APC Resistance - Stago BNL

3015121-008 08/2007
APC Resistance
GB
DE
REF 5344510 APC Resistance Kit
REF 5344515 APC Resistance Kit
REF 5344512 APC Control Kit 2 x 1 mL
Symbols key / Symbolschlüssel / interpretazione dei simboli / explicación de símbolos
manufactured by / Hergestellt von / prodotto da / fabricado por
expiry date / Verfallsdatum / data di scadenza / fecha de caducidad
storage temperature / Lagertemperatur / temperatura di conservazione /
temperatura de conservación
consult instruction for use / Gebrauchsanweisung beachten / / consultare le
istruzioni per l´uso / consulte las instrucciones de uso
CE-mark / CE-Zeichen / marchio CE / marca de CE
IT
ES
determinations/ Bestimmungen / determinazioni / determinaciones
AQUA
DIL
IVD
LOT
REF
CONT
distilled water / destilliertes Wasser / acqua distillata / agua destilada
dilute or disolve in / verdünnen oder lösen in / diluire o dissolvere in / diluir
o disolver
in vitro diagnostic use / in vitro Diagnostikum / diagnostico in vitro /
diagnóstico en vitro
lot / Charge / lotto / lote
catalogue number / Katalognummer / numero di catalogo / numéro de
catálogo
control / Kontrolle / controllo / control
Technoclone GmbH
Brunner Str. 59/5
1230 Vienna, Austria
www.technoclone.com

APC Resistance Kit
PRODUCT DESCRIPTION
INTENDEND USE
APC Resistance Kit is a plasma based functional assay for the
determination of resistance to activated protein C caused by the factor V
Leiden mutation (FV:Q 506 ). Activated protein C (APC) resistance is the most
frequent hereditary defect associated with deep vein thrombosis. Over 95%
of the APC resistance phenotype can be explained by the Factor V Leiden
mutation [1,2,3,4,5,6]. This defect is caused by point mutation in the factor
V gene resulting in a replacement of the amino acid Arg 506 by a Gln
residue [2,3,7]. The heterozygous (het) defect is associated with a 5 to 10
fold, the homozygous (hom) defect with a 50 to 100 fold increased
thrombosis risk [5,8,9]. There are two possibilities of detecting factor V (FV)
Leiden. Plasma based functional assays identifying the phenotype
expression of the defect [1] or genotype determination which can be done
by PCR technology [10].
TEST PRINCIPLE
APC Resistance Kit is a plasma based functional clotting assay and differs
from other functional APC resistance tests by acting specifically on the
prothrombinase complex level. It is based on a FV-dependent prothrombin
activator isolated from snake venom. Robustness and specificity of the
assay is enhanced by elimination of possible disturbing influences by
factors upstream the coagulation cascade and independency from calcium.
Interference from UFH, LMWH and Pentasaccharide in the blood sample is
precluded by a heparin inhibitor added to reagents 1 and 2. Sample plasma
is pre-diluted with reagent 4 (dilution plasma) and incubated at 37°C with
FV activator from snake venom (RVV-V from Daboia russelli). Coagulation
is triggered by the addition of a FV dependent prothrombin activator from
snake venom from Notechis scutatus scutatus in the absence of calcium.
The clotting times are recorded and the ratios (clotting time in the presence
of APC / clotting time in the absence of APC) are calculated.
COMPOSITION
3 x 2
3 x 2
3 x 4
3 x 2
1 x 1
1 x 1
mL
1 x 2
1 x 2
1 x 4
1 x 2
1 x 1
1 x 1
reagent other data
R1 APC / RVV-V (+APC)
R2 RVV-V (-APC)
R3 PTA Reagent
R4 Dilution Plasma
C1 FV-L Negative Control
C2 FV-L Heterozygous
Control
APC, RVV-V, Polybren,
Hepes, BSA, lyo
RVV-V, Polybren, Hepes,
BSA, lyo
Prothrombin Activator, EDTA,
Hepes, BSA, lyo
lyophilized Human Plasma,
processed
lyophilized Human Plasma
lyophilized Human Plasma
The APC Control Kit REF 5344512 contains one of C1 FV-L Negative
Control and C2 FV-L Heterozygous Control.
MATERIAL REQUIRED (not supplied with the kit)
Distilled water
- Calibrated pipettes
- Automated or semi-automated coagulation instruments which employ
mechanical or optical detection methods
Note: When using automated or semi-automated coagulation analyzers
refer always to manufacturer’s operator manual or ask for a detailed
adaptation protocol.
WARNING AND PRECAUTIONS
- IVD for in vitro diagnostic use.
- All blood and plasma samples and products have to be regarded as
potentially infectious and handled with appropriate care and in
compliance with the biosafety regulations in force and must be disposed
of in the same way as hospital waste.
- The reagents R1, R4, C1 and C2 contain products derived from human
blood and the samples have to be regarded as potentially infectious and
handled with appropriate care and in compliance with the biosafety
regulations in force and must be disposed of in the same way as hospital
waste. The reagents prepared from human blood and each single plasma
used is HbSAg, HIV 1/2 Ab and HCV Ab negative.
STABILITY AND STORAGE
The test kit may be used up to the expiry date given on the label when
stored unopened at 2…8 °C.
Stability of the reagents after reconstitution:
Stability +15...25°C +2...8°C -20°C
R1 APC / RVV-V (+APC), lyo
R2 RVV-V (-APC), lyo
R3 PTA Reagent, lyo
R4 Dilution Plasma
C1 FV-L Negative Control
C2 FV-L Heterozygous Control
24 hours
24 hours
24 hours
24 hours
8 hours
8 hours
14 days
14 days
14 days
14 days
8 days
8 days
6 months
6 months
6 months
6 months
6 months
6 months
Frozen reagents should be thawed at 37°C and gently mixed before use.
Freeze only once.
TEST PROCEDURE
BLOOD COLLECTION AND PREPARATION OF PLASMA
SAMPLES
The patient should be at rest for 10 min prior sampling. Collect venous
blood carefully in either 104 mM or 129 mM sodium citrate (volume ratio
9+1). Mix gently blood and anticoagulant directly after sampling, avoid foam
formation. Centrifuge immediately at no less than 2000x g for at least 20
min at room temperature. Take care to avoid contaminations from the
platelet layer into plasma when the plasma is separated from the cells. As a
general rule hemolytic plasma samples should not be used. For storage
freeze undiluted plasma rapidly at -70°C in aliquots. Freeze only once.
Avoid repeated freezing and thawing cycles. Thawing should be done
rapidly (within 5 min) in a water bath at 37°C. For more information see
NCCLS document H21-A2 [11].
Stability of undiluted samples (plasma):
-80 ° C -20 ° C + 2...8°C + 15...25 °C
at least 1 year 2 months 24 hours 4 hours
PREPARATION OF REAGENT
The lyophilized reagents are dissolved in the volume of distilled water
indicated on the vial.
Incubate reconstituted solutions R1-R4 and reconstituted C1 and C2
controls in closed vials for 30 min at room temperature and swirl gently
before use.
PERFORMANCE OF THE TEST
Prepare reagents as described above. Thaw frozen samples as described
above ensuring negligible loss of activity of labile coagulation factors and
absence of cryoprecipitate. Invert thawed sample for homogenization.
Determine +APC clotting time (clotting time in the presence of Activated
Protein C), -APC clotting time (clotting time in the absence of Activated
Protein C) and calculate the ratio according to the following scheme:
+ APC - APC
Sample or control Plasma 30 µL 30 µL
R4 Dilution Plasma 20 µL 20µL
mix prior to use mix prior to use
R1 APC/RVV-V
Reagent
(+ APC)
50 µL
R2 RVV-V (-APC) Reagent - 50 µL
Incubation 3 min, 37°C 3 min, 37°C
R3 PTA Reagent 50 µL 50 µL
determine determine
clotting time clotting time
Ratio
calculation
GB
+ APC clotting time
Ratio = -------------------------------
- APC clotting time

ANALYSES RESULTS
INTERPRETATION OF THE RESULTS
Differentiation of homozygous, heterozygous and negative samples is
based on the typical ratio ranges measured with genotyped patient plasma
samples
Typical ratio ranges for PCR-genotyped patient plasmas on different
devices are shown in the table below.
KC-4/-10 A Micro
Genotyp FV:Q 506 n Ratio Range (min/max)
negative 99 > 3.0
heterozygous 166 1.3 – 1.9
homozygous 25 0.9 – 1.1
BCS ® (Behring Coagulation System)
Genotyp FV:Q 506 n Ratio Range (min/max)
negative 143 > 3.0
heterozygous 170 1.4 – 2.2
homozygous 27 0.9 – 1.1
CA-1500 / CA-7000
Genotyp FV:Q 506 N Ratio Range (min/max)
negative 235 > 3.0
heterozygous 56 1.5 – 1.8
homozygous 2 1.0 – 1.1
ACL 9000
Genotyp FV:Q 506 n Ratio Range (min/max)
negative 127 > 3.0
heterozygous 119 1.4 – 2.1
homozygous 24 0.9 – 1.2
STA ® C
Genotyp FV:Q 506 n Ratio Range (min/max)
negative 134 > 2.9
heterozygous 83 1.3 – 1.8
homozygous 27 0.9 – 1.1
AMAX CS-190
Genotyp FV:Q 506 n Ratio Range (min/max)
negative 74 > 3.0
heterozygous 62 1.2 – 2.3
homozygous 10 0.9 – 1.1
It is recommended to determine laboratory specific ratio ranges with
geotyped patient samples.
Attention: Factors mentioned under “Limitations and Interferences” can
change the specific ratio ranges, so that differenciation of samples become
impossible.
QUALITY CONTROLS (C1 and C2)
Negative control or wild-type (neg) shows normal response to APC whereas
heterozygous control (het) shows response to the presence of the
heterozygous type of FV:Q 506 mutation. A control run should be made with
each test series. If values outside the certified range (ratio) are obtained, a
complete check of reagents should be made and the analysis should be
repeated. If the problem persists, a complete instrument check should be
made and the analysis should be repeated.
Device: C1 FV-L-
Negative
Control
C2 FV-L
Heterozygous
Control
KC-4/-10 A Micro > 5.1 1.4 – 1.8
BCS ® (Behring
System)
Coagulation > 4.0 1.4 – 2.1
CA-1500 / CA-7000 > 4.0 1.6 – 2.0
ACL 9000 > 4.0 1.3 – 2.4
AMAX CS-190 > 2.4 1.3 – 2.0
STA ® -C > 3.1 1.4 – 1.7
If values outside these ranges are obtained the test results are not valid and
shall not be used for diagnostic purposes. When controls are used in
combination with another suitable test or instrument expected ratio values
may be different and have to be determined locally under appropriate
conditions.
SPECIFICITY AND SENSITIVITY
With the samples tested so far APC Resistance Kit provided 100%
sensitivity and 100% specificity for carriers of heterozygous and
homozygous FV:Q 506 mutation as determined by BCS ® (n=340), KC-4/-10
A micro (n=290), CA-1500/CA-7000 (n=293), ACL 9000 (n=270), STA ®
C (n=244) and AMAX CS-190 (n=146). Due to the functional detection
technique the assay is supposed to detect other FV mutations leading to
APC-R phenotype as well. However their prevalence is very low compared
to the FV Leiden mutation.
LIMITATION AND INTERFERENCES
No significant differences are observed when fresh or frozen plasma
samples are used. It does neither matter whether buffered or un-buffered
citrate plasma is used.
There is no significant influence on ratio or test sensitivity in case of
Fibrinogen, Prothrombin, FVIII, FX, ATIII, Protein C, or Protein S deficiency
(up to 100%) or excess of Fibrinogen, FVIII, ATIII, or TFPI (up to 5 times
normal value). Mechanical measurements are neither influenced by the
hemolytic blood samples nor by samples containing platelet residues. In
contrast, optical methods can be influenced by the use of hemolytic or
lipemic plasmas. Lupus anticoagulant antibodies did not influence the test.
But a high Factor V deficiency (

APC Resistance Kit
PRODUKTBESCHREIBUNG
ANWENDUNG
APC Resistance Kit ist ein funktioneller Gerinnungstest zur Bestimmung
einer auf der FV-Leiden Mutation (FV:Q 506 ) basierenden Resistenz gegen
aktiviertes Protein C (APC-R). Häufigste Ursache einer erblich bedingten
tiefen Beinvenenthrombose ist eine Resistenz gegen aktiviertes Protein C
(APC). In über 95% der Fälle manifestiert sich diese phänotypisch durch die
FV Leiden (FVL) Mutation [1,2,3,4,5,6]. FVL basiert auf einer Punktmutation
im FV-Gen, einem Austausch der Aminosäure Arginin 506 durch Glutamin
[2,3,7]. Ein heterozygoter Genotyp (het) ist mit einer 5- bis 10-fachen und
ein homozygoter Genotyp (hom) mit einer 50- bis 100-fachen Erhöhung des
Thromboserisikos verbunden [5,8,9]. Der Nachweis des FVL-Phänotyps
erfolgt im Blutplasma mittels funktioneller Gerinnungstests [1]; die Genotypisierung
mit Hilfe PCR-basierter Methoden [10].
TESTPRINZIP
Im Unterschied zu anderen am Markt erhältlichen funktionellen
Gerinnungstesten erfolgt beim APC Resistance Kit die Aktivierung auf der
Ebene des Prothrombinasekomplexes durch einen FVa abhängigen
Prothrombinaktivator, isoliert aus dem Gift der australischen Tigerotter
(Notechis scutatus). Dies eliminiert potenzielle Störeinflüsse durch
vorgelagerte Faktoren der Gerinnungskaskade. Die geringe Störanfälligkeit
und Spezifität des Tests wird des Weiteren unterstützt durch die
Unabhängigkeit von Kalziumionen. Einflüsse von unfraktioniertem Heparin
(UFH), niedermolekularem Heparin (LMWH) oder Pentasaccharid in der
Blutprobe werden durch Polybrenzusatz in Reagenz 1 und 2 neutralisiert.
Das Probenplasma wird mit Reagenz 4 (Dilution Plasma) verdünnt und in
Gegenwart oder Abwesenheit von APC bei 37°C mit einem Faktor V
Aktivator (RVV-V), isoliert aus dem Gift der Kettenviper (Daboia russelli),
inkubiert. Die Gerinnung wird in Abwesenheit von Kalzium durch Zusatz des
FVa abhängigen Prothrombinaktivators ausgelöst. Die Gerinnungszeiten
werden bestimmt und die Ratio (Gerinnungszeit in Gegenwart von APC /
Gerinnungszeit in Abwesenheit von APC) berechnet.
ZUSAMMENSETZUNG
3 x 2
3 x 2
3 x 4
3 x 2
1 x 1
1 x 1
mL
1 x 2
1 x 2
1 x 4
1 x 2
1 x 1
1 x 1
Reagenz Sonstige Angaben
R1 APC / RVV-V (+APC)
R2 RVV-V (-APC)
R3 PTA Reagenz
R4 Verdünnungsplasma
C1 FV-L Negative
Kontrolle
C2 FV-L Heterozygote
Kontrolle
APC, RVV-V, Polybren,
Hepes, BSA, lyo
RVV-V, Polybren, Hepes,
BSA, lyo
Prothrombin Activator, EDTA,
Hepes, BSA, lyo
lyophilisiertes Human Plasma,
behandelt
lyophilisiertes Human Plasma
lyophilisiertes Human Plasma
Der APC Control Kit REF 5344512 enthält jeweils eine C1 FV-L Negativ
Kontrolle und eine C2 FV-L Heterozygote Kontrolle.
BENÖTIGTES MATERIAL (nicht im Testkit enthalten)
- Destilliertes Wasser
- Kalibrierte Pipetten
- Voll- oder halbautomatisches Koagulometer, mit optischer oder
mechanischer Gerinnungserkennung.
Hinweis: Bei Verwendung automatisierter oder halbautomatisierter
Gerinnungsgeräte beachten Sie bitte die Bedienungsanleitung oder
fragen Sie nach detaillierten Adaptionsprotokollen.
WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN
- Nur zur Anwendung als in vitro Diagnostikum
- Alle Blut- bzw. Plasmaprodukte und Proben müssen als potentiell
infektiös angesehen werden. Sie sind mit der notwendigen Sorgfalt und
entsprechend den Sicherheitsvorschriften zu behandeln und wie
Krankenhausmüll zu entsorgen.
- Die Reagenzien R1, R4, C1 und C2 sind Blut- bzw. Plasmaprodukte und
müssen ebenso wie die Proben als potentiell infektiös angesehen
werden. Sie sind mit der notwendigen Sorgfalt und entsprechend den
Sicherheitsvorschriften zu behandeln und wie Krankenhausmüll zu
entsorgen. Die Reagenzien R1, R4, C1 und C2, hergestellt aus
humanem Blut, und jedes hierzu verwendete Einzelplasma sind HBSAg,
HIV Ak und HCV Ak negativ.
LAGERUNG UND HALTBARKEIT
Der Testkit ist ungeöffnet bei 2-8°C bis zu dem auf dem Etikett
aufgedruckten Datum verwendbar. Stabilität der Reagenzien nach
Rekonstitution:
Stabilität +15...25°C +2...8°C -20°C
R1 APC / RVV-V (+APC), lyo
R2 RVV-V (-APC), lyo
R3 PTA Reagent, lyo
R4 Verdünnungsplasma
C1 FV-L Negativ Kontrolle
C2 FV-L Heterozygote Kontrolle
24 Stunden
24 Stunden
24 Stunden
24 Stunden
8 Stunden
8 Stunden
14 Tage
14 Tage
14 Tage
14 Tage
8 Tage
8 Tage
6 Monate
6 Monate
6 Monate
6 Monate
6 Monate
6 Monate
Tiefgefrorene Reagenzien sollten bei 37°C aufgetaut und vor Gebrauch
schonend gemischt werden. Nur einmal einfrieren..
TESTDURCHFÜHRUNG
PLASMAGEWINNUNG UND VORBEREITUNG DER
PLASMAPROBE
Der Patient sollte vor der Probennahme mindestens 10 Minuten ruhen. Zur
Plasmagewinnung 1 Teil Natriumcitrat (104 mM) mit 9 Teilen Venenblut
sorgfältig unter Vermeidung von Schaumbildung mischen. Sofort 20
Minuten bei Raumtemperatur mit mindestens 2000 g zentrifugieren. Beim
Abheben des Plasmas Kontamination durch Thrombozyten vermeiden. Es
sollten generell keine hämolytischen Plasmaproben verwendet werden. Für
die Lagerung das aliquotierte, unverdünnte Plasma rasch bei -70°C
einfrieren. Nur einmal einfrieren. Wiederholte Auftau- und Gefrierzyklen sind
zu vermeiden. Das Auftauen sollte rasch (innerhalb 5 Minuten) in einem
37°C Wasserbad erfolgen. Weitere Informationen entnehmen Sie dem
NCCLS Dokument H21 A2 [11].
Haltbarkeit von unverdünnten Proben:
-80 ° C -20 ° C + 2...8°C + 15...25 °C
Mind. 1 Jahr 2 Monate 24 Stunden 4 Stunden
VORBEREITUNG DER REAGENZIEN
Die lyophillisierten Reagenzien werden mit destillierten Wasser im am
Etikett angegebenen Volumen gelöst. Die aufgelösten Reagenzien R1-R4
sowie die Kontrollen C1 und C2 werden 30 Minuten bei Raumtemperatur
inkubiert und vor Gebrauch vorsichtig geschüttelt.
TESTDURCHFÜHRUNG
Bereiten Sie Reagenzien und Probenmaterial wie oben beschrieben vor.
Tauen Sie zur Vermeidung von Aktivitätsverlusten labiler
Gerinnungsfaktoren und Kryopräzipitaten gefrorene Proben rasch bei 37°C
in standardisierter Art und Weise auf. Mischen Sie sie vorsichtig unter
Vermeidung von Schaumbildung. Bestimmen Sie die Gerinnungszeiten in
Anwesenheit (+APC) und Abwesenheit (-APC) von aktiviertem Protein C
und berechnen Sie anschliessend deren Verhältnis (Ratio). Verfahren Sie
dabei nach folgendem Schema:
+ APC - APC
Probe oder Kontrolle 30 µL 30 µL
R4 Verdünnungsplasma 20 µL 20µL
mischen mischen
R1 APC/RVV-V
Reagenz
(+ APC)
50 µL
R2 RVV-V (-APC) Reagenz - 50 µL
Inkubation 3 min, 37°C 3 min, 37°C
R3 PTA Reagenz 50 µL 50 µL
Gerinnungszeit Gerinnungszeit
bestimmen bestimmen
Ratio
Berechnung
DE
+ APC Gerinnungszeit
Ratio = -------------------------------
- APC Gerinnungszeit

ANALYSENERGEBNISSE
INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
Die Unterscheidung bezüglich FVL von homozygoten, heterozygoten und
negativen Proben basiert auf typischen Bereichen für die Ratio, wie sie für
Plasmaproben genotypisierter Patienten bestimmt werden (siehe untenstehende
Tabellen
Typische Ratio Bereiche für Plasmaproben genotypisierter Patienten auf
verschiedenen Gerinnungsautomaten:
KC-4/-10 A Micro
Genotyp FV:Q 506 n Ratio Bereich (min/max)
negativ 99 > 3.0
heterozygot 166 1.3 – 1.9
homozygot 25 0.9 – 1.1
BCS ® (Behring Coagulation System)
Genotyp FV:Q 506 n Ratio Bereich (min/max)
negativ 143 > 3.0
heterozygot 170 1.4 – 2.2
homozygot 27 0.9 – 1.1
CA-1500 / CA-7000
Genotyp FV:Q 506 n Ratio Bereich (min/max)
negativ 235 > 3.0
heterozygot 56 1.5 – 1.8
homozygot 2 1.0 – 1.1
ACL 9000
Genotyp FV:Q 506 n Ratio Bereich (min/max)
negativ 127 > 3.0
heterozygot 119 1.4 – 2.1
homozygot 24 0.9 – 1.2
STA ® C
Genotyp FV:Q 506 n Ratio Bereich (min/max)
negativ 134 > 2.9
heterozygot 83 1.3 – 1.8
homozygot 27 0.9 – 1.1
AMAX CS-190
Genotyp FV:Q 506 n Ratio Bereich (min/max)
negativ 74 > 3.0
heterozygot 62 1.2 – 2.3
homozygot 10 0.9 – 1.1
Es wird empfohlen mit genotypisierten Plasmen die Referenzbereiche und
Cut-offs für jedes Labor und Koagulometer individuell zu ermitteln.
Weiters ist zu beachten, dass verschiedene Störfaktoren (siehe
„Einschränkungen der Testdurchführung“) bewirken, dass Ratios erhalten
werden, die nicht sicher einem Genotyp zugeordnet werden können.
QUALITÄTSKONTROLLEN (C1 und C2)
Die Normalkontrolle (C1, FV-L Negative Kontrolle) repräsentiert den
normalen Phänotyp, während die pathologische Kontrolle (C2, FV-L
Heterozygote Kontrolle) den positiven Phänotyp für FV-Leiden
repräsentiert. Die Kontrollen sollten in jeder Testserie mitgeführt werden.
Falls die ermittelten Werte ausserhalb der für die Kontrollen zertifizierten
Bereiche (Ratios) liegen, ist eine komplette Überprüfung der verwendeten
Reagenzien durchzuführen und die Analyse sollte wiederholt werden.
Besteht das Problem weiter, ist eine Überprüfung des verwendeten
Gerinnungsgerätes notwendig. Die Analyse ist zu wiederholen.
Gerät: C1 FV-L-
Negative
Kontrolle
C2 FV-L
Heterozygote
Kontrolle
KC-4/-10 A Micro > 5,1 1,4 – 1,8
BCS ® (Behring
System)
Coagulation > 4,0 1,4 – 2,1
CA-540 > 5,4 1,5 – 1,9
CA-1500 > 4,1 1,6 – 2,3
CA-7000 > 2,8 1,4 – 1,6
ACL 9000 > 4,0 1,3 – 2,4
AMAX CS-190 > 2,4 1,3 – 2,0
STA ® -C > 3,1 1,4 – 1,7
Sollten Ergebnisse erhalten werden, welche außerhalb der angegebenen
Bereiche liegen, so sind die Probenergebnisse ungültig und dürfen nicht für
diagnostische Befunde verwendet werden.
Werden die Kontrollen in Kombination mit einem anderen APC Resistance
Testsystem oder anderen Koagulometern verwendet, so können andere
Ratios erhalten werden. In diesem Fall müssen die Bereiche unter
geeigneten Bedingungen im Labor ermittelt werden.
SPEZIFITÄT UND SENSITIVITÄT
Mit den bisher getesteten genotypisierten Patientenproben zeigt der APC
Resistance Kit eine 100%-ige Sensitivität und Spezifität für die Detektion
heterozygoter und homozygoter Träger der FVL-Mutation. Die
Bestimmungen wurden mit folgenden Geräten durchgeführt: BCS ® (n=340),
KC-4/-10 A micro (n=290), CA-1500/CA-7000 (n=293), ACL 9000
(n=270), STA ® C (n=244) und AMAX CS-190 (n=146). Aufgrund des
funktionalen Nachweisprinzips sollte der Test neben der FV Leiden
Mutation auch andere Störungen einer FV-basierten phänotypischen APC-
R nachweisen können. Die Prävalenz ist verglichen mit der FVL-Mutation
jedoch sehr gering.
EINSCHRÄNKUNGEN DER TESTDURCHFÜHRUNG
Für das Ergebnis macht es keinen signifikanten Unterschied, ob mit
frischen oder eingefrorenen und wieder aufgetauten Proben gearbeitet wird.
Auch die Verwendung von gepuffertem vs. ungepuffertem Zitratplasma hat
keinen störenden Einfluss auf die Messergebnisse.
Ein bis zu 100%-iger Mangel der Faktoren Fibrinogen, Prothrombin, FVIII,
FX, ATIII, Protein C und Protein S, sowie ein Überschuss bis zum 5-fachen
der Normalwerte von Fibrinogen, FVIII, ATIII und TFPI hat in
experimentellen Untersuchungen keinen Einfluss auf die Ratio oder die
Sensitivität des Testes gezeigt. Weder hämolytische Proben noch
Kontamination durch Thrombozyten stören mechanische Messmethoden.
Optische Messmethoden können hingegen durch hämolytische oder
lipämische Plasmen beeinflusst werden. LA Antikörper haben keine Störung
des Tests ergeben. Ein schwerer Mangel an FV (

APC Resistance Kit
DESCRIZIONE DEL PRODOTTO
APPLICAZIONE
APC Resistance Kit è un test per la determinazione nel plasma della
resistenza alla Proteina C attivata, causata dalla mutazione del fattore
V:Q506 La resistenza alla Proteina C attivata (APC) si riferisce alla più
frequente causa ereditaria che predispone alla trombosi venosa profonda. Il
fenotipo APC resistente è, in oltre 95% dei casi, dovuto ad una mutazione
del gene del fattore V Leiden [1,2,3,4,5,6], che comporta la sostituzione
dell’Arginina con la Glutamina nella posizione 506 della proteina fattore V
[2,3,7]. I soggetti eterozigoti hanno un rischio di 5-10 volte superiore di
sviluppare una trombosi venosa, mentre gli omozigoti hanno un rischio di
50-100 volte [5,8,9].
La rilevazione del fattore V Leiden viene effettuata con test funzionali nel
plasma che indentificano il fenotipo della sindrome di Leiden [1] o con
determinazioni del genotipo mediante tecniche di amplificazione genetica
(PCR) [10].
PRINCIPIO DEL TEST
APC Resitance Kit è un test funzionale di coagulazione nel plasma e si
differenzia da altri test funzionali perché agisce specificamente a livello del
complesso protrombinase. Il test si basa su un attivatore della protrombina,
dipendente dal fattore V, isolato da veleno di serpente (Notechis scutatus).
La precisione e la specificità del test è molto alta a causa dell’eliminazione
di possibili influenze dovute a fattori che provengono dalla parte superiore
della cascata coagulativa ed in più il test è indipendente dal calcio. Nel
campione di sangue vengono neutralizzate interferenze da parte
dell'eparina non frazionata (UFH), delle eparine a basso peso molecolare
(LMWH) e del pentasaccaride tramite l'aggiunta di polibrene nei reagenti 1
e 2. I campioni di plasma vengono prediluiti con plasma di diluizione (R4)
ed incubati a 37°C con l'attivatore del fattore V proveniente dal veleno di
serpente (RVV-V, Daboia russelli) in presenza o assenza della APC. La
coagulazione viene innescata attraverso l’aggiunta di un attivatore della
protrombina estratto dal veleno del serpente Notechis scutatus in assenza
di calcio. Si registra il tempo di formazione del coagulo e si calcola la ratio
(tempo di coagulazione in presenza della APC / tempo di coagulazione in
assenza della APC).
COMPOSIZIONE
3 x 2
3 x 2
3 x 4
3 x 2
1 x 1
1 x 1
mL
1 x 2
1 x 2
1 x 4
1 x 2
1 x 1
1 x 1
Reagent Altri Datas
R1 APC / RVV-V (+APC)
R2 RVV-V (-APC)
R3 PTA Reagent
R4 Dilution Plasma
C1 FV-L Negativ
Control
C2 FV-L Heterozygous
Control
APC, RVV-V, Polybrene,
Hepes, BSA, liofilizzati
RVV-V, Polybrene, Hepes,
BSA, liofilizzati
attivatore della protrombina,
EDTA, Hepes, BSA),
liofilizzati
Plasma umano, liofilizzati,
trattato
Plasma umano, liofilizzati
Plasma umano, liofilizzati
APC Control Kit REF 5344512 contiene uno di C1 FV-L Negative Control e
uno di C2 FV-L Heterozygous Control.
MATERIALE RICHIESTO (non compreso nel kit di test)
- Acqua Distillata
- Pipetta di precisione calibrata
- strumenti automatici o semiautomatici con metodo di rilevazione
ottica o meccanica
Annotazione: Se si utilizzano analizzatori automatici o semiautomatici
riferirsi sempre al Manuale dell’Operatore o richiedere il dettagliato
protocollo d'adattamento per ulteriori informazioni.
AVVERTENZE E MISURE PRECAUZIONALI
- Applicazione prevista esclusivamente come diagnostico in vitro
- I reagenti R1, R4, C1 e C2 contengono prodotti di origine umana.
Il sangue e i campioni devono essere trattati come potenzialmente
infetti e devono essere trattati e maneggiati con la cura opportune, in
accordo con le normative di sicurezza vigenti e devono essere smaltiti
idoneamente quali rifiuti ospedalieri, I reattivi preparati da sangue
umano e ogni singolo plasma usato sono negativi ai test HbSAg, HIV
1/2 Ab e HCV Ab.
CONSERVAZIONE E STABILITÀ
Prima dell'apertura, se conservati a 2-8°C, i componenti del APC
Resistance Kit sono stabili fino alla data di scadenza riportata sull'etichetta.
Stabilità dei reagenti dopo ricostituzione:
Stabilità +15...25°C +2...8°C -20°C
R1 APC / RVV-V (+APC), lio.
R2 RVV-V (-APC), lio.
R3 PTA Reagent, lio.
R4 Dilution plasma
C1 FV-L Negative Control
C2 FV-L Heterozygous Control
24 ore
24 ore
24 ore
24 ore
8 ore
8 ore
14 giorni
14 giorni
14 giorni
14 giorni
8 giorni
8 giorni
6 mesi
6 mesi
6 mesi
6 mesi
6 mesi
6 mesi
I reagenti congelati vanno scongelati a 37°C ed agitati con delicatezza
prima dell'uso. Congelare una sola volta
ESECUZIONE DEL TEST
PRELIEVO DEL SANGUE E PREPARAZIONE DEI CAMPIONI DI
PLASMA
Il paziente deve restare a riposo per 10 minuti prima del prelievo. Prelevare
sangue venoso attentamente e mescolare accuratamente 1 parte di
soluzione di citrato di sodio 104 mM con 9 parti di sangue venoso. Evitare
la formazione di schiuma. Centrifugare immediatamente a una velocità non
inferiore a 2000x g per almeno 20 minuti a temperatura ambiente. Avere
cura di evitare la contaminazione piastrinica del plasma quando viene
separato dalle cellule. Non utilizzare mai plasma emolitico. Per la
conservazione congelare il plasma non diluito rapidamente a -70°C in
aliquote. Congelare una sola volta. Evitare di ricongelare e disgelare
ripetutamente. In modo di evitare il decremento dei fattori labili della
coagulazione e garantire l'assenza di crioprecipitato, i campioni vanno
scongelati rapidamente (entro 5 minuti) a bagno-maria a 37°C. Per ulteriori
informazioni vedere il documento NCCLS H21-A2 [11].
Stabilità dei campione non diluiti (plasma):
-80 ° C -20 ° C + 2...8°C + 15...25 °C
at least 1 year 2 mesi 24 ore 4 ore
PREPARAZIONE DEI REAGENTI
I reagenti liofilizzati vanno disciolti nel volume di acqua distillate indicate
sulla fiala del reagente stesso.
Incubare le soluzioni ricostituite R1-R4 e i controlli ricostituiti C1 e C2 in
fiale chiuse per 30 min a temperatura ambiente e agitare delicatamente
prima dell’uso.
ESECUZIONE DEL TEST
IT
Preparare i reagenti e campioni di plasma come descritto sopra.
Scongelare i campione congelati come descritto precedentemente
assicurandosi dell’assenza di criopecipitati e della perdita trascurabile di
attività dei fattori di coagulazione. Omogeneizzare i campioni scongelati di
plasma per inversione. Evitare la formazione di schiuma. Determinare il
tempo di coagulazione +APC (tempo di coagulazione in presenza della
APC), il tempo di coagulazione -APC (tempo di coagulazione in assenza
della APC) e calcolare la ratio della APC come segue:
+ APC - APC
Campione o plasma di
controllo
30 µL 30 µL
R4 Dilution Plasma 20 µL 20µL
agitare prima agitare prima
dell’ uso dell’ uso
R1 APC/RVV-V
Reagent
(+ APC)
50 µL
R2 RVV-V (-APC) Reagent - 50 µL
Incubare 3 minuti a 37°C 3 minuti a 37°C
R3 PTA Reagent 50 µL 50 µL
determinare il determinare il
tempo di tempo di
coagulazione coagulazione
Calcolo
tempo di coagulazione +APC
della ratio
Ratio = ------------------------------tempo
di coagulazione -APC

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
La differenziazione tra omozigoti, eterozigoti e campioni negativi si
basa sugli intervalli tipici per la ratio descritti per campioni di plasma di
pazienti genotipizzati (vedere tabella sottostante)
Intervalli per le ratio tipici per plasma di pazienti genotipizzati effettuati
con differenti analizzatori per determinare i tempi di coagulazione
KC-4/-10 A Micro
Genotipo FV:Q 506 n Intervallo della Ratio (min/max)
negativo 99 > 3.0
eterozigote 166 1.3 – 1.9
omozigote 25 0.9 – 1.1
BCS ® (Behring Coagulation System)
Genotipo FV:Q 506 n Intervallo della Ratio (min/max)
negativo 143 > 3.0
eterozigote 170 1.4 – 2.2
omozigote 27 0.9 – 1.1
CA-1500 / CA-7000
Genotipo FV:Q 506 n Intervallo della Ratio (min/max)
negativo 235 > 3.0
eterozigote 56 1.5 – 1.8
omozigote 2 1.0 – 1.1
ACL 9000
Genotipo FV:Q 506 n Intervallo della Ratio (min/max)
negativo 127 > 3.0
eterozigote 119 1.4 – 2.1
omozigote 24 0.9 – 1.2
STA ® C
Genotipo FV:Q 506 n Intervallo della Ratio (min/max)
negativo 134 > 2.9
eterozigote 83 1.3 – 1.8
omozigote 27 0.9 – 1.1
AMAX CS-190
Genotipo FV:Q 506 n Intervallo della Ratio (min/max)
negativo 74 > 3.0
eterozigote 62 1.2 – 2.3
omozigote 10 0.9 – 1.1
SI RACCOMANDA di determinare i valori degli intervalli di ratio del
laboratorio usando campioni di pazienti genotipizzati.
Attenzione: gli aspetti indicate nella sezione “Limitazioni ed interferenze”
possono cambiare gli intervalli specifici di ratio, cosicché la differenziazione
dei campioni diviene impossibile.
CONTROLLI DI QUALITÀ (C1 e C2)
Il controllo negative o wild-type (neg) mostra normale risposta alla APC
laddove il controllo eterozigote (het) mostra risposta alla presenza della
mutazione eterozigote di FV:Q 506 . si raccomanda di eseguire il controllo ad
ogni seduta di lavoro. In caso si ottengano risultati fuori dall’intervallo
certificato si raccomanda di controllare tutti I reattivi e di Ripetere l’analisi.
Se il problema persiste controllare anche lo strumento e Ripetere
nuovamente l’analisi.
STRUMENTO C1 FV-L-
Negativ
Control
C2 FV-L
Heterozygous
Control
KC-4/-10 A Micro > 5,1 1,4 – 1,8
BCS ® (Behring
System)
Coagulation > 4,0 1,4 – 2,1
CA-1500 / CA-7000 > 4,0 1,6 – 2,0
ACL 9000 > 4,0 1,3 – 2,4
AMAX CS-190 > 2,4 1,3 – 2,0
STA ® -C > 3,1 1,4 – 1,7
In caso si ottengano nuovamente risultati fuori dagli intervalli considerare la
seduta non valida allo scopo diagnostico.
In caso I controlli siano usati in combinazione con un altro test idoneo o su
un altro strumento I valori di ratio potrebbero essere diversi dall’atteso e
vanno quindi ricalcolati in base alle nuove condizioni di lavoro appropriate.
SPECIFICITÀ E SENSIBILITÀ
La determinazione dei campioni di plasma genotipizzati finora effettuata con
il kit APC Resistance ha indicato valori di sensibilità del 100% e di
specificità del 100% per il fattore V Leiden (FV:Q 506 ) etero- ed omozigote. I
risultati sono stati rilevati con i seguenti strumenti: BCS ® (n=340), KC-4/-10
A micro (n=290), CA-1500/CA-7000 (n=293), ACL 9000 (n=270), STA®
C (n=244) e AMAX CS-190 (n=146).
In base alla tecnica di rilevazione funzionale si suppone che il test
determini anche altre mutazioni del Fattore V che conducono al fenotipo
APC-R. Tuttavia la loro prevalenza è molto bassa paragonata alla
mutazione del fattore V Leiden.
LIMITAZIONI ED INTERFERENZE DEL TEST
Per i risultati non sono state osservate differenze significative tra campioni
di plasma fresco, di plasma congelato o plasma scongelato più volte.
L'utilizzo di plasma citrato tamponato vs plasma citrato non tamponato non
interferisce sulla misurazione dei risultati. Non esistono influenze rilevanti
sulla ratio o perdite di sensibilità nel caso di deficienza fino al 100% di
fibrinogeno, della protrombina, del FVIII, del FX, della ATIII, della Proteina
C o della Proteina S o nel caso di eccesso fino a 5 volte al di sopra dei
valori normali di fibrinogeno, del FVIII, della ATIII o del TFPI. Nel caso di
strumenti con metodo di rilevazione meccanica il test non è condizionato da
campioni di sangue emolitici o da campioni di sangue contenenti piastrine.
Nel caso di strumenti con metodo di rilevazione ottica il test può essere
condizionato da campioni di sangue emolitici o da campioni di sangue
lipemici. Inoltre gli anticorpi lupus anticoagulanti non interagiscono con il
test. Una deficienza severa del fattore V (

APC Resistance Kit
DESCRIPCIÓN DEL PRODUCTO
USO PREVISTO
APC Resistance Kit es una prueba de coagulación funcional para la
determinación de la resistencia a la proteína C activada causada por una
mutación en el factor V Leiden (FV:Q 506 ). La causa más frecuente de la
afección hereditaria trombosis venosa profunda de las piernas es una
resistencia a la proteína C activada (APC). En más del 95% de los casos,
ésta se manifiesta fenotípicamente debido a una mutación del FV Leiden
(FVL) [1,2,3,4,5,6]. El FVL se debe a una mutación puntual en el gen del
FV, en el que se ha producido un cambio del aminoácido 506 arginina por
glutamina [2,3,7]. La condición heterocigota (het) está asociada a un
aumento del riesgo de trombosis de 5 a 10 veces, mientras que la
condición homocigota (hom) está asociada a un aumento de este riesgo de
50 a 100 veces [5,8,9]. La determinación del fenotipo FVL se realiza en el
plasma mediante una prueba de coagulación funcional [1] y la del genotipo
se realiza mediante métodos basados en la PCR [10].
PRINCIPIO DEL TEST
A diferencia de otras pruebas de coagulación funcional comerciales, en el
caso del APC Resistance Kit, la activación del complejo de protrombina se
produce por un activador de la protrombina dependiente del factor FVa,
aislado del veneno de la víbora tigre australiana (Notechis scutatus), lo cual
elimina potenciales interferencias debidas a factores de la cascada de
coagulación acumulados. Esta menor interferencia y especificidad de la
prueba se ve favorecida, además, por el hecho de ser independiente del
calcio endógeno. Las interferencias producidas en la muestra de sangre
por heparina no fraccionada (UFH), heparina de bajo peso molecular
(LMWH) o por Pentasacárido, también se neutralizan por la adición de
Polibreno (un inhibidor de la heparina) a los reactivos 1 y 2. El plasma
problema se mezcla con el reactivo 4 (Dilution Plasma) y se incuba a 37°C,
en presencia o ausencia de APC, con un activador del factor V (RVV-V),
aislado del veneno de víbora de Russel (Daboia russelli). La coagulación se
desencadena en ausencia de calcio por la adición del activador de la
protrombina dependiente del FVa. Se determinan los tiempos de
coagulación y se calcula el cociente (tiempo de coagulación en presencia
de APC / tiempo de coagulación en ausencia de APC).
COMPOSICIÓN
3 x 2
3 x 2
3 x 4
3 x 2
1 x 1
1 x 1
mL
1 x 2
1 x 2
1 x 4
1 x 2
1 x 1
1 x 1
Reactivo Otros Datos
R1 APC / RVV-V (+APC)
R2 RVV-V (-APC)
R3 Reactivo PTA
R4 Dilution Plasma
C1 FV-L Control Negativo
C2 FV-L Control
Heterocigoto
APC, RVV-V, Polibreno,
Hepes, BSA, liofilizados
RVV-V, Polibreno, Hepes,
BSA, liofilizados
Activator de la Protrombina,
EDTA, Hepes, BSA, liofilzados
Plasma humano liofilizado,
procesado
Plasma humano liofilizado
Plasma humano liofilizado
El kit Control APC REF 5344512 contiene un Control Negativo C1 FV-L y
un Control Heterocigoto C2 FV-L.
MATERIAL NECESARIO (no incluido en el kit)
- Agua destilada
- Pipetas calibradas
- Aparatos de coagulación automatizados o semi-automatizados,
que utilizan métodos de detección mecánicos u ópticos.
Nota: Cuando utilice aparatos de coagulación automatizados o
semiautomatizados siga las instrucciones de uso o solicite protocolos
de adaptación detallados.
ADVERTENCIAS Y MEDIDAS DE PRECAUCIÓN
- Sólo para su uso en diagnóstico in vitro.
- Todas las muestras de sangre y plasma y productos deben considerarse
como potencialmente infecciosos y manipularse con el correspondiente
cuidado y de conformidad con las normas de seguridad aplicables,
siendo por tanto desechados como residuos del hospital.
- Los reactivos R1, R4, C1 y C2 que contienen productos derivados de
sangre humana y las muestras deben ser tratadas como potencialmente
infecciosas, esto es, manipuladas con el apropiado cuidado y de
acuerdo con las normas de seguridad vigentes y desechadas como
residuos hospitalarios. Los reactivos preparados a partir de sangre
humana y cada uno de los plasmas usados, son negativos para las
siguientes pruebas: Antígeno de superficie de la Hepatitis B (HBsAg),
VIH 1/2 Ab y HCV Ab.
ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO
Este kit sin abrir y almacenado a una temperatura entre 2º y 8°C se
conserva hasta la fecha de caducidad impresa en su etiqueta.
Estabilidad de los reactivos tras la reconstitución:
Estabilidad +15...25°C +2...8°C -20°C
R1 APC / RVV-V (+APC), lio.
R2 RVV-V (-APC), lio.
R3 Reactivo PTA, lio.
R4 Dilution Plasma
C1 FV-L Control Negativo
C2 FV-L Control Heterocigoto
24 horas
24 horas
24 horas
24 horas
8 horas
8 horas
14 días
14 días
14 días
14 días
8 días
8 días
6 meses
6 meses
6 meses
6 meses
6 meses
6 meses
Los reactivos congelados deberán descongelarse a 37°C y ser mezclados
cuidadosamente antes de su uso. Congelar sólo una vez.
REALIZACIÓN DEL TEST
OBTENCIÓN DE SANGRE Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
DE PLASMA
El paciente deberá estar en reposo durante 10 minutos como mínimo antes
de la extracción de la muestra. Para la obtención del plasma se mezclará
cuidadosamente 1 parte de citrato sódico (104 Mm o 129 Mm) con 9 partes
de sangre venosa, evitando en todo momento la formación de espuma.
Centrifugar inmediatamente después, durante al menos 20 minutos a
temperatura ambiente y a 2000xg como mínimo. Al extraer el plasma
deberá evitarse la contaminación con trombocitos. Por regla general, no se
debería usar ninguna muestra de plasma hemolítica. El plasma sin diluir y
en alícuotas deberá congelarse inmediatamente a -70°C. Congelar sólo
una vez. Evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación. Para evitar
pérdidas de actividad de los factores de coagulación más lábiles y la
formación de crioprecipitados; la descongelación se deberá realizar de
forma rápida (en el plazo de 5 minutos) en un baño de agua a 37°C. Puede
obtener más información en el documento NCCLS H21 A2 [11].
Estabilidad de las muestras sin diluir (plasma):
-80 ° C -20 ° C + 2...8°C + 15...25 °C
Al menos 1 año 2 meses 24 horas 4 horas
PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS
Los reactivos liofilizados son disueltos con el volumen de agua destilada
indicado en el vial.
Incubar las soluciones reconstituidas de R1-R4 y de los controles C1 y C2
en viales cerrados durante 30 min. a temperatura ambiente y agitar con
delicadeza antes de su uso.
REALIZACIÓN DEL TEST
Prepare los reactivos como se describe en el apartado anterior.
Descongele las muestras como se describe más arriba dando por hecho
una insignificante pérdida de actividad de los factores lábiles de
coagulación y ausencia de crioprecipitados. Mezcle las muestras
descongeladas cuidadosamente, evitando la formación de espuma.
Determine los tiempos de coagulación en presencia (+APC) y en ausencia
(-APC) de la proteína C activada y calcule el cociente (ratio) de acuerdo
con el siguiente esquema:
+ APC - APC
Muestra o plasma control 30 µL 30 µL
R4 Dilution plasma 20 µL 20µL
Mezclar antes de
usar
ES
Mezclar antes de
usar
R1 Reactivo APC/RVV-V (+
APC)
50 µL
R2 Reactivo RVV-V (-APC) - 50 µL
Incubación 3 min, 37°C 3 min, 37°C
R3 Reactivo PTA 50 µL 50 µL
Determinación Determinación
del tiempo de del tiempo de
coagulación coagulación
Cociente
Tiempo de coagulación +APC
= ------------------------------------------
Tiempo de coagulación -APC

ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
La distinción entre homocigotos, heterocigotos y muestras negativas
respecto al FVL se basa en los intervalos típicos del cociente determinados
en las muestras de plasma de pacientes genotipados (véase las tablas
siguientes).
Intervalos de cocientes típicos obtenidos a partir de muestras de plasma de
pacientes PCR-genotipados en diferentes aparatos se muestran en la
siguiente tabla:
KC-4/-10 A Micro
Genotipo FV:Q 506 n Intervalo del conciente (min/máx)
negativo 99 > 3.0
heterocigoto 166 1.3 – 1.9
homocigoto 25 0.9 – 1.1
BCS ® (Behring Coagulation System)
Genotipo FV:Q 506 n Intervalo del conciente (min/máx)
negativo 143 > 3.0
heterocigoto 170 1.4 – 2.2
homocigoto 27 0.9 – 1.1
CA-1500 / CA-7000
Genotipo FV:Q 506 n Intervalo del conciente (min/máx)
negativo 235 > 3.0
heterocigoto 56 1.5 – 1.8
homocigoto 2 1.0 – 1.1
ACL 9000
Genotipo FV:Q 506 n Intervalo del conciente (min/máx)
negativo 127 > 3.0
heterocigoto 119 1.4 – 2.1
homocigoto 24 0.9 – 1.2
STA ® C
Genotipo FV:Q 506 n Intervalo del conciente (min/máx)
negativo 134 > 2.9
heterocigoto 83 1.3 – 1.8
homocigoto 27 0.9 – 1.1
AMAX CS-190
Genotipo FV:Q 506 n Intervalo del conciente (min/máx)
negativo 74 > 3.0
heterocigoto 62 1.2 – 2.3
homocigoto 10 0.9 – 1.1
Se recomienda determinar intervalos de cociente específicos de laboratorio
con muestras de pacientes genotipadas.
Atención: Los factores que se mencionan en el apartado “Limitaciones e
Interferencias” pueden cambiar los intervalos de cociente específicos, de tal
modo que la diferenciación de las muestras puede resultar imposible.
CONTROLES DE CALIDAD (C1 y C2)
El control negativo o el tipo salvaje “wild-type” (neg) muestra una respuesta
normal frente a la APC mientras que el control heterocigoto (het) muestra
respuesta en presencia de la forma heterocigota de la mutación FV:Q 506 .
Se debería utilizar un control cada vez que se realiza el test. Si se obtienen
valores fuera del rango (ratio), debería de hacerse un completo chequeo de
los reactivos y repetir el análisis. Si el problema persiste, se debería hacer
una comprobación completa de los instrumentos y los análisis deberían ser
repetidos.
Instrumento: C1 FV-L-
Control
Negativo
C2 FV-L
Control
Heterocigoto
KC-4/-10 A Micro > 5,1 1,4 – 1,8
BCS ® (Behring
System)
Coagulation > 4,0 1,4 – 2,1
CA-1500 / CA-7000 > 4,0 1,6 – 2,0
ACL 9000 > 4,0 1,3 – 2,4
AMAX CS-190 > 2,4 1,3 – 2,0
STA ® -C > 3,1 1,4 – 1,7
Si se obtienen valores fuera de estos rangos, los resultados del test no son
válidos y no deberían usarse para diagnóstico. Cuando se usan controles
en combinación con otro test o instrumento aplicable, los valores del
cociente esperados pueden ser diferentes y han de ser determinados
localmente bajo unas condiciones apropiadas.
ESPECIFICIDAD Y SENSIBILIDAD
Con las muestras testadas hasta el momento, APC Resistance Kit presenta
una sensibilidad y especificidad del 100% para la detección de los
portadores heterocigotos y homocigotos de la mutación FV:Q506. Las
determinaciones se han realizado mediante los siguientes aparatos: BCS®
(n=340), KC-4/-10 A micro (n=290), CA-1500/CA-7000 (n=293), ACL
9000 (n=270), STA® C (n=244) y AMAX CS-190 (n=146).
Debido a la técnica de detección funcional, el test tiene que ser capaz de
detectar otras mutaciones de FV que dan lugar también a un fenotipo APC-
R. Sin embargo, su prevalencia comparada con la de la mutación FV
Leiden es muy pequeña.
LIMITACIÓN E INTERFERENCIAS
No se observan diferencias significativas cuando se utilizan muestras de
plasma frescas o congeladas. Asimismo, la utilización de plasma citratado
tamponado o no tamponado tampoco tiene ninguna influencia sobre los
resultados de la determinación.
En los estudios experimentales se ha demostrado que una deficiencia de
hasta el 100% de los factores fibrinógeno, protrombina, FVIII, FX, ATIII,
proteína C y proteína S, así como un exceso de hasta 5 veces el valor
normal de fibrinógeno, FVIII, ATIII y TFPI no afectan en absoluto al
cociente o a la sensibilidad de la prueba. Ni las muestras de sangre
hemolítica ni las muestras que contienen residuos de plaquetas alteran los
métodos de determinación mecánicos. Por el contrario, los métodos de
determinación ópticos pueden verse alterados por el uso de plasmas
hemolíticos o lipémicos. Los anticuerpos anticoagulantes lupus no
interfieren en el test. Sin embargo, una deficiencia grave de FV (