Ver/Abrir - Repositorio Digital - Instituto Politécnico Nacional

Clase II.
En tubos de 50 ml, se colocaron 10 ml de DMEM 1% antibiótico-antimicótico con
colagenasa Tipo I o II al 0.3%. Los tubos se ajustaron en el Orbital Shaker a 37° C
a 250 rpm durante 4 horas, vigilando el avance en la digestión.
Al finalizar las 4 hrs, de digestión se centrifugaron a 300 x g durante 12 minutos.
Después de la centrifugación con una pipeta Pasteur se absorbió el sobrenadante
cuidando el botón celular y fue resuspendido golpeando gentilmente el tubo
agregando 5 ml de PBS sin Calcio ni Magnesio con 1% antibiótico-antimicótico.
Nuevamente se centrifugó a 300 x g por 12 minutos.
Con una pipeta Pasteur desechamos el sobrenadante y agregaremos 5 ml de
DMEM 10% SBF 1% antibiótico-antimicótico.
Para realizar el conteo celular se utilizó la técnica de azul tripano la cual se lleva a
cabo de la siguiente manera: se agregan 10 μl de suspensión celular y 10 μl del
colorante en una placa de 96 pozos homogeneizando la mezcla. Se agregan 10 μl
de la mezcla a cada uno de los pozos de la cámara de Neubauer. Contando las
células viables y no viables (las células no viables se tiñen con el colorante azul).
El cálculo de la población celular se obtiene de acuerdo a la siguiente fórmula:
(número de células)(Factor de Dilución[2 en este caso]) x (ml de la solución
celular) = x104.
Al finalizar el procedimiento de extracción las células se sembraron en cajas de
cultivo de tipo T (Falcon BD, Biosciences) de acuerdo con el siguiente criterio: de
250 – 500 mil células recuperadas en cajas T25 con 5 ml de medio; de 500 – 1.5
millones de células en cajas T75 con 10 ml de medio; mas de 1.5 millones de
21