T43.09 U7d.pdf - Universidad de La Salle

DETERMINACION DE LAS CARACTERISTICAS
AROMATICAS DE Brettanomyces/Dekkera AISLADO
EN VINO TINTO BABIC DE LA REGION DE
DALMACIA, CROACIA.
DIANA ROCIO URREA BLANCO
UNIVERSIDAD DE LA SALLE- UNIVERSITY OF ZAGREB
FACULTAD DE INGENIERIA DE ALIMENTOS- FACULTY OF FOOD
TECHNOLOGY AND BIOTECHNOLOGY
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA DE ALIMENTOS - DEPARTMENT OF
TECHNOLOGY AND ANALYSIS OF BEVERAGES
BOGOTA, COLOMBIA – ZAGREB, CROATIA
2009

DETERMINACION DE LAS CARACTERISTICAS AROMATICAS DE
Brettanomyces/Dekkera AISLADO EN VINO TINTO BABIC DE LA REGION DE
DALMACIA, CROACIA.
DIANA ROCIO URREA BLANCO
Trabajo de grado para optar al título de Ingeniera de Alimentos
Asesores de investigación:
LEO GRACIN
PhD, Senior Scientific Assistant
PATRICIA CHAPARRO GONZALES
Ingeniera de Alimentos
UNIVERSIDAD DE LA SALLE- UNIVERSITY OF ZAGREB
FACULTAD DE INGENIERIA DE ALIMENTOS- FACULTY OF FOOD
TECHNOLOGY AND BIOTECHNOLOGY
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA DE ALIMENTOS - DEPARTMENT OF
TECHNOLOGY AND ANALYSIS OF BEVERAGES
BOGOTA, COLOMBIA – ZAGREB, CROATIA
2009

CONTENIDO
pág.
RESUMEN ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 6
ABSTRACT ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 7
INTRODUCCION -------------------------------------------------------------------------------------------- 8
1. MARCO TEORICO -------------------------------------------------------------------------------------- 10
1.1 REPRODUCCION -------------------------------------------------------------------------------------- 10
1.1.1 GEMACIÓN MULTILATERAL --------------------------------------------------------------------------------- 12
1.1.2 GEMACIÓN POLAR ------------------------------------------------------------------------------------------- 12
1.1.3 FISIÓN ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 12
1.1.4 PSEUDOMYCELIUM ------------------------------------------------------------------------------------------ 13
1.2 TAXONOMIA ------------------------------------------------------------------------------------- 13
1.2.1 DEKKERA/BRETTANOMYCES ------------------------------------------------------------------------- 14
1.3 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS ----------------------------------------------------- 16
1.3.2 IDENTIFICACIÓN DE BRETTANOMYCES/DEKKERA ----------------------------------------------- 21
1.4 MEDIOS SÓLIDOS SELECTIVOS ----------------------------------------------------------------- 21
1.5 DIÓXIDO DE AZUFRE (SO2) EN VINOS ---------------------------------------------------------- 23
1.5.1 FORMAS DEL DIÓXIDO DE AZUFRE (SO2) ---------------------------------------------------------------- 24
1.5.2 INHIBIDOR MICROBIANO ------------------------------------------------------------------------------------ 25
1.6 ANTIBRETT® COMO ALTERNATIVA DE PREVENCIÓN Y ELIMINACIÓN DE
BRETTANOMYCES/DEKKERA ------------------------------------------------------------------------------- 27
2 PROBLEMA -------------------------------------------------------------------------------------- 29
3 JUSTIFICACION -------------------------------------------------------------------------------- 31

4 OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------------------------------------ 32
4.1 GENERAL ------------------------------------------------------------------------------------------------- 32
4.2 ESPECÍFICOS ---------------------------------------------------------------------------------------------- 32
5 ALCANCES --------------------------------------------------------------------------------------- 33
6 ESTADO DEL ARTE --------------------------------------------------------------------------- 34
7 MATERIALES Y METODOS ----------------------------------------------------------------- 39
7.1 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA BRETTANOMYCES/DEKKERA ------------------------- 39
7.1.1 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------------- 39
7.1.2 METODOLOGÍA ------------------------------------------------------------------------------------------------ 39
7.2 MEDIO LÍQUIDO SELECTIVO PARA BRETTANOMYCES/DEKKERA ------------------ 42
7.2.1 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------- 42
7.2.2 METODOLOGÍA ------------------------------------------------------------------------------------------- 42
7.3 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETT® EN VINO TINTO DE
LA REGION DE DALMACIA, CROACIA ------------------------------------------------------------- 44
7.3.1 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------- 44
7.3.2 METODOLOGÍA ------------------------------------------------------------------------------------------- 44
7.4 DETERMINACION DE AROMAS DE CARÁCTER BRETT EN EL VINO TINTO
BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE --- 46
7.4.1 MATERIALES --------------------------------------------------------------------------------------------------- 46
7.4.2 METODOLOGÍA ------------------------------------------------------------------------------------------------ 46
8 DISCUSIÓN Y RESULTADOS --------------------------------------------------------------- 48
8.1 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO ------------------- 48
8.2 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO -------------------------------------------- 53
8.3 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETT®
EN VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA, CROACIA ----------------------------------- 55
4

8.4 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE CARÁCTER BRETT EN EL
VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID
PHASE --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 65
8.4.1 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGÚN TEMPERATURAS DE
ALMACENAMIENTO --------------------------------------------------------------------------------------------- 70
9 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES --------------------------------------------- 82
9.1 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DESARROLLO DEL MEDIO
SOLIDO 82
9.2 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DESARROLLO DEL MEDIO
LÍQUIDO ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 83
9.3 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA INFLUENCIA DE DIOXIDO
DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETT® EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE
DALMACIA, CROACIA. ----------------------------------------------------------------------------------- 84
9.4 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA DETERMINACION DE
AROMAS DE CARÁCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL
METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE ---------------------------------------------- 85
ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 87
5

RESUMEN
Este estudio presenta el desarrollo y evaluación de simples métodos para la detección de
la levadura Brettanomyces/Dekkera en vino y su medio de producción, con el uso de
medio solido y liquido selectivo, además se evalúa el efecto del Dióxido de Azufre SO2 y
AntiBrett®, en vino tinto de la región de Dalmacia, Croacia. El método de detección de
esta levadura emplea medios selectivos enriquecidos, los cuales contienen Glucosa (20
gr/l) en comparación con Etanol (6ml / l), como fuentes de carbón y energía, cicloheximida
(30 gr/l), para prevenir la presencia de Sachharomyces, ampicilina (10 mg/L), como
antibiótico para prevenir el crecimiento de bacterias, y acido p-cumárico (100 mg/L), como
precursor de la producción de 4-etilfenol; para el medio solido, el uso de agar se realiza
en una concentración de 16 gr/L. Después de la siembra realizada en los medios (solido y
liquido), de vino contaminado con la levadura Brettanomyces/Dekkera, es monitoreado
diariamente micro y macroscópicamente.
Una muestra de vino tinto Babic, de Croacia, fue contaminado con colonias de la levadura
Brettanomyces/Dekkera y fue dividido en 8 muestras de las cuales 2 de estas fueron
monitoreadas como control, sin adición de ningún compuesto, 2 con adición de dióxido de
azufre SO2, en una concentración de 40mg/L, y 4 de estos con AntiBrett® en una
concentración de 40gr/Hl. El método de este estudio se basa en la determinación del
comportamiento de la levadura Brettanomyces/Dekkera en estas condiciones. Este, se
evaluó en términos de crecimiento de la citada levadura (UFC/ml) presentes en las
muestras, y análisis fisicoquímicos antes y después de 15 días de adición y monitoreo.
6

ABSTRACT
This experiment presents the development and testing of a simple way to detect
Brettanomyces/Dekkera from wine and wine environments using selective media in solid
phase and liquid phase, and the influence of Sulfur Dioxide (SO2) and Antibrett ® in red
wines from Dalmatian region. The method of detection of this yeast employs selective
enrichment mediums. These mediums contains glucose (20g/l) and Ethanol (6%), as
carbon and energy source, cycloheximide (30 mg/l) to prevent growth of Sachharomyces,
ampicilin (10 mg/l) to prevent growth of bacteria and p-coumaric acid (100 mg/l) as a
precursor of the production of 4-etilphenol, depending on the phase of the medium agar
compound is used in a concentration of 16 gr/l. After putted on the medium wine
contaminated with Brettanomyces/Dekkera, is monitored by micro and macro inspection,
also with the liquid medium.
A red wine from Dalmatian region was contaminated with Brettanomyces/Dekkera colonies
and divided in 8 different containers; from these 8 containers we had two for control no
addition, two with addition of Sulfur Dioxide (SO2) in a concentration of 40 mg/l and four of
them with Antibrett ® in a concentration of 40g/Hl. The method for this study is based in
following the behavior of the yeast Brettanomyces/Dekkera with these compounds, in this
wine this behavior was monitored based in CFU/ml showing in the samples, and physic
and chemical analysis before addition and 15 days after.
7

INTRODUCCION
Las levaduras del género Brettanomyces, o su forma telemórfica (nombre que
reciben las especies que presentan reproducción sexual y en consecuencia,
formación de esporas por meiosis) Dekkera, fueron descritas por primera vez por
Claussen en 1903, en la producción de cerveza 1 .
Este género se conoce desde hace tiempo como agente contaminante, en la
industria cervecera, de la sidra y de bebidas carbonatadas 2 . En la industria
enológica su descripción como alterante es más reciente.
Durante los años 1950s muchos autores reportaron el aislamiento del genero
Brettanomyces en uvas francesas e italianas (Van der Walt y Van der Kerken
1958). Sin embargo, en muchas regiones del mundo vinícola esta levadura no ha
sido identificada lo cual dificulta su detección en materiales o productos
contaminados.Entre todos los microorganismos la levadura
Brettanomyces/Dekkera es una de las más temidas por los vinicultores. El
crecimiento y desarrollo de esta levadura causa alteraciones denominadas
“carácter Brett” lo cual ocurre especialmente en vinos tintos. 3
1 Gilliland, R. Brettanomyces. I. Occurrence, characteristics and effects on beer flavor., J. Inst. Brew
1961
2 Deak, T. y Beuchat, L.R.: Handbook of spoilage yeast. CRC Press, Nova York, 1996.
3 Heresztyn, T , Archives of Microbiology 1986. Metabolism of phenolic compounds from
hydroxycinnamic acids by Brettanomyces yeast
8

El “carácter Brett” produce un amplio espectro de sabores y aromas alterantes
entre los cuales están: corral, minerales, tinta, tabaco, cuero, fármacos, y
ahumado estas alteraciones se le atribuyen a los compuestos 4-etilfenol y 4-
etiguayacol, las cuales, causan una supresión de aromas atractivos en el vino
como de frutas y flores, y perdida de sabores agradables para el consumidor como
acido, salado, amargo o picante. 4
Esta levadura tiene distinto comportamiento según el tipo de vino al que esté
asociada pues cada tipo de vino tiene diferente composición de carbonos,
nitrógenos, vitaminas y minerales
.
Con este estudio se evalúa el comportamiento y caracterización de la levadura
Brettanomyces/Dekkera en vino tinto Babic de la región de Dalmacia, Croacia, con
el desarrollo de medios solido y liquido para la selectividad de la levadura,
alteraciones aromáticas del vino tinto Babic producidas por: 4 etilfenol y 4
etilguayacol, y el comportamiento de Brettanomyces/Dekkera en el vino al ser
tratado con Dióxido de azufre (SO2) comparativamente con tratamiento Antibrett®.
4 Boulton, Singleton, Bisson, & Kunkee, 1996. Descripción de aromas fenólicos.
9

1. MARCO TEORICO
Las levaduras representan el grupo de microorganismos más importante en la
industria vinícola, porque sin Saccharomyces, producir vinos de alta calidad sería
imposible. Ademas de Saccharomyces, hay muchos otros géneros y especies de
levaduras presentes durante la vinificación que afectan la calidad del vino, positiva
o negativamente 5 .
Las levaduras comprenden 39 géneros y 350 especies. Se identifican y clasifican,
basándose en características morfológicas y fisiológicas. Entre los aspectos
morfológicos considerados, se encuentran el tamaño y la forma de las células, en
medios sólidos y líquidos especificados, el modo de reproducción y si forma velo
en la superficie o sedimenta en un medio líquido. Entre las características
fisiológicas consideradas, se encuentra si puede crecer (y fermentar) en un
determinado carbohidrato y si puede o no utilizar determinadas fuentes de
nitrógeno, como los nitratos. 6
1.1 REPRODUCCION
Las levaduras son agrupadas en tres familias, conocidas como
Saccharomycetaceae, Sporobolomycetaceae, y Cryptococcaceae. Estas
5 H. Erten, June 2002. Relations between elevated temperatures and fermentation behavior of
Kloeckera apiculata and Saccharomyces cerevisiae associated with winemaking in mixed culture,
World Journal of Microbiology and Biotechnology, Volume 18, N 4, pag 1, Adana, Turkey.
6 Cerveceros de Argentina, 2006, Levadura, www.cervezadeargentina.com.ar/articulos/levadura.htm
10

epresentan el grupo de microorganismos entre bacterias y hongos respecto a su
tamaño de célula. Este grupo es caracterizado por su forma de reproducción
vegetativa conocida como “gemación”. Bajo condiciones optimas, una célula
madre puede gemar varias veces durante el periodo reproductivo. Sin embargo,
bajo estrictas condiciones de fermentación, una levadura va a gemar solamente
entre tres o cuatro veces. Aquí, la disponibilidad de oxigeno, la cual es necesaria
para la formación de precursores de la membrana de la célula, limita la
replicación. 7
Estos microorganismos muestran varios tipos de gemación, lo cual puede dar un
valor diagnostico. Entre aquellas aisladas de fermentación y añejamiento del vino,
se observan más frecuentemente multilateral y gemación polar. 8
La modalidad más común es la gemación, proceso asexual, en el cual la célula
progenitora emite un conducto tubular desde la vacuola nuclear hacia un punto
periférico próximo a la misma. Entonces se forma, en la dirección del conducto,
una pequeña protuberancia en la superficie externa de la célula, y el conducto
pasa atravesando la pared celular a dicha protuberancia, la cual se ensancha,
llenándose con el material citoplásmico y nuclear de la célula progenitora. Cuando
el brote o yema formada llega a ser casi tan grande como la célula progenitora, los
aparatos nucleares de ambas células se orientan de forma que sus centrosomas
respectivos equidisten del punto de unión. Al llegar este momento, la célula madre
y la célula hija se separan y se inicia la formación de nuevas ymas. En la
gemación normal no se forman tabiques de separación entre célula madre y
células hijas, pero en algunos casos, el proceso se inicia en la gemación y se
completa por división, con la separación definitiva de ambos individuos. La célula
madura de puede producir por gemación, durante el curso de vida, un promedio de
7 Brinton M, Miller and Warren Litsky. PhD, 1976. Industrial Microbiology, Edi. Mac Graw Hill. United States
of America
8 Kenneth C. Fugelsang, Charles G. Edwards,2007. Wine microbiology, practical applications and procedures,
edi. Springer, second edition, Fresno, California, United States of America
11

24 generaciones de células hijas. Las yemas sucesivas se forman siempre en
sitios diferentes de la superficie de la célula 9 .
1.1.1 Gemación multilateral
La gemación multilateral ocurre en el “hombro” o área de la levadura donde ocurre
la reproducción. La gemación y ciclo de separación crea un problema para las
levaduras durante su fase fermentativa pues en este tiempo la célula madre se
reduce aproximadamente un medio. Porque la síntesis de la membrana celular
ocurre bajo condiciones anaeróbicas, lo que limita los ciclos asexuales
replicativos. Como resultado, la mayoría de las fermentaciones se completan en la
fase estacionaria (no gemación). Un ejemplo de esta reproducción es
Brettanomyces/Dekkera. 10
1.1.2 Gemación Polar
A diferencia de la gemación multilateral, la gemación polar puede ocurrir en uno o
dos polos. En el caso de Kloeckera y Saccharomyces la gemación ocurre en
ambos polos, aumentando la población de levaduras con forma de “limón”. 11
1.1.3 Fisión
Esta reproducción es características del genero Schizosaccharomyces, donde la
formación de la célula hija ocurre sin la reducción de la madre célula como en los
casos anteriores. En este caso la formación de la microscópica pared celular
ocurre entre la madre célula y la hija, seguida por la separación. 12
9 Araya Pablo, 2002. Reproducción de hongos unicelulares mediante gemación, esporulación y
fisión. http://html.rincondelvago.com/reproduccion-asexual.html
10 , 11, 12 Fleet Graham, 1993. Wine Microbiology and Biotechnology, Edi. Hardwood Academic
Publishers GmbH, United States of America and Canada.
.
12

1.1.4 Pseudomycelium
Cualquier fabricante de vinos ha tenido la oportunidad de notar la formación de
una película en la superficie del vino. Esto surge debido a la gemación repetida de
las levaduras oxidativas y fallas en el momento de la separación de la célula hija
de la madre. Con el tiempo, el lazo previo entre la madre célula e hija se amplía
dando la impresión de filamentos como si se tratase de mohos siendo que son
levaduras. 13
1.2 TAXONOMIA
Para distinguir las levaduras que pueden producir ascoporas de aquellas que no,
los micologistas usan doble taxonomía para su clasificación. Desafortunadamente,
la nomenclatura para la combinación anamorfo/telemorfo es frecuentemente
diferente. Unos ejemplos de levaduras sexual/asexual o telemorfo/anamorfo son
Dekera/Brettanomyces, Metschnikowia pulcherrima/Candida pulcherrima,
Hanseniaspora uvarum/Kloeckera apiculata, Torulaspora delbruecki/ Candida
colliculosa. 14
Sin embargo, las levaduras son diferenciadas por los taxonomistas por asignación
de varios nombres de géneros/especies, varios vinicultores usan un sistema
informal para agrupar levaduras basadas en su morfología u otras características.
Por ejemplo, a Kloeckera apiculata se le refiere como “levadura apiculada”
tiene forma de limón. Esta levaduras asi com muchas otras presentes en el mosto
de la uva, como lo son Candida, Cryptococcus, Debaryomyces, Hansenula,
Issatchenkia, Kluyveromyces, Metschnikowia, Pichia, y Rhodotorula, también son
llamadas levaduras “nativas”, “naturales”, o “salvajes” por su origen el viñedo o en
13 Fleet Graham, 1993. Wine Microbiology and Biotechnology, Edi. Hardwood Academic Publishers
GmbH, United States of America and Canada.
14 Kenneth C. Fugelsang, Charles G. Edwards,2007. Wine microbiology, practical applications and
procedures, edi. Springer, second edition, Fresno, California, United States of America
13

la vinera. Algunos enólogos han discutido contra el uso de estos términos porque
esta implicancia no sucede en todas las levaduras ya que estas son de alguna
forma “no-nativas” o “no naturales” (E.j. Saccharomyces o Brettanomyces). El
término “no Saccharomyces” es más común para nombrar aquellas levaduras
presentes en el mosto de la uva que no son del genero Saccharomyces. 15
Las levaduras encontradas después de la fermentación alcohólica también son
asignadas a un grupo informal. Algunas veces, las levaduras que conducen la
principal fermentación (Saccharomyces) son muchas veces llamadas “levaduras
fermentativas” basados en su metabolismo. Durante su añejamiento algunas
levaduras (Candida, Hansenula y Pichia) pueden crecer en la superficie en
presencia de oxigeno. Esta película superficial es comúnmente asociada a
deterioro del vino, esta levadura se le conoce como “levadura formadora de
película”. 16
1.2.1 Dekkera/Brettanomyces
La taxonomía científica sobre Brettanomyces/Dekkera ha cambiado en los últimos
años. Brettanomyces está clasificado dentro de la misma familia que
Saccharomyces (familia Saccharomycetaceae). Actualmente, dentro del género
Brettanomyces, se aceptan cinco especies diferentes (B. bruxellensis, B.
anomalus, B. custersianus, B. nanas y B. naardenensis) 17 .
Las técnicas de biología molecular han demostrado que B. intermedious. B.
lambicus, B. custerseii o D. intermedia son sinónimos de B. bruxellensis, por lo
que estas denominaciones han quedado en desuso. Los microorganismos de este
género presentan dos formas, una capaz de reproducirse sexualmente (Dekkera)
15 Kenneth C. Fugelsang, Charles G. Edwards,2007. Wine microbiology, practical applications and
procedures, edi. Springer, second edition, Fresno, California, United States of America
16 Kurtzman C.P, 1998. The industrial and agricultural significance of yeasts. 4 th Edition, Amsterdam,
Holanda.
17 Hernandez I. y Barbero F, 2007.Brettanomyces bruxellensis en la bodega. Revista VINOTEQ, N 38, pag 21,
Edición Octubre-Noviembre 2007, La Rioja, España.
14

y otra que lo hace asexualmente (Brettanomyces). También se llaman,
respectivamente, forma perfecta y forma imperfecta. En algunos casos, la forma
perfecta y la imperfecta reciben nombres diferentes, como ocurre con B. anomalus
y D. anomala. En otros casos el nombre es similar, como las pertenecientes a la
especie bruxellensis, que pueden parecer como D. bruxellensis, como B.
bruxellensis o como Brettanomyces/Dekkera. A efectos prácticos en la bodega,
estos dos estados son similares. Cuando vemos referencias a Brettanomyces
como contaminante, en la mayor parte de los casos se refieren a
Dekkera/Brettanomyces, ya que este es el responsable de las alteraciones en el
18 y 19
vino.
La morfología celular de Brettanomyces/Dekkera es ojival o cilíndrica, con
gemación multipolar en reproducción vegetativa. Una de las características de
este género es su tamaño celular variable y la formación de filamentos. 19
18 Hernandez I. y Barbero F, 2007.Brettanomyces bruxellensis en la bodega. Revista VINOTEQ, N 38, pag 23,
Edición Octubre-Noviembre 2007, La Rioja, España.
19 Lopez-Cordon Eva, 2007. Brettanomyces/Dekkera: Control y detección en bodegas, ACE revista de
Enologia, No 78, pag 3, Cataluña, España.
15

Figura 1. Microfotografía de cultivo de Brettanomyces/Dekkera. a) Variabilidad morfológica y de
tamaño celular; b) forma filamentosa
Fuente: Lopez-Cordon Eva Brettanomyces/Dekkera: Control y detección en bodegas, ACE revista de
Enologia, www.acenologia.com
Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen
mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia
fisiología del microorganismo. Además, al ser una levadura de crecimiento muy
lento, la alteración se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre
todo, la crianza del vino, habitual en los vinos tintos de gama alta. En las barricas
de madera el microorganismo tiene a su disposición todo el sustrato y tiempo
suficiente para realizar su actividad. La naturaleza porosa de la madera y su difícil
limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso
después del lavado de la barrica. Además, Brettanomyces/Dekkera tiene la
capacidad de degradar uno de sus componentes, la celobiosa. 20
1.3 CARACTERISTICAS FISIOLOGICAS
S. cerevisiae y Brettanomyces/Dekkera tienen metabolismos similares, muy
adaptados a las condiciones de vinificación. Tras la fermentación alcohólica, S.
cerevisiae es la levadura mayoritaria debido a que las condiciones nutricionales
20 Lopez-Cordon Eva, 2007. Brettanomyces/Dekkera: Control y detección en bodegas, ACE revista de
Enologia, No 78, pag 3, Cataluña, España.
16

del vino son muy estrictas (altas concentraciones de etanol y bajas
concentraciones de nutrientes). En este momento, Brettanomyces/Dekkera
continúa creciendo gracias a que utiliza nutrientes que S. cerevisiae no ha podido
consumir, sobre todo algunos azúcares y fuentes de nitrógeno. 21
Una de las características que diferencia a Brettanomyces/Dekkera es la gran
diversidad de azúcares que puede fermentar (ver tabla de Relación de los
principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
Brettanomyces/Dekkera y su concentración media en vino tinto). La mayoría de
las cepas pueden crecer utilizando trealosa y celobiosa, azucares presentes en el
vino y no consumibles por S. cerevisiae . Otra de las ventajas que presenta frente
a S. cerevisiae (y frente a la mayoría de las levaduras) es que puede utilizar los
nitratos como fuente de nitrógeno. Debido a que S. cerevisiae sólo utiliza el
nitrógeno amoniacal y los aminoácidos libres, estos se consumen con relativa
rapidez. Al final de la fermentación el nitrógeno moniacal es escaso y se favorece
el crecimiento de las levaduras que pueden utilizar otras fuentes de nitrógeno.
Además, Brettanomyces puede crecer con concentraciones de fosfato diamónico
tan bajas como 0,5g/l, o a partir de diversos aminoácidos. En resumen,
Brettanomyces/Dekkera crece más despacio que S. cerevisiae, es resistente a
concentraciones altas de alcohol, puede utilizar otros azucares como fuentes de
energía y nitrato como fuente de nitrógeno. Esto explica que pueda reproducirse
cuando la fermentación alcohólica ha terminado, a partir de nutrientes no
consumibles por S. cerevisiae y cuando no tiene competidores. 22
21 Hernandez I. y Barbero F, 2007.Brettanomyces bruxellensis en la bodega. Revista VINOTEQ, N 38, pag 21,
Edición Octubre-Noviembre 2007, La Rioja, España.
22 . Hernandez I. y Barbero F, 2007.Brettanomyces bruxellensis en la bodega. Revista VINOTEQ, N 38, pag 21,
Edición Octubre-Noviembre 2007, La Rioja, España.
17

Tabla 1. Relación de los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
Brettanomyces/Dekkera y su concentración media en vino tinto
Fuente: Hernandez I. y Barbero F, 2007.Brettanomyces bruxellensis en la bodega. Revista
VINOTEQ, N 38, pag 21, Edición Octubre-Noviembre 2007, La Rioja, España.
1.3.1 Brettanomyces/Dekkera y síntesis de fenoles volátiles
El origen de los fenoles volátiles está relacionado con la actividad secuencial de
dos enzimas que descarboxilan los ácidos en hidroxiestirenos (vinilfenoles) que
18

son posteriormente reducidos a etilderivados (etilfenoles), 23 como puede
observarse en la figura 2.
Figura 2. Síntesis de etilfenoles de Brettanomyces/Dekkera
Fuente: ACE revista de Enologia www.acenologia.com
El primer paso de descaboxilacion de los ácidos hidroxicinamicos es común
también en otros microorganismos como bacterias, hongos y otras levaduras. Sin
embargo el segundo paso, reducción de vinilfenoles es característico de algunos
tipos de levaduras como: Dekkera bruxelliensis, D. anomala, Pichia guillermondi,
Candida versarilis, C. halophila y C. mannitofaciens 24
Los fenoles volátiles que se asocian al problema Brett en vinos son el 4-etilfenol y
el 4- etilguaiacol, así como sus precursores intermedios, 4-vinilfenol y 4-
vinilguaiacol, aunque estos últimos son menos importantes por ser muy reactivos y
rápidamente convertidos en etilfenoles por Brettanomyces/Dekkera o en su caso
23 Lopez-Cordon Eva, 2007. Brettanomyces/Dekkera: Control y detección en bodegas, ACE revista de
Enologia, No 78, pag 3, Cataluña, España
24 Lopez-Cordon Eva, 2007. Brettanomyces/Dekkera: Control y detección en bodegas, ACE revista de
Enologia, No 78, pag 3, Cataluña, España
19

condensan con otras moléculas como antocianos 25 .Los etilfenoles y
especialmente elevadas concentraciones de 4-vinilfenol en vinos se asocian con
aromas desagradables asociados a descriptores como “fenol”, “cuero”, “sudor de
caballo”, “establo” o “barniz” 26 .
El umbral sensorial del 4-etilfenol es de 230 μg l-1 y el del 4-etilguaiacol es de 47
μg/l. Pese a su menor umbral sensorial, el 4-etilguaiacol responde a descriptores
como “bacon” o “ahumado” que a bajas concentraciones aportan complejidad por
lo que se puede considerar sensorialmente menos conflitivo que el 4-etilfenol. 27
Figura 3. Defectos sensoriales producidos en el vino por Brettanomyces/Dekkera
Fuente: Lopez-Cordon Eva, 2007. Brettanomyces/Dekkera: Control y detección en bodegas, ACE
revista de Enologia, No 78, pag 3, Cataluña, España
25 Morata A., Gómez-Cordovés M, Calderón, F, Suárez J, 2006. Effects of pH, temperature and SO2 on the
formation of pyranoanthocyanins during red wine fermentation with two species of
Saccharomyces. . Journal Food Microbiology, No106, pag 4, Madrid, Espana.
26
Hernandez I. y Barbero F, 2007.Brettanomyces bruxellensis en la bodega. Revista VINOTEQ, N 38, pag 21,
Edición Octubre-Noviembre 2007, La Rioja, España.
27
Kenneth C. Fugelsang, Charles G. Edwards,2007. Wine microbiology, practical applications and
procedures, edi. Springer, second edition, Fresno, California, United States of America
20

1.3.2 Identificación de Brettanomyces/Dekkera
Los Biólogos usan sistemas de identificación basados en similitudes taxonómicas
entre organismos, dichas similitudes pueden ser morfológicas, tipos, capacidad de
producción de sustratos como azúcar y/o nitratos, características fisiológicas y
bioquímicas, secuencia del material genético, y respuestas inmunológicas. 28
En la industria vinícola es importante recurrir a diferentes tipos de pruebas para la
identificación de microorganismos, una de estas y la más realizada es la revisión
del microorganismo bajo el microscopio. Esta prueba brinda información sobre la
morfología del microorganismo (cocos, bacilos, formas puntudas, ojival, entre
otros), tamaño (dimensiones), agrupaciones celulares (solas, parejas, tríos,
grupos, o cadenas). Sin embargo el uso del microscopio es una prueba rápida
para examinar mostos o vino, pero no determina cantidades que muchas veces es
requerido para tratamientos de acción, otro de los inconvenientes es que los
microorganismos pueden variar su morfología en forma o tamaño dependiendo de
la edad y las condiciones de crecimiento, por lo que puede no ser clara la
identificación de este. 29
1.4 Medios sólidos selectivos
Si se requiere de la confirmación del microorganismo, este debe ser aislado del
vino para una caracterización, para esto se requiere de medios sólidos. Cuando se
examina un microorganismo en un medio solido, es importante revisar las
características morfológicas de las colonias (ver figura 4. Morfologías de colonias
en medios sólidos). Entre estas características están forma (circular, irregular o
28 , 29 Kenneth C. Fugelsang, Charles G. Edwards,2007. Wine microbiology, practical applications and
procedures, edi. Springer, second edition, Fresno, California, United States of America
21

izada), tamaño (dimensiones, estas normalmente se expresan en milímetros),
topografía (plano, elevado, convexo, cóncavo o embonado), presencia de
pigmentos, opacidad (transparente, traslucido, u opaco), superficie (suave, rugosa,
lisa o áspero), bordes (entero, ondulado, crespo, dentado, rizado) o cualquier
cambio en el agar (color, opacidad, cambios en los indicadores de pH, o CaCO3,
respectivamente) 30
Figura 4 . Varias morfologías de crecimiento de colonias en medio solido.
Fuente: Kenneth C. Fugelsang, Charles G. Edwards,2007
Gran número de medios selectivos se han creado para la aislación, detección y/o
conteo de levaduras provenientes de jugos de uva, mostos o vinos. El medio más
utilizado en estos fines es YPD (Yeast, Peptone, Dextrose) pero dicho medio no
es selectivo entre levaduras y se usa comúnmente para el conteo de
Saccharomyces 31 . Las colonias empiezan a parecer con un periodo de incubación
30 Kenneth C. Fugelsang, Charles G. Edwards,2007. Wine microbiology, practical applications and
procedures, edi. Springer, second edition, Fresno, California, United States of America
31 Essia Ngang J, Wolniewicz E, Villa P,2005. Stimulation of lactobacilli during alcoholic fermentation: action
of sucrose hydrolysis by yeast, Biotechnology letters, No 8, pag. 743, Amiens, France.
22

de 2 a 4 días a 22C a 25C. Igualmente, el agar de jugo de uva es no selectivo y
presenta fácil crecimiento de levaduras, bacterias, y mohos.
Para la levadura Brettanomyces/ Dekkera se han elaborado diferentes medios
selectivos entre ellos el más conocido es WL por sus siglas en ingles del
laboratorio que lo creo “Wallerstein Laboratories” este medio contiene
cicloheximida compuesto selectivo para Brettanomyces e inhibe Saccharomyces.
El punto crítico es encontrar la cantidad exacta de este compuesto para la
inhibición de las levaduras sin que afecte a Brettanomyces/Dekkera. 32
Además del medio WL Brettanomyces/Dekkera puede ser cultivado en otros
medios selectivos, como Brettanomyces medio A, creado por Vilas en 1993;
Brettanomyces medio B, el cual contiene cicloeximida como agente selectivo,
mientras que Brettanomyces medio C tiene cicloheximida y ampicilina, este medio
fue creado por B. Watson en 1998; Brettanomyces medio D fue creado
recientemente por Rodrigues en 2001, este medio es conocido como DBDM
(Dekkera/Brettanomyces differential medium ) es un medio selectivo para
Brettanomyces en contra de Saccharomyces y otras levaduras, este medio es el
más utilizado en la vineras para caracterización de Brettanomyces/Dekkera
actualmente. 33
1.5 Dióxido de azufre (SO2) en vinos
32 , 33 Fleet Graham, 1993. Wine Microbiology and Biotechnology, Edi. Hardwood Academic Publishers
GmbH, United States of America and Canada.
23

El dióxido de azufre también llamado oxido de azufre, es un eficaz agente
conservante, antioxidante y antimicrobiano, en la industria vinícola. 34
Durante la vinificación, SO2 ha representado históricamente una herramienta muy
importante usada por los vinicultores para el control de crecimiento microbiológico.
Debido a preocupaciones por la salud del consumidor el uso de este producto ha
disminuido dramáticamente, con el posible riesgo de aumentar el riesgo
microbiológico. 35
El actual límite legal de SO2 en vinos en los Estados Unidos es de 350mg/L, una
concentración mucho mayor a la usada en la industria vinícola. No obstante, vinos
que contienen más de 10mg/L deben declarar este compuesto en la etiqueta,
porque SO2 es un metabolito que las levaduras usan durante la fermentación. Los
vinos siempre contienen algo de sulfitos aunque la adición no se realice durante el
proceso. 36
1.5.1 Formas del Dióxido de Azufre (SO2)
Una vez disuelto en agua, el dióxido de azufre existe en equilibrio entre SO2
molecular (SO2·H2O), bisulfito (HSO3), y sulfito (SO3 2- ). Este equilibrio depende del
pH. Además de estar en equilibrio con el molecular y especies sulfito, el bisulfito
también existe en forma “libre” y en forma “atada”. Aquí, la molécula reaccionara
34 Orwine, Eureka, 2008,Investigadores europeos buscan alternativas al dioxido de azufre en vinos,
http://awpro.wordpress.com/2008/11/07/investigadores-europeos-buscan-alternativas-al-dioxido-deazufre-en-el-vino/
35,36 Kenneth C. Fugelsang, Charles G. Edwards,2007. Wine microbiology, practical applications and
procedures, edi. Springer, second edition, Fresno, California, United States of America
24

con compuestos carbonilos (ej. Acetaldehído), formando productos adicionales
como Acido Hydroxysulfonico. 37
Además de Acetaldehído, algunas moléculas presentes en el jugo de uva que
reaccionan con bisulfito son acido piruvico, α-keto-glutaric, dihidroxyacetona,
diacetyl, Pigmentos de antocianinas, entre otros. 38
1.5.2 Inhibidor Microbiano
El sulfuro molecular es la forma antimicrobiana del dióxido de azufre. La cantidad
de SO2 molecular presente en cualquier vino no se mide directamente. La
concentración es calculada conociendo la concentración de SO2 libre y el pH del
vino basándose en la siguiente fórmula:
Alternativamente, la figura 5. Se puede utilizar como guía para aproximar la
cantidad de SO2 libre necesitada a determinado valor de pH de valores entre 0.5 o
0.8 mg/l de SO2 molecular. 39
El SO2 inhibe microorganismos de varias formas incluyendo rupturas de puentes
bisulfitos en proteínas y reaccionando con coofactores como NAD + y FAD; también
reacciona con ATP.
37,39 Kenneth C. Fugelsang, Charles G. Edwards,2007. Wine microbiology, practical applications and
procedures, edi. Springer, second edition, Fresno, California, United States of America
38 Zoecklein Bruce, Fugelsang Kenneth C, Gump Barry, Nury Fred, , 1999. Wine Analysis and production, Edi
Springer, New York, United States.
25

Figura 5. Cantidades de SO2 libre a un pH determinado para obtener 0.5 o 0.8 mg/l de SO2
molecular.
Fuente: Kenneth C. Fugelsang, Charles G. Edwards,2007.
La concentración de SO2 molecular necesario para prevenir el crecimiento de
microorganismos varía según vino/jugo pH, temperatura, población, densidad y
diversidad, estado de crecimiento, grado de alcohol, entre otros factores. Beech,
1979, sugirió una adición de 0.8 mg/l de SO2 molecular como la cantidad
necesaria del compuesto en vinos blancos de mesa para dar una reducción de
cerca de 10 4 UFC/ml de la población de diferente tipo de microorganismos, en 24
horas. Las diferencias que existen entre las levaduras y bacterias en base a la
26

sensibilidad a este compuesto son dadas a conocer por diferentes autores (Warth,
1977; 1985; Du Toit, 2005; Davis, 1988; Hood, 1983). 40
1.6 Antibrett® como alternativa de prevención y eliminación de
Brettanomyces/Dekkera
Antibrett® es un producto nuevo creado por Spindal SARL-Gretz - Armainvilliers,
Francia. Es una preparación enzimática para inactivar Brettanomyces y para
reducir olores producidos por fenoles volátiles 41 .
Antibrett® es preparado a base de paredes celulares de levadura, activados
enzimáticamente, que presentan elevadas propiedades adsorbentes frente al 4-
etilfeno y 4- etilguayacol, compuestos asociados con olores desagradables en el
vino tales como sudor de caballo, farmacia, o barniz. 42
Antibrett® inhibe la producción de la vinilreductasa, que participa en la
transformación de los ácidos cinámicos, naturalmente presentes en los vinos, en
los correspondientes derivados etilados responsables de los olores atribuidos a
Brettanomyces/Dekkera. 43
40 Zoecklein Bruce, Fugelsang Kenneth C, Gump Barry, Nury Fred, , 1999. Wine Analysis and production, Edi
Springer, New York, United States
41 Manual de instrucciones de producto Antibrett ® producido por Spindal SARL-Gretz -
Armainvilliers, France
42,43,44 AEB Group, 2008. ANTIBRETT Preparado a base de paredes celulares de levadura para la inactivación
de Brettanomyces y la eliminación de los olores de estos productos. http://www.aebgroup.com/imgs/SPAGNOLO/Depliant/ANTIBRETT-lett-ESP.pdf
27

El uso de Antibrett® es efectivo incluso contra otros olores anómalos, como los
que se generan en las barricas sucias, principalmente húmedas dañando la
calidad olfativa del vino. 44
28

2 PROBLEMA
La levadura Brettanomyces/Dekkera es una levadura de contaminación presente
en la mayoría de industrias vinícolas en el mundo. Afecta directamente la
producción y calidad sensorial de los vinos, con el desarrollo de los compuestos 4
etilfenol y 4 etilguayacol los cuales dañan el perfil olfativo del vino dando aromas
características a “establo”, “cuero”, “sudor de caballo”, o “barniz” conocido como
“carácter Brett”.
Esta contaminación se da especialmente en los vinos tintos debido a sus
características de producción (fermentación, crianza, añejamiento) y sus
propiedades fisicoquímicas (Grado alcohólico, pH, Acidez total, Acidez volátil,
entre otros.).
En Croacia existe una gran producción de vinos tintos entre los cuales se
encuentra el vino tinto Babic proveniente de la isla de Hvar, el cual es famoso por
ser un vino duro, carnoso, estructurado y casi sobre-maduro con un grado
alcohólico que ronda los 15% v/v , siendo la primera denominación de origen que
se aprobó en Croacia en el año 1961, este vino es de gran importancia en la
región, la mayoría de sitios de elaboración, son pequeñas industrias que han sido
afectadas por el „carácter Brett‟. Muchas investigaciones se han realizado al
respecto de la levadura Brettanomyces/Dekkera, pero se conoce muy poco sobre
sus efectos en el vino Babic debido a sus características particulares (alcohol
29

15%, pH 3.5, Acidez total 5.20 gr Acido Tartarico/L, Acidez volátil 0.8 gr Acido
Acetico/L, Azucar residual 4,7 gr/Lt) 45 .
La dificultad de la pequeña industria para acceder a productos que lleven a la
identificación de la levadura mencionada y de esta manera conllevar a planes de
acción contra el “carácter Brett” es una de las grandes dificultades de la industria
vinera en este país en donde los productos para la industria enóloga son
complicados y de alto precio para acceder a ellos, y en consecuencia no se
realizan muchas de estas pruebas de detección de Brettanomyces/Dekkera
llevando al mercado productos contaminados de baja calidad que inicialmente
podría haber sido un vino de alta calidad debido a sus características únicas y de
gran popularidad.
45 Datos obtenidos en el laboratorio Vinolab Zagreb, Croacia.
30

3 JUSTIFICACION
Actualmente Croacia cuenta con más de 300 zonas vineras en las que se producen: 67%
de vino blanco, 32% vino tinto, y el restante 1% vino rosado. De acuerdo a recientes datos
estadísticos hay 650 km 2 de viñedos en Croacia, de los cuales 375 km 2 son uvas con
indicación geográfica de origen que producen más de 300 vinos y más de la mitad de este
número son vinos elaborados en microempresas, con un total de 50.000.000 de botellas
de vino el 8% es vino superior, 70% de calidad y el 22% es vino de mesa de producción
nacional. 46
Croacia es un fuerte productor de vino a nivel regional con sus diferentes variedades
propias (Merlot, Plavac, Dingač, Postup, Malvazija, Pošip, Kujundžuša, Babic) pero dicha
producción ha sido fuertemente afectada por la presencia de la levadura
Brettanomyces/Dekkera trayendo consecuencias como perdidas de producción, pérdida
de calidad sensorial del vino, grandes pérdidas económicas y desprestigio a sus vinos de
denominación de origen.
Es por esto que en este proyecto de investigación se busca una fácil y rápida
identificación de la levadura Brettanomyces/Dekkera causante del “carácter Brett” con el
desarrollo de medios selectivos liquido y solido, además de opciones para el tratamiento
y/o prevención de esta levadura en la cadena productiva comparativamente entre dióxido
de azufre (SO2 ) y Antibrett®, y la identificación de los aromas característicos del “carácter
Brett” en el vino tinto Babic, de la región de Dalmacia. Croacia.
46 Hrvatski zavod za vinogradarstvo i vinasrtvo, 2003. Pravilnik o vinu, http://www.hrzvv.hr/propisi.htm
31

4.1 General
4 OBJETIVOS
Caracterizar y evaluar el comportamiento de la levadura Brettanomyces/Dekkera
en términos de crecimiento y producción de aromas no deseados en vino tinto
Babic
4.2 Específicos
Desarrollar el medio solido y medio líquido selectivo para
Brettanomyces/Dekkera.
Evaluar el comportamiento de la levadura en estos medios selectivos.
Determinar la influencia del Dióxido de azufre (SO2) y el compuesto
Antibrett® en la levadura Brettanomyces/Dekkera presente en vino tinto
Babic 2007.
Identificar los compuestos aromáticos producidos por Brettanomyces
bruxellensis en vino tinto Babic usando el método “multiple headspace
solid-phase microextraction (SPME)”
32

5 ALCANCES
En este proyecto se pretende desarrollar un medio selectivo fácil de producir en
donde sea rápida la identificación de la levadura Brettanomyces/Dekkera en la
producción de vinos tintos, se realizaran pruebas para corroborar el crecimiento de
esta levadura en el medio determinando, el tiempo que esta levadura toma en
adaptarse en el medio, y su comportamiento en este; una vez comprobada su
adaptación al medio liquido, se trabajara con el método de cromatografía de gas
(GC) y el uso de micro extracción en fase solida (SPME) para el análisis
cuantitativo de los compuestos volátiles (4-etil-fenol, 4-etil-guayacol,4-vinilfenol y
4-vinil-guayacol) y posteriormente con el vino tinto Babic. Además se desea
comprobar la efectividad de los productos con que las vineras de Croacia inhiben
o eliminan la presencia de la levadura en los vinos tintos como lo son el producto
AntiBrett® y el Dióxido de azufre (SO2).
33

6 ESTADO DEL ARTE
Sobre el campo problemico causado por la levadura Brettanomyces/Dekkera en la
industria vinícola se han realizado bastante investigaciones a nivel de
caracterización de la levadura, los factores fisicoquímicos que favorecen el
crecimiento de la levadura, métodos de prevención y control, evaluación de
daños sensoriales en diferentes tipos de vinos, formación de compuestos fenólicos
en los diferentes tipos de vino, otros compuestos no fenólicos asociados al
“carácter Brett”, técnicas de detección de la levadura Brettanomyces/Dekkera,
evaluación de la técnicas de control e inhibición de dicha levadura, desarrollo de
nuevos medios de detección y aislamiento de la levadura, relación entre la
levadura Brettanomyces/Dekkera con las otras levaduras presentes en el vino,
entre otros.
Según estas investigaciones se analizan aquellas que pueden aportar datos
importantes para el desarrollo del trabajo que se quiere realizar y se tiene en
cuenta sus metodologías, conclusiones, recomendaciones y comentarios.
Entre las importantes para el planteamiento de este trabajo se menciona el trabajo
realizado por la Universidad Politécnica de Madrid, España, el cual analiza
algunas de las características más relevantes de este género de levaduras, su
crecimiento en bodega, factores fisicoquímicos que favorecen su crecimiento y
desarrollo en el vino, los defectos sensoriales que presenta en los vinos; y estudia
algunas de los métodos físicos para el control de Brettanomyces/Dekkera en vino
34

(clarificación, filtración amicrobica, proteínas clarificantes, anhídrido sulfuros,
dimetil dicarbonato, Aditivos). 47
Para conocer más sobre la levadura en condiciones de barrica y almacenamiento
se revisa el articulo elaborado en el Departamento Técnico Guserbiot, La rioja,
España, en este artículo se describe brevemente su metabolismo y su ecología en
las bodegas. Igualmente se comparan las técnicas utilizadas en los laboratorios
para su detección y cuáles son las limitaciones de los diferentes métodos.
Finalmente se analizan las estrategias desarrolladas para su eliminación de las
bodegas y se dan una serie de recomendaciones para su control. 48
El instituto de fermentaciones Industriales, Consejo superior de investigaciones
científicas, Juan de Cierva, Madrid España en el cual se revisa la formación de
etilfenoles (4 etil-fenol, 4 etil guayacol) en vinos tintos anejos. Los factores
fisicoquímicos que favorecen el crecimiento de la levadura no deseada
Brettanomyces/Dekkera, las técnicas usadas para la detectar la presencia de esta
levadura en vinos ( Revisión microscópica fluorescente, remoción de ácidos
grasos de su membrana, técnicas moleculares como PCR, y electroforesis), y de
control (Proteínas fining, Fining con gelatina liquida, filtración, variables
fisicoquímicas, adición de aditivos, procedimientos de altas presiones,
manipulación genética) con esta investigación se concluye que la combinación y el
uso de las numerosas técnicas pueden ayudar a la prevención y reducción de la
levadura Brettanomyces/Dekkera 49 . Este trabajo muestra las múltiples opciones
47 A. Morata, S. Benito, F. Palomero, F. Calderón y J. A. Suárez-Lepe Ecología y prevención de
Brettanomyces/Dekkera durante la elaboración y crianza de vinos tintos. Revista enólogos (Editada por la
Federación Española de Asociaciones de Enólogos y Periodistas Asociados), No 50, pág. 1-12 Madrid, España
48 Hernandez I. y Barbero F, 2007.Brettanomyces bruxellensis en la bodega. Revista VINOTEQ, N 38, pag 20-
24, Edición Octubre-Noviembre 2007, La Rioja, España
49 R. Suarez, J.A. Suarez-Lepe, A. Morata, F. Calderon, 2006. The production of ethyl phenols in wine by yeasts
of the genera Brettanomyces and Dekkera: A review, Journal Food Chemistry, No 102, pag. 10-21, Madrid,
España.
35

existentes en el control y prevención de la levadura mencionada, sin embargo deja
claro que la mayoría de estas opciones son costosas y no de fácil adquisición para
una pequeña industria.
El análisis sensorial ha sido de los aspectos más estudiados al respecto de
Brettanomyces/Dekkera una de estas investigaciones fue realizada en Centre
Européen des Sciences du Goût, en Talence, Francia, en el cual se evaluaron 50
vinos bordeaux sensorialmente, para demostrar la complejidad del “Carácter Brett‟‟
al cual se unen otros compuestos aromáticos además de los fenólicos, como acido
isobutirico e isovalerico, en este tipo de vino debido a sus características
fisicoquímicas. 50
De los métodos de detección de la levadura Brettanomyces/Dekkera los medios
selectivos son muy populares es por esto que el Laboratorio de Microbiología,
Departamento de Botanica e Engenharia Biologica, Instituto Superior de
Agronomia, Lisboa, Portugal realizo un trabajo en el cual se pretendia desarrollar
un medio selectivo o diferencial capaz de aislar la levadura
Brettanomyces/Dekkera del vino y de la cadena productiva del vino con el fin de
detreminar la relación entre esta levadura y los compuestos 4-etilfenol y 4 etil-
guayacol 51 , otro estudio realizado para la detección de dicha levadura fue
realizado en la Escola Superior de Biotecnología, Universidade Católica
Portuguesa, el desarrollo de un simple procedimiento, compatible con las rutinas
50 Andrea Romano a, Marie Claire Perello a, Aline Lonvaud-Funel, Gilles Sicard , Gilles de Revel,2008. Sensory
and analytical re-evaluation of ‘‘Brett character”, Journal Food Chemestry, No 114, pag. 15-19, Talence,
France
51 N. Rodrigues, G. Gonçalves, S. Pereira-da-Silva, M. Malfeito-Ferreira and V. Loureiro,2001. Development
and use of a new medium to detect yeasts of the genera Dekkera/Brettanomyces, Journal of applied
microbiology, No 90, pag. 588-599,Lisboa, Portugal.
36

usadas en las vineras, para la detección de Brettanomyces/Dekkera en vino y en
maquinarias. 52
En el laboratorio de Tecnología y Análisis de Bebidas Alcohólicas, de la
Universidad de Zagreb, se ha trabajado anteriormente en el desarrollo de medio
solido selectivo con pruebas de diferentes concentraciones de los compuestos,
como resultados se encuentra una buen relación entre las concentraciones de los
compuestos, sin embargo como recomendaciones se encuentran la falta de
antibiótico para evitar contaminación por bacterias, probar con diferentes fuentes
de carbono para comparación de tiempo de crecimiento positivo, y un monitoreo
diario en el medio. 53
Los compuestos aromáticos que libera la presencia de Brettanomyces/Dekkera
está asociada a los compuestos 4 etilfenol, 4 etilguayacol, 4 vinilfenol y 4
viniguayacol, a partir de esto los centros de investigación han hondado en la
identificación de dichos compuestos relacionados en la enología y especialmente
con Brettanomyces/Dekkera, a partir de eso el Departamento de Química,
Universidad de La Rioja, España, este estudio presenta un método basado en el
uso de Cromatografía de Gas y micro extracción en fase solida para el análisis
cuantitativo de 4-etilfenol, 4-etil guayacol, 4-vinilfenol, 4-vinilguayacol.
Demostrando la existencia de un efecto matriz en el análisis de compuestos
responsables del “carácter Brett” en vino. Este nuevo método fue
satisfactoriamente aplicado a cierto número de vinos tintos comerciales, vinos
52 J.A. Couto, A. Barbosa and T. Hogg, 2005. A simple cultural method for the presumptive detection
of the yeasts Brettanomyces/Dekkera in wines, Letters in Applied Microbiology, No 41, pag. 505-510, Porto,
Portugal.
53 Serkovic Dubravka, Gracin Leo, 2008. Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac
Brettanomyces bruxellensis, Prehrambeno Biotehnološki Fakultet, pag. 1-117 , Zagreb,Croatia.
37

lancos y rosé, Este método puede ser una alternativa para evitar el efecto matriz
en muestras de vino. 54
De acuerdo con este tema en la jornada científica del 99, el grupo de investigación
enológica se estudio la formación de sustancias volátiles por 13 cepas de S.
cerevisiae con buenas aptitudes enológicas, inoculadas individualmente en un
mosto homogéneo de la variedad airen, fermentado en las mismas condiciones
de aireación y a temperatura controlada 55
54 C. Pizarro, N. Perez-del-Notario, J.M. Gonzalez-Saiz, 2007. Determination of Brett character responsible
compounds in wines by using multiple headspace solid-phase micro extraction, Journal of Chromatography,
No 1143, pag. 176-181, La Rioja, España.
55 E. Pueyo, P. Hidalgo, K. Fernández, y P. Martín-Álvarez, 1999. Análisis de compuestos volátiles en vinos
obtenidos con distintas cepas de Saccharomyces cerevisiae. Aplicación de la técnica de microextracción en
fase sólida (SPME), Revista Jornadas Cientificas 99 Grupos de Investigacion Enologica, Zaragoza, Espana.
38

7 MATERIALES Y METODOS
A continuación se presentan materiales y métodos para la investigación.
Este proyecto fue realizado en su gran mayoría en las instalaciones de la
Universidad de Zagreb, en la Facultad de Tecnología y Biotecnología de Alimentos
(PBF), Laboratorios del Departamento de Tecnología y Análisis de Bebidas
Alcohólicas, ubicado en la ciudad de Zagreb, Croacia.
Los análisis fisicoquímicos del vino tinto Babic, fueron realizados en los
laboratorios de VINOLAB, ubicado en Zagreb, Croacia.
7.1 MEDIO SOLIDO SELECTIVO PARA Brettanomyces/Dekkera
7.1.1 Materiales
Cultivo de levaduras Brettanomyces/Dekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnología y análisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb, Croacia.
Autoclave de laboratorio
Químicos de laboratorio (Glucosa, Etanol, peptona, extracto de levadura,
agar, cicloheximida, acido cumárico, ampicilina)
Balanza electrónica de precisión
Microscopio óptico
7.1.2 Metodología
Basados en estudios anteriores realizados en el laboratorio para el desarrollo de
medio solido selectivo para Brettanomyces/Dekkera (Serkovic Dubravka, Gracin
39

Leo, 2008. Razvoj medija identificirati izolirati od kvasac Brettanomyces
bruxellensis, Prehrambeno Biotehnološki Fakultet, Universidad de Zagreb, pag. 1-
117, Zagreb, Croacia), se evaluaron las recomendaciones mencionadas en dicha
investigación para la mejoría y desarrollo de otros medios sólidos selectivos.
Se usó como base el medio YPD (Yeast, Peptone, Dextrose), el cual está
compuesto de la siguiente forma: 20g/L peptona, 10 g/l extracto de levadura, 20 g/l
de agar 56 , este medio es selectivo para levaduras pero no es selectivo entre ellas.
Es necesario el uso de una fuente de carbono para la levadura
Brettanomyces/Dekkera de acuerdo a la teoría y revisando la tabla 1 (Relación de
los principales azucares que pueden utilizar diferentes cepas de
Brettanomyces/Dekkera y su concentración media en vino tinto), y según
facilidades de disponibilidad en el laboratorio, se utiliza glucosa la cual es
utilizable por entre 75-100% de las cepas de Brettanomyces/Dekkera según la
tabla mencionada anteriormente.
Esta fuente de carbono (Glucosa) fue probada en una concentración de 20 g/L,
Cicloheximida fue probada a 30 mg/L para inhibir Saccharomyces en el medio y
darle mayor selectividad para Brettanomyces/ Dekkera. Se añade acido p-
cumarico en una concentración de 100 mg/L como precursor para la formación
del compuesto 4 etilfenol característico de la levadura Brettanomyces/Dekkera.
Para inhibir bacterias en el medio se usa ampicilina a 10 mg/L, esta se agrega
después de realizada la esterilización y cuando la temperatura del medio este
igual o menor a 40C. El pH del medio se ajusto a 5.
Paralelamente, se crea el medio con Etanol como fuente de carbono en una
concentración de 6% o 60 ml/L con la misma concentración de los otros
compuesto como cicloheximida 30mg/L, acido cumarico 100mg/L, 20 g/L peptona,
10 g/L de extracto de levadura, 16g/L de agar. Este medio se crea como
56 Concentraciones preestablecidas en el laboratorio de tecnología y análisis de bebidas alcoholicas
40

comparativo para determinar cual fuente de carbono es la más utilizada por la
levadura Brettanomyces bruxellensis para su reproducción. Según la teoría (ver
tabla 1) el etanol es utilizado por entre 25-75% de las cepas de
Brettanomyces/Dekkera, pero es el azúcar que se encuentra en mayor
concentración presente en los vinos tintos, aproximadamente 130 g/l. 57
Estos medios fueron debidamente esterilizados para eliminar cualquier
microorganismo o espora presente en este. Este procedimiento se realizo por el
método de combinación de altas temperatura y presión (Autoclave 121 C a 103.4
kPa)
Se usaron colonias de Brettanomyces/Dekkera aisladas anteriormente de vinos
contaminados y guardas para investigaciones en el Departamento de Tecnología y
Análisis de Bebidas de la Facultad de Tecnología y Biotecnología de Alimentos,
Universidad de Zagreb, Croacia.
Los medios fueron monitoreados visualmente todos los días y se toman
observaciones de macroscópicas y microscópicas. Se comparan estos dos medios
en términos de rapidez de crecimiento de la levadura y selectividad. Estas
muestras fueron incubadas a 28C por 10 días.
La prueba fue realizada por duplicado en diferentes tiempos.
57 Hernandez I. y Barbero F, 2007.Brettanomyces bruxellensis en la bodega. Revista VINOTEQ, N 38, pag 21,
Edición Octubre-Noviembre 2007, La Rioja, España
41

7.2 MEDIO LÍQUIDO SELECTIVO PARA Brettanomyces/Dekkera
7.2.1 Materiales
Cultivo de levaduras Brettanomyces/Dekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnología y análisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb, Croacia.
Frascos de vidrio estériles
Autoclave de laboratorio
Químicos de laboratorio (Glucosa, peptona, extracto de levadura,
cicloheximida, acido cumarico, ampicilina, etanol)
Microscopio óptico
Balanza electrónica de precisión
7.2.2 Metodología
En el mercado para enología existen medio líquidos selectivos para la detección
de Brettanomyces/Dekkera en vinos, sin embargo estos son de difícil accesibilidad
por sus elevados precios es por esto que se desarrolla un medio liquido selectivo
para dicha levadura en el laboratorio del Departmaneto de Tecnología y Análisis
de Bebidas, de la Universidad de Zagreb, Croacia .
Para este medio se toma como base el medio selectivo con Glucosa como fuente
carbono desarrollado anteriormente sin usar agar para mantener el medio en su
estado liquido
42

La composición de este medio líquido es la siguiente:
20 g/L Glucosa,
20 g/L peptona,
10g/L extracto de levadura,
30mg/L de cicloheximida,
100mg/L acido p-cumarico,
10 mg/L ampicilina.
Estos compuestos fueron medidos en una balanza electrónica de precisión, se
añade 250 ml de agua destilada y se mezcla constantemente, se pasa a proceso
de esterilización en autoclave a 120C y 103.4 KPa por 45 minutos.
De esta forma se asegura la usencia de microorganismos y/o esporas en el
medio. Después de bajar la Temperatura a 40C se agrega a la mezcla ampicilina
en una concentración de 10mg/L.
En frascos de vidrio estéril se agrega 40 ml de medio líquido y diferentes
cantidades iniciales de levaduras Brettanomyces/Dekkera fueron inoculadas al
respectivo medio; el primer frasco tiene una cantidad de 10 6 células/ml, el segundo
tiene 10 4 células/ml, el tercero tiene 10 2 celulas/ml, y el cuarto con una cantidad
aproximada de 25 células/ml. Estas cantidades están basadas en estudios
anteriores para medios líquidos selectivos en levaduras 58
58 J. Ungar, A. M. James, P. W. Muggleton, H. F. Pegler y E. G. Tomich,1950. The Cultivation of
Haemophilus pertussis in Partially Defined Liquid Media, Journal of General Microbiology, No 4,
pag. 345-359, Greenford.
43

Este medio líquido inoculado fue inspeccionado diariamente, visualmente, revisión
de turbidez, microscópicamente, y olfativamente para detección de olores del
“carácter Brett”.
Los días fueron contabilizados para determinar resultados positivos en estos
ensayos.
7.3 INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETT® EN
VINO TINTO DE LA REGION DE DALMACIA, CROACIA
7.3.1 Materiales
Cultivo de levaduras Brettanomyces/Dekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnología y análisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb, Croacia.
Medio selectivo solido para Bretanomyces/Dekkera
Medio selectivo Liquido para Brettanomyces/Dekkera
Químicos de laboratorio (Dioxido de Azufre (SO2), Antibrett®, Glucosa)
Vino Babic 2007
Anallizador infrarojo Bacchius II microdom
7.3.2 Metodología
Con los medios desarrollados (solido y liquido) se quiere conocer el efecto del
dióxido de azufre (SO2) y el producto Antibrett® en la levadura
Brettanomyces/Dekkera presente en el vino tinto de la región de Dalmacia.
Con las herramientas que se tienen en el laboratorio del departamento de
tecnología y análisis de bebidas de la Universidad de Zagreb, Croacia se quiere
determinar la influencia de estos productos en la levadura Brettanomyces/Dekkera
presente en vino tinto croata de la región de Dalmacia, Babic.
44

El primer paso es adaptar la levadura al vino tinto croata (Babic) para esto se
inoculan 20 colonias de Brettanomyces/Dekkera en 500 ml de vino, se añadió
glucosa en una concentración de 2g/L, y se oxigena la mezcla. Para este paso de
adaptación se dejan las muestras de 1 a 2 días a temperatura ambiente (20C).
Después de este periodo se revisa microscópicamente la presencia positiva de
Brettanomyces/Dekkera en los 500 ml de vino en los que se estaba haciendo el
paso de adaptación en Babic, al comprobar su presencia positiva se procede a
mezclar los 500 ml de vino contaminado con Brettanomyces/Dekkera con los 3
Litros de vino Babic que se disponen para esta prueba.
Estos 3 litros de vino tinto Babic contaminado con la levadura
Brettanomyces/Dekkera se reparten en 8 frascos de vidrios estériles, al siguiente
día se toman dos frascos para agregar cada uno de los compuestos a evaluar
(SO2 y Antibrett®).
Para SO2 se toman dos frascos: uno de 600ml y uno de 100ml, se agrega una
concentración de 40 mg/l.
Para el producto AntiBrett® se toman cuatro frascos: dos de 600 ml y dos de 100
ml, según especificaciones del producto, y la alta población de
Brettanomyces/Dekkera en las muestras se adiciono la máxima concentración de
AntiBrett® a las muestras, la cual fue de 40 g/Hl.
Estas muestras se dejaron a temperatura ambiente simulando condiciones de
almacenamiento del vino en barricas, temperatura aproximada de 20C, evitando el
contacto con la luz solar, y evitando movimientos fuertes. Esto se mantuvo por 15
días que fue el tiempo de duración del experimento.
Con el vino restante se mantuvo en las mismas condiciones de almacenamiento
de los demás para hacer un paralelo de comparación.
Previamente se analizaron las características del vino sin contaminar por medio
del analizador infrarrojo Bacchus II microdom antes de agregar los compuestos
45

SO2 y AntiBrett®, y después se volvió a realizar el análisis para determinar los
efectos de estos compuestos en el vino y así mismo al de control.
7.4 DETERMINACION DE AROMAS DE CARÁCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
7.4.1 Materiales
Cromatografo de Gas HP5890 Serie II
Microextractor de fase solida (SPME)
Cultivo de levaduras Brettanomyces/Dekkera aisladas y guardadas en el
departamento de tecnología y análisis de bebidas de la Universidad de
Zagreb, Croacia
Químicos de laboratorio (p-cresol,Acetaldehido, Propanol, diacetil, etil-
acetato, i-butanol, acido acético, i-amil-alcohol, n-amil, lactato de etilo,
acetato amil metílico, 1-hexanol, etil-hexanol, linalol, nerol, citronelol,
geraniol, 2-feniletanol, octanoato de etilo, 4-etilfenol, 2-feniletil acetato, 4-
etilguaiacol)
Vino Tinto Babic
Agua destilada
7.4.2 Metodología
El método fue desarrollado anteriormente en el Departamento de Tecnología y
Análisis de Bebidas de la Facultad de Tecnología y Biotecnología de Alimentos de
la Universidad de Zagreb, Croacia. Y después de modificaciones fue utilizado en el
desarrollo del trabajo. El método utilizado es descrito a continuación.
46

Cromatografo de gas HP 5890 SERIES II
Programa HP-chem
a) Condiciones para analisis SPME-GC
Muestra diluida 50:50 con adicion de estandar interno (p-cresol1mg/l)
25ml de la muestra diluida con mezcla continua a temperatura ambiente
Tiempo de adsorcion: 30 minutos
SPME es colocado en la muestra para la adsorcion durante el tiempo
previsto
b) Condiciones para el Cromatografo de gas (GC):
La columna usada en este experimento es RTX®-5 (Restec, USA s.n. 210627):
30m; i.d.=0.25mm; 0,25μm.
Gas portador : Nitrogeno
Flujo del Nitrogeno: 5 ml/min
Temperatura del inyector: 240 C
Temperatura del detector: 250 C
Temperaturas programadas: 35 C,5 min 150 C, 3.4 C/min 180 C,
10C/min, 190 C, 5 C/min .
Se conocen los resultados del cromatografía de gases (ver tabla 10) y se hacen
necesarias varias correcciones del método y algunas pruebas con unos
compuestos para determinar realmente su tiempo de retención en este tipo de
vino. Se deben comprobar tiempos de retención.
47

8 DISCUSIÓN Y RESULTADOS
8.1 RESULTADOS PARA EL DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Tabla 2. Medio Selectivo con Glucosa como fuente de carbono para
Brettanomyces/Dekkera en incubación por 5 días a 28 C.
Día Crecimiento Olor Color Revisión
microscópica
1 Negativo Negativo - No se realiza
2 Negativo Negativo - Presencia de levaduras
3 Negativo Negativo - Presencia de
4 Aparición de
algunas colonias
5 Colonias definidas Positivo-
Levaduras
Negativo Transparente Presencia de levaduras
Fenoles.
Amarillo Presencia positiva de
Brettanomyces/Dekkera
48

Este medio tiene alto grado de selectividad para levaduras, con un tiempo de
crecimiento de aproximadamente 5 días en 28C lo que lo hace rápido; gracias al
antibiótico (ampicilina) que hace parte de la composición del medio no hay
presencia de bacterias. Se hace confiable para resultados positivos de levaduras
Brettanomyces/Dekkera, debido a que las levaduras Saccharomyces fueron
inhibidas con el compuesto cicloheximida, su selectividad fue comprobada por
revisión microscópica, macroscópica y sensorial.
Las características morfológicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para Brettanomyces/Dekkera con glucosa como fuente de carbón, son las
siguientes:
Forma: Circular
Dimensiones: 5-6 mm
Topografía: convexa
Color: Amarillo
Opacicidad: oscuro
Superficie: lisa y suave
Borde: entero
El agar no presenta cambios de color, ni turbidez.
49

Tabla 3. Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono para Brettanomyces/ Dekkera en
incubación por 10 días a 28 C.
Día Crecimiento Olor Color Revisión Microscópica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras y
bacterias
9 Diminutas
colonias
transparentes
10 Positivo Positivo-
Negativo Transparentes Presencia de levaduras y
algunas bacterias
Fenólicos
Amarillo Presencia de levaduras
Brettanomyces/Dekkera y
bacterias
El medio selectivo para Brettanomyces/Dekkera con etanol como fuente de
carbono también es selectiva entre levaduras ya que solo se identifico la levadura
Brettanomyces/Dekkera en este, sin embargo se evidencia una presencia de otro
microorganismo, presuntamente bacteria ya que este medio no contiene agente
antibacteriano (ampicilina). Es necesaria la adición de ampicilina, en una
concentración de 10mg/l, para inhibir la presencia de bacterias.
Este medio presenta un tiempo más prolongado para mostrar crecimiento de la
levadura Brettanomyces/Dekkera aproximadamente 10 días.
50

Las características morfológicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para Brettanomyces/Dekkera con etanol como fuente de carbón, son iguales a las
presentadas en el medio selectivo con glucosa como fuente de carbono, y son las
siguientes:
Forma: Circular
Dimensiones: 5-6 mm
Topografía: convexa
Color: Amarillo
Opacicidad: oscuro
Superficie: lisa y suave
Borde: entero
El agar no presenta cambios de color, ni turbidez.
51

Tabla 4. Medio Selectivo con Etanol como fuente de carbono, y adición de ampicilina, para
Brettanomyces/ Dekkera en incubación por 10 días a 28 C
Día Crecimiento Olor Color Revisión Microscópica
1 Ninguno Negativo - -
2 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
3 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
4 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
5 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
6 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
7 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
8 Ninguno Negativo - Presencia de levaduras
9 Diminutas
colonias
transparentes
10 Positivo Positivo-
Negativo Transparentes Presencia de levaduras
Fenólicos
Amarillo Presencia de levaduras
Brettanomyces/Dekkera
El efecto de la ampicilina sobre el medio selectivo con etanol como fuente de
carbono, fue el esperado, inhibió completamente el crecimiento de colonias
bacterianas en el medio, el tiempo de crecimiento de la levadura y presencia de
aromas fenólicos fue el mismo de 10 días en incubación de 28C.
52

Las características morfológicas de las colonias presentes en el medio selectivo
para Brettanomyces/Dekkera con etanol como fuente de carbón, son iguales a las
presentadas anteriormente, y son las siguientes:
. Forma: Circular
Dimensiones: 5-6 mm
Topografía: convexa
Color: Amarillo
Opacicidad: oscuro
Superficie: lisa y suave
Borde: entero
El agar no presenta cambios de color, ni turbidez.
8.2 RESULTADOS PRUEBAS MEDIO LIQUIDO
Tabla 5. Influencia de la concentración de levaduras Brettanomyces/Dekkera en el
tiempo necesario para detectar la producción de 4-etil-fenol en medio liquido.
Número de
células/ ml
(concentración
final)
Tiempo necesario
para obtener
resultados
positivos (días)
1. Experimento
3.2x10 6 ≤ 3
3 X 10 4
3
3.3x10 2 7
40 No detectado
2. Experimento
4.3x10 6
≤3
3.9x10 4
≤3
3.7x10 2
8
62 No detectado
53

El número de células de levadura de Brettanomyces/Dekkera fue contabilizado
usando contador de células Chamber.
Los aromas fenólicos son difíciles de detectar debido al fuerte olor que tiene el
medio liquido, característico de sus componentes, esto dificulta la identificación del
“carácter Brett” en especial cuando las concentraciones de
Brettanomyces/Dekkera no son elevadas. Además de los olores fenólicos otros
compuestos volátiles se detectan tales como, acido acético y olores oxidativos,
también producido por la levadura Brettanomyces/Dekkera.
En la inspección visual se detecta alta turbidez en el medio. Se compara con un
medio sin presencia de Brettanomyces/Dekkera.
En las muestras con mayor concentración de la levadura es más notoria la
turbidez. Después de 3 días se presenta un precipitado blanco en todas las
muestras de altas concentraciones.
La revisión microbiológica se realiza diariamente para determinar el número de
células y la presencia positiva de la levadura a evaluar.
Entre los dos experimentos realizados con el medio liquido, el tiempo que se
demoro en detectar compuestos fenólicos, fue muy similar entre ellos,
dependiendo del número de células en el medio, en mayores concentraciones el
tiempo de detección fue menor.
Hay que señalar que Brettanomyces/Dekkera debe alcanzar una concentración
mínima (denominada población crítica) de 10 3 UFC/ml para comenzar a liberar etil
fenoles. Por debajo de esta concentración la levadura sería metabólicamente
activa pero no producirá compuestos alterantes a niveles detectables, esto se ve
reflejado en los resultados en los que las concentraciones de células son muy
bajas.
54

Estos resultados se comparan con los resultados dados en el medio solido. Los
dos medios muestran altos grados de selectividad hacia la levadura
Brettanomyces/Dekkera y similar comportamiento para el crecimiento de dicha
levadura.
En el medio líquido cuando hay altas concentraciones de Brettanomyces/Dekkera
el tiempo de detección del microorganismo es menor que con el medio solido pues
en el líquido es aproximadamente 3 días y en el sólido son 5 días.
8.3 RESULTADOS DE LA INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE
(SO2) Y ANTIBRETT® EN VINO TINTO DE LA REGION DE
DALMACIA, CROACIA
El vino fue analizado antes de la adición de los compuestos químicos a evaluar y
15 días después de adición para ver la reacción de este frente a SO2 y Antibrett®
estas características se determinaron con el equipo de laboratorio Bacchus II
Microdom localizado en el laboratorio Vinolab d.o.o, Zagreb, Croacia. Los
resultados se muestran en la tabla .
Tabla 6 .Resultados de las muestras de vino inoculados con la levadura Brettanomyces/Dekkera
durante 15 días. Comparativos con los diferentes compuestos
CFU/ml
Vino Day 1 Day 4 Day 10 Day 15
Control 1.30E+04 8.00E+03 7.00E+03 5.00E+03
Control 8.00E+03 6.40E+03 7.00E+03 2.80E+03
SO2 1.10E+04 4.00E+02 4.00E+02 67
SO2 9.00E+03 3.80E+03 2.70E+03 183
Antibrett 1.40E+05 9.20E+04 1.40E+04 4.00E+03
Antibrett 2.10E+05 1.81E+05 1.60E+04 9.00E+03
Antibrett 1.20E+05 9.90E+04 1.20E+04 1.00E+03
Antibrett 2.30E+05 2.04E+05 3.00E+03 2.00E+03
55

Control
Control
Tabla 7. Características del vino Babic 2007 antes de la adición de Dióxido de Azufre (SO2) o
Antibrett®. Día 0*
Alcohol
(%)
14.73
14.71
Acidez
Total.
(gr Aci.
Tartárico
/L)
5.25
5.22
Acidez
volátil
(Aci.
Acético/L)
0.83
0.84
Densidad
(gr/ml)
0.9928
0.9927
Azúcar
residual
(gr/l)
4.73
Extracto
seco
(gr/l)
33.2
Acido
Láctico
(gr/l)
1.64
Glicerol
*Análisis realizado con Bacchus II Microdom, Laboratorio Vinolab, Zagreb, Croacia.
4.79
32.9
1.62
(gr/l)
7.99
7.86
Taninos
(gr/l)
3.05
2.99
Acetato
Tabla 8. Características del vino Babic 2007 después de la adición de Dióxido de Azufre (SO2) o
Antibrett®. Día 15*
Alcohol
(%)
14.14
14.15
Acidez
Total.
(gr Aci.
Tartárico
/L)
5.65
5.56
Acidez
volátil
(Aci.
Acético/L)
1.07
1.08
Densida
d
(gr/ml)
0.9935
0.9936
Azúcar
residual
(gr/l)
4.36
4.20
Extrac
to
seco
(gr/l)
36.4
Acido
Láctico
(gr/l)
1.77
Glicerol
(gr/l)
8.27
Taninos
(gr/l)
2.59
(gr/l)
117
116
Acetatos
SO2 14.56 5.43 1.08 0.9932 4.76 36.9 1.67 8.03 2.81 125
SO2
Antibrett
Antibrett
14.57
36.5
5.42 1.08 0.9933 4.72 37.0 1.70 8.04 2.71 124
14.54 5.33 1.06 0.9933 4.48 37.1 1.75 8.13 2.77 125
14.55 5.34 1.05 0.9933 4.60 37.2 1.71 8.09 2.82 124
*Análisis realizado con Bacchus II Microdom, Laboratorio Vinolab, Zagreb, Croacia.
1.70
8.24
2.56
56
(gr/l)
136
137

Figura 4. Numero de UFC/ml de Brettanomyces/Dekkera en el vino de control para
evaluación y comparación durante un periodo de 15 días.
El comportamiento de la levadura Brettanomyces/Dekkera en la prueba por
duplicado en el vino de control, fue muy similar, pues con el tiempo esta levadura
deja de reproducirse y va muriendo cuando las condiciones ya no son aptas para
su desarrollo debido a que la mayoría de su fuente de carbono (Glucosa) esta
consumida, sin embargo esta levadura no llega a su desaparición total lo que
representa uno de los mayores problemas en la elaboración del vino.
Esta levadura tiene un metabolismo lento y el factor tiempo es un requisito
fundamental para su desarrollo, este experimento se empezó con una alta
población de Brettanomyces/Dekkera (1,30 x 10 4 UFC/ml y 8 x 10 3 UFC/ml,
respectivamente) y durante el transcurso del tiempo la población fue disminuyendo
debido a la perdida de las condiciones necesarias para la reproducción.
57

Figura 5. Numero de UFC/ml de Brettanomyces/Dekkera en vino con adición de SO2 en
concentración de 40 mg/l para evaluación y comparación durante un periodo de 15 días.
El SO2 tuvo un comportamiento efectivo y rápido contra las colonias de
Brettanomyces/Dekkera. La población de esta levadura se redujo de forma
significativa entre el día primero y el cuarto, se encontró una diferencia porcentual
de 96% en la primera prueba y del 60% en la de duplicado, al día 15 ya la
población era casi nula, pasando rápidamente de un numero por encima de la
población critica de la levadura Brettanomyces/Dekkera a un numero

Figura 6. Numero de UFC/ml de Brettanomyces/Dekkera en vino con adición de
Antibrett® en concentración de 40g/Hl para evaluación y comparación durante un periodo
de 15 días.
Figura 7. Numero de UFC/ml de Brettanomyces/Dekkera en vino con adición de
Antibrett® en concentración de 40g/Hl para evaluación y comparación durante un periodo
de 15 días.
El compuesto Antibrett® en la primera prueba tanto como en el duplicado tuvo su
mayor tiempo de reducción de UFC/ml entre los días 4-10 con una diferencia
porcentual de 91% en comparación con el día cuarto al decimo, a diferencia de
59

SO2 el cual presenta la gran disminución de colonias entre los primeros días de
agregarse el producto.
El tiempo para que la población de la levadura llegara a la cantidad menor a la de
la población critica es mucho mayor que la del compuesto SO2 sabiendo que esta
población debe ser

Analizando el comportamiento del vino durante el experimento de 15 días sin
compuestos químicos y con SO2 y Antibrett® a partir de las características
iníciales que se determinaron según el equipo BACCHUS, analizador infrarrojo; se
presenta en general una reducción del contenido alcohólico de este vino pero se
ve una mayor reducción en el vino de control el cual redujo en un 3.94% su
contenido alcohólico desde el dia 0 hasta el día 15 este vino no tiene ningún
compuesto contra la levadura Brettanomyces/Dekkera y por su elevada presencia
en los 15 días de experimento consumió esta cantidad de etanol.
Mientras en el vino que contenía SO2 tras 15 días de tratamiento se vio una
reducción de alcohol de 1% ya que este compuesto redujo la cantidad de
Brettanomyces/Dekkera en los primeros días de tratamiento previniendo su
reproducción y protegiendo el contenido alcohólico del vino Babic 2007.
En los vinos de prueba con Antibrett ® la reducción alcohólica se dio en un
porcentaje de 1,22% un poco más alta que con SO2 y mucho más baja en
comparación del vino de control, este compuesto también previno la gemación de
la levadura evitando la perdida de etanol en el vino sin embargo como este
compuesto duro mas en este proceso de eliminar Brettanomyces/Dekkera se
produjo una mayor pérdida alcohólica.
61

Figura 9. Comportamiento del contenido de acidez volatil en vino Babic 2007 desde el día 0 (sin
adición) hasta el día 15 con tratamiento de SO2 y Antibrett® en comparación con el vino de control.
0,8
0,6
0,4
0,2
0
1
1,2
Debido a la presencia de oxigeno en los frascos, la acidez volátil aumento pero no
significativamente en las muestras. No hubo grandes diferencias entre las
muestras con compuestos y las de control por lo que se deduce que estos
compuestos no ayudan a evitar esta acidez. Esta acidez tan alta puede dañar la
calidad del vino de forma casi irreparable. Pero el factor oxigeno, es de los más
controlados en la producción de vinos.
la alteración del aumento de la acidez volátil no está relacionada con la levadura
Brettanomyces/Dekkera sino a la presencia de oxigeno en el almacenamiento, el
oxigeno fue usado en esta prueba para promover condiciones apropiadas para el
desarrollo de la levadura.
Acidez Volatil
Day 0 Day 15
62

Figura 10. Comportamiento del contenido de Acido Acetico en vino Babic 2007 desde el día 0 (sin
adición) hasta el día 15 con tratamiento de SO2 y Antibrett® en comparación con el vino de control.
Brettanomyces/ Dekkera son productores de ácido acético y elevan el contenido
de los vinos anormalmente en condiciones de anaerobiosis. En condiciones de
aerobiosis producen concentraciones bajas o nulas de ácido acético.
Este acido acético al igual que los fenoles afecta el sabor y el perfil olfativo del
vino tinto este efecto es también producido por la levadura
Brettanomyces/Dekkera, vemos en los resultados el gran crecimiento de este
compuesto en el vino control el cual no tenia compouestos en contra de
Brettanomyces/Dekkera lo que produjo este aumento significativo del acido acético
en comparación con estos que tenían SO2 y Antibrett® entre ellos la diferencia en
este compuesto es muy reducida y no significativa pues estos compuestos no
permitieron la gemación de esta levadura y esta no produjo este acido en esa gran
cantidad.
140
135
130
125
120
115
110
105
Acido Acetico
Day 0 Day 15
A este compuesto se le atribuye el olor y sabor a vinagre del vino tinto un defecto
muy común y poco agradable para el consumidor.
63

Figura 11. Comportamiento del contenido de Azucares reductores en vino Babic 2007
desde el día 0 (sin adición) hasta el día 15 con tratamiento de SO2 y Antibrett® en
comparación con el vino de control.
5
4,8
4,6
4,4
4,2
4
3,8
Azucares Reductores
Day 0 Day 15
Brettanomyes/Dekkera utiliza los azucares residuales como fuente de carbono
para su crecimiento en el vino este es el factor más importante para su desarrollo
y este es el que determina en cierto caso la cantidad de levaduras de
Bretanomyces/Dekkera presente, en las graficas se determina claramente que en
el vino de control donde la cantidad de esta levadura es muy alta 15 días después
de empezar las pruebas la cantidad de azucares reductores es muy baja y ha
bajado en un porcentaje de 10% mientras que el vino que tiene SO2 bajo la
cantidad de azucares reductores en un 0.42% y el vino que tiene el compuesto
Antibrett® redujo su nivel de azucares reductores en 4,62%.
64

8.4 RESULTADOS DE DETERMINACION DE AROMAS DE
CARÁCTER BRETT EN EL VINO TINTO BABIC 2007 CON
EL USO DEL METODO MULTIPLE HEAD SPACE SOLID
PHASE
Tabla 10. Tiempos de retención para los compuestos volátiles y no volátiles del carácter Brett en
vino Babic 2007 con el método propuesto.
Compuesto Tiempos de
retención (min)
Acetaldehído 1.437
Propanol 3.759
Diacetil 4.202
Etil-acetato 4.523
i-butanol 6.232
Acido Acético 7.840
i-amil alcohol 11.740
n-amil 13.489
lactato de etílico 15.741
acetato amil metílico 17.796
1-hexanol 19.101
etil-hexanol 24.456
Linalol 30.370
2-feniletanol 32.768
p-cresol 33.522
octanoato de etilo 34.226
4-etilfenol 37.100
2-feniletil acetato 32.769
4-etilguayacol 39.704
4 vinilfenol 40.529
decanoato de etilo 42.117
Refiriéndose a estos resultados es necesaria la creación de soluciones estándar
para determinar tiempos de retención con el método y si es necesario ajustes a
este.
65

Tabla 11. Soluciones estándar para compuestos en vinos tintos Croatas.
Compuesto Pureza Cantidad
MODEL 0
(en volumen de 100 ml en 40% Etanol)
Acetaldehído 0.99 1.623 16.0677
Propanol 0.995 1.3849 13.7718
Diacetil 0.98 0.1071 1.04958
Etil-acetato 0.995 3.0172 30.02114
i-butanol 0.99 1.5016 14.86584
Acido Acetico 0.995 0 0
i-amil alcohol 0.99 2.0116 19.91484
n-amil 0.98 1.5442 15.13316
lactato de etilio 0.98 0.0507 0.49686
acetato amil metilico 0.98 0.1028 1.00744
1-hexanol 0.98 0.0367 0.35966
etil-hexanol 0.98 0.0308 0.29876
Linalol 0.97 0.0288 0.27936
Nerol 0.97 0.0311 0.30478
Citronelol 0.98 0.031 0.3038
Geraniol 0.98 1.5803 15.48694
2-feniletanol 0.98 0.0402 0.39396
4-etilfenol 0.98 0.0812 0.78764
octanoato de etilo 0.97 0.0597 0.59103
2-feniletil acetato 0.99 0.0315 0.31185
4-etilguayacol 0.98 0.0803 0.79674
(g)
Concentración (g/l)
Fuente: Laboratorio de análisis e investigación de bebidas, Facultad de Tecnología y Biotecnología
de Alimentos, Universidad de Zagreb, Zagreb, Croacia. 2009.
Las soluciones estándar se realizan teniendo como referencia las cantidades de
estos compuestos en los vinos tintos croatas, datos suministrados por el Doctor
Leo Gracin, en concentraciones de g/l, a partir de este dato y teniendo en cuenta
66

la pureza de los compuestos que se tenían en el laboratorio de análisis e
investigación de bebidas se crean las soluciones estándar. Ejemplo
Solución estándar para 4 etil-fenol, en un volumen de 100 ml.
Con estas soluciones estándar se realizo el tiempo de retención para corroborar el
método. Los resultados de esto fueron tiempos de retención diferentes a los del
método primero con el que se realizaron los ensayos y a partir de esos resultados
se ajusto el método con el que se trabajo.
67

Tabla 12. Tiempos de retención para los compuestos volátiles y no volátiles del carácter Brett en
vino Babic 2007 con el método modificado.
Compuesto Tiempos de
retención (min)
Acetaldehído 1.542
Propanol 4.046
Diacetil 4.733
Etil-acetato 4.807
i-butanol 6.659
Acido Acetico 8.343
i-amil alcohol 12.123
n-amil 13.866
lactato de etilio 16.072
acetato amil metilico 18.336
1-hexanol 19.447
etil-hexanol 24.835
Linalol 31.831
2-feniletanol 33.305
p-cresol 33.703
octanoato de etilo 34.571
4-etilfenol 37.724
Citronelol 38.326
Nerol 38.576
2-feniletil acetato 39.012
Geraniol 39.944
4-etilguayacol 40.271
4 vilifenol 41.168
decanoato de etilo 42.657
68

DIA 0
Se coloca ISTD a todas las muestras respectivas para poder determinar
cantidades de los compuestos aromáticos.
Se realiza la cromatografía de gas al vino Babic 2007 antes de ser inoculado con
Brettanomyces/Dekkera.
Tabla 13. Resultados de la cromatografía de gas del vino Babic 2007.
Compuesto Tiempo de retención
min
Cantidad
Acetaldehído 1.542 0
mg/l
Propanol 4.046 0
Diacetil 4.733 372.15204
Etil-acetato 4.807 0
i-butanol 6.659 0
Acido Acético 8.343 28.17465
i-amil alcohol 12.123 167.99019
n-amil 13.866 26
lactato de etílico 16.072 109.83961
acetato amil metílico 18.336 0.185196
1-hexanol 19.447 2.64655
etil-hexanol 24.835 0.158751
Linalol 31.831 0
2-feniletanol 33.305 42.35560
p-cresol 33.703 1
octanoato de etilo 34.571 0.152412
4-etilfenol 37.724 0.0581345
Citronelol 38.326 0.0439729
Nerol 38.576 0.0344799
2-feniletil acetato 39.012 0.0407983
Geraniol 39.944 0
4-etilguayacol 40.271 0
4 vilifenol 41.168 0
Decanoato de etilo 42.657 0.0190144
69

Basados en los compuestos aromáticos que brinda el “Carácter Brett” se van a
analizar detalladamente los siguientes aromas: 4-Etilfenol, 4-Etilguayacol, 4-
Vinylfenol
Figura 12. Compuestos aromaticos en vino tinto Babic sin estar contaminado con la levadura
Brettanomyces/Dekkera.
C (mg/L)
0,2
Vino Babic 2007 Dia 0
0
4 etilfenol 4 etilguayacol 4 vinylfenol
Vino 0,0581345 0 0
El vino a analizar esta por debajo de las concentraciones consideradas como
perjudiciales para el aroma del vino tinto (El umbral sensorial del 4-etilfenol es de
230 μg/l y el del 4-etilguaiacol es de 47 μg/l) pues posee una concentracion de
58µg/L de 4etilfenol, 0 µg/L de 4 etilguayacol y 0 µg/L de vinylfenol.
8.4.1 RESULTADOS PARA LAS PRUEBAS SEGÚN TEMPERATURAS
DE ALMACENAMIENTO
70

Tabla 14 .Resultados de las cantidades en mg/L de los compuestos aromáticos que otorgan el
“carácter Brett” al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 20C por 4 días. Prueba por duplicado
.
Compuesto Day 1
MUESTRAS INCUBADA A 20C
Amount
(mg/L)
Day 2
Amount
(mg/L)
Day 3
Amount
(mg/L)
Day 4
Amount
(mg/L)
4-etilfenol 0.260244 0.17294 0.177547 0.20156
4-etilfenol 0.260244 0.245915 0.204542 0.262499
4-etilguayacol 0 0 0 0
4-etilguayacol 0 0 0 0
4 vinilifenol 11.07096 7.81349 6.85317 4.60323
4 vinilifenol 11.07096 12.97465 6.21324 6.93225
71

Figura 13 . Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces/Dekkera almacenado a 20C por 4 días en comparación con el vino sin
contaminar. Prueba por duplicado
C (mg/L)
C (mg/L)
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 0,0581345 0,260244 0,172935 0,177547 0,20156
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
4 etilfenol
4 etilfenol
0
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 0,0581345 0,260244 0,245915 0,204542 0,262499
Brettanomyces/Dekkera es la levadura responsable de la produccion de 4-etil-
fenol compuesto asociado con olores caracteristicos a “fenol”, “cuero”, “sudor de
72

caballo”, “establo” o “barniz” dañando la calidad sensorial del vino tinto Babic, la
producción de este compuesto en esta muestra realizada por duplicado fue
ascendente y tuvo incremento muy grande en el primer dia de almacenamiento y
en el transcurso de los siguientes cuatro días se mantuvo relativamente estable lo
cual no concuerda con el comportamiento típico de esta levadura quien tiene un
crecimiento lento e incrementa la producción de fenoles con su gemación, esto
genera muchas dudas sobre el buen funcionamiento del equipo GC o de la
estabilidad de las levaduras Brettanomyces/Dekkera en este almacenamiento.
Figura 14. Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces /Dekkera almacenado a 20C por 4 días en comparación con el vino sin
contaminar prueba por duplicado
C (mg/l)
4 etilguayacol
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Vino Dia Dia Dia Dia
1 2 3 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
4 etilguayacol
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Vin Dia Dia Dia Dia
o 1 2 3 4
4 etilguayacol 0 0 0 0 0
73

Presencia negativa de 4 etil guayacol durante todo el almacenamiento,
probablemente las condiciones de almacenamiento y el medio no dieron lugar al
desarrollo de este compuesto el cual se considera menos conflictivo que el 4-etil-
fenol.
Figura 15. Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces /Dekkera almacenado a 20C por 4 días en comparación con el vino sin
contaminar. Prueba por duplicado
C (mg/l)
12
10
8
6
4
2
4 vinylfenol
0
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 11,07097,813496,853174,60323
4 Vinylfenol
14
12
10
8
6
4
2
0
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
Series1 0 11,071 12,974 6,2132 6,9322
Estos resultados también dejan dudas del normal comportamiento de dicha
levadura pues indican que la levadura no convirtió este compuesto en etilfenol
74

durante el almacenamiento característica que solo la levadura
Brettanomyces/Dekkera puede realizar, se ve que las concentraciones de
vinylfenoles son mucho mas altas que las de fenoles lo que nos deja determinar
que la población de Brettanomyces/Dekkera es muy baja y existen otras levaduras
productoras de vinylfenoles en este tipo de vino en las condiciones de
almacenamiento dadas para estas pruebas.
Tabla 16 .Resultados de las cantidades en mg/L de los compuestos aromáticos que otorgan el
“carácter Brett” al vino Tinto Babic 2007 almacenado a 28C por 4 días
Compuesto Day 1
MUESTRA 2 INCUBADA A 28C
Amount
(mg/L)
Day 2
Amount
(mg/L)
Day 3
Amount
(mg/L)
Day 4
Amount
(mg/L)
4-etilfenol 0.260244 0.19612 0.186614 0.19932
4-etilfenol 0.260244 0.20576 0.214917 0.193554
4-etilguayacol 0 0.14304 0.223836 0
4-etilguayacol 0 0.02287 0.0529832 0
4 vinilifenol 11.07096 7.87068 6.65182 3.97847
4 vinilifenol 11.07096 2.84389 0.0204392 0
75

Figura 16 . Compuesto aromatico 4 etilfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces /Dekkera almacenado a 28C por 4 días en comparación con el vino sin
contaminar.
El desarrollo de este compuesto en el día 1 fue significativo y luego relativamente
estable, el comportamiento fue similar en las pruebas de diferentes temperaturas
de almacenamiento para este compuesto el cual es el más problemático en la
industria vinícola.
0,2
0,15
0,1
0,05
4 etilfenol
0
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 0,058130,199320,186610,196110,19932
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
4 etilfenol
0
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 etilfenol 0,05813 0,19355 0,21491 0,20576 0,26024
76

Figura 17 . Compuesto aromatico 4 etilguayacol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces/Dekkera almacenado a 28C por 4 días en comparación con el vino sin
contaminar.
Los resultados de la prueba son poco confiables y no entendibles, por lo que
podemos verificar que el GC no está trabajando de forma adecuada para la
detección del compuesto.
C (mg/l)
C (mg/l)
4 etilguayacol
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
Vi Di Di Di Di
no a 1 a 2 a 3 a 4
4 Etilguayacol 0 0 0,022 0,053 0
4 etilguayacol
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
Vin Dia Dia Dia Dia
o 1 2 3 4
4 etilguayacol 0 0 0,223 0,143 0
77

Figura 18 . Compuesto aromatico 4 Vinylfenol producido en vino tinto Babic contaminado con la
levadura Brettanomyces/Dekkera almacenado a 28C por 4 días en comparación con el vino sin
contaminar. Prueba por duplicado
El comportamiento de este compuesto en la prueba es muy irregular y poco
confiable
8
6
4
2
4 vinylfenol
0
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 3,978476,651827,870683,97847
4 vinylfenol
12
10
8
6
4
2
0
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
4 vinylfenol 0 11,071 2,8438 0,0204 0
78

Figura 19. Comportamiento del compuesto 4 etilfenol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparación con el inicial del vino son contaminar.
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
4 etil fenol
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
La concentración de 4 etil fenol fue mayor al cuarto día almacenado a
temperatura ambiente de 20C pero este compuesto no tuvo una actividad notoria
de ascenso durante su almacenamiento como se esperaba, lo que deja muchas
dudas sobre los resultados de este ensayo
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
79

Figura 20. Comportamiento del compuesto 4 etil guayacol durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparación con el inicial del vino son contaminar
C (mg/L)
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
4 etil guayacol
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3
Comportamiento anormal del compuesto, no se ve tendencias de aumento o
disminución de este en ninguna de las pruebas, no tiene un comportamiento
regular pues se esperaba que la levadura Brettanomyces/Dekkera
descarboxinizara el compuesto 4-vinilguaiacol y aumentar las concentraciones de
4-etilguaiacol esta reacción no se hizo notoria en los compuestos aromáticos
según lo determino el Cromatografo de Gas (GC).
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 20C
80

Figura 21. Comportamiento del compuesto 4 Vinyl fenoll durante almacenamiento en diferentes
condiciones de temperatura en comparación con el inicial del vino son contaminar
La no presencia de este compuesto en el vino original demuestra las baja o casi
nula presencia de la levadura Brettanomyces/Dekkera al día primero este
compuesto incrementa de forma notoria en las muestras debido a la presencia de
acido cumárico en el medio ya que sufre su carboxilacion convirtiéndose en 4 vinyl
fenol sin embargo su comportamiento no fue regular y presento problemas de
lecturas.
C (mg/L)
14
12
10
8
6
4
2
0
4 Vinyl fenol
Vino Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4
Muestra 1 a 28C
Muestra 2 a 28C
Muestra 1 a 20C
Muestra 2 a 28C
81

9 CONCLUSIONES Y
RECOMENDACIONES
9.1 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO SOLIDO
Se desarrolló un medio selectivo sólido para Brettanomyces/Dekkera
accesible y fácil de elaborar.
Se detectan colonias de la levadura Brettanomyces/Dekera en el agar
selectivo con glucosa como fuente de carbono, en un lapso de 5 días en
incubación a 28C.
El medio selectivo sólido con Glucosa como fuente de carbono fue más
rápido y efectivo ya que toma 5 días para dar resultados positivos frente al
de Etanol como fuente de carbono el cual toma 10 días para mostrar
resultados positivos, aunque ambos dieron resultados satisfactorios en la
selectividad de la levadura Brettanomyces/Dekkera.
La levadura se adapto de forma satisfactoria a estos medios, en
condiciones de almacenamiento propias para su desarrollo (28C).
Las colonias de la levadura Brettanomyces/Dekkera tiene un crecimiento
en estos medios sólidos de forma circular, con topografía convexa y borde
entero, dimensiones: 5-6 mm, color: Amarillo, opacicidad: oscuro,
82

superficie: lisa y suave, siendo fácil de identificar y realizar los conteos
necesarios.
El medio solido es un buen complemento en los métodos de identificación
de la levadura Brettanomyces/Dekkera en vino tinto, es rápido, económico,
y útil.
El uso de azucares para fermentación de la levadura
Brettanomyces/Dekkera que Saccharomyces no puede fermentar, para
mayor selectividad.
Realización de pruebas Bioquímicas como método rápido de selectividad.
9.2 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DESARROLLO DEL MEDIO LÍQUIDO
Se desarrollo un medio selectivo liquido para Brettanomyces/Dekkera
accesible y fácil de elaborar
Este medio mostró resultados positivos de la presencia de
Brettanomyces/Dekkera en un lapso de tiempo menor (3 días) que con el
medio solido (5 días) en caso de que el número de células de la levadura
Brettanomyces/Dekkera sea mayor a la población critica (10 3 )
Cuando la población de células de la levadura Brettanomyces/Dekkera es
menor a la población critica el tiempo de identificación de esta levadura por
medio liquido es muy prolongado, puede tomar más de 10 días o incluso no
detectarlo.
83

Los compuestos químicos usados para el desarrollo del medio líquido no
son los adecuados para este tipo de medios donde los resultados positivos
son olfativos pues estos compuestos emiten fuertes olores que confunden
los olores característicos del carácter Brett.
El medio liquido es un buen complemento en los métodos de identificación
de altas concentraciones de la levadura Brettanomyces/Dekkera en vino
tinto, es rápido, económico, y útil.
9.3 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
INFLUENCIA DE DIOXIDO DE AZUFRE (SO2) Y ANTIBRETT®
EN VINO TINTO BABIC 2007 DE LA REGION DE DALMACIA,
CROACIA.
Este trabajo mostró que el dióxido de azufre (SO2) tiene buenos resultados
en contra de la levadura Brettanomyces/Dekkera en concentraciones
normales de 40mg/l concentración en la que se trabaja este compuesto en
los vinos tintos.
En Europa el dióxido de azufre es usado de forma tradicional en gran
número de alimentos y especialmente en vinos, sin embargo y a pesar de
su uso regulado se busca la sustitución de este o su máxima reducción
para hacer de este producto más sano para las personas no tolerantes a
este tipo de compuestos, sin embargo según el trabajo realizado en
comparación con el producto Antibrett®, el SO2 es más eficaz en el control
84

de la levadura ayudando a evitarla y eliminarla de la cadena productiva del
vino tinto.
Gracias a sus características el vino tinto Babic es muy vulnerable a la
levadura Brettanomyces/Dekkera, pero a su vez se puede tratar fácilmente
con productos como SO2 y Antibrett®, aunque es más efectivo contra
Brettanomyces/Dekkera el dióxido de azufre (SO2).
Antibrett® es una buena opción para el control de Brettanomyces/Dekkera,
para evitar el uso de productos alergenicos como SO2.
9.4 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES PARA
DETERMINACION DE AROMAS DE CARÁCTER BRETT EN
EL VINO TINTO BABIC 2007 CON EL USO DEL METODO
MULTIPLE HEAD SPACE SOLID PHASE
Al terminar la primera prueba con análisis en cromatografía a gas y el SPME
queda como resultados:
Es necesario repetir la prueba
No se determina el efecto de los estándares internos sometidos a tiempos
de almacenamiento en temperaturas de 20C y 28C lo que puede dar falsos
resultados de cantidades de compuestos
85

Se debe crear un medio más apto para el desarrollo de la levadura y un
control diario de crecimiento ( agregar más Glucosa en caso de que se
haya consumido toda, controlar presencia de Bacterias y otros
microorganismos que no se deseen en el medio)
Es necesario control de aromas con panel sensorial para determinar el
umbral de detección en este vino
Control de crecimiento por medio solido Selectivo para
Brettanomyces/Dekekra conteo de colonias presentes en el vino inoculado
y su desarrollo durante almacenamiento a diferentes temperaturas.
La segunda prueba no fue posible realizarla por daños en el equipo de
cromatografía de gas (GC)
86

ANEXOS
87

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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of Brett character responsible compounds in wines by using multiple
headspace solid-phase micro extraction, Journal of Chromatography, No
1143, pag. 176-181, La Rioja, España
E. Pueyo, P. Hidalgo, K. Fernández, y P. Martín-Álvarez, 1999. Análisis de
compuestos volátiles en vinos obtenidos con distintas cepas de
Saccharomyces cerevisiae. Aplicación de la técnica de micro extracción en
fase sólida (SPME), Revista Jornadas Científicas 99 Grupos de
Investigación Enológica, Zaragoza, España
92

GRACIAS, es una palabra corta para todo lo que quiero expresar a todos aquellos que
hicieron parte de este sueño, hecho realidad…
A Dios y a la virgen Auxiliadora por llevarme de su mano cada día de mi carrera, en cada
momento alegre y en cada momento difícil fueron mi fortaleza.
A mis papitos por hacer de mi estudio una realidad, por su sacrificio y apoyo desinteresado y
sincero.
A mi Hermanito por ser mi fortaleza, mi ejemplo y mi amigo incondicional
A mi familia Blanco y Urrea, por su compañía durante esta etapa.
A mi facultad (Decano Dr Camilo Rozo, Dra Patricia Jiménez, y mis profesores) por
ensenarme mi profesión y aportar lo mejor de ustedes para mi formación personal.
A mis asesores de Tesis (Ing. Patricia Chaparro y Dr. Sc. Leo Gracin) por su guía y
colaboración oportuna.
A mis queridos amigos quienes siempre han estado a mi lado en las dificultades y en las
alegrías (Ingrid, Mafe, Cami G, Cami R, Harold, Pipe, Karla, Andrés T, Diego G)
A IAESTE en alianza con el ORI por hacer posible mi intercambio y poder hacer mi tesis en el
maravilloso país de Croacia.
A Croacia por ser mi segundo hogar, por abrirme sus puertas y su corazón, por brindarme
tan maravillosas personas en mi camino
Croatia Thank you for being my second home, for opening your doors and your heart to me,
and give me the opportunity to meet so many wonderful people.
To my boss, my teacher, my mentor and specially my friend, Leo.
To the faculty of food technology and Biotechnology, and the department of technology
and analysis of beverages for give me the opportunity to give all my knowledge to the
project, and learn a lot more.
To all the amazing people I met during this experience (Igor, Karin, Natka, Josip, Ana Matija,
Daniel Pz, Szilvia, Dini, Daniela, Lidija, Sanja, and everybody else who I had the pleasure to
meet in this great trip) for give me the best of your hearts.
I only have one thing to say …THANK YOU
Solo me queda una palabra por decir…GRACIAS.