Cromatografía

Metodos de purificación purificaci
Basado en las siguientes propiedades proteicas:
Tamaño Tama o
Solubilidad
Carga
Adsorción Adsorci
Afinidad
CAROLINA VITA

Característica
Caracter stica Procedimientos
Tamaño
Solubidad
Polaridad
Carga
Dialisis – ultrafiltración
Electroforesis en gel
Cromatografia de exclusión molecular
Ultracentrifufacion
Precipitación con Sales
“ Solventes organicos
‘’ por pH
Cromatografia de absorción
C. En papel
C. En fase reversa
C. De interaccion hidrofóbica
Cromatografia de intercambio iónico
Electroforesis
Isoelectroenfoque
Selectividad Cromatografia de afinidad

Cromatografias de exclusión exclusi n
molecular
Separan por tamaño tama o
Las columnas rellenas polimeros inertes
Insolubles pero muy hidratados
Insolubles pero muy hidratados
Sephadex: polimeros de dextrano
Sepharose: agarosa
Superose: agarosa entrecruzada
Sephacryl: dextrano-bisacrilamida
Superdex: agarosa y dextrano

1.La columna se equilibra con el buffer de corrida
2. Aplicación de la muestra (0.5 - 5% volumen de columna)
3. Elución.
.
Exclusión Exclusi molecular

Exclusión Exclusi molecular
1. Separa mezclas de proteínas prote nas por tamaño tama
2. De macromoléculas macromol culas diferente
3. De grandes estructuras celulares como
ribosomas
Determinación n de PM
4. Determinaci

Volumen de exclusión exclusi
Proteínas Prote nas de gran tamaño tama o no penetran
los poros permaneciendo en el
volumen de exclusión exclusi n de la columna
Vo

Se determina Vo con Blue Dextran
Ve se determina para cada proteína
Vt se calcula de la fórmula π r 2 x h
Kav
Determinacion de PM
Log Mw
Kav =Ve-Vo / Vt-Vo

CARGA
Los grupos R en las proteínas prote nas globulares
se encuentran sobre la superficie
exterior de la molécula, mol cula, aunque también tambi n
pueden tener grupos ocultos o
participando de puentes de H
Carga ⇒⇒ depende de las propiedades
ácido cido – base de los grupos R
Carga

Cromatografía Cromatograf a de intercambio iónico i nico
Un intercambiador iónico consiste en una matriz porosa
con grupos cargados unidos covalentemente.
Estos grupos se asocian con iones de la fase móvil
(contraiones), estos pueden intercambiarse por otros
iones de las misma carga sin alterar la matriz.
La matriz generalmente es un compuesto inorgánico,
resinas sintéticas o polisacáridos.
Matriz Nombre
Dextrano Sephadex
Agarosa Sepharose CL-6B
Celulosa Sephacel

Grupos cargados
• Son una propiedad fundamental del intercambiador.
• Determina el tipo y la fuerza del intercambiador
• El número total y su disponibilidad determinan la
capacidad del intercambiador
Los de carga negativa adsorben cationes
mientras que los de carga positiva adsorben aniones.
Así se llaman intercambiadores catiónicos y
aniónicos respectivamente.

Cromatografía de intercambio iónico(IEX)
Mecanismo de
separación
• Separa a moléculas por
carga neta.
• Grupos cargados unidos a
la matriz adsorben
muestras de carga
opuesta(reversible)
• La desorción se logra a
través el cambio del pH o
aumentando la
concentración de sal del
eluyente.
Fig 1.1. las moléculas cargadas se
absorben en los en los
intercambiadores de carga opuesta.
La interacción es un equilibrio
dinámico que puede estar
influenciado por pH como por la
concentración de las sales.

Proteínas →poseen aa cargados
en su superficie, se adsorben
sobre el intercambiador
Proteínas con carga neta
negativa se absorben a I.
catiónicos,
La fuerza de adsorción aumenta
con el aumento de carga neta.
La carga de los aa depende del
pH.
la carga neta dependerá del pH
de una manera que es bastante
específica para cada proteína
individual.
Adsorción Adsorci
Fig 1.2. El tamaño de la fecha
representa la fuerza de la adsorción

Existen 2 posibilidades
•Reducir la carga neta
cambiando el pH.
•Agregar un ión que compita
por las cargas del
intercambiador
En IEX se utiliza una sal
monovalente como NaCl, ya
que tiene poco efecto sobre
el pH de la corrida.
Fig 1.3. A mayor carga neta,
mayor es la adsorcion y
mayor la concentracion de
sales que se necesita para
desorber la muestra
Desorción Desorci

1. El buffer se
bombea por la
columna
hasta que la
[salina] y el
pH lleguen a
un equilibrio
Separación Separaci de proteínas prote nas usando
2. La
muestra se
aplica , se
adsorbe y
se lava con
buffer
gradiente de NaCl
Elution
order:
3. El gradiente comienza y los
componentes adsorbidos de la muestra
comienzan a eluir en función de su carga
neta.
4. Regeneración de
los componentes
cargados hasta
remoción completa.

CARGA
Los grupos R en las proteínas prote nas globulares
se encuentran sobre la superficie
exterior de la molécula, mol cula, aunque también tambi n
pueden tener grupos ocultos o
participando de puentes de H
Carga ⇒⇒ depende de las propiedades
ácido cido – base de los grupos R
Carga

Electroforesis
Transporte de partículas part culas a través trav s de un
campo eléctrico. el ctrico.

ELECTROFORESIS
en Papel de filtro o acetato de celulosa
• Revela la presencia de proteínas prote nas con colorantes
específicos
espec ficos
• No existe interacción interacci n con el soporte
• Resolución Resoluci muy baja
• Rápido pido

ELECTROFORESIS EN GELES
Separa por CARGA Y TAMAÑO TAMA
El material soporte interacciona con las
proteínas prote nas actuando como matriz retardando
a las proteínas prote nas más m s grandes
Geles agarosa
Geles poliacrilamidas
Condición Condici n
nativa(PAGE) nativa(PAGE)
o desnaturalizante(SDS-PAGE)
desnaturalizante(SDS PAGE)

Geles poliacrilamida

SDS-Page SDS Page
Condiciones desnaturalizante
Utiliza en la corrida:
β-mercaptoetanol
mercaptoetanol → reducidas reducida
SDS →desnaturalizadas
desnaturalizadas

Las proteinas se separan sólo lo por su PM
El SDS interacciona con las proteínas prote nas por
interacciones hidrofóbicas
hidrof bicas
cumple 2 funciones críticas: cr ticas:
Recubre las proteinas con carga negativa
proporcional a su PM
Desnaturaliza la estructura nativa de la proteína prote na
β -mercaptoetanol
mercaptoetanol rompe los puentes disulfuros

Se puede entonces
determinar el peso
molecular aparente de
cualquier proteína prote na por
comparación comparaci n con un patrón patr n
de proteínas prote nas de pesos
moleculares conocidos. Las
movilidades de las
proteínas prote nas en los geles de
SDS-PAGE SDS PAGE son funciones
lineales del logaritmo de su
peso molecular.

SDS PAGE of Purification
1. Complete mix of proteins
2. High Salt
3. Ion exchange
4. Gel-filtratio
5. Affinity
10micrograms loaded in each lane

USOS
• DETERMINACIÓN DETERMINACI N DE PI
• DETERMINACIÓN DETERMINACI DE PM
• # DE PROTEÍNAS PROTE NAS DE UNA MUESTRA
•# DE SUBUNIDADES de PROTEÍNA
PROTE NA

Isoelectroenfoque
Es Es un un tipo tipo de de electroforesis
electroforesis
Se basa en el desplazamiento de las moléculas mol culas
en un gradiente de pH.
Las moléculas mol culas anfotéricas anfot ricas(aa (aa) ) se separan en un
medio en el que existe una diferencia de
potencial y un gradiente de pH .
La región regi n del áno nodo do es ácida cida
La región regi n del cátodo c todo es alcalina.
Se establece un gradiente de pH tal que las
moléculas mol culas que se han de separar tengan su pI
dentro del rango.

Isoelectroenfoque
Las sustancias que estan en regiones de pH < pI
tendran carga ⊕ y migraran hacia el cátodo c todo
Las que se encuentran en medios con pH > pI
tendrán tendr n carga - y migrarán migrar n hacia el ánodo nodo
La migración migraci n las conducirá conducir a una región regi n donde el pH
coincidirá coincidir con su pI →neta neta nula y se detendrán detendr
De esta forma las moléculas mol culas anfotéricas anfot ricas se sitúan sit an en
estrechas bandas donde coincide su pI con el pH

IEF

IEF

Electroforesis bidimensional
La electroforesis bidimensional se basa en
separar las proteínas prote nas en una mezcla según seg n sus dos
propiedades moleculares, una en cada dimensión. dimensi n.
El procedimiento más m s usado se basa en la
separación separaci n
Primera dimensión dimensi n mediante ief
Segunda dimensión dimensi n según seg n PM mediante
electroforesis en poliacrilamida SDS-Page SDS Page

Electroforesis bidimensional

Se tiñen ti en los geles
se adquieren las imágenes im genes de los geles con un
escáner esc ner de alta resolución resoluci n
se analizan con un software especializado.
Así As se pueden comparar geles y observar
cambios en el patrón patr n de manchas:
1. variación variaci n de intensidades,
2. aparición aparici n y/o desaparición desaparici n de manchas.
La electroforesis 2D, englobada en un estudio de
proteómica prote mica, , va seguida del análisis an lisis de
manchas concretas hasta llegar a la
identificación identificaci n de les proteínas prote nas
correspondientes.

Electroforesis 2D
Primera dimensión: dimensi n: IEF, rango de pI 3-10 10
Segunda dimensión: dimensi n: SDS-PAGE SDS PAGE 12%

Las aplicaciones de la proteómica prote mica
Identificación Identificaci n de nuevos marcadores para el
diagnóstico diagn stico de enfermedades
Identificación Identificaci n de nuevos fármacos f rmacos
Determinación Determinaci n de mecanismos moleculares
involucrados en la patogenia de
enfermedades
Análisis An lisis de rutas de transducción transducci n de señales se ales

Cromatografia hidrofóbica hidrof bica
Separacion de las proteínas prote nas por diferente
hidrofobicidad
Interaccíon Interacc on reversible entre la proteína prote na y la
superficie hidrofóbica hidrof bica del medio
cromatográfico
cromatogr fico
La interaccion ↑↑ con alt fuerza iónica i nica
Desorción: Desorci : ∇ decreciente de [salina]

Cromatografia hidrofóbica hidrof bica

Cromatografia hidrofóbica hidrof bica
Distintos ligandos: ligandos
↑ fuerza:
Eter< Eter<
isopropil

Cromatografia hidrofóbica hidrof bica
HiTrap HIC Selection Kit
-Seleccionar el ligando apropiado y las condiciones
experimentales
5 medios con distintas características hidrofóbicas
para screening y selección a pequeña escala
Phenyl Sepharose High Performance
Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (low sub)
Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub)
Butyl Sepharose 4 Fast Flow
Octyl Sepharose 4 Fast Flow

Cromatografia hidrofóbica hidrof bica

Adsorción
Adsorci
En agua pura los efectos hidrofóbicos son muy débiles para
causar la interacción de la proteína con el ligando.
Ciertas sales aumentan las interacciones hidrofóbicas⇒se
pegan al ligando
Fig 1.7. HIC deals with the relation between
water shells around hydrophobic surfaces,
bulk water clustersand salts enhancing
hydrophobic interaction.
Las siguientes sales aumentan la interacción hidrofóbica:
Na2SO4 > K2SO4 > (NH4)2SO4 > NaCl > NH4Cl > NaBr >
NaSCN

Para lograr una desorción selectiva la
concentración de sal se disminuye de forma
gradual y los componentes eluyen en orden de
hidrofobicidad
Fig 1.8. The adsorption of hydrophobic molecules
is a reversible reaction whose equilibrium
is controlled by the salt concentration.

Cromatografia hidrofóbica hidrof bica

Cromatografía Cromatograf a de afinidad

Cromatografía Cromatograf a de afinidad