Mycotrim® RS - Irvine Scientific

Mycotrim ® RS
Triphasic Culture System
Catalog No. D303-012
For use in detecting Mycoplasma pneumoniae in respiratory
specimens. For in vitro diagnostic use.
Zum Gebrauch in der Erkennung von Mycoplasma pneumoniae
in respiratorischen Probekörpern. Zum Gebrauch in in vitro
diagnostischen Verfahren.
Para la detección de Mycoplasma pneumoniae en muestras del
aparato respiratorio. Para uso diagnostico in vitro.
Para la detección de Mycoplasma pneumoniae genito-urinarias. Para
uso diagnostico in-vitro.
Pour détecter Mycoplasma pneumoniae dans les prélèvements
respiratoires. Pour le diagnostic in vitro.
Para a utilização na detecção de Mycoplasma pneumoniae em
amostras respiratórias. Para utilização em diagnóstico in vitro.

INTENDED USE
Mycotrim ® RS is a complete culture system for Mycoplasma pneumoniae
(M. pneumoniae) in human respiratory specimens.
Mycoplasma pneumoniae is a common cause of respiratory infections.
M. pneumoniae is the cause of primary atypical pneumonia,
often called “walking pneumonia”. It is associated with chronic
bronchitis and is thought to account for more than 20% of all
pneumonia cases.
Mycotrim RS is designed to selectively isolate and identify M.
pneumoniae in human respiratory specimens.
PRODUCT DESCRIPTION
Each Mycotrim RS flask contains agar and broth specially formulated
to support the growth of M. pneumoniae. When the flask is
inoculated and incubated with the agar side up, the agar and broth
are separated by humid air. This creates optimal conditions for the
growth of M. pneumoniae on the agar surface. Antimicrobial discs
are added before inoculation to prevent the growth of microorganisms
other than mycoplasma.
Positive cultures of M. pneumoniae lower the pH and cause a
color change in the media. In specimens with high titers, this
color change may occur in as little as 72 to 96 hours, while in
specimens with low titers it may take 7 to 10 days. Flasks showing
no color change after 72 hours are reinoculated with the enrichment
broth in the flask. Once the media changes color, the flask is
examined microscopically (low power) for M. pneumoniae colonies
on the agar surface.
STORAGE AND STABILITY
Store all the Mycotrim RS components (fl asks, antimicrobial discs and
Dienes stain) in the original box at 2° C to 8° C.
Do not freeze.
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Mycotrim RS kit components should be used before the expiration
date printed on the box.
MATERIALS PROVIDED
Component Qty per 12 Flask Kit
Agar/Broth Flask 12
Cefoperazone Sodium/Nystatin Discs 2 dishes (15 discs/dish)
Thallous acetate 2 dishes (15 discs/dish)
Dienes Stain 1 Vial (2.5 mL/vial)
Antimicrobial Discs
A single white CN antimicrobial disc yields an approximate
concentration in agar and broth of:
Cefoperazone sodium 100.0 μg/mL
Nystatin 50.0 U/mL
Each pink TA antimicrobial disc yields approximately:
Thallous acetate 250.0 μg/mL
Dienes stain - contains methylene blue and azure II.
MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED
Sterile pipets, or
Sterile swabs, or
Sterile bacteriological loop
Sterile forceps
Conventional microscope with 10x eyepieces and 10x objective or
dissecting microscope with 70x to 100x magnification.
Incubator capable of maintaining temperatures of 34° C to 37° C.
PRECAUTIONS AND WARNINGS
Do not use if the Mycotrim RS flask is cracked or if the media
shows signs of contamination. The broth should be clear and
reddish-colored with no signs of cloudiness.
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M. pneumoniae is killed by temperatures above 40° C (104°F)
and is physiologically compromised at temperatures above 38°C
(100° F).
Antimicrobial effectiveness is compromised if the specimen is
inoculated either before complete dispersion of the antimicrobials
or after the discs have been in the Mycotrim RS flask for more
than 24 hours.
M. pneumoniae is a human pathogen. Proper safety precautions
for handling and discarding infectious biological materials should
be followed at all times.
CAUTION: Federal (U.S.) law restricts this device to sale by or on
the order of a physician.
SPECIMEM COLLECTION AND HANDLING
Specimens should be inoculated in Mycotrim RS as soon as possible
after collection. If specimens cannot be inoculated promptly
after collection, they are best maintained in the Mycotrans ® transport
system (available from Irvine Scientific) at 15° C to 30° C.
Type of
Specimen Collection, Handling and Inoculation
Throat Swab throat according to established
practice. Place the swab in Mycotrans
transport media until it can be inoculated
into Mycotrim RS.
Sputum Dip a sterile swab in the specimen and use
as inoculum. (Place swab in Mycotrans for
transport).
Bronchial washings Use 1 mL of washings as inoculum.
Pneumocentesis fluid Use 1 mL of fluid as inoculum.
Tissue from biopsy Aseptically grind a small piece of tissue.
Pipet up to 1 mL of ground tissue and
washings as inoculum.
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DIRECTIONS FOR USE
1. Preparation of Flask
A. Loosen the flask cap 1/4 to 1/2 turn and warm the flask
in the incubator (34° C to 37° C) for approximately five
minutes.
B. Aseptically add antimicrobial discs according to specimen
type:
Specimen Source Antimicrobial Discs
Throat 1 CN, 1 TA
Bronchial washings 1 CN, 1 TA
Pneumocentesis fluid 1 CN, 1 TA
Tissue from biopsy 1 CN, 1 TA
Sputum 2 CN, 2 TA
C. Recap the flask tightly and place it agar side down, as
shown below in Figure 1, for a minimum of 30 minutes.
BROTH
AGAR
Figure 1
2. Inoculation
Use aseptic technique.
A. For liquid specimens such as bronchial washings, pneumocentesis
fluid and washings of tissue biopsy:
1. Hold the flask at about a 45° angle as shown in Figure 2
and allow approximately 1.0 mL of specimen to slow flow
down the center of the agar.
2. As the pipet is withdrawn from the flask, press it firmly into
the agar to make a deep cut in the area inoculated.
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3. Recap the flask tightly.
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Figure 2
B. For specimens in Mycotrans:
1. Remove approximately 1.0 mL of the broth from the area
near the agar/broth interface.
NOTE: It is not necessary to remove the swab used to
inoculate Mycotrans.
2. Repeat steps 1 through 3 for liquid specimens as
described in section A (above).
C. For specimens on swabs such as throat or sputum specimens:
1. Hold the flask at about a 45° angle (as shown in Figure 2)
and streak the central area of the agar from bottom to top.
2. Rinse the swab in the broth and press it against the wall
of the flask to expel the specimen from the swab into the
broth.

3. As the swab is withdrawn from the flask, carefully press it
into the agar to make a deep cut in the center of the inoculated
area. The swab will not make a clean cut; however,
a jagged cut will not adversely affect the performance of
Mycotrim RS.
4. Recap the flask tightly.
3. Incubation
Incubate the flask agar side up at 34° C to 37° C for 72 hours
or until the color of the media changes. Check the flask for a
color change every 24 hours (see 4. Observation, below).
Temperatures above 38° C will inhibit M. pneumoniae.
When removing flasks from the incubator for examination,
care should be taken to avoid washing growth off the agar by
splashing the broth over the agar.
4. Observation
A. Color change
The first sign of M. pneumoniae in Mycotrim RS is a color
change in the media which may occur within 72 to 96 hours
after inoculation. Growth of M. pneumoniae will cause the
media to change from red to yellow-orange.
Unlike bacteria and fungi, M. pneumoniae does not cause
turbidity in the broth, even at maximum titers. Gross turbidity
of visible colonies on the agar indicate bacterial or fungal
overgrowth, making the color change unreliable and possibly
hiding mycoplasma colonies. If no color change occurs
within 72 hours, reinoculate the agar as indicated in step 5.
Reinoculation, below.
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B. Colony appearance
Do not use an inverted microscope.
When a color change occurs within the first 72 hours, colonies
are usually visible microscopically. A conventional light
microscope with a low power (10x) objective lens and 10x
eyepiece, or a good quality dissecting microscope with 70x to
100x magnifying capability is adequate. It will be necessary
to adjust the stage or nosepiece of the microscope to accommodate
the depth of the Mycotrim RS flask.
In specimens with very high or very low titers of ureaplasma,
it may be possible to observe a color change and be unable to
see microscopic colonies.
To examine the flask for M. pneumoniae colonies:
1. Place the flask, agar side up, on the microscope stage as
indicated in Figure 3. Focus through the flask and agar
to the inside surface of the agar. The cut made during
inoculation marks the area inoculated and aids in focusing.
2. Scan the length of the flask along both sides of the cut for
colonies.
AGAR
BROTH
10x
Figure 3
3. Examine suspected colonies by focusing up and down
on them . Colonies may grow on the agar surface or
penetrate below the agar surface. Colonies growing in the
agar may not appear in sharp focus.
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M. pneumoniae colony appearance:
M. pneumoniae colonies are 60 to 200 microns in diameter,
about 1/10 as large as a small bacterial colony, 1 to 5 times
larger than a single buccal epithelial cell, and 10 to 15 times
larger than a single white blood cell. Mycoplasma colonies
have a characteristic “fried egg” or “sand patty” (grainy)
appearance. Epithelial cells are clearly distinguished from
mycoplasma colonies by their sharp, angular margins and
clear cytoplasm (often folded over upon itself).
5. Reinoculation
Do not open the Mycotrim RS flask.
If no color change occurs after 72 hours, reinoculate the agar
by tilting the flask so that the broth contacts 1/3 to 1/2 of
the agar surface, as shown in Figure 4. After reinoculation,
incubate the flask at 34° C to 37° C with the agar side up.
Continue to examine the flask daily for a color change. When
the color change is observed, look for typical microscopic
colonies (see B. Colony Appearance, above).
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Figure 4

6. Optional Use of Dienes Stain
Dienes stain should only be used when the flask will no longer
be incubated. The Dienes stain kills M. pneumoniae. Once
stained, a flask may be stored for several months in the
refrigerator.
To apply Dienes stain:
a. Open the flask and remove the broth with a pipet. Dispose
of the broth in a suitable infectious waste container.
b. Taking care not to wash the growth off of the surface of the
agar, gently apply two or three drops of stain to the agar
surface. Recap the flask.
c. Let the flask stand agar side down for 30 minutes to allow
the stain to diffuse into the agar.
d. Examine the flask microscopically for colonies. M. pneumoniae
will retain the stain while bacteria will decolorize
and not appear stained.
INTERPRETATION OF RESULTS
A positive result is indicated when the color changes (in the absence
of gross contamination) from red to yellow-orange and colonies are
observed on the agar.
Unlike bacteria and fungi, M. pneumoniae does not cause turbidity
in the broth, even at maximum titers. Gross turbidity or visible
colonies on the agar indicate bacterial or fungal overgrowth,
making the color change unreliable and possibly hiding M.
pneumoniae colonies.
A negative result is reported if there is no color change within 10
days after reinoculation (13 days total incubation).
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LIMITATIONS
The presence of very large numbers of organisms other than M.
pneumoniae may cause overgrowth even when antimicrobic discs
are used. Turbid broth or colonies visible to the naked eye indicate
overgrowth. Bacteria and fungi may cause a color change in the
absence of M. pneumoniae. Overgrowth may hide the presence of
M. pneumoniae colonies.
Antimicrobial effectiveness is compromised when the specimen
is inoculated before complete dispersion of the antimicrobials or
when the disc has been in the Mycotrim RS flask for more than 24
hours before it is inoculated.
QUALITY CONTROL
Each fl ask of Mycotrim RS is incubated and inspected for
contamination. Each lot of Mycotrim RS is tested for its ability to
maintain M. pneumoniae (ATCC #15531) and Acholeplasma laidlawii
(ATCC #23206). Growth of these organisms must be demonstrated
in both broth and agar media. The inhibitory activity of antimicrobial
discs is tested by inoculating fl asks containing antimicrobial discs
with Staphylococcus aureus (ATCC #25923), Escherichia coli (ATCC
#25922), and Candida albicans (ATCC #10231). Inhibition of all three
organisms must be shown after incubation for 24 hours at 34° C to 37° C.
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ANWENDUNG
Mycotrim ® RS ist ein vollständiges Kultursystem zum Nachweis
von Mycoplasma pneumoniae (M. pneumoniae) in menschlichen
respiratorischen Probekörpern.
Mycoplasma pneumoniae ist ein häufiger Grund für respiratorische
Infektionen. M. pneumoniae ist der Grund für primär-atypische
Lungenentzündung (oft “walking pneumonia” genannt). M.
pneumoniae steht in Zusammenhang mit chronischer Bronchitis
und ist angeblich der Grund für mehr als 20% von allen Fällen von
Lungenentzündung.
Mycotrim RS ist entwickelt worden, M. pneumoniae in menschlichen
respiratorischen Probekörpern selektiv zu isolieren und zu
erkennen.
PRODUKTBESCHREIBUNG
Jede Mycotrim RS Flasche beinhaltet Agar und Brühe, die spezifisch
formuliert worden sind, das Wachsen von M. pneumoniae zu
stützen. Wenn die Flasche mit der Agar-Seite nach oben beimpft
und bebrütet wird, werden das Agar und die Brühe durch feuchte
Luft getrennt. Das ergibt optimalen Zustand für das Wachsen (auf
dem Agar) von M. pneumoniae. Antimikrobische Scheiben werden
vor der Beimpfung hinzugefügt, um das Wachsen von Mikroorganismen
(ausser Mycoplasma) zu verhindern.
Positive Kulturen von M. pneumoniae reduzieren den pH-Wert
und ergeben einen Farbwechsel im Medium. In Probekörpern mit
hohen Titern kann dieser Farbwechsel so bald wie in von 72 bis
zu 96 Stunden stattfinden. In Probekörpern mit niedrigen Titern
kann dieses Verfahren von 7 bis 10 Tagen dauern. Flaschen, die
nach 72 Stunden keinen Farbwechsel zeigen, werden mit der
Anreicherungsbrühe in der Flasche wieder beimpft. So bald wie
der Farbwechsel stattfindet, dann wird die Flasche mikroskopisch
(niedrige Kraft) für Kolonien von M. pneumoniae auf dem Agar
untersucht.
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LAGERUNG UND STABILITÄT
Alle Mycotrim RS Komponenten ( Flasche, antimikrobielle
Plättchen und Dienes-Färbung) sollten in der Originalverpackung
bei 2-8° C gelagert werden.
Bitte nicht einfrieren!
Mycotrim RS Kit Komponenten sollten vor dem auf der Verpackung
angegebenen Verfallsdatum verwendet werden.
MATERIALIEN BEREITGESTELLT
Installationssatz mit
Komponenten 12-Patienten
Agar/Bouillon Flasche 12
Cefoperazone Natrium/
Thallus Acetat 2 Teller (15 Disketten/Teller)
Dienes-Färbung 1 Flasche (2.5 mL/Phiolen)
Eine einzelne Schale ergibt eine weisse CN (Cefoperazone
Natrium/Nystatin) ungefähre Konzentration in Agar und Brühe von:
Cefoperazone Natrium 100.0 μg/mL
Nystatin 50.0 U/mL
Jedes rosa TA(Thallus Acetat) antimikrobische Schalen beinhalten
ungefähr.
Thallus Acetat 250.0 μg/mL
Dienes-Färbung - enthält Methylenblau und Azur II.
ERFORDERLICHE ABER NICHT IM KIT ENTHALTENE KOMPONENTEN
Sterile Pipetten, oder
Sterile Tupfer, oder
Sterile Ösen
Sterile Pinzetten
Mikroskop mit 70 bis 100 facher Vergrösserung.
Inkubator für Temperaturen von 34° C bis 37° C.
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VORSICHTSMASSNAHMEN UND WARNHINWEISE
Das Produkt nicht gebrauchen, falls die Mycotrim RS Flasche
gesprungen ist oder falls das Medium Anzeichen von Kontaminierung
zeigt. Die Brühe soll klar und rot sein und soll keine
Anzeichen von Trübheit zeigen.
M. pneumoniae wird von Temperaturen über 40° C abgetötet und
durch Temperaturen über 38° C physiologisch beeinträchtigt.
Die antimikrobielle Wirkung wird beeinträchtigt, falls die Proben
vor der vollständigen Dispersion des Antimikrobiums inokuliert
werden oder falls die Plättchen länger als 24 h vorher in der
Mycotrim RS Flasche waren.
M. pneumoniae ist ein humane Pathogene. Professionelle Sicherheitsvorschriften
zur Handhabung und Entsorgung von infektiösem
biologischen Material müssen jederzeit befolgt werden.
VORSICHT: Das Bundesgesetz (U.S.) schränkt dieses Medizinprodukt
auf den Verkauf oder auf den Auftrag eines Arztes ein.
PROBENSAMMLUNG UND HANDHABUNG
Die Proben sollten möglichst unmittelbar nach der Entnahme
inokuliert werden. Für längere Aufbewahrung wird empfohlen, sie
im Mycotrans ® Transport System (erhältlich von Irvine Scientific)
bei 15° C bis 30° C aufzubewahren.
Probe Entnahme, Aufbewahrung und Inokulation
Hals Den Hals nach dem feststehenden Verfahren
betupfen. Den Tupfer in Mycotrim RS Transportnährboden
lassen, bis er in Mycotrim RS beimpft
werden kann.
Auswurf Einen sterilen Tupfer in den Probekörper tauchen
und als Inoculum gebrauchen. (Den Tupfer zum
Transport in Mycotrans stellen.)
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Bronchiale
Waschungen 1 ml der Waschungen als Inoculum gebrauchen.
Pneumozentese
Flüssigkeit 1 ml der Flüssigkeit als Inoculum gebrauchen.
Biopsiegewebe Ein kleines Stück Gewebe aseptisch mahlen. Bis
zu 1 ml gemahlenes Gewebe und Waschungen
als Inoculum pipettieren.
GEBRAUCHSANLEITUNG
1. Vorbereitung der Flasche
A. Den Flaschenverschluss 1/4 bis 1/2 Drehung öffnen und ca. 5
Minuten in einem Inkubator bei 34°C bis 37°C erwärmen.
B. Antimikrobische Scheiben zufolge die Art von Probekörper
aseptisch hinzufügen:
Probekörper Herkunft Antimikrobische Scheiben
Hals 1 CN, 1 TA
Bronchiale Waschungen 1 CN, 1 TA
Pneumozentese Flüssigkeit 1 CN, 1 TA
Gewebe von Biopsie 1 CN, 1 TA
Auswurf 2 CN, 2 TA
C. Die Flasche fest wieder bedecken und mit der Agar-Seite nach
unten (siehe Figur 1) für mindestens 30 Minuten stehen lassen.
BROTH
AGAR
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Bild 1

2. Aseptische Inokulation
A. Für fl üssige Probekörper (z.B. bronchiale Waschungen, Pneumozentese
Flüssigkeit, und Waschungen von Gewebebiopsie):
1. Flasche ca 45° neigen, siehe Bild 2, and etwa 1 mL der
Probe langsam bis zur Agarmitte fliessen lassen.
2. Anschliessend die Pipette fest in den Agar pressen und
einen tiefen Schnitt in die inokulierte Fläche machen.
3. Flasche anschliessend fest zuschrauben.
B. Für Proben in Mycotrans:
1. Ca. 1 mL Bouillon aus der Grenzfläche Agar/Bouillon
entnehmen
2. Schritt 1-3 für flüssige Proben wiederholen. ( siehe
Abschnitt A).
Deutsch 5/11
Bild 2

3. Proben auf Tupfern sollten in Mycotrans versandt werden und
dann, wie in Abschnitt C beschrieben, verarbeitet werden.
C. Für Probekörper auf Tupfern (z.B. Hals- oder Auswurfsprobekörper):
1. Flasche ca. 45° neigen ( siehe Bild 2) und den zentralen
Bereich des Agars von unten nach oben abstreichen.
2. Den Tupfer in die Bouillon tauchen und anschliessend fest
gegen die Innenwand pressen, damit die Probe in das
Medium läuft.
3. Danach den Tupfer fest in das Zentrum des inokulierten
Agars pressen. Der Tupfer hinterlässt keinen scharfen
Schnitt aber auch ein unscharfer Schnitt beeinträchtigt das
Ergebnis des Mycotrim RS Tests nicht.
4. Flasche fest zuschrauben.
3. Inkubation
Die Flasche mit der Agarseite nach oben bei 34° C – 37°C für
72 h oder bis zum Farbwechsel des Mediums inkubieren. Die
Flasche alle 24 h auf Farbwechsel überprüfen (siehe Punkt
4. Beobachtung).
Temperaturen über 38° C inhibieren das Wachstum von M.
pneumoniae.
Bei Kontrolle des Farbwechsels die Flaschen vorsichtig aus
dem Inkubator entnehmen, um zu vermeiden, dass gewachsene
Kolonien durch die Bouillon vom Agar gespült werden.
4. Beobachtung
A. Farbwechsel
Das erste Anzeichen von M. pneumoniae in Mycotrim RS
ist ein Farbwechsel im Medium. Dieser Farbwechsel kann
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zwischen 72 bis zu 96 Stunden nach der Beimpfung geschehen.
Der Wuchs von M. pneumoniae wird einen Farbwechsel
von rot zu gelb-orange bewirken.
Im Gegensatz zu Bakterien und Pilzen, M. pneumoniae bewirkt
keine Trübheit in der Brühe, sogar bei höchsten Titern. Trübheit
oder sichtbare Kolonien sind Anzeichen von Pilzen- oder bakteriologische
Überwuchung. Das macht den Farbwechsel unzuverlässig
und kann Kolonien von Mycoplasma verstecken. Falls kein
Farbwechsel innerhalb von 72 Stunden geschieht, das Agar wie in
Schritt 5, Wiederbeimpfung (unten) wieder beimpfen.
B. AUSSEHEN DER KOLONIEN
Kein Inversionsmikroskop verwenden.
Falls ein Farbwechsel innerhalb von den ersten 72 bis 96
Stunden geschieht, sind Kolonien normalerweise mikroskopisch
sichtbar. Ein konventionelles Lichtmikroskop mit
einem Objektiv von niedriger Kraft (10x) und mit 10x Okularen,
oder ein hochwertiges Seziermikroskop mit einem Vergrösserungsfaktor
von 70x bis zu 100x ist passend. Es wirt nötig sein,
das Mikroskop zu eichen, um die Tiefe von der Mycotrim RS
Flasche anzupassen.
Überprüfung der Flasche auf M. pneumoniae Kolonien:
1. Die Flasche, Agarseite nach oben, sieheBild 3, unter das
Mikroskop legen. Die innere Oberfläche des Agars fokussieren.
Der während der Inokulation gemachte Schnitt
markiert den inokulierten Bereich.
2. Beide Agarseiten entlang des Schnittes auf Kolonien
absuchen.
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AGAR
BROTH
10x
Bild 3
3. Verdächtige Kolonien durch Fokussieren untersuchen. Die
Kolonien können sowohl auf der Agaroberfläche wachsen
als auch in den Agar hinein. Letztere können unter
Umständen nicht scharf gesehen werden.
Erscheinungsbild: M. pneumoniae Kolonie
Kolonien von M. pneumoniae haben einen Durchmesser von
zwischen 60 und 200 Mikrometern, ungefähr ein zehntel so
gross wie eine Bakterienkolonie, von 1 bis zu 5 Mal grösser
als eine einzelne bukalle Epithelzellen, und von 10 bis zu
15 Mal grösser als ein einzelnes weisses Blutkörperchen.
Mycoplasma Kolonien sehen wie ein “Spiegelei” aus. Epithelzellen
werden von Mycoplasma Kolonien klar differenziert.
Epithelzellen haben scharfe, winklige Begrenzungen und
klares Zytoplasma (oft über sich gefaltet).
5. Reinokulation
Die Mycotrim RS Flasche darf nicht geöffnet werden.
Falls nach 72 h kein Farbwechsel sichtbar ist, wird die Flasche so
gedreht, dass 1/3 bis 1/2 der Agaroberfl äche durch die Bouillon
benetzt werden ( siehe Bild 4). Nach der Inokulation wird die
Flasche mit der Agarseite nach oben erneut bei 34°C bis 37°C
inkubiert und täglich auf einen Farbwechsel überprüft. Nach
Farbwechsel werden typische Kolonien unter dem Mikroskop
begutachtet (siehe Erscheinungsbild, oben).
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Bild 4
6. Optionale Anwendung der Dienes-Färbung
Die Dienes-Färbung sollte nur angewendet werden, wenn
die Flasche nicht mehr inkubiert werden soll, da die Dienes-
Färbung tötet M. pneumoniae. Nach der Anfärbung kann die
Flasche mehrere Monate im Kühlschrank aufbewahrt werden.
Durchführung der Dienes-Färbung:
a. Flasche öffnen und die Bouillon mit einer Pipette absaugen.
Bouillon in einem geeigneten Behälter für infektiöse
Abfälle entsorgen
b. Vorsichtig, um die Kolonien nicht von der Agaroberfläche
zu waschen, 2 bis 3 Tropfen Dienes-Färbung auf die
Agaroberfläche applizieren und die Flasche wieder
verschliessen.
c. Die Flasche 30 min mit der Agarseite unten stehen lassen,
damit die Farbe in den Agar diffundieren kann.
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d. Die Flasche unter dem Mikroskop auf Kolonien absuchen.
M. pneumoniae und U. urealyticum bleiben gefärbt während
Bakterien ungefärbt sichtbar sind.
DEUTUNG VON RESULTATEN
Ein positives Ergebnis wird angezeigt, falls die Farbe (im Fehlen
von Kontaminierung) des Agars von rot zu gelb-orange wechselt.
Im Gegensatz zu Bakterien und Pilzen, bewirkt M. pneumoniae
keine Trübheit in der Brühe, sogar bei höchsten Titern. Trübheit
oder sichtbare Kolonien auf der Oberfläche des Agars zeigen
Pilzen- oder bakteriologische Überwuchung an. Das macht den
Farbwechsel unzuverlässig und kann Kolonien von M. pneumoniae
verstecken.
Ein negatives Ergebnis wird angezeigt, falls es keinen Farbwechsel
innerhalb von 10 Tagen nach der Wiederbeimpfung (Endzahl
von Bebrütungszeit: 13 Tage) gibt.
EINSCHRÄNKUNGEN
In Gegenwart grosser Nummern von Organismen anders als M.
Pneumonia kann Überwuchung geschehen, sogar wenn antimikrobische
Scheiben gebraucht werden. Trübe Brühe oder mit blossem
Auge sichtbare Kolonien zeigen Überwuchung an. Bakterien und
Pilzen können einen Farbwechsel im Fehlen von M. pneumoniae
bewirken. Überwuchung kann den Gegenwart von M. pneumoniae
Kolonien verstecken.
Antimikrobische Wirksamkeit wird beeinträchtigt, wenn der
Probekörper vor der vollständigen Diffusion der antimikrobiellen
Substanzen beimpft wird oder wenn die Scheibe in der Mycotrim
RS Flasche für mehr als 24 Stunden vor der Beimpfung der
Scheibe gewesen ist.
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QUALITÄTSKONTROLLE
Jede Flasche von Mycotrim RS wird bebrütet und für Kontaminierung
untersucht. Jedes Los von Mycotrim RS wird für Beibehaltefähigkeit
von M. pneumoniae (ATCC #15531) und Acholeplasma
Laidlawii (ATCC #23206) überprüft. Wuchs dieser Organismen
muss beide in der Brühe und im Agar Medium angezeigt werden.
Die wachstumhemmende Aktivität von antimikrobische Scheiben
wird durch durch die Beimpfung von Flaschen überprüft, die
antimikrobische Scheiben mit Staphylococcus aureus (ATCC
#25923), Escherichia coli (ATCC #25922), und Candida Albicans
(ATCC #10231). Hemmung von allen drei Organismen muss nach
24 Stunden von Bebrütung bei von 34°C bis zu 37°C gezeigt
werden.
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ISTRUZIONI D’USO
Mycotrim ® RS è un sistema di coltura completo per Mycoplasma
pneumoniae (M pneumoniae) in campioni respiratori umani.
Mycoplasma pneumoniae è una causa comune di infezioni respiratorie.
M. pneumoniae è la causa della polmonite atipica primaria,
spesso chiamata “ polmonite ambulante”. Essa è associata alla
bronchite cronica e si ritiene che conti per più del 20% di tutti i
casi di polmonite.
Mycotrim RS è disegnato per isolare selettivamente ed identifi care M.
pneumoniae in campioni respiratori umani.
DESCRIZIONE DEL PRODOTTO
Ogni beuta di Mycotrim RS contiene agar e brodo specificamente
formulato per sostenere la crescita di M. pneumoniae. Quando
la beuta è inoculata ed incubata con il lato agar rivolto verso
l’alto, l’agar ed il brodo sono separati da aria umida. Ciò crea
le condizione ottimali per la crescita di M. pneumoniae sulla
superficie dell’agar. Dischi antimicrobici vengono aggiunti prima
dell’inoculazione per prevenire la crescita di altri microrganismi
oltre che mycoplasma.
Colture positive di M. pneumoniae abbassano il PH e causano un
cambiamento di colore nel prodotto. In campioni a titoli alti, questo
cambiamento di colore può verifi carsi in sole 72 - 96 ore, mentre in
campioni a titoli bassi il cambiamento di colore può impiegare da
7 a 10 giorni. Le beute che non presentano alcun cambiamento di
colore dopo 72 ore vengono reinoculate con il brodo arricchito nella
beuta. Quando il prodotto cambia colore, la beuta viene esaminata
microscopicamente (a bassa potenza) per rilevare colonie di M.
pneumoniae sulla superfi cie dell’agar.
IMMAGAZZINAGGIO E STABILITÀ
Conservare tutti i componenti di Mycotrim RS (beute, dischi
antimicrobici e Diene coloranti) nella scatola originale ed a
temperature da 2°C a 8°C.
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Non congelare.
I kit di Mycotrim RS devono essere usati prima della data di scadenza
riportata sulla scatola.
MATERIALI FORNITI
Componente Corredo dei
12 pazienti
Agar/Beute del Brodo 12
Sodio di Cefoperazone/
Dischi della Nystatin 2 Piatti (15 discs/piatto)
Acetato di tallio 2 Piatti (15 discs/piatto)
Diene Colorante 1 Fiala (2.5 mL/fiala)
Dischi Antimicrobici
Un singolo antimicrobici CN bianchi disco rende una concentrazione
di agar e brodo prossima a:
Cefoperazone 100.0 μg/mL
Nystatin 50.0 U/mL
Ciascuno dischi antimicrobici TA rosa approssimativamente.
Acetato di tallio 250.0 μg/mL
Diene colorante - contiene blu di metilene e azzurre II.
MATERIALI NECESSARI MA NON PROVVISTI
Pipette sterili, o
Scovoli sterili, o
Un anello batteriologico sterile
Pinze sterili
Un microscopio convenzionale con 10x di oculare e 10x di
obiettivo o un microscopio per dissezione con una capacità di
ingrandimento da 70x a 100x.
Un’incubatrice che sia capace di mantenere temperature di 34°
- 37°C.
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PRECAUZIONI ED AVVERTENZE
Non usare se la beuta o il coperchio della beuta di Mycotrim RS è
rotto o se il preparato da segni di contaminazione. Il brodo deve
essere limpido e rossastro senza segni di torbidezza.
M. pneumoniae e muoiono se esposti a temperature superiori a
40° C (104° F) e sono fi siologicamente compromessi a temperature
superiori a 38° C (100° F).
L’effi cacia antimicrobica è compromessa se il campione è inoculato
prima della dispersione completa degli antimicrobici o se è inoculato
dopo che i dischi sono rimasti nella beuta di Mycotrim RS per più di
24 ore.
M. pneumoniae è un patogeno umano. Le dovute precauzioni di
sicurezza devono essere seguite continuamente nel maneggiare e nel
gettare materiali biologici infettivi.
ATTENZIONE: La legge (U.S.) permette la vendita del prodotto solo
dietro presentazione di ricetta medica.
RACCOLTA DI CAMPIONI E TRATTAMENTO
I campioni devono essere inoculati nel Mycotrim RS al più presto
possibile dopo la raccolta. Se i campioni non possono essere inoculati
prontamente dopo la raccolta, si consiglia di mantenerli nel
Mycotrans ® sistema di trasporto (disponibile da Irvine Scientific)
a 15°C - 30° C.
Tipo di
Campione Raccolta, Trattamento e Inoculazione
Gola Pulire la gola con uno scovolo secondo la
procedura stabilita. Conservare lo scovolo
nel prodotto per il trasporto Mycotrans finché
viene inoculato in Mycotrim RS.
Sputo Immergere uno scovolo sterile nel campione
ed usare come inoculo. (Mettere lo scovolo in
Mycotrans per il trasporto).
Italiano 3/11

Sciacqui bronchiali Usare 1 mL dello sciacquo come inoculo.
Fluido da
pneumocentesi Usare 1 mL del fl uido come inoculo.
Tessuto dalla biopsia Levigare in asepsi una piccola quantità di tessuto.
Pipettare fi no ad 1 mL di tessuto levigato
e di tessuto sciacquato come inoculatore.
ISTRUZIONI PER L’USO
1. Preparazione della beuta
A. Allentare il tappo della beuta da 1/4 fino a 1/2 di giro e
riscaldare la beuta in un’incubatrice (da 34° C a 37° C)
per circa 5 minuti.
B. . Aggiungere dischi antimicrobici in asepsi secondo il tipo di
campione:
Origine del Campione Dischi Antimicrobici
Gola 1 CN, 1 TA
Sciacqui bronchiali 1 CN, 1 TA
Fluido da pneumocentesi 1 CN, 1 TA
Tessuto da biopsia 1 CN, 1 TA
Sputo 2 CN, 2 TA
C. Richiudere la beuta fermamente e lasciarla con il lato agar
rivolto verso il basso, vedi fi gura 1, per un minimo do 30 minuti.
BROTH
AGAR
2. Inoculazione
Usare come tecnica in asepsi.
A. Per campioni liquidi come sciacqui bronchiali, fluido da
pneumocentesi e sciacqui di tessuto da biopsia:
Italiano 4/11
Figura 1

1. Tenere la beuta ad un angolatura di circa 45° e permettere
che circa 1.0 mL di campione scorrano lentamente raggiungendo
il centro dell’agar.
2. Quando la pipetta è stata rimossa dalla beuta, premerla
fermamente dentro l’agar per causare un taglio profondo
nell’area inoculata.
3. Richiudere la beuta ermeticamente.
Figura 2
B. Per campioni in Mycotrans :
1. Rimuovere circa 1.0 mL del brodo dall’area vicino all’
interfaccia dell’agar/brodo.
2. Ripetere le fasi da 1 a 3 per i campioni liquidi come descritto
nella sezione A (vedi sopra).
3. I campioni su scovoli possono essere trasportati intatti nel
Mycotrans e poi elaborati come descritto nella sezione C (vedi
sotto).
Italiano 5/11

C. Per campioni su scovoli come campioni da gola o di sputo:
1. Tenere la beuta ad un angolatura di circa 45° (vedi figura
2) e rigare l’area centrale dell’agar dal basso all’alto.
2. Risciacquare lo scovolo nel brodo e premerlo contro la parete
della beuta per espellere il campione dallo scovolo e versarlo
nel brodo.
3. Quando lo scovolo viene ritirato dalla beuta, premerlo con
cura dentro l’agar in modo da creare un taglio profondo nel
cento dell’area inoculata. Lo scovolo non farà un taglio pulito;
nonostante ciò, un taglio ineguale non avrà un effetto avverso
sulla prestazione di Mycotrim RS.
4. Richiudere la beuta ermeticamente.
3. Incubazione
Incubare la beuta con il lato agar rivolto verso l’alto a 34°
C - 37° C per 72 ore o finché il colore del preparato cambia.
Controllare la beuta ogni 24 ore per un cambiamento di colore
(vedi sotto 4. Osservazione).
Temperature superiori a 38° C inibiscono M. pneumoniae.
Nel rimuovere le beute dall’incubatrice per l’evalutaione bisogna
far attenzione per evitare di sciacquare via parte della crescita
dell’agar facendo scorrere il brodo sopra l’agar.
4. Osservazione
A. Cambiamento di colore
Il primo segno di M. pneumoniae in Mycotrim RS è un
cambiamento di colore nel preparato che può avvenire da 72
a 96 ore dopo l’inoculazione. La crescita di M. pneumoniae fa
cambiare il colore del preparato da rosso a giallo - arancio.
Italiano 6/11

Diversamente da batteri o funghi, M. pneumoniae non causa
torbidezza nel brodo, anche a titoli massimi. Intensa torbidezza
o colonie visibili sull’agar indicano una sovracrescita di batteri o
funghi, rendendo il cambiamento di colore inaffi dabile e possono
nascondere colonie di mycoplasma. Se nessun cambiamento di
colore avviene entro 72 ore, reinoculare l’agar come indicato nella
fase 5, Reinoculazione, vedi sotto.
B. Apparenza della colonia
Non usare un microscopio rovesciato.
Quando un cambiamento di colore avviene entro le prime 72
- 96 ore, le colonie sono genericamente visibili microscopicamente.
Un microscopio a luce convenzionale con una
lente di obiettivo a bassa potenza (10x) e 10x di oculare o un
microscopio per dissezione di buona qualità con una capacità
di ingrandimento di 70x - 100x è adeguato. Sarà necessario
aggiustare il piano o il pezzo nasale del microscopio per accomodare
la profondità della beuta di Mycotrim RS.
Per esaminare la beuta per colonie di M. pneumoniae:
1. Mettere la beuta, con il lato agar rivolto verso l’alto,
sul piano del microscopio come indicato nella figura 3.
Focalizzare attraverso la beuta e l’agar all’interno della
superficie dell’agar. Il taglio fatto durante l’inoculazione
segna l’area inoculata e aiuta la focalizzazione.
2. Analizzare la lunghezza della beuta lungo entrambi i lati del
taglio in cerca di colonie.
3. Esaminare le presunte colonie focalizzandole su e giù. Le
colonie possono crescere sulla superficie dell’agar e sotto
la superficie dell’agar. Le colonie che crescono nell’agar
possono non apparire perfettamente a fuoco.
Italiano 7/11

AGAR
BROTH
10x
Figura 3
Apparenza della colonia di M. pneumoniae:
Le colonie di M. pneumoniae hanno un diametro di 60
- 200 micron, sono circa 1/10 della grandezza di una piccola
colonia batterica, sono da 1 a 5 volte più grandi di una singola
cellula epiteliale buccale, e da 10 a 15 volte più grandi di un
singolo globulo bianco. Le colonie di Mycoplasma hanno
un aspetto caratteristico di “uova fritte” o di “una polpetta di
sabbia” (granulare). Le cellule epiteliali si distinguono chiaramente
da colonie di Mycoplasma per via dei loro margini acuti
ed angolari e del loro citoplasma limpido (spesso ripiegato su
se stesso).
5. Reinoculazione
Non aprire la beuta di Mycotrim RS.
Se un cambiamento di colore non avviene dopo 72 ore, reinoculare
l’agar inclinando la beuta cosicché il brodo venga a contatto
con 1/3 - 1/2 della superficie dell’agar, vedi figura 4. Dopo la
reinoculazione, incubare la beuta a 34°C - 37°C con il lato agar
rivolto verso l’alto. Continuare ad esaminare la beuta giornalmente
in cerca di un cambiamento di colore. Quando si nota un
cambiamento di colore, cercare colonie microscopiche tipiche
(vedi sopra, fase B. Aspetto della colonia).
Italiano 8/11

Figura 4
6. Uso Opzionale del Diene Colorante
Il Diene colorante deve essere usato solo quando la beuta non
verrà più incubata. Il Diene colorante distrugge M. pneumoniae.
Una volta colorata, la beuta può essere conservata per diversi
mesi in frigorifero.
Per applicare il Diene colorante:
a. Aprire la beuta e rimuovere il brodo con una pipetta. Gettare
il brodo in un contenitore apposita per rifiuti infetti.
b. Facendo cura a non sciacquare la crescita dalla superfi cie,
applicare gentilmente due o tre gocce del colorante alla
superfi cie dell’agar. Richiudere la beuta.
c. Posizionare la beuta con il lato agar rivolto verso il basso per
30 minuti per permettere che il colorante si diffonda all’interno
dell’agar.
d. Esaminare la beuta microscopicamente per colonie. M.
pneumoniae trattiene il colorante mentre i batteri si decolorano
e non appaiono colorati.
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INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
Un risultato positivo è indicato da un cambiamento di colore (in
assenza di intensa contaminazione) da rosso a giallo - arancio e
se si osservano colonie sull’agar.
Diversamente da batteri o funghi, M. pneumoniae non causa
torbidezza nel brodo, anche a titoli massimi. Intensa torbidezza
o colonie visibili sull’agar indicano una sovracrescita di batteri o
funghi, rendendo il cambiamento di colore inaffidabile e possono
nascondere colonie di M. pneumoniae.
Un risultato negativo è riportato se nessun cambiamento di colore
avviene entro 10 giorni dopo la reinoculazione (13 giorni di totale
incubazione).
LIMITAZIONI
La presenza di elevate quantità di organismi diversi da M.
pneumaoniae può causare una sovracrescita anche se vengono
usati dischi antimicrobici. Un brodo torbido o colonie visibili a
occhio nudo indicano una sovracrescita. Batteri e funghi possono
causare un cambiamento di colore in assenza di M. pneumoniae.
Una sovracrescita può nascondere la presenza di colonie di M.
pneumoniae.
L’efficacia antimicrobica è compromessa quando il campione è inoculato
prima della completa dispersione degli agenti antimicrobici
o quando il disco rimane nella beuta di Mycotrim RS per più di 24
ore prima dell’inoculazione.
Italiano 10/11

CONTROLLO DI QUALITÀ
Ogni beuta di Mycotrim RS è incubata e testata per contaminazione.
Ogni partita di Mycotrim RS è testata per la sua abilità
di mantenere M. pneumoniae (ATCC #15531) ed Acholeplasma
Laidlawii (ATCC #23206). La crescita di questi organismi deve
essere dimostrata sia nel brodo che nel preparato agar. L’attività
inibitoria dei dischi antimicrobici è testata inoculando beute
contenenti dischi antimicrobici con Staphyloccus aureus (ATCC
#25923), Colibacillo (ATCC #25922) e Candida Albicans (ATCC
#10231). L’inibizione di tutti e tre gli organismi deve essere
dimostrata dopo un’incubazione di 24 ore a 34°C - 37°C.
Italiano 11/11

APLICACIÓN
Mycotrim ® RS es un sistema de cultivo completo para Mycoplasma
pneumoniae (M. pneumoniae) a partir de muestras humanas del
sistema respiratorio.
M. pneumoniae es una causa común de infecciones respiratorias.
M. pneumoniae es la causa de la pneumonía primaria atípica.
Está asociada a la bronquitis crónica y se lo considera responsable
de más del 20% de los casos de pneumonía.
Mycotrim RS está diseñado para el aislamiento selectivo e
identificación M. pneumoniae a partir de muestras del aparato
respiratorio.
DESCRIPCIÓN DEL PRODUCTO
Cada frasco de Mycotrim RS contiene agar y un caldo especialmente
formulado para permitir el crecimiento de M pneumoniae.
Cuando el frasco es inoculado e incubado con el agar hacia
arriba, el agar y el caldo están separados por aire húmedo. Esto
crea condiciones óptimas para el crecimiento de M. pneumoniae
en la superficie del agar. Antes de la inoculación, se añaden
discos de antimicrobianos para evitar el crecimiento de otros
microorganismos distintos de M pneumoniae.
En los cultivos positivos para M. pneumoniae se produce un
aumento de pH que provoca un cambio de color en el medio. En
el caso de muestras con alta carga de patógeno, este cambio de
color puede ocurrir en tan sólo 72 a 96 horas, mientras que en las
de baja carga, puede tardar de 7 a 10 días. Los frascos que no
muestran cambio de color después de 72 horas son re-inoculados
con caldo enriquecido dentro del mismo frasco. Al producirse
el cambio de color, se examina el frasco al microscopio (a bajo
aumento) para diferenciar las colonias de M pneumoniae en la
superficie del agar.
Español 1/11

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
Almacene todos los componentes del Mycotrim RS ( frascos, discos
antimicrobiales y colorante de Dienes ) en la caja original, de 2° C
a 8° C.
No lo congele.
Mycotrim RS y los componentes del kit deben ser usados antes de
la fecha de caducidad impresa en la caja.
LOS MATERIALES PROPORCIONARON
Componente Kit de 12 pacientes
Agar/Frasco del caldo 12
Sodio de Cefoperazona/
Discos del la Nistatina 2 Platos (15 discos/plato)
Acetato de talosa 2 Platos (15 discos/plato)
Dienes Stain 1 Frasco (2.5 mL/frasco)
Discos de Antimicrobianos
Un disco CN blanco permite alcanzar una concentración aproximada
en agar y caldo de :
Cefoperazona 100.0 μg/mL
Nistatina 50.0 U/mL
Cada antimicrobianos TA rosa cada una.
Acetato de talosa 250.0 μg/mL
Colorante Dienes - contiene azul de metileno y azul II.
MATERIAL NECESARIO NO INCLUIDO EN EL KIT
Pipetas estériles, o
Hisopos estériles, o
Asa bacteriológica estéril
Pinzas estériles
Microscopio convencional con oculares 10x y objetivos 10x,
o lupa binocular con aumento de 70x a 100x.
Incubador capaz de mantener temperaturas entre 34°C a 37°C.
Español 2/11

PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS
No use Mycotrim RS si el frasco o los tapones están agrietados o
si los medios muestran signos de contaminación. El caldo debe
ser claro y de color rojizo, sin signos de turbidez.
M. pneumoniae se destruyen con temperaturas superiores a 40° C
(104° F ), y resultan fisiológicamente alterados a temperaturas por
encima de los 38° C ( 100° F ).
La eficacia antimicrobiana se ve disminuida en dos casos: si la
muestra es inoculada antes de la completa dispersión de los
antimicrobianos, o si se inocula después de que los discos hayan
estado en el frasco de Mycotrim RS más de 24 horas.
M. pneumoniae es un patógeno humanos. Deberían seguirse las
precauciones de seguridad apropiadas para el manejo y desecho
de materiales biológicos potencialmente infecciosos.
Advertencia: las leyes federales (U.S.) prohiben la venda de este
producto si no es bajo la supervisión de un médico.
RECOLECCIÓN Y PROCESADO DE MUESTRAS
Las muestras deben ser inoculadas en Mycotrim RS en el plazo
más breve posible después de su obtención. Si esto no es posible,
es mejor mantenerlas en el medio de transporte Mycotrans ®
(disponible en Irvine Scientific) de 15° C a 30° C.
Tipo de
Muestra Obtención y Procesado
Frotis de Garganta Haga el frotis de la garganta de acuerdo a los
procedimientos establecidos. Mantenga el
hisopo en medio de transporte Mycotrans hasta
que pueda ser inoculado en Mycotrim RS
Esputo Sumerja un hisopo estéril en la muestra y
úselo para inocular. (Mantenga el hisopo en
Mycotrans para transportarlo)
Español 3/11

Lavados Bronquiales Use hasta 1mL de fl uido para inocular.
Fluido de
Pneumocentesis Use hasta 1mL de fl uido para inocular.
Tejido de Biopsia Asépticamente, muela una pequeña pieza de
tejido. Pipetee hasta 1 mL del tejido molido +
lavados y úselo para inocular.
INSTRUCCIONES DE USO
1. Preparación del Frasco
A. Afloje el tapón del frasco de ¼ a ½ vuelta y atempere
el frasco en el incubador entre 34° C y 37° C durante
aproximadamente 5 minutos.
B. Asépticamente añada los disco antimicrobianos según el
tipo de muestra:
Origen de la muestra Disco antimicrobiano
Garganta 1 CN, 1 TA
Lavados bronquiales 1 CN, 1 TA
Fluidos de pneumocentesis 1 CN, 1 TA
Tejido de biopsia 1 CN, 1 TA
Esputo 2 CN, 2 TA
C. Coloque el frasco con el agar hacia abajo, como se muestra en
la fi gura #1, durante un mínimo de 30 minutos.
BROTH
AGAR
Español 4/11
Figura 1

2. Inoculación
Manipule en condiciones asépticas.
A. Para muestras líquidas tales como lavados bronquiales,
fluidos de pneumocentesis y lavados de tejidos de biopsia:
1. Sostenga el frasco en un ángulo aproximado de 45° como
se muestra en la figura No. 2, y deje fluir aproximadamente
1.0 mL, lentamente hacia abajo, al centro del agar.
2. Mientras va sacando la pipeta del frasco, presione
firmemente sobre el agar para hacer un corte profundo en
el área inoculada.
3. Vuelva a tapar el frasco herméticamente.
Figura 2
B. Para muestras en Mycotrans:
1. Retire aproximadamente 1.0 mL de caldo del área cercana
a la interfase del agar/caldo.
2. Repita los pasos del 1 al 3, para muestras líquidas, como
las descritas en la sección A (arriba).
Español 5/11

3. Las muestras en hisopos pueden ser transportadas intactas
en Mycotrans, y procesadas más tarde como se describe en
la sección C (abajo).
C. Para muestras en hisopo, tales como muestras procedentes
de garganta o esputo:
1. Sostenga el frasco en un ángulo aproximado de 45° (como
se muestra en la figura No. 2) y haga una raya en el área
central del agar, del fondo hacia el cuello del frasco.
2. Enjuague el hisopo en el caldo y presiónelo contra la
pared del frasco para liberar la muestra contenida en el
mismo, de forma que caiga sobre el caldo.
3. Conforme se va sacando el hisopo del frasco, presiónelo
cuidadosamente sobre el agar para hacer un corte profundo
en el centro del área inoculada. El hisopo no va a
hacer un corte limpio; pero de cualquier manera, el corte
imperfecto no va a afectar en forma adversa el funcionamiento
del Mycotrim RS.
4. Tape el frasco de nuevo herméticamente.
3. Incubación
Incube el frasco con el agar hacia arriba durante 24 horas de
34°C a 37°C, o hasta que cambie el color del medio. Revise
el frasco cada 24 horas para ver si hay algún cambio de color
( ver paso 4. Observación a continuación).
Temperaturas superiores a 38°C inhibirán M. pneumoniae.
Cuando saque los frascos del incubador para su observación,
debe tener cuidado de no provocar salpicaduras de caldo que
podrían arrastrar las colonias crecidas sobre el agar.
Español 6/11

4. Observación
A. Cambio de color
El primer signo de M.pneumoniae en el Mycotrim RS, es un
cambio de color en el medio que puede ocurrir entre 72 y
96 horas después de la inoculación. El crecimiento de M.
pneumoniae provocará un cambio de color del medio de rojo a
amarillo-anaranjado.
A diferencia de las bacterias y hongos, M pneumoniae no
provoca turbidez en el caldo, incluso a concentraciones máximas.
Una turbidez elevada o colonias visibles sobre el agar,
indican contaminación por bacterias u hongos. Esto hace que
el cambio de color no sea un indicador fiable y es posible que
enmascare la presencia de colonias de mycoplasma. Si no se
produce un cambio de color en 72 horas, re-inocule el agar
como se indica en el paso 5. Reinoculación, a continuación.
B. Aspecto de la colonia
No use microscopio invertido.
Cuando se produce el cambio de color dentro de las primeras
72 a 96 horas, las colonias pueden observarse normalmente
con el microscopio. Un microscopio óptico convencional con
objetivos y oculares 10x, o un microscopio de disección de
buena calidad con capacidad de aumento de 70x a 100x, son
adecuados. Ajuste la altura de la platina para que permita la
colocación del frasco de Mycotrim RS.
Para examinar la presencia de colonias de mycoplasma en
el frasco:
1. Coloque el frasco con el agar hacia arriba, sobre la platina
del Microscopio como se indica en la figura 3. Enfoque a
través del frasco y el agar hacia la superficie interior del
agar. El corte hecho durante la inoculación marca el área
inoculada y ayuda a enfocar.
Español 7/11

2. Revise ambos lados del corte a lo largo del frasco, para ver si
hay colonias.
3. Examine las colonias sospechosas enfocando varios
planos. Las colonias pueden crecer en la superficie del
agar o penetrar por debajo de la superficie del mismo. Las
colonias que penetran debajo de la superficie pueden ser
difíciles de enfocar.
AGAR
BROTH
10x
Figura 3
Aspecto de las colonias de M. pneumoniae:
Las colonias de M. pneumoniae tienen un diámetro de 60
a 200 micras, cerca de 1/10 del tamaño de una colonia
pequeña de bacterias, de 1 a 5 veces más grande que una
célula epitelial bucal aislada, y de 10 15 veces mayor que
un leucocito. Las colonias de micoplasma tienen un aspecto
característico de “huevo frito” o “granulado”. Las células epiteliales
se distinguen claramente de las colonias de micoplasma
por sus bordes angulosos y su citoplasma claro (a menudo
doblado sobre si mismo).
5. Reinoculación
No abra el frasco de Mycotrym RS.
Si no se produce un cambio de color después de 72 horas,
reinocule el agar inclinando el frasco para que el caldo
haga contacto de 1/3 a ½ de la superficie del agar, como se
muestra en la figura 4. Después de la re-inoculación, incube el
frasco entre 34° C y 37° C con el agar hacia arriba. Continúe
Español 8/11

examinando el frasco diariamente para ver si el color cambia.
Cuando se observe cambio de color, busque colonias microscópicas
típicas (vea sección B. Apariencia de la colonia).
Figura 4
6. Uso Opcional del Colorante Dienes
El colorante Dienes sólo debe ser utilizado cuando no se va a
seguir incubando el frasco. El colorante Dienes es letal para
micoplasmas. Una vez teñido, el frasco puede ser almacenado en
el refrigerador durante algunos meses.
Para aplicar el colorante Dienes:
a. Abra el frasco y aspire el caldo con una pipeta. Tire el
caldo en un contenedor para residuos infecciosos.
b. Deposite cuidadosamente, para evitar arrastrar las
colonias, dos o tres gotas de colorante sobre la superficie
del agar. Cierre el frasco.
c. Deje reposar el frasco con el agar hacia abajo unos 30
minutos para permitir que colorante difunda en el agar.
Español 9/11

d. Examine microscópicamente el frasco para localizar colonias.
M.pneumoniae retendrá el colorante mientras que las
bacterias aparecerán sin tinción.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
El cambio de color de rojo a amarillo-anaranjado, y la observación
de colonias en el agar es un indicador de resultado positivo
(en ausencia de contaminación).
A diferencia de bacterias y hongos, no causa turbidez en el caldo,
aun a concentraciones máximas. Una turbidez elevada o colonias
visibles sobre el agar, indican contaminación por bacterias u
hongos. Esto hace que el cambio de color no sea un indicador
fiable y es posible que enmascare la presencia de colonias de M.
pneumoniae.
Se considera resultado negativo si no hay cambio de color dentro
de los 10 días siguientes a la reinoculación (13 días de incubación
en total).
LIMITACIONES
La presencia de un inóculo demasiado alto de microorganismos
distintos de M. pneumoniae podría provocar contaminación aún
cuando se empleen discos antimicrobianos. Un caldo turbio o colonias
visibles a simple vista indican contaminación. Las bacterias
y los hongos pueden causar cambio de color en ausencia de M.
pneumoniae. La aparición de contaminaciones puede enmascarar
la presencia de M. pneumoniae.
La efectividad antimicrobiana se ve mermada cuando la muestra
es inoculada antes de que se complete la difusión del antimicrobiano,
o cuando los discos han estado en el frasco de Mycotrim
RS más de 24 horas antes de proceder a su inoculación.
Español 10/11

CONTROL DE CALIDAD
Cada frasco de Mycotrim RS es incubado y se verifica la ausencia
de contaminación. Para cada lote de Mycotrim RS se comprueba
su capacidad de permitir el crecimiento de M. pneumoniae (ATCC
# 15531) y Acheloplasma laidlawii (ATCC # 23206). El crecimiento
de estos organismos debe ser demostrado en ambos medios:
caldo y agar. La actividad inhibidora de los discos antimicrobianos
es comprobada frente a Staphylococcus aureus (ATCC # 25923),
Escherichia coli (ATCC # 25922) y Candida albicans (ATCC #
10231). La inhibición de estos tres organismos debe ser demostrada
después de 24 horas de incubación a 34-37° C.
Español 11/11

UTILISATION
Mycotrim ® RS est un système complet de culture de Mycoplasma
pneumoniae (M. pneumoniae) dans les prélèvements respiratoires
humains.
M. pneumoniae est une cause commune d’infections respiratoires.
M. pneumoniae est la cause de la pneumonie atypique primaire
souvent appelée “pneumonie ambulatoire”. Il est associé à des
bronchites chroniques et on pense qu’il est responsable de 20%
de tous les cas de pneumonie.
Mycotrim RS est conçu pour isoler et identifier sélectivement M.
pneumoniae dans les prélèvements respiratoires humains.
DESCRIPTION DU PRODUIT
Chaque flacon Mycotrim RS contient une agar et un bouillon de
culture spécialement formulés pour favoriser le développement
de M. pneumoniae. Quand le flacon est ensemencé et incubé,
côté agar en haut, l’agar et le bouillon de culture sont séparés
par de l’air humide. Ceci crée les conditions optimum pour le
développement de M. pneumoniae sur la surface de l’agar. Des
disques anti-microbiens sont ajoutés avant l’ensemencement pour
prévenir le développement de microorganismes autres que les
mycoplasmes.
Les cultures positives de M. pneumoniae font baisser le pH et
induisent un changement de couleur du milieu de culture. Dans
les prélèvements avec une concentration élevés, ce changement
de couleur peut se manifester après 72 ou 96 heures, alors
que dans les prélèvements à basse concentration ce processus
peut prendre jusqu’à 7 ou 10 jours. Les flacons de culture ne
montrant aucun changement de couleur après 72 heures sont
ré-ensemencé avec le bouillon de culture enrichi, dans le flacon.
Une fois que le milieu change de couleur, le flacon est examiné au
microscope (faible grossissement) pour détecter des colonies de
M. pneumoniae sur la surface de l’agar.
Français 1/10

STOCKAGE ET STABILITÉ
Conserver tout les composants de Mycotrim RS (flacons, disques
antimicrobiens et colorant de Dienes) dans la boite d’origine entre
2 et 8° C.
Ne pas congeler.
Les composants du kit Mycotrim RS doivent être utilisés avant la
date d’expiration imprimée sur la boite.
MATÉRIAUX FOURNIS
Composant Kit de 12 patients
Agar/Flacon le bouillon de culture 12
Sodium de Cefoperazone/
Disques de Nystatin 2 boîtes (15 disques/boîte)
Acétate de Thallous 2 boîtes (15 disques/boîte)
Colorant de Dienes 1 fiole (2.5 mL/fiole)
Disques Antimicrobiens
Chaque disque donne une antimicrobiens CN blancs concentration
approximative (dans l’agar et le bouillon de culture) de:
Cefoperazone de sodium 100.0 μg/mL
Nystatin 50.0 U/mL
Chaque disques antimicrobiens TA roses aboutissent approximatives:
Acétate de Thallous 250,0 μg/ml
Colorant de Dienes - contiennent du bleu de méthylène et de l’azure II.
MATÉRIEL REQUIS MAIS NON FOURNI
Pipette stérile, ou
Ecouvillons stériles, ou
Anse bactériologique stérile
Pince stérile
Microscope conventionnel avec des oculaires 10X et des objectifs
10X ou une loupe binoculaire avec un pouvoir agrandissant
de 70 à 100X.
Une étuve capable de maintenir une température de 34 à 37°C.
Français 2/10

PRÉCAUTIONS ET MISE EN GARDE
Ne pas utiliser les flacons Mycotrim RS ni leurs bouchons s’ils
sont fêlés ou si le milieu montre des signes de contamination. Le
bouillon de culture doit être clair et de couleur rougeâtre avec
aucun signe de trouble.
M. pneumoniae est tué par des températures supérieures à 40°C
(104 °F) et physiologiquement compromis à des températures
supérieures à 38°C (100°F).
L’efficacité des disques antimicrobiens est altérée si
l’ensemencement a lieu avant la dispersion des agents antimicrobiens
ou si les disques sont restés dans le flacon Mycotrim RS
plus de 24 heures.
M. pneumoniae est un pathogène humain. Les mesures de sécurité,
pour la manipulation et l’élimination du matériel biologique
infectieux, doivent être suivies tout le temps.
ATTENTION : La loi fédérale (U.S.) limite la vente de ce dispositif
aux médecins ou sur ordre d’un médecin.
RECUEIL ET MANIPULATION DES PRÉLÈVEMENTS
Les prélèvements doivent être utilisés pour ensemencer Mycotrim
RS le plus rapidement possible après leur recueil. S’il est impossible
d’utiliser les prélèvements, juste après leur recueil, le mieux
est de les maintenir dans le système de transport Mycotrans ®
(disponible, par Irvine Scientific) entre 15° et 30° C.
Type de
Prélèvement Recueil, Manipulation et Ensemencement
Gorge Récurer la gorge à l’aide d’un écouvillon selon la
pratique en vigueur. Placer l’écouvillon dans le milieu
de Mycotrans jusqu’à l’ensemencement de Mycotrim
RS
Crachat Plonger un écouvillon dans le prélèvement et
l’utiliser pour ensemencer. (Placer l’écouvillon dans
Mycotrans pour le transporter).
Français 3/10

Lavage des
bronches Utiliser 1 ml du prélèvement de lavage pour
ensemencer.
Liquide de
pneumocentèse Utiliser 1 ml de liquide pour ensemencer.
Tissu de biopsie Broyer stérilement une petite pièce de tissu. Prélever
jusqu’à 1 ml de tissu broyé (avec son extrait) et
l’utiliser pour ensemencer.
CONSEILS D’UTILISATION
1. Préparation des flacons de culture
A. Desserrer les bouchons des flacons ¼ ou ½ tour et
préchauffer les flacons dans une étuve (34°C à 37°C)
pendant cinq minutes environ.
B. Déposer de façon stérile un disque anti-microbien selon le
type de prélèvement :
Source du prélèvement Disque antimicrobien
Gorge 1CN, 1TA
Lavage des bronches 1CN, 1TA
Liquide de pneumocentèse 1CN, 1TA
Tissu de biopsie 1CN, 1TA
Crachat 2CN, 2TA
C. Fermer le flacon et le placer coté agar en bas comme dans
la figure 1, laisser dans cette position pendant au moins
30 minutes.
BROTH
AGAR
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Figure 1

2. Ensemencement
Manipuler stérilement
A. Pour les prélèvements liquide comme le liquide de lavage des
bronches, le liquide de pneumocentèse et le milieu de lavage
de tissu de biopsie:
1. Tenir le flacon à un angle de 45° comme sur la figure 2 et
permettre à 1 ml de prélèvement de couler lentement au
milieu de l’agar.
2. Au fur et à mesure que la pipette est retirée du flacon
presser fermement sur l’agar pour créer un profond sillon
dans la région ensemencée.
3. Bien fermer le flacon.
Figure 2
B. Pour les prélèvements dans Mycotrans:
1. Prélever environ 1 ml de bouillon de culture de la région
d’interface entre l’agar le bouillon.
Remarque : il n’est pas nécessaire d’enlever l’écouvillon ayant
servis à ensemencer Mycotrans
Français 5/10

2. Reprendre les étapes 1 à 3 du paragraphe A ci-dessus.
C. Pour les prélèvements sur écouvillons comme les prélèvements
de gorge et les crachats:
1. Tenir le flacon à un angle de 45° environ (comme sur la
figure 2) et faire des rayures dans la partie centrale de
l’agar commençant par le fond vers le col du flacon.
2. Rincer l’écouvillon dans le bouillon de culture et le presser
contre la paroi du flacon pour libérer le prélèvement dans
le bouillon.
3. En retirant l’écouvillon du flacon, le presser soigneusement
sur l’agar pour créer un profond sillon dans la
région ensemencée. L’écouvillon ne créera pas un sillon
parfait ; un sillon denté n’affectera pas négativement la
performance de Mycotrim RS.
4. Bien fermer le flacon.
3. Incubation
Incuber les flacons côté agar en haut entre 34° C et 37°C
pendant 72 heures ou jusqu’à ce que la couleur du milieu
change. Examiner la couleur du milieu dans les flacons toutes
les 24 heures (voir le paragraphe 4. Observation ci-dessous).
Les températures supérieures à 38° C inhiberont M. pneumoniae.
En sortant les flacons de l’étuve pour l’observation, faire attention
d’éviter de déloger, par les mouvements du bouillon de
culture sur l’agar, le tapis de microorganismes.
4. Observation
A. Changement de couleur
Le premier signe de M. pneumoniae dans Mycotrim RS est
un changement de couleur du milieu de culture qui peut
survenir dans les 72 à 96 heures après l’ensemencement. La
Français 6/10

croissance de M. pneumoniae provoquera un changement de
couleur du milieu du rouge au jaune orangé.
A la différence des bactéries et des champignons, M. pneumoniae
ne cause pas de turbidité dans le bouillon de culture, même aux
concentrations maximales. Une turbidité élevée et des colonies
visibles sur l’agar indiquent une surcroissance de bactéries ou
de champignons, rendant non fi able le changement de couleur
et cachant éventuellement des colonies de mycoplasmes. Si au
bout de 72 heures aucun changement de couleur n’est observé,
ré-ensemencer l’agar comme indiqué au paragraphe 5, Ré-ensemencement,
ci-dessous.
B. Apparence des colonies
Ne pas utiliser un microscope inversé.
Quand un changement de couleur est visible dans les premières
72 à 96 heures, les colonies sont en général visibles
au microscope. Un microscope optique classique avec un
objectif à faible grossissement 10x et des oculaires 10x ou
une loupe binoculaire de bonne qualité, avec un pouvoir
agrandissant de 70 x à 100X, sont adéquats. Il faudra ajuster
la platine du microscope pour accommoder la profondeur des
flacons Mycotrim RS.
Pour examiner les fl acons pour l’existence de colonies de M.
pneumoniae :
1. Placer le flacon sur la platine du microscope, côté agar
en haut comme indiqué sur la figure 3. Ajuster la mise
au point sur l’intérieur de l’agar. Le sillon crée durant
l’ensemencement sert de repère et facilite la mise au
point.
2. Balayer le fl acon le long des deux cotés du sillon à la recherche
de colonies.
Français 7/10

3. Examiner les éventuelles colonies en ajustant la mise au point.
Les colonies peuvent se développer à la surface de l’agar ou
pénétrer sous cette dernière. Les colonies qui pénètrent sous la
surface de l’agar peuvent être diffi ciles à mettre au point.
AGAR
BROTH
10x
Figure 3
Apparence des colonies M. pneumoniae:
Les colonies M. pneumoniae sont de 60 à 200 microns de diamètre,
environ le 1/10 de la taille d’une petite colonie bactérienne, 1 à 5 fois
la taille d’une seule cellule épithéliale de la bouche et 10 à 15 fois
plus large qu’une cellule blanche du sang. Les colonies de mycoplasme
ont l’aspect caractéristique “d’œuf sur le plat” ou de “pâté de
sable” (granuleux). Les cellules épithéliales peuvent être distinguées
des colonies de mycoplasme par leur forme, leurs bords angulaires
et leur claire cytoplasme (souvent plié sur lui même).
5. Ré-ensemencement
Ne pas ouvrir les flacons Mycotrim RS
Si aucun changement de couleur ne survient au bout de 72
heures, ré-ensemencer l’agar en faisant pencher le fl acon
de façon à ce que le bouillon de culture soit en contact avec
1/3 ou ½ de la surface de l’agar comme sur la fi gure 4. Après
ré-ensemencement, incuber le fl acon entre 34°C et 37°C, côté
agar en haut. Examiner le fl acon quotidiennement pour détecter
tout changement de couleur. Quand le changement de couleur
est observé, chercher au microscope les colonies typiques. (Voir
paragraphe B. Apparence des colonies, ci-dessus).
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Figure 4
6. Utilisation optionnelle du colorant de Dienes
Le colorant de Dienes doit être utilisé uniquement quand les
fl acons ne seront plus incubés. Le colorant de Dienes tue M.
pneumoniae. Une fois colorés, les fl acons peuvent être conservés
pendant quelques mois au réfrigérateur.
Application du colorant de Dienes :
a. Ouvrir le flacon et aspirer le bouillon de culture avec une
pipette. Jeter le bouillon dans un récipient adéquat pour
déchets infectieux.
b. En faisant attention d’éviter de déloger de l’agar le tapis
de microorganismes, soigneusement déposer deux ou trois
gouttes de colorant à la surface de l’agar. Fermer le fl acon.
c. Laisser reposer le flacon, côté agar en bas, pendant 30
minutes pour permettre au colorant de diffuser dans l’agar.
d. Examiner le flacon au microscope pour chercher les
colonies. M. pneumoniae va retenir le colorant alors que
les bactéries vont se décolorer et apparaîtront incolores.
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INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
Un résultat positif est indiqué par le changement de couleur (en
l’absence de grande contamination) du rouge au jaune orangé et
quand les colonies sont observées sur l’agar.
A la différence des bactéries et des champignons, M. pneumoniae
ne cause pas de turbidité dans le bouillon de culture, même aux
concentrations maximales. Une turbidité élevée et des colonies
visibles sur l’agar indiquent une surcroissance de bactéries ou
de champignons, rendant non fiable le changement de couleur et
cachant éventuellement des colonies de M. pneumoniae.
Un résultat négatif est rapporté en cas d’absence de changement
de couleur 10 jours après le ré-ensemencement (13 jours
d’incubation totale).
LIMITES
La présence d’un grand nombre d’organismes autres que M. pneumoniae
peut causer une surcroissance de microorganismes, même
quand les disques antimicrobiens sont utilisés. Un bouillon de culture
trouble ou des colonies visibles à l’œil nu indique une surcroissance.
Les bactéries et les champignons peuvent causer un changement de
couleur en l’absence de M. pneumoniae. Une surcroissance élevée
peut cacher la présence des colonies de M. pneumoniae.
L’efficacité antimicrobienne est affectée quand l’ensemencement a
lieu avant la diffusion complète du produit antimicrobien ou quand
le disque a été placé dans le flacon Mycotrim RS plus de 24 heures
avant l’ensemencement.
CONTRÔLE DE QUALITÉ
Chaque flacon de Mycotrim RS est incubé et inspecté pour une
éventuelle contamination. Chaque lot de Mycotrim RS est testé
pour sa capacité de maintenir M. pneumoniae (ATCC
Français 10/10
# 15531)
et Acholeplasma taidlawii (ATCC # 23206). La croissance de ces
organismes doit être démontrée dans l’agar et le bouillon de
culture. L’activité inhibitrice des disques antimicrobiens est testée
en ensemençant des flacons contenant des disques antimicrobiens
avec Staphylococcus aureus (ATCC # 25923), Escherichia coli
(ATCC # 25922) et Candida albicans (ATCC # 10231). L’inhibition des
trois organismes doit être évidente après une incubation pendant 24
heures entre 34°C et 37°C.

MODO DE UTILIZAÇÃO
Mycotrim ® RS é um sistema de cultura completo para Mycoplasma
pneumoniae (M. Pneumoniae) em amostras respiratórias
humanas.
O Mycoplasma pneumoniae é uma causa comum de infecções
respiratórias. O M. Pneumoniae é causa de pneumonia primária
atípica, vulgarmente conhecida como “pneumonia andante”. Está
associado a bronquites crónicas e pensa-se que seja o responsável
por mais de 20 % de todos os casos de pneumonia.
Mycotrim RS foi concebido para isolar e identifi car selectivamente o
M. Pneumoniae em amostras respiratórias humanas.
DESCRIÇÃO DO PRODUTO
Cada recipiente de Mycotrimâ RS contém agar e um caldo
especialmente formulado para manter o crescimento de M.
Pneumoniae. Quando o recipiente é inoculado e incubado com o
agar para cima, o agar e o caldo estão separados por ar húmido.
Isto cria condições óptimas para o crescimento de M. Pneumoniae
à superfície do agar. Antes da inoculação, adicionam-se discos
de antimicrobianos para evitar o crescimento de outros microorganismos,
que não o micoplasma.
Culturas positivas para M. Pneumoniae baixam o pH e causam
uma alteração de cor no Meio. Em amostras com elevada concentração,
esta alteração de cor poderá ocorrer num espaço de
tempo entre 72 a 96 horas, enquanto que em amostras com baixa
concentração, poderá demorar entre 7 e 10 dias. Os recipientes
que não apresentam alteração de cor após 72 horas são re-inoculados
com caldo enriquecido dentro do mesmo recipiente. Assim
que o meio apresente alteração de cor, o recipiente é examinado
microscopicamente (baixa ampliação) para a presença de colónias
de M. Pneumoniae à superfície do agar.
Português 1/11

ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE
Conservar todos os compostos de Mycotrim RS (recipientes, discos
antimicrobianos, corante de Dienes) na caixa original, entre 2° C e
8° C.
Não congelar.
Os componentes do kit do Mycotrim RS devem ser utilizados
antes da data de expiração impressa na caixa.
MATERIAIS FORNECIDOS
Compostos Jogo de
12 pacientes
Agar/Recipientes
do Caldo 12
Sódio de Cefoperazone/
Disques de Nystatin 2 prato (15 discs/pratos)
Thallous acetate 2 prato (15 discs/pratos)
Corante de Dienes 1 frasco (2.5 mL/frasco)
Iscos Antimicrobianos
Cada um CN disco antimicrobianos branco com uma concentração
aproximada de agar e caldo de :
Cefoperazone 100.0 μg/mL
Nystatin 50.0 U/mL
Cada TA disco antimicrobial cor-de-rosa rendem cada um de:
Thallous acetate 250.0 μg/mL
Corante de Dienes - contem azul de metileno e azul II.
MATERIAIS REQUERIDOS MAS NÃO INCLUÍDOS
Pipetas estéreis, ou
Cotonetes estéreis, ou
Ansa bacteriológica estéril, ou
Pinças estéreis
Português 2/11

Microscópio convencional com oculares 10x e objectivas 10x, ou
microscópio de dissecção com ampliação de 70x a 100x.
Incubadora apta a manter temperaturas de 34°C a 37°C.
PRECAUÇÕES E ADVERTÊNCIAS
Não utilizar Mycotrim RS se o recipiente ou a respectiva tampa
estiverem quebradas ou apresentarem sinais de contaminação. O
caldo deve ser límpido e apresentar coloração avermelhada, sem
sinais de turvação.
O M. pneumoniae é destruído a temperaturas acima dos 40° C
(104° F) , e fica fisiologicamente comprometido a temperaturas
acima dos 38° C (100° F).
A actividade antimicrobiana fica comprometida se a amostra for
inoculado, quer antes da dispersão dos discos estar completa, ou
depois dos discos terem permanecido no recipiente de Mycotrim
RS por mais de 24 horas.
O M. pneumoniae é um agente patogénico humanos. Deve
utilizar-se todas as precauções de segurança sempre que se
manipule ou descarte materiais biológicos infecciosos.
Atenção: A venda deste produto é feita exclusivamente sob
prescrição médica (U.S. lei).
RECOLHA E MANIPULAÇÃO DOS AMOSTRAS
Os amostras devem ser inoculadas em Mycotrim RS o mais rapidamente
possível após a recolha. Se as amostras não poderem
ser inoculadas logo após a sua recolha, é preferível mantê-las no
sistema de transporte Mycotrans ® (disponível na Irvine Scientific)
entre15° C e 30° C.
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Tipo de
Amostra Recolha, Manipulação e Inoculação
Garganta Utilize um cotonete de acordo com a
prática. Coloque o cotonete em sistema de
transporte Mycotrans até ser inoculado no
Mycotrim RS.
Expectoração Envolva um cotonete estéril na amostra e
uso para inocular. (Coloque o cotonete em
sistema de transporte Mycotrans)
Lavagem brônquica Utilize 1 mL de lavagem para inocular.
Fluído de
Pneumocentese Utilize 1 mL de fluído para inocular.
Tecido de Biópsia Assepticamente triture uma pequena porção
de tecido. Pipete até 1 mL de tecido triturado
+ lavado e utilize-o para inocular.
INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO
1. Preparação do Recipiente
A. Desenrosque a tampa do recipiente ¼ a ½ de volta e
aqueça o recipiente numa incubadora durante aproximadamente
5 minutos entre 34° C e 37° C.
B. Assepticamente, adicione um disco antimicrobiano ao
recipiente de acordo coma amostra:
Fonte da amostra Discos Antimicrobianos
Garganta 1 CN 1 TA
Lavagem brônquica 1 CN 1 TA
Fluído de Pneumocentese 1 CN 1 TA
Tecido de biópsia 1 CN 1 TA
Expectoração 2 CN 2 TA
C. Coloque o recipiente com o agar para baixo, como se
mostra na figura 1, durante um tempo mínimo de 30
minutos.
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BROTH
AGAR
Figura 1
2. Inoculação
Utilização de técnicas de assepsia.
A. Para amostras líquidos tais como lavagens brônquicas, fluído
de pneumocentese e lavados de biópsias de tecido:
1. Coloque o recipiente num ângulo aproximado de 45° como
mostra a figura 2, e deixe que aproximadamente 1.0 mL
flua lentamente até baixo, para o centro do agar.
2. Assim que retire a pipeta do recipiente, pressione firmemente
sobre o agar para fazer um corte profundo na área
inoculada.
3. Volte a tapar o recipiente firmemente.
Português 5/11
Figura 2

B. Para amostras em Mycotrans :
1. Remova aproximadamente 1.0 mL do caldo da área
circundante à interface do agar/caldo.
NOTA: Não é necessário retirar o cotonete utilizado para inocular
Mycotrans
2. Repita os passos de 1 a 3, para amostras líquidos, como os
descritos na secção A (em cima).
C. Para amostras em cotonete, tais como garganta ou expectoração:
1. Coloque o recipiente num ângulo aproximado de 45°
(como se mostra na figura 2) e faça um corte na área central
do agar, desde o fundo do recipiente até à superficíe.
2. Lave a cotonete no caldo e pressione-a contra a parede
do recipiente para expelir a amostra contida na cotonete,
e transferi-la para o caldo.
3. Conforme for retirando a cotonete do recipiente,
cuidadosamente pressione-a sobre o agar para fazer um
corte profundo no centro da área inoculada. A cotonete
não vai fazer um corte perfeito; de qualquer forma, o
corte imperfeito não vai afectar adversamente o funcionamento
do Mycotrim RS.
4. Tape o recipiente, firmemente.
3. Incubação
Incubar o recipiente com agar para cima durante 72 horas
entre 34°C e 37°C, ou até que a cor do meio sofra alteração.
Observe o recipiente todas as 24 horas para verificar se
houve alteração de cor ( ver 4. Observação. Abaixo).
Temperaturas acima de 38°C inibem o M. pneumoniae.
Português 6/11

Quando retirar os recipientes da incubadora para examinação,
deve ter cuidado para não remover a cultura que cresce
sobre o agar, salpicando o caldo sobre o agar.
4. Observação
A. Alteração de cor
O primeiro sinal de M. pneumoniae no Mycotrans RS, é uma
alteração de cor no meio, a qual pode ocorrer entre 72 e 96
horas depois da inoculação.
O crescimento M. pneumoniae provoca uma alteração de cor no
meio de cultura de vermelho para amarelo-alaranjado.
Ao contrário das bactérias e fungos, o M. pneumoniae não causa
turvação no caldo, ainda que esteja em elevadas concentrações.
Turvação forte de colónias visíveis sobre o agar, indicam
sobrepopulação de bactérias ou fungos, tornando a alteração
de cor não confi ável e possivelmente escondendo colónias de
micoplasma. Se a alteração de cor não ocorrer dentro de 72
horas, re-inocule o agar como se havia indicado no passo 5.
Reinoculação.
B. Aparência da colónia
Não utilize microscópio invertido.
Quando ocorrer alteração de cor dentro das primeiras 72
a 96 horas, as colónias podem observar-se normalmente
ao microscópio. Um microscópio convencional de luz com
uma ampliação baixa, com objectivas e oculares 10x, ou um
microscópio de dissecção de boa qualidade com capacidade
de ampliação de 70x a 100x. Vai ser necessário ajustar as
oculares do microscópio para adaptá-las à profundidade do
recipiente de Mycotrim RS.
Para examinar o recipiente para colónias de M. pneumoniae:
Português 7/11

1. Coloque o recipiente com o agar para cima sobre a placa
do microscópio como se indica na figura 3. Foque através
do recipiente e agar até à superficie interior do agar. O
corte feito durante a inoculação, marca a área inoculada e
ajuda na focagem.
2. Observe ambos os lados do corte ao longo do recipiente,
para verificar a presença de colónias.
3. Examine as colónias suspeitas focando por cima e por
baixo das mesmas. As colónias podem crescer na superfície
do agar ou penetrar por baixo da mesma. As colónias
que penetram por baixo da superfície não podem ser bem
focadas.
AGAR
BROTH
10x
Figura 3
Aparência de colónias de M. pneumoniae:
As colónias de M. pneumoniae apresentam entre 60 a 200
microns de diâmetro, cerca de 1/10 do tamanho de uma colónia
pequena de bactérias, 1 a 5 vezes maior que uma célula
epitelial bucal, e 10 a 15 vezes maiores que um leucócito.
As colónias de micoplasma têm uma aparência característica
de “ovo estrelado” ou uma aparência “granulosa”. As células
epiteliais distinguem-se das colónias de micoplasma pelas
suas margens em forma de ângulos agudos e citoplasma
transparente.
5. Reinoculação
Não abra o recipiente de Mycotrim RS.
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Se não ocorrer alteração de cor após 72 horas, re-inocular
o agar inclinando o recipiente para que o caldo esteja em
contacto com 1/3 a 1/2 da superfície do agar, como se mostra
na figura 4. Após a re-inoculação, incubar o recipiente entre
34° C e 37° C com o agar para cima. Continue observando
o recipiente diariamente para ver alguma alteração de cor.
Quando observar alteração de cor, procure colónias microscópicas
típicas (veja secção B. Aparência das colónias).
Figura 4
6. Utilização Opcional do Corante Dienes
O corante Dienes deverá ser utilizado apenas quando o
recipiente já não for mais incubado. O corante Dienes mata
o M. pneumoniae. Uma vez corado, o recipiente pode ser
armazenado durante alguns meses no frigorífico.
Para aplicar o corante Dienes:
a. Abra o recipiente e deite o caldo utilizando uma pipeta.
Descarte o caldo para um contentor de lixo infeccioso.
b. Tenha cuidado para não salpicar e eliminar a cultura da
superfície do agar, suavemente aplique duas ou três gotas
de corante na superficie do agar. Tape o recipiente.
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c. Deixe que o recipiente repouse com o agar para baixo
durante 30 minutos para permitir a difusão do corante no
agar.
d. Examine o recipiente microscopicamente para ver se
houve formação de colónias. O M. pneumoniae retêm
o corante, enquanto que as bactérias descoram apresentando-se
incolores.
INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
A alteração de cor é um indicador de resultado positivo (na ausência
de contaminação forte), de vermelho para amarelo-alaranjado
e são observadas colónias no agar.
Ao contrário de bactérias e fungos, o M. pneumoniae não causa
turvação do caldo, ainda que em concentrações elevadas. Turvação
forte ou colónias visíveis no agar indicam crescimento de
fungos ou bactérias, o que provoca uma alteração de cor não confiável
e possivelmente o ocultar de colónias de M. pneumoniae.
Um resultado negativo é notificado se não há alteração de
cor dentro dos 10 dias seguintes à re-inoculação (13 dias de
incubação no total).
LIMITAÇÕES
A presença de um número demasiado grande de organismos que
não o M. pneumoniae poderá causar o sobrecrescimento ainda
que se utilizem discos antimicrobianos. Caldo turvo ou colónias
visíveis à vista indicam sobrecrescimento. Bactérias e fungos
podem provocar alteração de cor na ausência de M. pneumoniae.
O sobrecrescimento forte poderá ocultar a presença de colónias
de M. pneumoniae.
A actividade antimicrobiana fica comprometida quando a amostra
é inoculada antes que a dispersão do disco antimicrobiano esteja
completa, ou quando os discos tenham permanecido no recipiente
de Mycotrim RS por mais de 24 horas antes de ser inoculado.
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CONTROLE DA QUALIDADE
Cada recipiente de Mycotrim RS é incubado e verificado para
contaminação. Cada lote de Mycotrim RS é testado para a sua
capacidade de manter o M. pneumoniae (ATCC # 15531) E Acholeplasma
laidlawii (ATCC # 23206). O crescimento destes organismos
deve ser demonstrado em ambos os meios: caldo e agar. A
actividade inibidora dos discos antimicrobianos é testada através
da inoculação de recipientes contendo os discos antimicrobianos
com Staphylococcus aureus (ATCC # 25923), Escherichia coli
(ATCC # 25922) e Candida albicans (ATCC # 10231). A inibição
destes três organismos deve ser demonstrada após 24 horas de
incubação entre 34° C e 37° C.
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MYCOTRIM ® is a registered trademark of Irvine Scientific.
MYCOTRANS ® is a registered trademark of Irvine Scientific.

REFERENCES
1. Klein JO, Mycoplasma Infections. Ch. 12, Infectious Diseases
of the Fetus and Newborn Infant:. 3rd Ed. 1990, W.B. Saunders
Company, Philadelphia.
2. Clyde WA, Mycoplasma pneumoniae Respiratory Disease
Symposium: Summation and Significance. Yale J. Biol and
Med. 1983, 56:523-527.
3. Garibaldi RA, Epidemiology of Community-Acquired Respiratory
Tract Infections in Adults: Incidence,Etiology, and Impact.
Am J. of Med. 1985, 78 (Suppl 6B) : 32-37.

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