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23<br />
INSTITUTO POLITÉCNICO<br />
NACIONAL<br />
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA<br />
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E<br />
INVESTIGACIÓN<br />
Efecto condroprotector de un menisco de<br />
bioingeniería en un modelo animal de osteoartritis.<br />
TESIS<br />
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:<br />
MAESTRÍA EN CIENCIAS<br />
CIENCIAS DE LA SALUD<br />
Área Investigación Clínica<br />
PRESENTA:<br />
Dr. Carlos Javier Pineda Villaseñor<br />
Director de Tesis: Dra. María Elena Sánchez Mendoza<br />
.<br />
1
III
Noviembre de 2011<br />
Este trabajo fue realizado en el <strong>Instituto</strong> <strong>Nacional</strong> de Rehabilitación (INR) de la<br />
Ciudad de México en donde colaboran el Bioterio, el laboratorio de Ingeniería de<br />
Tejidos, Patología, Ultrasonido y el Servicio de Ortopedia del Deporte y<br />
Artroscopía.y en las instalaciones del Centro de Enseñanza, Investigación y<br />
Extensión en Producción Ovina (CEIEPO) de la facultad de Medicina Veterinaria y<br />
Zootecnia de la UNAM, Tres Marías, estado de Morelos.<br />
Este proyecto contó con financiamiento por parte del Fondo Sectorial de<br />
Investigación en Salud y Seguridad Social SSA/IMSS/ISSSTE-CONACyT Registro<br />
115511.<br />
IV
INDICE<br />
Glosario ............................................................................................................... V<br />
Abreviaturas .................................................................................................... V<br />
Términos ......................................................................................................... V<br />
Relación de figuras y tablas ............................................................................... VIII<br />
Resumen ............................................................................................................. IX<br />
Abstract ............................................................................................................... XI<br />
1. Introducción ..................................................................................................... 1<br />
2. Antecedentes .................................................................................................. 4<br />
2.1 Patogénesis del daño articular en la osteoartritis ..................................... 6<br />
2.2 Anatomía y fisiología de los meniscos ..................................................... 6<br />
2.3 Morfología de los meniscos ..................................................................... 9<br />
2.4 Trasplante de menisco ............................................................................ 10<br />
2.5 Ingeniería de tejidos ................................................................................ 11<br />
3. Justificación .................................................................................................... 13<br />
4. Hipótesis......................................................................................................... 15<br />
5. Objetivos ........................................................................................................ 16<br />
5.1. Objetivo General .................................................................................... 16<br />
5.2. Objetivos Particulares ............................................................................ 16<br />
6. Material y Métodos ......................................................................................... 18<br />
6.1 Tipo de estudio ....................................................................................... 18<br />
6.2 Variables de estudio ............................................................................... 18<br />
6.3 Protocolo quirúrgico y manejo de las especies 19<br />
6.4 Métodos de laboratorio 20<br />
6.4.1 Cultivo de células de menisco 20<br />
6.4.2 Pasaje celular de menisco 22<br />
6.4.3 Construcción del menisco de bioingeniería 22<br />
6.5 Procedimiento anestésico 22<br />
6.6 Procedimientos quirúrgicos 23<br />
V
6.6.1 Técnica quirúrgica del trasplante de menisco 23<br />
6.7 Histología 25<br />
6.8 Ultrasonido 25<br />
6.9 Microscopía electrónica 26<br />
6.10 Cálculo tamaño muestral 26<br />
6.11 Análisis estadístico 27<br />
7. Resultados 28<br />
7.1 Población de estudio .................................................................................... 28<br />
7.2 Microscopía electrónica ................................................................................ 28<br />
7.3 Evaluación cartílago articular ....................................................................... 29<br />
7.3.1 Evaluación macroscópica .......................................................................... 29<br />
7.3.2 Evaluación histológica ............................................................................... 31<br />
7.4 Evaluación ultrasonográfica ......................................................................... 33<br />
7.5 Eventos adversos ......................................................................................... 34<br />
8. Discusión ........................................................................................................ 35<br />
9. Conclusiones .................................................................................................. 39<br />
10. Perspectivas ................................................................................................. 40<br />
11. Bibliografía ................................................................................................... 42<br />
12. Anexos ......................................................................................................... 49<br />
VI
I GLOSARIO<br />
I.I ABREVIATURAS<br />
• CEIEPO Centro de Enseñanza, Investigación y Extensión en<br />
Producción Ovina de la facultad de Medicina<br />
Veterinaria y Zootecnia de la UNAM<br />
• DE Desviación Estándar<br />
• DNA Ácido desoxiribonucleico<br />
• DMEM Medio de cultivo [Dulbecos Modified Eagle Medium]<br />
• IL1 Interleucina 1<br />
• INR <strong>Instituto</strong> <strong>Nacional</strong> de Rehabilitación<br />
• HE Hematoxicilina y eosina<br />
• LCA Ligamento cruzado anterior<br />
• nm Nanómetro<br />
• OA Osteoartritis<br />
• OARSI Osteoarthritis research society international<br />
• PACS Picture Archiving and Communication System<br />
• PGA Ácido poliglicólico<br />
• US Ultrasonido musculoesquelético<br />
• VMO Vasto medial oblicuo<br />
I.2 TÉRMINOS<br />
• Artrofibrosis: presencia de material fibrocicactricial distribuido en las<br />
estructuras articulares, resultado de una intervención quirúrgica.<br />
• Babilla: En los cuadrúpedos, conjunto de músculos y tendones que articulan<br />
el fémur con la tibia y la rótula.<br />
• Biomecánica: Ciencia que investiga las fuerzas internas y externas que<br />
actúan sobre los cuerpos vivientes, considerando las propiedades y<br />
VII
supuestos mecánicos del aparato locomotor, que a su vez depende<br />
funcionalmente de las condiciones biológicas de los mismos.<br />
• Etiología: Estudio de las causas de las enfermedades.<br />
• Incidencia: La incidencia es el número de casos nuevos de una<br />
enfermedad en una población determinada y en un periodo<br />
determinado.<br />
• Menisco: Estructuras fibrocartilaginosas en forma de letra “C” que se<br />
encuentran en la rodilla y tienen funciones de estabilidad, distribución de<br />
energía de la articulación. Normalmente existen dos meniscos uno medial y<br />
otro lateral en cada rodilla.<br />
• Menisco de Bioingeniería: Constructo formado por un polímero de ácido<br />
PGA y recubierto con una malla bioabsorbible de celulosa y fibrocondrocitos<br />
autólogos de menisco.<br />
• Meniscectomía: Evento quirúrgico en donde se reseca quirúrgicamente la<br />
totalidad del menisco.<br />
• Meniscectomía artroscópica: Intervención quirúrgica que consiste en la<br />
introducción por punción dentro de la articulación de un sistema de lentes<br />
conectados a una pantalla que permite la visualización de las estructuras<br />
intraarticulares. Por otro acceso se introducen los instrumentos que<br />
permiten la extirpación y regularización de los meniscos.<br />
• Osteoartritis (OA): También conocida como artrosis u osteoartrosis; es una<br />
enfermedad articular crónica, ocasionada básicamente por el deterioro del<br />
cartílago hialino e hiperreactividad de los osteoblastos del hueso<br />
subcondral. A pesar de que es considerada una enfermedad articular<br />
VIII
degenerativa, es debida a un proceso dinámico que refleja un desbalance<br />
entre la formación y la destrucción del cartílago articular, asociado a una<br />
hiperplasia del hueso subcondral.<br />
• Osteoblastos: son células del hueso, sintetizadoras de la matriz ósea<br />
por lo que están involucradas en el desarrollo y el crecimiento de los<br />
huesos.<br />
• Trasplante de Menisco: Traslado de la estructura fibrocartilaginosa en forma<br />
de “C” del compartimento lateral de la rodilla a uno deficiente en especies<br />
homólogas.<br />
• Ultrasonido: Método de diagnóstico por imágenes que emplea haces<br />
sonoros cuya frecuencia se ubica por arriba del espectro audible por el oído<br />
humano (> 20,00 Hz) y evalúa las estructuras musculoesqueléticas de<br />
acuerdo a su particular impedancia acústica.<br />
IX
II. RELACIÓN DE FIGURAS Y TABLAS<br />
Tabla 1. Clasificación de Kelly para la evaluación de cambios macroscópicos del<br />
cartílago (Pág. 49).<br />
Tabla 2. Clasificación de OARSI de osteofitos (Pág. 49).<br />
Tabla 3. Calificación histológica modificada de Mankin (Pág. 50).<br />
Tabla 4. Variables dependientes (Pág. 51).<br />
Tabla 5. Flujograma metodológico (Pág. 52).<br />
Tabla 6. Descripción de los sujetos de estudio (Pág. 53).<br />
Tabla 7. Microscopía Electrónica (Pág. 53).<br />
Tabla 8. Evaluación macroscópica cartílago y osteofitos (OARSI) (Pág. 54).<br />
Tabla 9. Evaluación ultrasonográfica (Pág. 55 ).<br />
Figura 1. Evaluación por Microscopía Electrónica (Pág. 29).<br />
Figura 2. Evaluación Macroscópica del cartílago articular (Pág. 30).<br />
Figura 3. Evaluación histológica del daño del cartílago articular (Pág. 32).<br />
Gráfica 1. Evaluación histológica del daño del cartílago articular (Pág. 33).<br />
X
III. RESUMEN<br />
Introducción. La meniscectomía es un factor conocido de riesgo para el<br />
desarrollo de osteoartritis (OA) de la rodilla. En un esfuerzo por restablecer o<br />
preservar la anatomía y función normal de la rodilla, se han empleado trasplantes<br />
de menisco que mejoran la sintomatología de los pacientes, pero no han retrasado<br />
la aparición de OA. La meniscectomía es el estándar para producir OA de la rodilla<br />
en modelos animales. La ingeniería de tejidos es una estrategia que permite<br />
formar tejido autólogo para restituir funciones biológicas perdidas. Objetivo. El<br />
objetivo central de este trabajo fue construir un tejido similar al menisco utilizando<br />
un polímero biodegragadable sembrado con fibrocondrocitos autólogos, que<br />
reemplace al menisco nativo y prevenga el desarrollo de OA. Material y métodos<br />
Se intervinieron quirúrgicamente 10 ovejas Sufolk, mayores de 6 años. Se<br />
asignaron por sorteo simple a 4 grupos: las rodillas no operadas fueron tomadas<br />
como control (grupo 1), el grupo de meniscectomía (grupo 2), un grupo de<br />
trasplante de menisco (grupo 3), un grupo de menisco de bioingeniería (grupo 4).<br />
Resultados. Los meniscos de bioingeniería presentaron mejores características<br />
estructurales en la microscopía electrónica de transmisión que los trasplantes de<br />
menisco y la meniscectomía. Encontramos fibrocondrocitos productores de matriz<br />
extracelular y fibras de colágena inmadura en los meniscos de bioingenierías a<br />
diferencia de los otros grupos experimentales.<br />
Por otro lado, en ningún grupo experimental se demostró efecto condroprotector.<br />
Se corroboró la permanencia en posición anatómica los meniscos implantados y<br />
XI
trasplantados por US y evaluación directa. Dos sujetos de investigación<br />
presentaron artrofibrosis, uno en el grupo de meniscectomía y otro del grupo de<br />
menisco de bioingeniería. Conclusiones, se demostró la capacidad de formar<br />
tejido similar al menisco usando una plataforma de fibrocondrocitos autólogos y<br />
una matriz sintética biodegradable. Sin embargo, no previno el desarrollo de OA.<br />
Palabras Clave: Osteoartritis, menisco de bioingeniería, condroprotección,<br />
trasplante menisco.<br />
XII
IV. ABSTRACT<br />
Background. Meniscus injuries represent the most common cause of arthroscopic<br />
surgery. Meniscectomy is a well-known risk factor for developing osteoarthritis<br />
(OA) of the knee. Meniscus transplants improve patient’s symptoms, but up to day,<br />
there is no evidence for delay the onset of knee OA. The main objective of this<br />
work is to generate a bioengineered meniscus implant, based on cell cultures to<br />
prevent the development of knee OA and to compare the efficacy and safety of<br />
different surgical procedures (bioengineered meniscus implant and autologous<br />
meniscus transplant) through the assessment of OA lesions, in a Sufolk sheep<br />
model. Main results, suggest that there is no solid evidence for the prevention of<br />
Knee OA with any of the procedures evaluated (meniscus transplant,<br />
bioengineering meniscus implant). However, the tissue found in bioengineered<br />
implants showed better ultrastructural features than that in autologous meniscus<br />
transplants. Minor complications in different surgical techniques such as<br />
arthrofibrosis, effusion and synovial hypertrophy were present, suggesting that<br />
there is a need to refine the surgical technique and peri-and postoperative<br />
management. Conclusion. There was no evidence of condroprotective effect of<br />
any of the surgical procederes evaluated in this study. We were able to recover<br />
meniscal tissue from our bioengineered implant.<br />
XIII
1. INTRODUCCIÓN<br />
Los meniscos son estructuras fibrocartilaginosas que juegan un importante papel<br />
en la transmisión de cargas, estabilidad de la articulación y protección del cartílago<br />
articular, también conocido como cartílago hialino. Las lesiones a los meniscos<br />
frecuentemente son sintomáticas y resultan en una cirugía artroscópica para su<br />
reparación.<br />
Hoy en día, la cirugía conservadora dirigida a preservar la mayor cantidad menisco<br />
es la conducta quirúrgica a seguir ya que se ha demostrado que la remoción de<br />
entre el 16 y el 34% del menisco incrementa la carga biomecánica sobre el<br />
cartílago articular, hecho que se correlaciona con la aparición y progresión de<br />
cambios de OA (1-2). Sin embargo, en algunas circunstancias, la meniscectomía<br />
total es la única opción debido a la complejidad y gravedad de las lesiones<br />
meniscales. Por otro lado, la meniscectomía es un factor conocido de riesgo para<br />
el desarrollo de osteoartritis (OA) de la rodilla (1-9).<br />
En un esfuerzo de restablecer la anatomía y fisiología normales de la rodilla (10-<br />
17) y prevenir el subsecuente daño degenerativo al cartílago articular, se han<br />
empleado diferentes estrategias quirúrgicas, una de ellas es el trasplante de<br />
menisco de cadáver técnica con la que se consigue mejorar la sintomatología de<br />
los pacientes hasta en un 70% de los casos, sin embargo, este procedimiento no<br />
ha demostrado prevenir el desarrollo de la OA (18-23). En modelos animales, la<br />
meniscectomía es el estándar para producir OA de la rodilla experimentalmente.<br />
La OA, también conocida como artrosis, es una enfermedad articular crónica,<br />
ocasionada básicamente por el deterioro del cartílago hialino e hiperreactividad de<br />
1
los osteoblastos del hueso subcondral. A pesar de que es considerada una<br />
enfermedad de tipo degenerativo relacionada con la mayor edad del individuo, es<br />
debida a un proceso patológico dinámico que resulta de un desbalance entre la<br />
formación y la destrucción del cartílago articular, asociado a un intento de<br />
reparación manifestado por osificación endocondral e hiperplasia del hueso<br />
subcondral.<br />
En diferentes modelos animales, en los que se han trasplantando meniscos<br />
homólogos, NO se ha logrado demostrar que la maniobra tenga un papel<br />
condroprotector, específicamente en la prevención del daño al cartílago articular<br />
que desemboca en el desarrollo de OA (24-30).<br />
Objetivo General:<br />
El objetivo central de este trabajo fue desarrollar un menisco con ingeniería de<br />
tejidos que sea eficaz y seguro para prevenir el desarrollo de la OA en un modelo<br />
animal.<br />
Para ello, el estudio contó con 4 grupos experimentales:<br />
Grupo 1. Control (Rodillas no operadas)<br />
Grupo 2. Meniscectomía<br />
Grupo 3. Trasplante de menisco.<br />
Grupo 4. Menisco de Bioingeniería.<br />
Los desenlaces a comparar para eficacia fueron: presencia de alteraciones<br />
osteocartilaginosas propias de la OA evaluadas tanto macroscópicamente, como<br />
microscópicamente y calidad de tejido implantado evaluado por microscopía<br />
electrónica.<br />
2
Con respecto a seguridad los desenlaces a comparar fueron: la permanencia en<br />
posición anatómica del menisco de bioingeniería y el desarrollo de eventos<br />
adversos.<br />
3
2. ANTECEDENTES<br />
Las lesiones de los meniscos se presentan mas frecuentemente en pacientes<br />
jóvenes dentro de rangos de la segunda a la cuarta década de la vida.<br />
Las lesiones meniscales están entre las lesiones de la rodilla más comunes. La<br />
incidencia de lesiones meniscales agudas es 61/100,000. En pacientes sobre 65<br />
años, hay un 60% de incidencia de rupturas meniscales degenerativas. Las<br />
lesiones meniscales son mas frecuentes entre el género masculino que entre el<br />
femenino, con una frecuencia de 2.5:1, El pico de edad para el género masculino<br />
se presenta entre los 31 y 40 años de edad y para el femenino entre los 11 y 20<br />
años. Los procedimientos quirúrgicos sobre los meniscos se realizan sobre un<br />
estimado de 850,000 pacientes por año (1).<br />
Las lesiones meniscales son 2.5 veces más frecuentes que las lesiones del<br />
ligamento cruzado anterior (LCA). En Suecia, se realizaron 20,000 cirugías de<br />
menisco que representan ocho veces más procedimientos quirúrgicos que las<br />
reconstrucciones del LCA (1). El estado del menisco es un determinante<br />
fundamental de la función y de riesgo de OA a mediano plazo (10 años) después<br />
de una cirugía de LCA (2) .<br />
Estas estimaciones de incidencia poblacional, sugieren un riesgo atribuible de<br />
lesiones meniscales sintomáticas que requiere cirugía de por lo menos el 15%, en<br />
pacientes con un rango de edad de 10 a 64 años, a las cuales se debe agregar las<br />
lesiones meniscales que no causan síntomas (1,2).<br />
4
En población joven, la lesión a los meniscos, usualmente es el resultado de<br />
trauma o lesiones deportivas, y constituye una de las principales indicaciones de<br />
cirugía artroscópica (1-3). Los meniscos son muy importantes en las funciones de<br />
absorción del impacto biomecánico, lubricación articular y de proveer funciones<br />
estabilizadoras de la rodilla (4-6). La meniscectomía es uno de los determinantes<br />
más importantes de la función a largo plazo y factor de riesgo para el desarrollo de<br />
OA de la rodilla. El cirujano ortopedista aborda las lesiones del menisco con el<br />
interés de preservar la mayor cantidad de tejido posible, ya que su ausencia se<br />
asocia directamente con el desarrollo de OA de la rodilla (7, 8).<br />
Se ha demostrado un riesgo relativo de 6 a 8 veces para el desarrollo de OA<br />
radiográfica, en pacientes con meniscectomía, comparados a controles no<br />
operados. También se ha descrito mayor asociación de OA en pacientes con<br />
meniscectomías del compartimiento lateral más que del medial, y mayor<br />
asociación de OA en meniscectomía totales que en meniscectomías parciales, y<br />
se considera un factor de riesgo más importante en la génesis de OA de rodilla<br />
que las causas hereditarias (9-10). Con una meniscectomía parcial, hasta el 84%<br />
de los pacientes mostraran evidencia radiográfica de deterioro de la articulación de<br />
la rodilla a través del tiempo (11-12).<br />
Tradicionalmente, la OA se ha reconocido como una artropatía no inflamatoria, de<br />
carácter degenerativo, pero con los nuevos métodos de estudio y evaluación, se<br />
ha demostrado que algunas vías de la cascada de la inflamación están activadas<br />
en el líquido sinovial. Algunos de los factores implicados en su génesis son<br />
mecánicos como la obesidad, lesiones meniscales, y sobrecarga biomecánica.<br />
5
Recientes estudios mencionan la importancia de otros factores como la<br />
inestabilidad articular, debilidad muscular y síndromes de mala alineación.<br />
2.1 Patogénesis del daño articular en la osteoartritis.<br />
Los cambios en el cartílago articular en la OA, incluyen una degradación<br />
proteolítica de la matriz extracelular, asociada al aumento en la síntesis de<br />
algunos componentes de la matriz por los condrocitos. Estos eventos se reflejan<br />
por cambios morfológicos tempranos del cartílago como: fibrilación de la superficie<br />
condral, formación de fisuras y disminución del espesor del cartílago articular. Los<br />
cambios óseos de la OA son: formación de osteofitos en el margen articular,<br />
aumento del aporte vascular y endurecimiento del hueso subcondral.<br />
Las citocinas pro-inflamatorias, como la Interleucina 1 (IL-1), la colagenasa-1<br />
(MMP-1), la estromelisina-1 (MMP-3) y la gelatinasa que son enzimas<br />
proteolíticas encargadas de la degradación de la matriz extracelular en la OA y<br />
otros factores como la plasmina, catepsina, y el óxido nítrico son liberados desde<br />
el cartílago, el tejido sinovial y el hueso, lo que conduce a un proceso inflamatorio<br />
de los condrocitos y del tejido meniscal.<br />
2.2.Anatomía y fisiología de los meniscos<br />
Es esencial un conocimiento de la anatomía de los meniscos, su bioquímica, su<br />
biomecánica y sus funciones para comprender su patología, su tratamiento y las<br />
técnicas de la cirugía de reparación meniscal (13).<br />
En la rodilla hay dos meniscos, uno medial y otro lateral, cada uno con su propia<br />
morfología y función. Las propiedades fisiológicas, bioquímicas, biomecánicas,<br />
6
ultraestructurales de los meniscos han sido estudiadas por diversos autores tanto<br />
en situaciones de normalidad como de patología y de meniscectomía (13-15).<br />
El menisco interno o medial cubre aproximadamente el 30% de la meseta tibial<br />
medial y tiene forma oval. El menisco externo o lateral, recubre aproximadamente<br />
un 50% del platillo tibial lateral y tiene una forma más circular. Los cuernos anterior<br />
y posterior del menisco medial se encuentran más separados que en el menisco<br />
lateral. La zona periférica del menisco interno o medial se inserta anteriormente al<br />
platillo tibial mediante los ligamentos menisco-tibiales o coronarios, centralmente a<br />
la cápsula articular y al ligamento lateral interno, y posteriormente a la cápsula<br />
articular. No hay inserciones del menisco externo al ligamento lateral, y el tendón<br />
poplíteo interrumpe su inserción capsular posterior. El menisco interno tiene una<br />
inserción más firme que el externo y menor movilidad en sentido anteroposterior,<br />
con una translación de hasta 5 mm. durante la flexión de la rodilla, mientras que el<br />
menisco externo puede desplazarse hasta 11 mm.<br />
La irrigación del menisco es importante en la cicatrización del trasplante y para<br />
aportar los nutrientes necesarios para la repoblación del injerto con<br />
fibrocondrocitos. El 10-30% de la periferia de los meniscos recibe su nutrición a<br />
través de una red capilar premeniscal que se origina a lo largo de la periferia del<br />
menisco desde las arterias geniculadas medial, lateral y media. El tercio central<br />
avascular del menisco adulto recibe su aporte de nutrientes por difusión desde el<br />
líquido sinovial. Esto significa que la porción central tiene una capacidad limitada<br />
de cicatrización, pero la zona periférica es capaz de una respuesta vascular.<br />
También existen canales vasculares que se extienden a la zona avascular,<br />
7
preparando al cartílago meniscal para actuar como un andamio para la<br />
repoblación por fibrocondrocitos.<br />
Los meniscos intervienen en la estabilidad articular, la absorción de impactos y la<br />
lubricación de la articulación. Ayudan a estabilizar la rodilla profundizando la<br />
meseta tibial de manera que el fémur y la tibia conserven una mayor superficie de<br />
contacto y una posición relativa adecuada a través de todo el arco de movilidad de<br />
la articulación. La carga del peso provoca que el menisco comprima el líquido<br />
sinovial hacia el interior del cartílago articular, disminuyendo las fuerzas de la<br />
rodilla hasta un coeficiente de fricción de 0,001. La importancia de la función<br />
estabilizadora de los meniscos es más patente en la rodilla sin LCA, porque en ella<br />
se produce un aumento significativo en la translación de los cóndilos femorales<br />
durante el movimiento de la rodilla después de la meniscectomía medial,<br />
especialmente tras la resección del cuerno posterior.<br />
La transmisión de cargas y la absorción de fuerzas de choque son dos funciones<br />
mecánicas importantes de los meniscos y que intervienen en la prevención del<br />
desgaste o degeneración del cartílago articular. Las propiedades viscoelásticas del<br />
menisco producen tensión que resiste el desplazamiento radial convirtiendo las<br />
cargas axiales en stress tensil. En conjunto, los meniscos transmiten 45-60% de la<br />
carga compresiva (más en la parte medial que en la lateral), y esta puede<br />
aumentar hasta 95% al flexionar 90º la rodilla, centrándose la mayoría de la carga<br />
en los cuernos posteriores a 70º de flexión. Las fuerzas de contacto aumentan<br />
enormemente tras la meniscectomía, y la capacidad de absorción de impactos de<br />
la rodilla puede reducirse hasta en un 20%.<br />
8
Tanto la meniscectomía parcial como la total, conducen a una disminución del<br />
área de contacto con el consecuente aumento de los picos y la media de las<br />
fuerzas de contacto. Radin demostró lo anterior a través de estudios fotoelásticos;<br />
Baratz utilizando película sensible a la presión y Kurosawa empleando técnicas de<br />
moldeo. Todos ellos demostraron que el hecho de concentrar una fuerza<br />
biomecánica de mayor magnitud sobre un área más reducida de cartílago hialino<br />
conlleva un desgaste del cartílago articular y en consecuencia al desarrollo de la<br />
OA (5).<br />
2.3 Morfología de los meniscos.<br />
Los meniscos son estructuras fibrocartilaginosas en forma de “C”, interpuestas<br />
entre los cóndilos del fémur y tibia. Realizan importantes funciones en la<br />
articulación de la rodilla dadas sus propiedades viscoelásticas: se mueven y<br />
distribuyen la carga al pasar de posición de flexión a extensión con carga,<br />
absorben el impacto al funcionar como un medio bifásico que al ser comprimido<br />
expulsa el agua y al relajarse es afín por ella, y favorecen la estabilidad articular<br />
(13-15).<br />
Histológicamente, el menisco esta compuesto principalmente por agua y un<br />
entramado de fibras de colágena y células, dispuestas en una matriz de<br />
proteoglicanos y glicoproteínas.<br />
Las células del menisco son responsables de sintetizar y mantener la matriz<br />
extracelular. Se han descrito dos formas de células dentro del menisco: una<br />
fusiforme localizada en la superficie del menisco, y una ovoidea o poligonal<br />
dispuesta en el resto del mismo. A esta última se le ha llamado fibrocondrocito por<br />
9
su apariencia, y por la capacidad de formar una matriz extracelular fibrosa (16).<br />
Desde 1936, se sentaron las bases de la reparación meniscal: para que haya<br />
cicatrización debe haber comunicación con el aporte sanguíneo periférico y una<br />
respuesta reparadora adecuada. Al examinar un menisco lesionado para su<br />
potencial reparación, frecuentemente se clasifica de acuerdo a la localización de la<br />
lesión y su “apariencia vascular”, se denominan lesiones periféricas a aquellas<br />
lesiones ubicadas en la zona roja-roja; centrales a aquellas localizadas en la zona<br />
blanca-blanca; y roja-blanca en la transición periferia-centro. Teóricamente, las<br />
lesiones en la región roja-roja tienen suficiente vascularidad para sanar con un<br />
excelente pronóstico, y las lesiones de la región blanca-blanca no sanan por la<br />
ausencia de vasos sanguíneos (17).<br />
2.4 Trasplante de menisco.<br />
Una vez resecado un menisco, se han utilizado diferentes estrategias terapéuticas<br />
en los pacientes sintomáticos (síndrome post-meniscectomía): implantes de<br />
colágena, tejido interpuesto (submucosa intestinal, tejido adiposo, tendones, etc.),<br />
la técnica más difundida es el trasplante homólogo de menisco. El trasplante de<br />
menisco se ha utilizado en procedimientos de reconstrucción y salvamento (18,<br />
19). Ha demostrado ofrecer mejoría clínica en cuanto a sintomatología y función<br />
(20-23). Existen diferentes tipos de trasplantes; frescos, frescos congelados,<br />
congelados y desecados, criopreservados. La sobrevida clínica de los meniscos a<br />
los 10 años para los meniscos mediales y laterales es de 74.2% y de 69.8%<br />
respectivamente. Las técnicas de congelamiento profundo y congelamiento<br />
desecación han mostrado que destruyen las células viables y desnaturalizan<br />
10
antígenos de histocompatibilidad (21-23).<br />
Se han superado algunos cuestionamientos iniciales como la cicatrización a la<br />
cápsula y la repoblación del injerto. Sin embargo, durante artroscopias de revisión<br />
se ha puesto de manifiesto una rápida degeneración del menisco y por otro lado,<br />
existe evidencia de una menor capacidad biomecánica del menisco trasplantado.<br />
No existe evidencia que el trasplante meniscal detenga en alguna medida el<br />
desarrollo de OA de la rodilla acorde con el desenlace a largo plazo mostrado en<br />
diferentes estudios (24-30,42).<br />
2.5 Ingeniería de tejidos.<br />
La ingeniería de tejidos busca reemplazar las funciones biológicas y estructura<br />
perdidas de los tejidos del cuerpo. La ingeniería de tejidos aplicada al cartílago<br />
articular es un campo científico emergente con diferentes perspectivas clínicas<br />
(31).<br />
Desde que los condrocitos fueron aislados y mantenidos en cultivo a finales de<br />
1960, la tecnología para expansión condrocítica, para la medición de la<br />
proliferación y de la actividad biosintética han progresado. El entendimiento de<br />
cómo algunos factores ambientales influyen en la expresión fenotípica de los<br />
condorcitos también ha avanzado. Los cultivos celulares de cartílago, son<br />
relativamente sencillos de aislar y mantener, ya que son de tan solo una estirpe<br />
celular.<br />
Los cultivos celulares de condrocitos, han sido aprobados para el uso<br />
clínico en procedimientos de reparación de cartílago articular (32).<br />
El ácido poliglicólico (PGA) un polímero biodegradable, se ha utilizado en<br />
diferentes protocolos generando constructos con células de menisco (33), sin<br />
11
embargo no se ha probado su eficacia en modelos in vivo de OA. La celulosa<br />
oxidada regenerada, se absorbe del lugar de implante dando lugar al crecimiento<br />
celular y generación de matriz; la tasa de absorción depende de varios factores,<br />
incluyendo la cantidad utilizada y la zona de implantación. En este proyecto de<br />
investigación se pretende generar un sustituto de menisco utilizando un polímero<br />
comercial de PGA y celulosa oxidada (BIOFELT®, Concordia fibers) como<br />
andamio interno para las células, aunado a una malla de celulosa biodegradable<br />
(PROCEED® Surgical Mesh, Ethicon) para proporcionar sostén y fijación a la<br />
superficie articular.<br />
12
3. JUSTIFICACION<br />
La lesión a los meniscos es la principal indicación de cirugía artroscópica. La<br />
ausencia de menisco es un factor de riesgo bien identificado de OA de la rodilla y<br />
en este contexto, el trasplante de menisco es un tratamiento ampliamente<br />
difundido que no ha probado retrasar el desarrollo de la OA.<br />
En modelos animales y mediante el empleo de estrategias de ingeniería de tejidos,<br />
se ha tenido éxito en la formación de un tejido similar al del menisco, pero no se<br />
ha demostrado la prevención de OA en tales modelos.<br />
En el <strong>Instituto</strong> <strong>Nacional</strong> de Rehabilitación durante el periodo 2002-2005, de un total<br />
de 1309 pacientes sometidos a artroscopía de rodilla, se encontraron 355 con<br />
lesiones meniscales y 804 pacientes con lesiones condrales (43).<br />
Los avances tecnológicos aplicados a la cirugía ortopédica tienen como objetivo<br />
disminuir la discapacidad de estas enfermedades, retrasar su aparición, optimizar<br />
la actividad física realizada por los pacientes y mejorar la calidad de vida. Varios<br />
intentos para limitar los daños ocasionados por lesiones a las estructuras<br />
articulares y las enfermedades degenerativas de las articulaciones, se han<br />
enfocado en las técnicas de reparación del cartílago articular y del fibrocartílago.<br />
En este proyecto de investigación se pretende generar un sustituto de menisco<br />
utilizando un polímero comercial de PGA y celulosa oxidada (BIOFELT®,<br />
Concordia fibers) como andamio interno para las células, aunado a una malla de<br />
celulosa biodegradable (PROCEED® Surgical Mesh, Ethicon) para proporcionar<br />
13
sostén y fijación a la superficie articular y valorar su efecto condroprotector en un<br />
modelo animal de osteoartritis .<br />
14
4. HIPOTESIS<br />
¿Es posible desarrollar un neo-menisco con fibrocondrocitos autólogos y<br />
polímeros biodegradables que sea eficaz y seguro en la prevención de la OA en<br />
un modelo animal?<br />
Un menisco de bioingeniería desarrollado con fibrocondrocitos autólogos en una<br />
matriz biodegradable presentará un daño cartilaginoso menor (10 puntos) que la<br />
meniscectomía de acuerdo a la calificación histológica de OA de Mankin<br />
modificada por Little en un modelo ovino de osteoartritis.<br />
15
5. OBJETIVOS<br />
5.1. OBJETIVO GENERAL:<br />
Desarrollar un menisco con ingeniería de tejidos que sea eficaz y seguro para la<br />
prevención de la OA de rodilla en un modelo animal.<br />
5.2. OBJETIVOS PARTICULARES:<br />
1. Construir un menisco de bioingeniería con fibrocondrocitos autólogos<br />
embebidos en una matriz biodegradable en forma de menisco medial ovino.<br />
2. Implantar un menisco de bioingeniería en la localización anatómica del<br />
menisco medial en un modelo ovino de OA.<br />
3. Trasplantar un menisco homólogo fresco congelado en la localización<br />
anatómica del menisco medial en un modelo ovino de OA.<br />
4. Comparar el grado de daño al cartílago articular macroscópicamente entre<br />
los diferentes grupos experimentales.<br />
5. Comparar el grado de cambios histomorfológicos del cartílago articular entre<br />
los diferentes grupos experimentales.<br />
6. Comparar el tamaño de las fibras de colágena medidas por microscopía<br />
electrónica de transmisión en el tejido cicatricial del grupo de<br />
meniscectomía, el menisco de bioingeniería y trasplante de menisco al<br />
momento del sacrificio.<br />
16
7. Corroborar la localización anatómica de los meniscos, de los implantes y<br />
trasplantes por técnicas de ultrasonido (US) y a través de la evaluación<br />
macroscópica directa.<br />
17
6. MATERIAL Y METODOS<br />
6.1. Tipo de Estudio.<br />
Experimental.<br />
6.2 Variables de estudio:<br />
Las variables dependientes se muestran en la tabla 4.<br />
Eficacia:<br />
Evaluación Macroscópica de Kelly (Cualitativa ordinal 0-4) (tabla 1)<br />
Evaluación Macroscópica de OARSI de osteofitos (Cualitativa ordinal de 0-3)<br />
(tabla 2)<br />
Evaluación histológica de OA modificada de Mankin (Escala Cuantitativa continua<br />
0-27 puntos posibles) (Tabla 3)<br />
Promedio de ancho de fibras de colágena en nm (Escala cuantitativa continua)<br />
Presencia/ausencia de fibrocondrocitos productores de matriz extracelular por<br />
microscopía electrónica (Evaluación cualitativa dicotómica).<br />
Seguridad<br />
Evaluación de la localización anatómica de los implantes y trasplantes.<br />
Localización por US (cualitativa dicotómica)<br />
Localización en observación directa (cualitativa dicotómica)<br />
Variable independiente:<br />
Los cuatro grupos experimentales constituyen la variables independiente, estos<br />
son: grupo control de rodillas no operadas (grupo 1), grupo de meniscectomía<br />
18
(grupo 2); grupo de trasplante de menisco (grupo 3), el grupo de menisco de<br />
bioingeniería (grupo 4).<br />
6.3 Protocolo quirúrgico y manejo de las especies.<br />
Se intervinieron quirúrgicamente 10 ovejas, mayores de 6 años. Se asignaron por<br />
sorteo simple a 4 grupos: las rodillas no operadas fueron tomadas como control<br />
(grupo 1), el grupo de meniscectomía (grupo 2), un grupo de trasplante de<br />
menisco (grupo 3), un grupo de menisco de bioingeniería (grupo 4).<br />
Acorde con el flujograma metodológico (tabla 5), se realizó la meniscectomía<br />
medial de la rodilla derecha de los 3 grupos de tratamiento. Los meniscos del<br />
grupo de meniscectomía se mantuvieron en congelación a -80 grados<br />
centígrados, desde su obtención hasta 1 hr. antes del implante. Los meniscos del<br />
grupo 3 (trasplante de menisco) se emplearon para realizar las pruebas de<br />
adhesión celular al implante. Los meniscos del grupo 3, fueron procesados para<br />
retirar la matriz extracelular y realizar el cultivo tisular y constructo.<br />
A los 2 meses de la meniscectomía se llevó a cabo tanto el trasplante de menisco<br />
como el implante del menisco de bioingeniería.<br />
A los 6 meses de la meniscectomía se sacrificaron los sujetos de estudio con una<br />
sobredosis de pentobarbital acorde con la normas bioéticas establecidas y la<br />
norma oficial mexicana NOM-062-ZOO-1999 (46). Se tomaron muestras de la<br />
superficie osteocartilaginosa femoral y tibial de las rodillas operadas así como de<br />
las no operadas para su estudio.<br />
Se evaluaron clínicamente los sujetos de estudio por veterinarios experimentados<br />
19
en manejo de grandes especies de la facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia<br />
de la UNAM en sus instalaciones de Tres Marías, estado de Morelos Centro de<br />
Enseñanza, Investigación y Extensión en Producción Ovina (CEIEPO). Los<br />
hallazgos se anotaron en el expediente clínico. En caso de presentar datos de<br />
infección después de alguna cirugía, se inició el tratamiento médico con<br />
antibióticos y analgésico y/o desbridamiento quirúrgico. Si algún sujeto de estudio<br />
presentaba dolor no tratable o incapacidad física grave que comprometiera su<br />
bienestar, fue sacrificado.<br />
Todos los procedimientos involucrados en el cuidado y manejo de los animales<br />
fueron efectuados de acuerdo a los requerimientos que en la materia determina la<br />
NOM-062-ZOO-1999 Especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso<br />
de animales de laboratorio<br />
6.4 Métodos de laboratorio<br />
6.4.1 Cultivo de células de menisco.<br />
Se colocaron las muestras de menisco en tubos con 15 ml de PBS sin calcio ni<br />
magnesio, suplementado con antibiótico-antimicótico y se mantuvieron en<br />
refrigeración hasta su procesamiento. Se seccionaron con bisturí en fragmentos<br />
de aproximadamente 1 mm 3<br />
, procurando no dejarlas secar. Se mantuvieron en<br />
medio de cultivo [Dulbecos Modified Eagle Medium] DMEM suplementado con<br />
10% de suero bovino fetal inactivado por calor, 100 U/mL de penicilina, 100<br />
ugr/ML de estreptomicina, anfotericina B al 0.1% y ácido ascórbico 30ug/mL.<br />
Todo el procedimiento se realizó en un gabinete de seguridad microbiológica<br />
20
Clase II.<br />
En tubos de 50 ml, se colocaron 10 ml de DMEM 1% antibiótico-antimicótico con<br />
colagenasa Tipo I o II al 0.3%. Los tubos se ajustaron en el Orbital Shaker a 37° C<br />
a 250 rpm durante 4 horas, vigilando el avance en la digestión.<br />
Al finalizar las 4 hrs, de digestión se centrifugaron a 300 x g durante 12 minutos.<br />
Después de la centrifugación con una pipeta Pasteur se absorbió el sobrenadante<br />
cuidando el botón celular y fue resuspendido golpeando gentilmente el tubo<br />
agregando 5 ml de PBS sin Calcio ni Magnesio con 1% antibiótico-antimicótico.<br />
Nuevamente se centrifugó a 300 x g por 12 minutos.<br />
Con una pipeta Pasteur desechamos el sobrenadante y agregaremos 5 ml de<br />
DMEM 10% SBF 1% antibiótico-antimicótico.<br />
Para realizar el conteo celular se utilizó la técnica de azul tripano la cual se lleva a<br />
cabo de la siguiente manera: se agregan 10 μl de suspensión celular y 10 μl del<br />
colorante en una placa de 96 pozos homogeneizando la mezcla. Se agregan 10 μl<br />
de la mezcla a cada uno de los pozos de la cámara de Neubauer. Contando las<br />
células viables y no viables (las células no viables se tiñen con el colorante azul).<br />
El cálculo de la población celular se obtiene de acuerdo a la siguiente fórmula:<br />
(número de células)(Factor de Dilución[2 en este caso]) x (ml de la solución<br />
celular) = x104.<br />
Al finalizar el procedimiento de extracción las células se sembraron en cajas de<br />
cultivo de tipo T (Falcon BD, Biosciences) de acuerdo con el siguiente criterio: de<br />
250 – 500 mil células recuperadas en cajas T25 con 5 ml de medio; de 500 – 1.5<br />
millones de células en cajas T75 con 10 ml de medio; mas de 1.5 millones de<br />
21
células en cajas T175 con 20 ml de medio. Las células se incubaron a 37°C y 5%<br />
CO2, cambiando el medio de cultivo cada 2 días.<br />
6.4.2 Pasaje celular de menisco<br />
Cuando los cultivos en monocapa llegaron a confluencia después de 7 a 10 días,<br />
se cosecharon las células de la siguiente manera: se aspiró el medio con pipeta<br />
Pasteur de la caja de cultivo y se agregó tripsina-EDTA y esperamos 5 minutos<br />
exactamente mientras se monitorea el desprendimiento de la capa celular. Ya<br />
desprendida la monocapa, se colocó en tubos de 50 ml y se agrega 5 ml de<br />
PBS/albúmina al 2.5% y se centrífuga a 300 x g por 6 minutos.<br />
6.4.3 Construcción del menisco de bioingeniería.<br />
Se sembraron alrededor de 10 millones de células por constructo meniscal, y se<br />
utilizaron dos polímeros para generar el sustituto de menisco, el primero que forma<br />
el centro del mismo y se constituye de PGA y el segundo, envuelve al primero y<br />
se compone de celulosa oxidada.<br />
El constructo de PGA se cubrió con la celulosa oxidada y se le dio forma y medida<br />
dependiendo de cada caso.<br />
6.5 Procedimiento anestésico.<br />
Los sujetos de estudio se indujeron con Xilazina intramuscular a 0.8mg x kg, y se<br />
realizó una sedación leve con la infusión intravenosa de 5 mgr x kg de Ketamina.<br />
Acto seguido, se colocó a la oveja en decúbito lateral y se realizó la preparación<br />
de aproximadamente 20 cm de la región lumbar en donde se quitó la lana, se hizo<br />
22
un lavado con isodine espuma y alcohol y se prepararon campos estériles para<br />
realizar una punción espinal con una aguja espinal 22 G. Una vez corroborado la<br />
ubicación epidural se procedió a infiltrar lentamente 3 cc de lidocaína simple al<br />
2%. Esto garantizó tres horas de bloqueo.<br />
6.6 Procedimientos quirúrgicos.<br />
Meniscectomía. Después del procedimiento anestésico, se colocó a la oveja en<br />
decúbito dorsal con las extremidades fijas con vendas elásticas protegidas con<br />
algodón para evitar puntos de presión. La babilla derecha fue rasurada para<br />
quitarle la lana. Se realizó antisepsia de la rodilla con espuma de Iodo povidona y<br />
alcohol. Se colocaron campos estériles y se realizó una incisión longitudinal de la<br />
babilla de 8-10 cm de longitud, se disecó por planos, se realizó una artrotomía en<br />
‘J’ para exponer el menisco. Se disecó de la cápsula articular con cuidado de no<br />
lesionarla. Se cerraron los planos con sutura de PGA (Vicryl 1-0) y la piel con<br />
sutura de nylon (Dermalon 2-0). Se aplicó sobre la superficie cutánea azul de<br />
metileno como antiséptico y gasas estériles fijas a la piel con sutura para cubrir la<br />
herida. Se retiraron dichas gasas a los 3 días, para permitir la exposición de la<br />
herida quirúrgica al medio ambiente.<br />
6.6.1 Técnica quirúrgica del trasplante de menisco.<br />
Se aplicó el tratamiento (trasplante de menisco o menisco de bioingeniería)<br />
acorde al grupo asignado a los 2 meses de la meniscectomía. La babilla derecha<br />
fue rasurada para quitarle la lana y puntos de nylon de la meniscectomía. Se<br />
realizó antisepsia de la rodilla con espuma de Iodo povidona y alcohol. Se<br />
colocaron campos estériles y se realizó una incisión longitudinal de la babilla de 8-<br />
23
10 cm de longitud, se disecó por planos, se realizó una artrotomía en ‘J’ para<br />
exponer el compartimiento femoro-tibial medial. Una vez expuesta la superficie<br />
articular de la tibia se hicieron túneles transóseos de manera anterógrada con una<br />
broca de 2.5 mm. Dichos túneles se dirigieron a la región anatómica de la<br />
inserción de los cuernos anterior y posterior del menisco. Se tuvo cuidado de<br />
labrar los túneles de manera independiente en una situación superior a la<br />
inserción del pes anserinus ipsilateral y dejando 3 mm al menos entre cada túnel.<br />
Lograda la perforación de los túneles se transportaron las suturas guías del<br />
trasplante de menisco o del menisco de bioingeniería a través de los túneles. Se<br />
fijó la periferia del menisco o menisco de bioingeniería con puntos verticales<br />
independientes y las suturas guía fueron anudadas sin tensión excesiva. Se<br />
cerraron los planos con sutura de PGA (Vicryl 1-0) y la piel con sutura de Nylon<br />
(Dermalon 2-0). Se colocó azul de metileno como antiséptico y gasas estériles<br />
fijas a la piel con sutura para cubrir la herida. Se retiraron dichas gasas a los 3<br />
días, para permitir la exposición de la herida al medio ambiente.<br />
La evolución clínica fue registrada durante 6 semanas, se realizó US articular de<br />
ambas rodillas y el sacrificio fue realizado con una dosis letal de pentobarbital para<br />
la toma de muestras a los 6 meses de la meniscectomía. Después del sacrificio<br />
de las ovejas se tomaron fotografías de las superficies articulares para las<br />
evaluaciones macroscópicas.<br />
Evaluaciones del cartílago articular:<br />
a. Evaluación macroscópica de Kelly (Tabla 1) (44).<br />
b. Evaluación macroscópica de OARSI para osteofitos (Tabla 2) (45).<br />
24
c. Calificación histológica modificada de Mankin de OA (Tabla 3) (40).<br />
6.7 Histología.<br />
Los tejidos osteocartilaginosos fueron fijados en formol amortiguado para su<br />
procesamiento y posterior descalcificación y tinción con safranina O y azul alciano,<br />
para la evaluación macroscópica e histológica. Dicha evaluación fue hecha por un<br />
patólogo independiente entrenado en patología articular.<br />
6.8 Ultrasonido<br />
A través de un equipo Siemens Sonoline Antares® y un transductor de 7 a 13 MHz<br />
en forma de “palo de hockey” con una huella de 1.5 cms de longitud se adquirieron<br />
las imágenes ecográficas en modo B con escala de grises ajustando la frecuencia<br />
del transductor a la máxima permitida por el equipo. La evaluación sonográfica se<br />
realizó con el sujeto de experimentación anestesiado con la babilla en flexión de<br />
110°, se localizó la interlínea articular y mediante maniobras de “punta-tacón” se<br />
determinó la presencia de tejido meniscal entre el fémur y la tibia. La evaluación<br />
se realizó en ambas babillas y las imágenes se adquirieron en planos ortogonales.<br />
Las imágenes representativas de la situación se seleccionaron y se guardaron en<br />
la memoria del equipo y finalmente se almacenaron en el sistema local PACS<br />
(Picture Archiving and Communication System) para ser evaluadas y revisadas<br />
posteriormente.<br />
La presencia de material intraarticular hiperecóico ubicado entre las superficies<br />
articulares femorotibiales mediales definió la ubicación anatómica del menisco<br />
25
nativo, del trasplante meniscal y del menisco de bioingeniería.<br />
La presencia de otras alteraciones articulares como hipertrofia sinovial, derrame<br />
sinovial se diagnosticaron de acuerdo a las definiciones para patología<br />
ultrasonográfica de OMERACT (41).<br />
Evaluación de la localización anatómica de los implantes y trasplantes.<br />
. US y evaluación macroscópica directa.<br />
6.9 Evaluación del menisco con microscopia electrónica de transmisión<br />
(menisco nativo, cicatriz de meniscectomía, menisco de bioingeniería y trasplante<br />
de menisco).<br />
1. Presencia/Ausencia de fibrocondrocitos productores de matriz<br />
extracelular y fibras de colágena.<br />
2. Medición del ancho de las fibras de colágena y comparación entre los<br />
diferentes grupos.<br />
6.10 Cálculo de Tamaño de Muestra<br />
Basado en el trabajo de Young [39] y colaboradores, de donde se tomaron los<br />
siguientes valores:<br />
- Tamaño del efecto (d)= 5 puntos<br />
- Desviación Estándar (s): 1.8<br />
Asumimos un tamaño del efecto en el grupo experimental 4 con los siguientes<br />
valores:<br />
-zα = 1.96 α = 0.05<br />
- zβ = 1.282 β = 0.20<br />
26
Despejando:<br />
2 (1.8) 2 (1.96 + 1.282) 2 / (5) 2<br />
aprox = 3 sujetos por grupo<br />
- por conveniencia usamos 4 ovejas por grupo experimental.<br />
6.11 Análisis Estadístico. Se realizó estadística descriptiva y expresamos los<br />
valores en mediana e intervalo intercuartilar para las variables cuantitativas y<br />
en frecuencias relativas las cualitativas. Dado que la muestra es pequeña,<br />
utilizamos estadística no paramétrica. Las comparaciones entre grupos de las<br />
variables cuantitativas las analizamos con Kruskal-Wallis y el ajuste de<br />
Bonferroni para el análisis post-hoc. El valor de p significativo fue ajustado<br />
entre el numero de grupos evaluados para las comparaciones de OA<br />
histológica (modificada de Mankin) p = 0.05/4 = 0.0125 y para el ancho de<br />
las fibras de colágena 0.005/3 = 0.017<br />
27
7. RESULTADOS<br />
7.1 Población de estudio.<br />
Las características generales de la población de estudio se muestran en la tabla 6.<br />
Las babillas de las ovejas incluidas se dividieron en 4 grupos experimentales:<br />
controles no operados (grupo 1); meniscectomía medial (grupo 2), trasplante de<br />
menisco (grupo 3) y menisco de bioingeniería (grupo 4).<br />
7.2 Microscopia electrónica.<br />
Las muestras de tejido de los controles, meniscectomía, trasplante de menisco, y<br />
menisco de bioingeniería fueron evaluadas por microscopia electrónica de<br />
transmisión (Figura 1 y Tabla 7). Mediante calibradores se realizó la medición del<br />
ancho de las fibras de colágena (mediana e intervalo intercuartilar): grupo control<br />
63.9 nm (51.2-69.6); grupo meniscectomía, las fibras de colágena resultaron mas<br />
delgadas 27.8 nm (22.6-33.0) y fibroblastos alargados que representan tejido<br />
cicatricial; la degeneración y desorganización de las fibras de colágena en los<br />
trasplantes de menisco impidió que se pudieran hacer mediciones; y en el grupo<br />
de menisco de bioingeniería flas fibras de colágena resultaron adelgazadas y de<br />
pequeño tamaño 30.23 nm (rango 26.1-32.6), adicionalmente en este grupo se<br />
observo la presencia de fibrocondrocitos . La diferencia entre los controles y los<br />
grupos de intervención fue estadísticamente significativa (p
Figura 1.<br />
Evaluación por microscopía electrónica de transmisión<br />
Fibras De Colágena<br />
7.3 Evaluación del cartílago articular.<br />
7.3.1.Evaluación macroscópica.<br />
Células<br />
Grupo 1 Controles<br />
Grupo 2 Meniscectomía<br />
Grupo 3 Trasplante de<br />
Menisco<br />
Grupo 4 Menisco de<br />
Bioingeniería<br />
En el grupo 1 Controles. Observamos fibras de colágena con el ancho de referencia<br />
y un fibrocondrocito maduro.<br />
En el grupo 2 Meniscectomía. Se observan fibras de colágena de menor calibre y<br />
fibroblastos alargados.<br />
En el grupo 3 Trasplante de menisco. Se puede apreciar fibras de colágena con<br />
degeneración hialina y desarregladas y fibrocondrocitos escasos, pequeños y<br />
fragmentados.<br />
En el grupo 4 Menisco de bioingeniería. Las fibras de colágena son pequeñas y<br />
delgadas, y presentan un arreglo heterogéneo; se puede observar una célula con<br />
abundante reticulo endoplasmico, complejos de Golgi, y pocas mitocondrias y con<br />
matriz extracelular inmadura a su alrededor, que sugiere ser un fibrocondrocito.<br />
La meniscectomía medial resultó en alteraciones morfoestructurales<br />
macroscópicas del cartílago articular consistentes con OA y que se manifestaron<br />
por irregularidades de la superficie, fibrilación y erosión del cartílago articular y<br />
29
adicionalmente por la presencia de osteofitosis en los márgenes articulares de la<br />
meseta tibiales. Las anormalidades macroscópicas estuvieron presentes en los<br />
tres grupos y se manifestaron por la presencia de fibrilación de la superficie<br />
condral y osteofitosis, hecho que contrasta significativamente con el grupo control,<br />
en el que no se encontraron alteraciones osteocartilaginosas macroscópicas. El<br />
cartílago articular de las mesetas tibiales del grupo control resultó liso, sin<br />
irregularidades, áreas de erosión o adelgazamiento (Figura 2 y Tabla 8).<br />
Figura 2.<br />
Grupo 1 Controles<br />
Grupo 2 Meniscectomía<br />
Grupo 3 Trasplante<br />
de Menisco<br />
Grupo 4 Menisco<br />
de Bioingeniería<br />
Evaluación macroscópica del cartílago articular.<br />
Mesetas tibiales de los grupos de estudio.<br />
Grupo 1. La superficie articular se observa lisa, sin osteofitos ni<br />
irregularidades.<br />
Grupo 2. Observamos fibrilación leve, un caso con artrofibrosis y tejido<br />
fibroso en la periferia.<br />
Grupo 3. Se observan remanentes de la sutura en de los túneles óseos,<br />
osteofitos de 2 a 4 mm. y fibrilación.<br />
Grupo 4. Observamos un caso con artrofibrosis, formación de osteofitos<br />
de tamaño moderado y fibrilación de la superficie.<br />
30
7.3.2 Evaluación Histológica<br />
Los cambios histomorfológicos del cartílago articular evaluados mediante la<br />
clasificación de OA modificada de Mankin (figura 3 y gráfica 1) se comportaron de<br />
la manera siguiente: Grupo control 1.5 (0.3-5); Grupo Meniscectomía 15.5 (13.3-<br />
18.5); Grupo Trasplante de Menisco 12.5 (10.5-14.5); Grupo Menisco de<br />
Bioingeniería 23 (16.5-25).<br />
Como se muestra en la gráfica 1. En todos los grupos en los que se asigno una<br />
maniobra quirúrgica, encontramos un mayor daño estructural del cartílago articular<br />
comparado con el grupo de contraste (p
Figura 3.<br />
Evaluación Histológica del cartílago articular.<br />
Grupo 1 Controles<br />
Grupo 2 Meniscectomía<br />
Grupo 3 Trasplante de<br />
Menisco<br />
Grupo 4 Menisco de<br />
Bioingeniería<br />
Micrografías de superficie articular de meseta tibial medial con Safranina O<br />
/<strong>Ver</strong>de rápido.<br />
Grupo 1. Observamos tinción intensa y uniforme de la matriz extracelular.<br />
Observe la integridad de la transición de la capa de cartílago calcificado y<br />
hueso subcondral.<br />
Grupo 2. Se observan irregularidades en la tinción, griestas y algunos<br />
clones celulares.<br />
Grupo 3. Se observan irregularidades en la tinción, grietas, clones celulares.<br />
Grupo 4. Se observan alteraciones severas de la tinción, grietas que llegan<br />
al hueso subcondral y transgrede el frente calcificado. Adicionalmente se<br />
observa abundante tejido cicatricial<br />
32
Grafica 1. Evaluación histológica del daño del cartílago articular<br />
7.4 Evaluación Ultrasonográfica<br />
Daño histológico del cartílago articular.<br />
Diagrama de cajas y bigotes que muestra la diferencia<br />
entre los grupos experimentales y los controles.<br />
Además, se observa una diferencia significativa entre el<br />
grado daño histológico del grupo de menisco de<br />
bioingeniería y el grupo de trasplante de menisco.<br />
En el grupo control encontramos el menisco nativo en posición normal en todas las<br />
rodillas y con características sonográficas normales. Como era esperado, no<br />
33
encontramos evidencia sonográfica de menisco (estructura ecogénica de forma<br />
triangular en la interlinea articular femoro-tibial) en el grupo de meniscectomía, y<br />
constatamos a través de ésta técnica de imagen que en todos los sujetos de<br />
estudio, tanto del grupo de trasplantes como de meniscos de bioingeniería la<br />
estructura trasplantada o implantada estaba ubicada en el sitio anatómico<br />
esperado, esto es entre el cóndilo femoral y el platillo tibial medial<br />
En todos los grupos operados, encontramos evidencia sonográfica de moderada<br />
sinovitis, manifestada por la presencia ya sea de derrame o hipertrofia sinovial y<br />
señal Doppler de poder positiva.<br />
En todos los sujetos de estudio, tanto los trasplantes como los implantes se<br />
mantuvieron en su posición anatómica. La correcta ubicación anatómica de los<br />
mismos se corroboró visualmente a través de la artrotomía postmortem.<br />
7.5 Eventos adversos.<br />
En un caso de meniscectomía y en otro de menisco de bioingeniería encontramos<br />
evidencia macroscópica de artrofibrosis manifestada por la presencia de un<br />
proceso fibrocicatricial que involucraba a diferentes estructuras articulares y que<br />
no se manifestó clínicamente.<br />
34
8. DISCUSION<br />
En este estudio demostramos la capacidad de formar un tejido con características<br />
morfológicas similares al tejido meniscal a través de técnicas de ingeniería de<br />
tejidos sobre una plataforma de materiales biosintéticos y biodegradables.<br />
De un modelo animal obtuvimos fibrocondrocitos, los proliferamos e insertamos en<br />
un polímero biocompatible de PGA y celulosa oxidada. Documentamos por medio<br />
de microscopía electrónica de transmisión la presencia en el menisco de<br />
bioingeniería de una población celular morfológicamente similar a fibrocondrocitos,<br />
adicionalmente la presencia de fibras de colágena, y matriz extracelular. A<br />
diferencia del menisco trasplantado y del tejido cicatricial de reparación presente<br />
en el grupo de meniscectomía, los rasgos ultraestructurales y morfológicos del<br />
neotejido mostraron características similares al tejido meniscal nativo.<br />
Se ha reportado una perdida de la permeabilidad meniscal y alteraciones<br />
vasculares como causantes de la degeneración y desarreglo morfoestructural de<br />
las fibras de colágena en los meniscos congelados (48). Estos observaciones son<br />
similares a las encontradas por nosotros en el grupo de trasplante de menisco<br />
fresco congelado, en el cual se perdió la periodicidad de las bandas de colágena,<br />
hubo mayor grado de disrupción, desarreglo conformacional y edema. Por otro<br />
lado, nuestros resultados muestran que también hay degeneración hialina,<br />
alteración en la disposición de las fibrillas y una menor densidad de<br />
fibrocondrocitos.<br />
35
En el menisco de bioingeniería encontramos abundantes células parecidas a<br />
fibrocondrocitos, ya que contienen cuantioso retículo endoplásmico, complejos de<br />
Golgi, pocas mitocondrias, y producción de matriz extracelular. Esto contrasta con<br />
la baja densidad celular presente en los meniscos trasplantados. En otro estudio,<br />
en un grupo de 28 pacientes se tomaron biopsias de meniscos trasplantados a 16<br />
meses de seguimiento. Las muestras estudiadas mostraron una repoblación<br />
incompleta de células viables del huésped, ya que solo se encontraron en las<br />
capas superficiales y no en el centro del menisco trasplantado. El fenotipo de<br />
dichas células orientaba al origen fibroblástico y sinovial de la cápsula adyacente<br />
(48).<br />
El tratamiento y preservación de la función del menisco después de una lesión<br />
representa un reto clínico que aún no se logra vencer, ya que hoy en día no<br />
contamos con un tratamiento que reemplace las características biomecánicas del<br />
menisco, que evite el síndrome postmeniscectomía y que a prevenga el desgaste<br />
cartilaginoso, por lo que a través de técnicas de ingeniería de tejidos buscamos<br />
una alternativa terapéutica.<br />
La idoneidad de un plataforma de bioingeniería está dada por su<br />
biocompatibilidad, estabilidad mecánica, reproducibilidad y disponibilidad (47). Uno<br />
de los problemas que presenta la adición de células a un andamio meniscal es la<br />
dificultad de que estas permanezcan en la zona el tiempo adecuado para ejercer<br />
su función. El andamio elegido es suave, flexible, biocompatible y de alta<br />
porosidad (>97%), con poros interconectados en tres dimensiones, lo que<br />
favoreció la adecuada densidad celular encontrada. Sin embargo, las fibras de<br />
36
colágena de los implantes de bioingeniería fueron de menor calibre, con una<br />
disposición desordenada y menos compactas que las del menisco nativo. Esta<br />
condición de ultra-arquitectura, pudo haber tenido un efecto negativo en las<br />
propiedades biomecánicas del tejido neo formado, y de esta manera repercutir en<br />
la pobre protección al cartílago articular encontrada en el grupo de menisco de<br />
bioingeniería.<br />
Para evaluar en términos de eficacia el efecto condroprotector de los diferentes<br />
tratamientos quirúrgicos utilizamos las recomendaciones de OARSI (45). En ellas,<br />
se sugiere evaluar la apariencia macroscópica de toda la superficie tibial cubierta<br />
por cartílago, la presencia de osteofitos en la periferia, y los cambios<br />
histomorfológicos característicos de la OA. En general, en nuestro estudio los tres<br />
grupos de tratamiento mostraron una pobre condroprotección, principalmente en<br />
las regiones periféricas de la superficie articular estudiada. En el trabajo de Kelly<br />
se reportaron resultados similares. En un modelo ovino de trasplante de menisco<br />
fresco congelado encontraron mayor daño en la zona periférica del cartílago<br />
articular, y establecieron que el centro de la articulación fue parcialmente<br />
condroprotegido (50).<br />
En un estudio en donde compararon meniscos frescos congelados tomados de<br />
manera estéril con meniscos frescos congelados esterilizados, encontraron que<br />
las fuerzas de compresión disminuyeron a los 4 meses de ser trasplantados y que<br />
eran más débiles que el menisco nativo. Además, la celularidad de ambos tipos<br />
de injerto fue inferior que la de los meniscos nativos, y la severidad del daño<br />
condral de las rodillas trasplantadas fue indistinguible de las articulaciones con<br />
37
meniscectomía (51).<br />
En nuestra técnica quirúrgica preferimos utilizar el compartimento medial por<br />
diversas razones: posee una superficie articular de menor tamaño, la tibia no es<br />
tan convexa, y principalmente no se lesionan los tendones extensor largo de los<br />
dedos y poplíteo, en comparación al compartimento lateral. Se usaron túneles<br />
transóseos para fijar las inserciones anterior y posterior de los meniscos. Esta<br />
técnica tiene ventajas mecánicas y asegura la permanencia del implante en<br />
posición anatómica. Este hecho fue corroborado en nuestro estudio mediante la<br />
evaluación ultrasonográfica y por visualización directa de la posición del implante<br />
y/o trasplante.<br />
Se presentaron complicaciones como atrofibrosis en dos sujetos de investigación,<br />
uno en el grupo de meniscectomía y otro en el grupo de menisco de bioingeniería.<br />
Atribuimos las complicaciones a la excesiva tensión generada sobre las suturas<br />
que reinsertaban el vasto medio oblicuo (VMO) y ligamento patelofemoral medial.<br />
El abordaje medial requiere incidir el tendón del VMO y la cápsula articular medial<br />
(que incluye al ligamento patelofemoral medial). Al término del estudio en las<br />
ovejas con artrofibrosis observamos abundante tejido cicatricial en esta región.<br />
Para proyectos futuros, repararemos este complejo medial a la patela con suturas<br />
de polietileno de alta densidad (Orthocord, Fiberwire 2-0), que brindan una mayor<br />
resistencia.<br />
Los resultados obtenidos en este trabajo son alentadores aunque de ninguna<br />
manera se pueden considerar como óptimos. Como principal fortaleza y<br />
relacionada con la eficacia, podemos resaltar el hecho de que se logró obtener un<br />
38
tejido similar al menisco nativo a partir de una plataforma de materiales<br />
biosintéticos y biodegradables que fue sembrada con fibrocondrocitos autólogos<br />
que consiguieron mantenerse viables, poblar el andamio poroso y mantenerse<br />
funcionalmente activos a lo largo del estudio. Como principal debilidad tenemos<br />
que el menisco de bioingeniería no fue capaz de prevenir el daño<br />
osteocartilaginoso propio de la OA.<br />
Otra debilidad radica en la falta de caracterización de los cultivos celulares, en<br />
este estudio solo se cuantificaron manualmente las células que provenían de los<br />
meniscos tomados y se evaluaron los fenotipos morfológicos en cultivo. Para<br />
estudios ulteriores, proponemos evaluar el fenotipo con técnicas de<br />
inmunohistoquímica, ELISA y PCR. La seguridad del modelo experimental se<br />
obtuvo al demostrar que los implantes y trasplantes se mantuvieron en la posición<br />
anatómica a lo largo del estudio.<br />
9. DISCUSION<br />
En conclusión, la plataforma de PGA y celulosa oxidada sembrada con<br />
fibrocondrocitos autólogos es eficaz para producir un tejido similar al menisco<br />
nativo. Las maniobras quirúrgicas fueron seguras al confirmarse la fijación y<br />
permanencia en posicion anatómica de los meniscos trasplantados o implantados.<br />
Sin embargo, no observamos un efecto de protección al cartílago articular con<br />
estos tratamientos después de la meniscectomía.<br />
39
10. PERSPECTIVAS<br />
Este estudio sienta las bases experimentales suficientes para continuar con la<br />
búsqueda de un modelo de bioprotesis que sea eficaz y segura para reemplazar el<br />
menisco nativo dañado con una bioprotesis.<br />
En un futuro continuaremos los trabajos experimentales ahora en un proyecto en<br />
el que la plataforma o andamio sea construida con materiales sintéticos<br />
bioabsorbibles y sembrada con células troncales autólogas con la finalidad de<br />
evitar el dolor del síndrome postmeniscectomía y que sobre todo sea eficaz en la<br />
protección y prevención del daño al cartílago articular y de este modo prevenir el<br />
desarrollo de OA<br />
Nuestros estudios han mostrado que las células meniscales cultivadas en<br />
polímeros de PGA tienen la capacidad de formar un tejido similar al menisco<br />
cultivado en un biorreactor, pero la utilidad clínica y de prevención de osteoartritis<br />
no ha sido probada. Más aún, un inconveniente de los cultivos celulares de<br />
células meniscales es que requiere dos etapas de cirugía para la aplicación de un<br />
implante, aumentando el riesgo y los<br />
costos.<br />
La sustitución de tejido de menisco con células troncales mesenquimales<br />
autólogas es un tema de intenso estudio. Ofrece ventajas logísticas, ya que<br />
permite tomar células fuera de quirófano, cultivarlas, proliferarlas y caracterizarlas<br />
para situarlas en un implante tridimensional en forma de menisco e implantarlas en<br />
40
un solo tiempo. Nuestro grupo ha tenido éxito previamente en la formación de<br />
tejido similar al menisco en un modelo ovino de OA con células autólogas. Pero el<br />
tejido obtenido de biopsias directas de células meniscales requiere al menos 4<br />
semanas de cultivo, haciendo logísticamente difícil, caro y riesgoso el uso en el<br />
paciente humano. Así, las células troncales mesenquimales autólogas parecen<br />
ser una respuesta biológicamente plausible en la sustitución de menisco.<br />
41
11. BIBLIOGRAFIA<br />
1. Wroble RR, Henderson RC, Campion ER, el-Khoury EY, Albright JE.<br />
Meniscectomy in children and adolescents. A long-term follow-up study. Clin<br />
Orthop Relat Res. 1992;(279):180-9.<br />
2. Andrish JT. Meniscal Injuries in Children and Adolescents: Diagnosis and<br />
Management. J Am Acad Orthop Surg. 1996;4(5): 231-7.<br />
3. Alford JW, Lewis P, Kang RW, Cole BJ. Rapid progression of chondral disease<br />
in the lateral compartment of the knee following meniscectomy. Arthroscopy 2005;<br />
21(12): 1505-9.<br />
4. Bargar WL, Moreland JR, Markolf KL, Shoemaker SC, Amstutz HC, Grant TT. In<br />
vivo stability testing of postmeniscectomy knees. Clin Orthop Relat Res.<br />
1980;(150): 247-52.<br />
5. Kurosawa H, Fukubayashi T, Nakajima H. Load-bearing mode of the knee joint:<br />
physical behavior of the knee joint with or without menisci. Clin Orthop Relat Res.<br />
1980; 149:283-90.<br />
6. Ahmed AM, Burkle DL. In-vitro measurement of static pressure distribution in<br />
synovial joints. Part I. Tibial surface of the knee. J Biomech Eng. 1983; 105: 216-<br />
25.<br />
7. Fairbank TJ. Knee joint changes after meniscectomy J Bone Joint Surg Br.<br />
1948; 30B: 664-70.<br />
8. Krause WR, Pope MH, Johnson RJ, Wilder DG. Mechanical changes in the knee<br />
after meniscectomy. J Bone Joint Surg Am. 1976; 58: 599-604.<br />
42
9. Englund M, Lohmander LS. Risk factors for symptomatic knee osteoarthritis<br />
fifteen to twenty-two years after meniscectomy. Arthritis Rheum. 2004; 50(9): 2811-<br />
10. Roos EM, Bremander AB, Englund M, Lohmander LS. Change in self-reported<br />
outcomes and objective physical function over 7 years in middle-aged subjects with<br />
or at high risk of knee osteoarthritis. Ann Rheum Dis. 2008; 67(4): 505-10.<br />
11. Riyazi N, Rosendaal FR, Slagboom E, Kroon HM, Breedveld FC, Kloppenburg<br />
M.<br />
Risk factors in familial osteoarthritis: the GARP sibling study. Osteoarthritis<br />
Cartilage 2008; 16(6): 654-9<br />
12. Belo JN<br />
Berger MY, Reijman M, Koes BW, Bierma-Zeinstra SM. Prognostic<br />
factors of progression of osteoarthritis of the knee: a systematic review of<br />
observational studies. Arthritis Rheum. 2007; 57(1): 13-26.<br />
13. Messner K, Gao J. The menisci of the knee joint. Anatomical and functional<br />
characteristics, and a rationale for clinical treatment. J Anat. 1998; 193 ( Pt 2): 161-<br />
78.<br />
14. Aagaard H, <strong>Ver</strong>donk R. Function of the normal meniscus and consequences of<br />
meniscal resection. Scand J Med Sci Sports. 1999; 9(3): 134-40.<br />
15. Gupte CM, Bull AM, Thomas RD, Amis AA. A review of the function and<br />
biomechanics of the meniscofemoral ligaments. Arthroscopy. 2003; 19(2): 161-71.<br />
16. Webber RJ. In vitro culture of meniscal tissue. Clin Orthop Relat Res.<br />
1990;(252): 114-20<br />
17. Newman AP, Daniels AU, Burks RT. Principles and decision making in<br />
meniscal surgery. Arthroscopy. 1993; 9(1): 33-51.<br />
18. Noyes FR, Barber-Westin S, Butler DL, Wilkins RM. The role of allografts in<br />
43
epair and reconstruction of the knee joint ligaments and menisci. Instr Course<br />
Lect. 1998; 47:379-96.<br />
19. Cole BJ, Carter TR, Rodeo SA. Allograft meniscal transplantation: Background,<br />
techniques, and results. Instr Course Lect. 2003;52:383-96.<br />
20. Wirth CJ, von Lewinski G. Long-term results after combined medial meniscal<br />
allograft transplantation and anterior cruciate ligament reconstruction: minimum<br />
8.5-year follow-up study. Arthroscopy. 2004; 20(7): 782-3; author reply 784-5.<br />
21. van Arkel ER, Goei R, de Ploeg I, de Boer HH. Meniscal allografts: evaluation<br />
with magnetic resonance imaging and correlation with arthroscopy. Arthroscopy.<br />
2000; 16(5): 517-21.<br />
22. Stollsteimer GT, Shelton WR, Dukes A, Bomboy AL. Meniscal allograft<br />
transplantation: a 1- to 5-year follow-up of 22 patients. Arthroscopy. 2000; 16(4):<br />
343-7.<br />
23. Ryu RK, Dunbar VW, Morse GG. Meniscal allograft replacement: a 1-year to 6-<br />
year experience. Arthroscopy. 2002;18(9): 989-94.<br />
24. Hamlet W, Liu SH, Yang R. Destruction of a Cryopreserved Meniscal Allograft:<br />
a Case for Acute Rejection. Arthroscopy. 1997;13(4):517-21.<br />
25. Rodeo SA, Seneviratne A, Suzuki K, Felker K, Wickiewicz TL, Warren RF.<br />
Histological analysis of human meniscal allografts. A preliminary report J Bone<br />
Joint Surg Am. 2000; 82: 1071-82.<br />
26. Wirth CJ, Peters G, Milachowski KA, Weismeier KG, Kohn D. Long-term results<br />
of meniscal allograft transplantation. Am J Sports Med. 2002; 30(2): 174-81.<br />
27. <strong>Ver</strong>donk PC, <strong>Ver</strong>straete KL, Almqvist KF, De Cuyper K, Veys EM, <strong>Ver</strong>bruggen<br />
44
G, et al. Meniscal allograft transplantation: long-term clinical results with<br />
radiological and magnetic resonance imaging correlations. Knee Surg Sports<br />
Traumatol Arthrosc, 2006; 14:694-706.<br />
28. Sekiya JK, Ellingson CI. Meniscal allograft transplantation. J Am Acad Orthop<br />
Surg. 2006; 14(3): 164-74.<br />
29. Rijk PC, Tigchelaar-Gutter W, Bernoski FP, Van Noorden CJ. Functional<br />
changes in articular cartilage after meniscal allograft transplantation: a quantitative<br />
histochemical evaluation in rabbits. Arthroscopy. 2006; 22(2): 152-8.<br />
30. Noyes FR, Barber-Westin SD, Rankin M. Meniscal transplantation in<br />
symptomatic patients less than fifty years old. J Bone Joint Surg Am, 2005; 87<br />
Suppl 1(Pt 2): 149-65.<br />
31. Ibarra C, Koski JA, Warren RF. Tissue engineering meniscus: cells and matrix.<br />
Orthop Clin North Am. 2000; 31(3): 411-8.<br />
32. Wood JJ, Malek MA, Frassica FJ, Polder JA, Mohan AK, Bloom ET, et al.<br />
Autologous cultured chondrocytes: adverse events reported to the United States<br />
Food and Drug Administration. J Bone Joint Surg Am. 2006; 88(3): 503-7.<br />
33. Silva MM, Cyster LA, Barry JJ, Yang XB, Oreffo RO, Grant DM, et al. The<br />
effect of anisotropic architecture on cell and tissue infiltration into tissue<br />
engineering scaffolds. Biomaterials. 2006;27:5909-17.<br />
34. Petersen W, Pufe T, Stärke C, Fuchs T, Kopf S, Raschke M, et al. Locally<br />
applied angiogenic factors--a new therapeutic tool for meniscal repair. Ann Anat.<br />
2005; 187(5-6): 509-19.<br />
35. Izuta Y, Ochi M, Adachi N, Deie M, Yamasaki T, Shinomiya R. Meniscal repair<br />
45
using bone marrow-derived mesenchymal stem cells: experimental study using<br />
green fluorescent protein transgenic rats. Knee 2005; 12(3): 217-23.<br />
36. Abdel-Hamid M, Hussein MR, Ahmad AF, Elgezawi EM. Enhancement of the<br />
repair of meniscal wounds in the red-white zone (middle third) by the injection of<br />
bone marrow cells in canine animal model. Int J Exp Pathol. 2005; 86(2): 117-23.<br />
37. Yamazaki K, Tachibana Y. Vascularized synovial flap promoting regeneration<br />
of the cryopreserved meniscal allograft: experimental study in rabbits. J Orthop Sci.<br />
2003; 8(1): 62-6.<br />
38. Sethi PM, Cooper A, Jokl P. Technical tips in orthopaedics: meniscal repair<br />
with use of an in situ fibrin clot. Arthroscopy. 2003; 19(5): E44.<br />
39. Young AA, Smith MM, Smith SM, Cake MA, Ghosh P, Read RA, et al. Regional<br />
assessment of articular cartilage gene expression and small proteoglycan<br />
metabolism in an animal model of osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 2005; 7(4):<br />
R852-61.<br />
40. Little C, Smith S, Ghosh P, Bellenger C: Histomorphological and<br />
immunohistochemical evaluation of joint changes in a model of osteoarthritis<br />
induced by lateral meniscectomy in sheep. J Rheumatol. 1997; 24:2199-209.<br />
41. Wakefield RJ, Balint PV, Szkudlarek M, et al. Musculoskeletal ultrasound<br />
including definitions for ultrasonographic pathology. J Rheumatol. 2005;32:2485-7.<br />
42. Redon TA, Alcántara RC, Arévalo EJL, Escalier PMG, Ayala ZM. Trasplante de<br />
meniscos. Procedimiento quirúrgico experimental en la rodilla del perro. Rev Mex<br />
Ortop Traum. 1994;8 (4):170-8<br />
43. Villalobos FE, Izaguirre A, Almazán A, Cruz F, Pérez F, Ibarra JC. Articular<br />
46
cartilage injuries in 1309 knee arthorscopies, a public health problem in a<br />
developing country? Osteoarthritis and Cartilage. 2007; 15B: B102<br />
44. Kelly BT, Potter Hg, Deng XH, Pearle AD, Tuner AS, Warren RF et al. Meniscal<br />
allograft transplantation in the sheep knee: evaluation of chondroprotective effects.<br />
Am J Sports med 2006; 34(9):1464-77.<br />
45. Little CB, Smith MM Cake MA Read RA Murphy MJ Barr FP. The OARSI<br />
histopathology initiative- recommendations for histological assessments of<br />
osteoarthritis in sheep and goats. Osteoarthritis and Cartilage 2010; 18: S80-S92.<br />
46. NOM-062-ZOO-1999. Normal oficial Mexicana, Especificaciones técnicas para<br />
la producción, cuidado y uso de animales de laboratorio.<br />
47. Safran MR, Kim H, Zaffagnini S. The use of scaffolds in the management of<br />
articular cartilage injury. J Am Acad Orthop Surg 2008;16:306-311.<br />
48. Gelber PE, Gonzalez G, Lloreta JL, Reina F, Caceres E, Monllau JC. Freezing<br />
causes changes in the meniscus collagen net: a new ultrastructural meniscus<br />
disarray scale. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 2008;16(4):353-9.<br />
49. Rodeo SA, Seneviratne A, Suzuki K, Felker K, Wickiewicz TL, Warren RF.<br />
Histological analysis of human meniscal allografts. A preliminary report. J Bone<br />
joint Surg Am. 2000;82-A: 1071-82<br />
50. Kelly BT, Potter HG, Deng XH, Pearle AD, Turner AS, Warren RF et al.<br />
Meniscal allograft transplantation in the sheep knee. Evaluation of<br />
chondroprotective effects. Am J Sports Med. 2006;34(9):1464-77<br />
51. McNickle AG, Wang VM, Shewman EF, Cole BJ, Williams JM. Performance of<br />
a sterile meniscal allograft in an ovine model. Clin Orthop Relat Res<br />
47
2009;467:1868-76<br />
48
12. ANEXOS<br />
Tabla 1. Clasificación de Kelly para la evaluación de cambios macroscópicos<br />
del cartílago<br />
GRADO Daño articular<br />
0 Normal<br />
1 Irregularidades superficiales<br />
2 Fibrilación y fisuras<br />
3 Erosiones pequeñas hasta el hueso subcondral (5mm de diámetro)<br />
Kelly BT, Potter Hg, Deng XH, Pearle AD, Tuner AS, Warren RF, et al. Meniscal<br />
allograft transplantation in the sheep knee: evaluation of chondroprotective effects.<br />
Am J Sports med 2006; 34(9):1464-77.<br />
Tabla 2. Clasificación de OARSI de osteofitos<br />
GRADO Desarrollo de Osteofitos<br />
0 Normal<br />
1 Desarrollo leve de osteofitos (50% del<br />
margen articular)<br />
Little CB, Smith MM Cake MA Read RA Murphy MJ Barr FP. The OARSI<br />
histopathology initiative - recommendations for histological assessments of<br />
osteoarthritis in sheep and goats. Osteoarthritis and Cartilage 2010; 18: S80-S92.<br />
(45)<br />
49
Tabla 3. Calificación histológica modificada de Mankin<br />
GRADO Desarrollo de Osteofitos<br />
A – Estructura - Normal 0<br />
- Irregularidades de superficie leves 1<br />
- Irregularidades de superficie moderadas 2<br />
- Irregularidades de superficie severas 3<br />
- Grietas a la zona de transición (1/3 de profundidad) 4<br />
- Grietas a la zona radial (2/3) 5<br />
- Grietas a la zona calcificada (3/3 de profundidad) 6<br />
- Fibrilación y/o pérdida de la zona de transición (1/3 de<br />
profundidad) 7<br />
- Fibrilación y/o pérdida de la zona radial (2/3 de<br />
profundidad) 8<br />
- Fibrilación y/o pérdida de la zona calcificada (3/3 de<br />
profundidad) 9<br />
B – Densidad de<br />
condrocitos<br />
C- Clonación<br />
celular<br />
D- Tinción<br />
interterritorial<br />
E- Transición<br />
cartílago calcificado<br />
/ hueso subcondral<br />
- Fibrilación y/o pérdida del hueso subcondral 10<br />
- Normal 0<br />
- Aumento o disminución leve 1<br />
- Disminución moderada 2<br />
- Disminución grave 3<br />
- Sin células 4<br />
- Normal 0<br />
- Algunos dobletes 2<br />
- Muchos dobletes 2<br />
- Dobletes y tripletes 3<br />
- Múltiples nidos celulares 4.<br />
- Normal 0<br />
- Pérdida de tinción de la zona tangencial (1/3) 1<br />
- Pérdida de tinción en la zona de transición (2/3) 2<br />
- Pérdida de tinción en la zona radial (3/3) 3<br />
- Sin tinción 4<br />
- Hueso subcondral intacto + único “tide mark” 0<br />
- Hueso subcondral intacto + “tide mark” múltiple 1<br />
- Vasos sanguíneos que entran a la zona calcificada 2<br />
- “Tide mark” atravesada por vasos sanguíneos 3.<br />
Little C, Smith S, Ghosh P, Bellenger C: Histomorphological and<br />
immunohistochemical evaluation of joint changes in a model of osteoarthritis<br />
induced by lateral meniscectomy in sheep. J Rheumatol. 1997; 24:2199-209 (40).<br />
50
Tabla 4. Variables dependientes<br />
Variable Tipo de variable Definición conceptual<br />
Evaluación macroscópica<br />
de Kelly<br />
Evaluación macroscópica<br />
de OARSI de osteofitos<br />
Evaluación histológica de<br />
OA modificada de Mankin<br />
Cualitativa ordinal<br />
0-4<br />
Cualitativa ordinal<br />
0-3<br />
Escala cuantitativa<br />
0-27<br />
Ultrasonido meniscal Cualitativa dicotómica<br />
Sí o no<br />
Evaluación cualitativa del<br />
cartílago articular bajo<br />
visión directa<br />
Evaluación cualitativa del<br />
cartílago articular bajo<br />
visión directa<br />
Evaluación histológica de<br />
la estructura, celularidad,<br />
características tintoriales,<br />
y clonación de<br />
condrocitos<br />
Evalúa la ubicación<br />
anatómica del<br />
implante/trasplante de<br />
menisco<br />
Microscopía electrónica Cuantitativa continua Determina el promedio<br />
del grosor de las fibras de<br />
los meniscos estudiados.<br />
51
Tabla 5. Flujograma metodológico:<br />
52
Tabla 6. Descripción de los sujetos de estudio.<br />
Ovejas<br />
Suffolk<br />
(n=10)<br />
Peso<br />
(Kg.)<br />
Edad<br />
(años)<br />
Controles<br />
Grupo 1<br />
4<br />
79.5<br />
8.0<br />
Meniscectomía<br />
Grupo 2<br />
4<br />
80<br />
8.5<br />
Tabla 7. Microscopía Electrónica.<br />
Ancho Fibras de<br />
Colágena<br />
Mediana nm<br />
(Intervalo intercuartilar)<br />
Presencia de<br />
Fibrocondrocitos<br />
Controles<br />
Grupo 1<br />
63.9 nm<br />
(51.2-69.6)<br />
Si<br />
Trasplante<br />
de Menisco<br />
Grupo 3<br />
2<br />
80.5<br />
8.0<br />
Meniscectomía<br />
Grupo 2<br />
27.8 nm<br />
(22.6-33.0)<br />
No<br />
Trasplante<br />
Menisco<br />
Grupo 3<br />
NE<br />
Menisco de<br />
Bioingeniería<br />
Grupo 4<br />
4<br />
80.25<br />
8.5<br />
Menisco<br />
Bioingeniería<br />
Grupo 4<br />
30.23 nm<br />
(26.1-32.6)<br />
p<br />
NS<br />
NS<br />
NS<br />
P<br />
Evaluación<br />
Cartílago<br />
Mediana (Intervalo<br />
intercuartilar)<br />
Tabla 8. Evaluación macroscópica cartílago y osteofitos (OARSI).<br />
Controles<br />
Grupo 1<br />
0<br />
Meniscectomía<br />
Grupo 2<br />
2.0 (1.25-3.5)<br />
Trasplante<br />
Menisco<br />
Grupo 3<br />
3 (3-3)<br />
Menisco<br />
Bioingeniería<br />
Grupo 4<br />
2.0(1.25-3.5)<br />
P<br />
0.03<br />
Evaluación<br />
osteofitos<br />
Mediana (Intervalo<br />
intercuartilar)<br />
0<br />
1.0 (1-2.5) 2.5 (2-3) 1.0(1-2.5) 0.02<br />
* Hubo diferencia estadísticamente significativa de todos los grupos cuando se<br />
compararon con el grupo control.<br />
54
Derrame<br />
sinovial (%)<br />
Hipertrofia<br />
sinovial<br />
Localización<br />
anatómica<br />
(% éxito)<br />
Tabla 9. Evaluación ultrasonográfica<br />
Meniscectomía<br />
n=4<br />
Trasplante<br />
de<br />
Menisco<br />
n=2.<br />
Menisco de<br />
Bioingeniería<br />
n=4<br />
Rodillas<br />
no<br />
operadas<br />
n=10<br />
1(25%) 1(50%) 1(25%) 0(0%)<br />
1(25%) 1(50%) 1(25%) 0(0%)<br />
0<br />
2 (100%)<br />
4 (100%)<br />
10(100%)<br />
55
HOJA DE TRABAJO<br />
PROYECTO: EFECTO CONDROPROTECTOR DE UN MENISCO DE<br />
BIOINGENIERÍA BIOMÉDICA DE UN MODELO OVINO DE OSTEOARTROSIS<br />
No. Borrego: _______________ Fecha: __________________________<br />
Rodilla intervenida: _______________ Sitio de intervención:<br />
_______________<br />
FASE I: EVALUACIÓN INICIAL<br />
Menisco<br />
Lesión<br />
Menisco de bioingeniería<br />
Menisectomía<br />
Derrame<br />
Hipertrofia sinovial<br />
Rodilla derecha Rodilla Izquierda<br />
Presencia/ausencia Presencia/ausencia<br />
Señal Doppler Grado Grado<br />
Elastografía<br />
Osteofitosis<br />
Cartílago Homogeneo/Heterogeneo Homogeneo/Heterogeneo<br />
Observaciones<br />
FASE II: PUNCIÓN ARTICULAR Y ANÁLISIS DE LIQUIDO SINOVIAL<br />
Rodilla derecha<br />
Rodilla izquierda<br />
Punción<br />
realizada (si/no)<br />
FASE III: ESTUDIO CARTÍLAGO HIALINO<br />
Rodilla<br />
derecha<br />
Rodilla<br />
izquierda<br />
Grosor<br />
(mm)<br />
Cantidad LS<br />
extraída<br />
Ecogenicidad Superficie Elastografía<br />
Resultado del análisis<br />
Observaciones<br />
adicionales<br />
56