones específicas: El Ph de la solución debe ser ajustado a 8.0 después de añadir el substrato (ácido
cis -aconítico). Mezclar el resto de ingredientes e incubar en oscuridad a temperatura ambiente hasta la
aparición de bandas azules. Después, eliminar el tampón de tinción, lavar y fijar.
Configuración del enzima: Monómérico
Número de isozimas: 2
Tampón de electroforesis recomendado: 2
Alcohol deshidrogenasa (ADH) Cantidad
Tris -HCl 0.1 M Ph 8 50 ml
Etanol (95%) 3 ml
NAD* (10 mg/ml) 1.5 ml
MTT* (20 mg/ml) 0.5 ml
PMS* (4 mg/ml) 0.5 ml
Indicaciones específicas: El aumento de la cantidad de etanol puede resultar en la inhibición del enzima.
Mezclar los ingredientes e incubar en oscuridad a temperatura ambiente hasta la aparición de bandas azules.
Después, eliminar el tampón de tinción, lavar y fijar.
73

Configuración del enzima: Dimérico
Número de isozimas: 3
Tampón de electroforesis recomendado: 1
Aldolasa (ALD) Cantidad
Tris -HCl 0.1 M Ph 8 50 ml
Fructosa 1,6 difosfato (Trisodium salt) 100 mg
Arsenato sódico 1.0M 0.5 ml
Gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa 100 U
NAD* (10 mg/ml) 1 ml
MTT* (20 mg/ml) 1 ml
PMS* (4 mg/ml) 0.5 ml
Indicaciones específicas: Mezclar los ingredientes e incubar en oscuridad a temperatura ambiente hasta la
aparición de bandas azules. Después, eliminar el tampón de tinción, lavar y fijar.
Configuración del enzima: Tetramérico
Número de isozimas: 1
Tampón de electroforesis recomendado: 2
Diaforasa (DIA) Cantidad
Tris -HCl 0.1 M Ph 8 50 ml
2,6 diclorofenol-indofenol 5 mg
NADH* 20 mg
MTT* (20 mg/ml) 1 ml
Indicaciones específicas: Puede resultar equivalente al sistema MNR. Mezclar los ingredientes e incubar en
oscuridad a temperatura ambiente hasta la aparición de bandas azules. Después, eliminar el tampón de tinción,
lavar y fijar.
Configuración del enzima: Monomérico, Dimérico, Tetramérico (depende del locus).
Número de isozimas: 2-6
Tampón de electroforesis recomendado: 1, 2
L-Glutamato deshidrogenasa (GDH) Cantidad
Tris -HCl 0.1 M Ph 8 50 ml
L-ácido glutámico (Neutralizado a Ph 8.0 con NaOH en pastillas) 10 ml
NAD* (10 mg/ml) 1 ml
MTT* (20 mg/ml) 0.5 ml
PMS* (4 mg/ml) 0.5 ml
74

Indicaciones específicas: Mezclar los ingredientes e incubar en oscuridad a temperatura ambiente hasta la
aparición de bandas azules. Después, eliminar el tampón de tinción, lavar y fijar.
Configuración del enzima: Hexamérico
Número de isozimas: 1
Tampón de electroforesis recomendado: 2
Isocitrato deshidrogenasa (IDH) Cantidad
Tris -HCl 0.1 M Ph 8 50 ml
Ácido isocítrico (Trisodium salt) 50 mg
MgCl2 1M 2.5 ml
NADP* (10 mg/ml) 0.5 ml
MTT* (20 mg/ml) 0.5 ml
PMS* (4 mg/ml) 0.5 ml
Indicaciones específicas: Mezclar los ingredientes e incubar en oscuridad a temperatura ambiente hasta la
aparición de bandas azules. Después, eliminar el tampón de tinción, lavar y fijar.
Configuración del enzima: Dimérico
Número de isozimas: 1
Tampón de electroforesis recomendado: 3
Enzima málica (EM) Cantidad
Tris -HCl 0.1 M Ph 8 50 ml
DL-Ácido málico 2.0M 5 ml
(Neutralizado a Ph 8.0 con NaOH en pastillas)
MgCl2 1M 1 ml
NADP* (10 mg/ml) 1 ml
MTT* (20 mg/ml) 1 ml
PMS* (4 mg/ml) 0.5 ml
Indicaciones específicas: Mezclar los ingredientes e incubar en oscuridad a temperatura ambiente hasta la
aparición de bandas azules. Después, eliminar el tampón de tinción, lavar y fijar.
Configuración del enzima: Tetramérico
Número de isozimas: 1
Tampón de electroforesis recomendado: 2
α y βEsterasas (EST) Cantidad
fosfato monosódico 0.1 M Ph 6 50 ml
α-Naphtylacetato 20 mg
β-Naphtylacetato 20 mg
Fast Blue RR salt* 50 mg
75

Indicaciones específicas: Disolver los substratos en 2 ml de acetona. Variar el Ph de la solución de tinción si
no se obtiene buen resultado (5.5-7). Mezclar los ingredientes e incubar en oscuridad a temperatura ambiente
o a 37ºC, hasta la aparición de bandas azules. Después, eliminar el tampón de tinción, lavar y fijar.
Configuración del enzima: Muy variable (depende del locus y taxon)
Número de isozimas: Muy variable
Tampón de electroforesis recomendado: 2
Malato deshidrogenasa (MDH) Cantidad
Tris -HCl 0.1 M Ph 8 50 ml
DL-Ácido málico 2.0M (Neutralizado a Ph 7.5 con NaOH en pastillas) 5 ml
NAD* (10 mg/ml) 0.5 ml
MTT* (20 mg/ml) 0.5 ml
PMS* (4 mg/ml) 0.5 ml
Indicaciones específicas: Mezclar los ingredientes e incubar en oscuridad a temperatura ambiente hasta la
aparición de bandas azules. Después, eliminar el tampón de tinción, lavar y fijar.
Configuración del enzima: Dimérico
Número de isozimas: 3
Tampón de electroforesis recomendado: 3, 4
Menadiona reductasa (MNR) Cantidad
Tris -HCl 0.05 M Ph 7 o fosfato monosódico 0.1 M Ph 7 50 ml
Menadiona* 40 mg
NADH* 20 mg
MTT* (20 mg/ml) 1 ml
Indicaciones específicas: Disolver la Menadiona en 2 ml de acetona. Puede ser equivalente a DIA. Mezclar
los ingredientes e incubar en oscuridad a temperatura ambiente hasta la aparición de bandas azules. Después,
eliminar el tampón de tinción, lavar y fijar.
Configuración del enzima: Monomérico, Tetramérico
Número de isozimas: 2-4
Tampón de electroforesis recomendado: 2
6-Fosfogluconato deshidrogenasa (6PGD) Cantidad
Tris -HCl 0.1 M Ph 8 50 ml
Ácido 6 fosfoglucónico (Barium salt) 20 mg
MgCl2 1M 1 ml
NADP* (10 mg/ml) 0.5 ml
MTT* (20 mg/ml) 0.5 ml
PMS* (4 mg/ml) 0.5 ml
76

Indicaciones específicas: Mezclar los ingredientes e incubar en oscuridad a temperatura ambiente hasta la
aparición de bandas azules. Después, eliminar el tampón de tinción, lavar y fijar.
Configuración del enzima: Dimérico
Número de isozimas: 2
Tampón de electroforesis recomendado: 3
Fosfoglucoisomerasa (PGI) Cantidad
Tris -HCl 0.1 M Ph 8 50 ml
Fructosa 6 fosfato (Disodium salt) 15 mg
MgCl2 1M 0.5 ml
Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa 20 U
NADP* (10 mg/ml) 0.5 ml
MTT* (20 mg/ml) 0.5 ml
PMS* (4 mg/ml) 0.5 ml
Indicaciones específicas: Mezclar los ingredientes e incubar en oscuridad a temperatura ambiente hasta la
aparición de bandas azules. Después, eliminar el tampón de tinción, lavar y fijar.
Configuración del enzima: Dimérico
Número de isozimas: 2
Tampón de electroforesis recomendado: 1
Fosfoglucomutasa (PGM) Cantidad
Tris -HCl 0.1 M Ph 8 50 ml
Glucosa 1 fosfato (Disodium salt) 25 mg
MgCl2 1M 1 ml
Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa 20 U
NADP* (10 mg/ml) 0.5 ml
MTT* (20 mg/ml) 0.5 ml
PMS* (4 mg/ml) 0.5 ml
Indicaciones específicas: Mezclar los ingredientes e incubar en oscuridad a 37ºC hasta la aparición de bandas
azules. Después, eliminar el tampón de tinción, lavar y fijar.
Configuración del enzima: Monomérico
Número de isozimas: 2
Tampón de electroforesis recomendado: 1
77

Shikimato deshidrogenasa (SKD) Cantidad
Tris -HCl 0.1 M Ph 8 50 ml
Ácido Shikimico 50 mg
NADP* (10 mg/ml) 0.5 ml
MTT* (20 mg/ml) 1 ml
PMS* (4 mg/ml) 0.5 ml
Indicaciones específicas: Mezclar los ingredientes e incubar en oscuridad a temperatura ambiente hasta la
aparición de bandas azules. Después, eliminar el tampón de tinción, lavar y fijar.
Configuración del enzima: Monomérico
Número de isozimas: 1
Tampón de electroforesis recomendado: 3
Triosafosfatoisomerasa (TPI) Cantidad
Tris -HCl 0.1 M Ph 8 50 ml
Dihidroxiacetona fosfato 4.5 mg
EDTA (Na4-salt) 24 mg
Arsenato sódico 1.0M 1 ml
Gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa 200 U
NAD* (10 mg/ml) 2 ml
MTT* (20 mg/ml) 0.5 ml
PMS* (4 mg/ml) 0.5 ml
Indicaciones específicas: Mezclar los ingredientes e incubar en oscuridad a temperatura ambiente hasta la
aparición de bandas azules. Después, eliminar el tampón de tinción, lavar y fijar.
Configuración del enzima: Dimérico
Número de isozimas: 2
Tampón de electroforesis recomendado: 1, 2
78

Anexos II-VI : Protocolos para los estudios del ADN
Pedro Torrecilla López y Pilar Catalán Rodríguez (Universidad de Zaragoza)
Anexo II: COLECTA Y CONSERVACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL:
1- Colectar hojas jóvenes.
2- Conservarlas a – 80 ºC, liofilizarlas o secarlas con gel de sílice (si se quieren utilizar en fecha posterior a
la de la colecta).
3- Recortar las nervaduras de las hojas.
4- Agregar N2 líquido a un mortero (preferiblemente enfriado también en N2 líquido o en refrigerador a –
20ºC o menos), añadir las hojas previamente cortadas en trozos pequeños, esperar a que actúe el N2, y en
el momento en que éste se termina de evaporar, macerar vigorosamente la muestra hasta obtener un polvo
fino.
5- Transferir el polvo a un tubo Eppendorf (1.5ml) y utilizarlo para la extracción inmediata del ADN. El
polvo vegetal puede guardarse a –20 ºC para posteriores extracciones, aunque se corre el riesgo de
degradación del ADN.
Anexo III: EXTRACCIÓN DEL ADN (MINIPREPARACIONES):
1- Pesar 150 mg de polvo vegetal.
2- Colocar el polvo en un tubo Eppendorf de 1,5 ml con 700 ul de tampón de extracción CTAB
precalentado a 60ºC, 1,4 ul de mercaptoetanol (¡producto cancerígeno!), y una 'pizca' de PVPP (Polivinil
polipirrolidona ). La mezcla resultante debe quedar parcialmente fluida, no demasiado espesa, a fin de
facilitar la acción del tampón en la extracción del ADN, así que de ser necesario (dependiendo de la
consistencia del material vegetal sobretodo) debe reducirse la cantidad de polvo vegetal a utilizar.
3- Colocar el tubo en baño de María (60 ºC) durante media hora agitándolo suavemente cada 5 min.
4- Añadir al tubo 700 ul de cloroformo / alcohol isoamílico (24:1) y mezclar las soluciones, suavemente,
durante 2 min.
5- Centrifugar el tubo a 3.500 rpm durante 5 min.
6- Pipetear el sobrenadante (con micropipeta regulada a 150 ul) y transferirlo a un nuevo tubo (prestar
atención para no pipetear nada de la interfase blanca ni de la fase inferior).
7- Repetir el paso 4.
8- Repetir el paso 5.
9- Repetir el paso 6.
10- Añadir al nuevo tubo 450 ul de isopropanol a – 20ºC (precipita el ADN).
11- Mezclar suavemente y observar si se forman flocos (madeja flotante de ADN).
12.1- Si hubiera floculación, pescar los flocos con pipeta Pasteur de cristal (o una punta de micropipeta fina) y
transferirlos a un tubo nuevo con 500 ul de solución de lavado , dejando que se laven durante 20 min y
agitando suavemente el tubo cada 5 min.
12.2- Si no hubiera floculación , centrifugar a 10.000 rpm durante 10 min, eliminar con cuidado el
sobrenadante para que no se pierda el 'pellet' que se forma en el fondo del tubo, dejar que se seque el
'pellet' y añadir al tubo 500 ul de solución de lavado. Dejar que se lave el 'pellet' durante 20 min en la
solución, agitando suavemente el tubo cada 5 min.
13.1- Pescar nuevamente los flocos con la misma pipeta Pasteur de cristal (o punta de micropipeta fina) y
mantener el floco en el aire hasta que se seque. Disolverlo en 100 ul de tampón 0,1 x TE añadido a un
tubo Eppendorf de 0,5 ml.
13.2- Centrifugar a 4.000 rpm durante 5 min, eliminar el sobrenadante con cuidado para no perder el 'pellet' ,
dejar que se seque completamente el tubo colocándolo boca abajo sobre papel absorbente, y añadir 100
79

ul de tampón 0,1 x TE. Agitar cada 2 min hasta disolver el 'pellet' y transferir la solución de ADN a un
tubo Eppendorf de 0,5 ml.
14- Guardar la solución de ADN a – 20 ºC.
15- cuantificar la concentración de ADN, bien sea con fluorómetro/espectrofotómetro, o por comparación con
un marcador de concentración conocida.
TAMPÓN CTAB DE EXTRACCIÓN DE ADN (500 ml):
10 x CTAB………………………………...100,00ml
1 M Tris -HCl pH 8,0………………………50,00ml
0,25 M EDTA……………………………….40,00ml
NaCl………………………………………….43,50g
ddH2O……………………………………...310,00ml
Solución de lavado de ADN: 76% Etanol , 10mM Acetato amónico.
PREPARACIÓN DE GEL DE AGAROSA:
La concentración a la que se hace el gel depende del uso que se le vaya a dar al mismo. Mientras más
concentrado esté el gel, menores serán sus poros y ofrecerá una mayor selectividad a la migración de
fragmentos de distinto peso molecular. Para revisar simplemente la presencia o no de ADN (total,
amplificados, etc) bastará un gel de 1% o incluso 0,8 %; para RAPDs puede ser necesario un gel de 1,5 o 2 %.
Protocolo para gel de 1%:
- Añada 1 gr. de agarosa a 100 ml de tampón 0,5 x TBE (= 1% de agarosa), dispuestos en matraz
Erlenmeyer de 500 m
- Añada 7 ul de Bromuro de etidio por cada 100 ml de gel.
PRECAUCIÓN: EL BROMURO DE ETIDIO ES CANCERÍGENO !! UTILIZAR SIEMPRE
GUANTES
- Caliente en el horno microondas hasta que la agarosa se disuelva totalmente y el gel sea líquido (¡tener
cuidado de que, si hierve, la solución no se desparrame por el microondas! ).
Nota: los geles con bromuro de etidio no se reciclan; se desechan en un contenedor propio.
MONTAJE DEL GEL Y DESARROLLO DE LA ELECTROFORESIS.
1- Tape con doble tira de tirro los laterales abiertos de la bandeja del gel, cuidando de que quede totalmente
sellado, y colocar los peines correspondientes.
2- Vierta el gel de agarosa líquido en la bandeja, en una superficie plana, y dejar que se solidifique al aire o
en la nevera (¡ en ese caso taparlo con plástico para evitar contaminaciones!!!). El gel debe tener un
grosor mínimo de 3 mm).
3- Llene la cubeta de electroforesis con tampón 0,5 TBE.
4- Una vez solidificado el gel, quite el tirro de la bandeja y los peines, y colocar la bandeja en la cubeta de
electroforesis de tal forma que el gel quede cubierto por el tampón, sobrepasándolo unos 2 mm.
80

5- Cargue las muestras (verificación de obtención de ADN, RAPD, PCR, etc) en los pocillos del gel (a cada
muestra a correr en el gel se le debe añadir 2 ul de solución de azul de bromofenol, mezclando bien los
dos componentes). Las muestras se preparan con antelación y se cargan lo más rápidamente en el gel para
evitar que difundan en él.
6- Asegúrese de que la orientación del gel y las muestras es la apropiada para la dirección de la
electroforesis (las muestras deben desplazarse desde el cátodo – polo negativo – hacia el ánodo – polo
positivo – ya que el ADN tiene carga negativa), colocar los cables en los polos adecuados, y enchufar la
corriente eléctrica al voltaje adecuado (éste está en función de lo que se esté haciendo, 100 volts. si se
quiere una migración rápida simplemente para revisar si existe ADN luego de una extracción o
comprobar la ocurrencia de amplificación en una PCR; 25-45 volts. si lo que se están corriendo son
muestras RAPD, aunque aquí el voltaje se correlaciona con el tiempo que se esté dispuesto a dejar
corriendo la electroforesis y el número de bandas que normalmente se expresen en el material de estudio,
ya que en RAPD la clave está en lograr una adecuada separación en el patrón de bandas).
7- Espere el tiempo correspondiente (va desde 30 min o menos en un gel pequeño a 100 volts para revisar
presencia de ADN o amplificación de PCR, hasta 8 horas en un RAPD a 25-30 volts. en muestras con
numerosas bandas muy cercanas entre si).
8- Una vez transcurrida la electroforesis examine los resultados en un transiluminador de rayos ultravioleta
o en un analizador de imágenes.
NOTA: Se usan siempre guantes en todo el procedimiento, pero hay que quitárselos para manipular el
teclado, pantalla, etc. del ordenador y los CDs. ¡Evitar las contaminaciones!.
Anexo IV: REACCIONES DE PCR
1- La Reacción en cadena de la Polimerasa se emplea como base de distintas técnicas moleculares, bien
sean los RAPD , la secuenciación , etc. En todo caso lo que varía es la fórmula específica del conjunto de
reactivos y los programas de amplificación empleados.
2- Por lo sensible de la reacción es necesario tomar todas las precauciones para evitar contaminaciones y por
supuesto emplear guantes en todo momento.
3- Debido a que la enzima se activa con el calor, es necesario realizar todo el trabajo en frío para evitar que
la enzima comience a actuar antes de colocar los tubos con la mezcla de reacción completa en el
termociclador. Una forma de hacerlo es colocar los tubos en una lámina de anime delgada colocada a su
vez sobre hielo.
4- Es recomendable agregar en primer lugar el agua doble destilada, a fin de que en la medida que se
agreguen el resto de componentes de la fórmula mantengan la concentración adecuada.
5- Es necesario garantizar una buena mezcla de todos los componentes de la reacción, especialmente en el
caso de la enzima Taq polimerasa, ya que ésta es pesada y se va al fondo del tubo.
6- Las fórmulas que se dan más abajo hacen referencia a las cantidades necesarias para una sola reacción en
tubo de PCR de 0,2 ml. Lo que se hace es preparar la cantidad necesaria para el número total de muestras
a amplificar en un tubo de 0,5 o 1,5 , agitar bien y luego repartir las alícuotas establecidas para cada tubo
de PCR (un tubo por muestra a amplificar). Finalmente se agrega la cantidad establecida del ADN de
cada muestra en su tubo de 0,2 correspondiente.
7- Si el termociclador no tiene tapa térmica, añadir a cada tubo una gota de aceite mineral (10 ul); tapar bien
los tubos (deben estar herméticamente cerrados), y colocarlos en el termociclador.
81

PCR (Amplificados para posterior secuenciación):
Fórmula de la reacción (ul):
Las fórmulas pueden modificarse; por ejemplo, con una Taq de muy alta calidad pudiese agregarse solo
0,25 ul en lugar de 1 ul; puede jugarse en general con todos los parámetros buscando la combinación que en
la práctica nos de los mejores resultados con nuestro grupo de estudio. En cualquier caso, la cantidad total
de mezcla se mantiene ajustando la cantidad de agua. La cantidad de ADN está en función de su
concentración y calidad, pudiendo agregarse más de 1ul si es necesario.
ndhF ITS trnL-F
10x buffer 5 5 5
MgCl2 (25 nM) 3 3 3
dNTP (10 mM) 4 2,5 4
ddH2O 31 32,5 31
Cebador 1 (10 mM) 2,5 2,5 2,5
Cebador 2 (10 mM) 2,5 2,5 2,5
Taq 1 1 1
__________________________________________
TOTAL: 49ul 49ul 49ul
ADN 1ul 1ul 1ul
Programas de PCR:
ndhF:
94ºC por 3 min al principio, seguido de
35 ciclos de lo siguiente:
92ºC - 1 min (desnaturalización)
45ºC - 1 min (anillamiento o apareamiento)
72ºC - 1,5 min (extensión)
entonces:
72ºC - 7 min
4ºC…(para mantener las muestras frias)
82

ITS:
94ºC por 5 min al principio, seguido de
39 ciclos de lo siguiente:
94ºC - 1 min
58ºC - 1 min
72ºC - 2 min
entonces:
72ºC - 8 min
4ºC…(para mantener las muestras frias)
trnL-F:
94ºC por 1 min al prin cipio, seguido de:
35 ciclos de lo siguiente:
92ºC - 1 min
52ºC - 1 min
72ºC - 2 min
entonces:
72ºC - 7 min
4ºC…(para mantener las muestras frias)
Anexo V: RAPD
- Fórmula de la reacción:
10x tampón de PCR……………. 1,0ul
MgCl12 50mM…………………. 0,2ul
dNTPs 10mM………………...…. 0,2ul
Cebador (28 -36 ng/ul)………….. .0,5ul
ddH2O…………………………… 6,9ul
Taq polimerasa…………………... 0,2ul
______
Total…………………………...... 9,0ul
ADN…………………………..... 1,0ul
- Programa de PCR:
1 ciclo 91 ºC 1 min
10 ciclos 91 ºC 20 sg
42 ºC 30 sg
71 ºC 1 min
40 ciclos 91 ºC 20 sg
42 ºC 15 sg
71 ºC 1 min
1 ciclo 71 ºC 3 min
83

Anexo VI: REACCIÓN DE SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA (PCR)
- Fórmula de la mezcla:
Tampón……………………………… 2ul
Mezcla de reactivos………………… 2ul
Cebador (10 uM)…………………… 1ul
ADN + H2O………………………… 5ul
____
Total………………………………... 10ul
- Programa de Secuenciación:
28 ciclos de:
95ºC - 30 sg.
50ºC - 15 sg.
60ºC - 4 min.
Purificación de productos secuenciados:
1- Utilice tubos Eppendorf de 1,5 ml, numérelos correlativamente.
2- Añada a cada tubo 1 ul acetato sódico 3 M (una gota en el lateral de cada tubo).
3- Añada 25 ul 95% etanol (lavando la gota previa de acetato sódico)
4- Transfiera el producto secuenciado a cada tubo y coloque los tubos en hielo (10 min., no más)
5- Centrifugue a 13.000 rpm, 20 min.
6- Pipetee el sobrenadante (desde el lado opuesto al del 'pellet') y descártelo.
7- Añada 100 ul 70% Etanol .
8- Agite en vort ex durante 1 sg (o menos).
9- Centrifugue a 13.000 rpm, 10 min.
10- Pipetee y elimine el sobrenadante (desde el lado opuesto al 'pellet').
11- Centrifugue al vacío durante 2–5 min. (a temperatura media).
84