Determinación semicuantitativa de la expresión de ARNm de las ...

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O r i g i n a l
VOL. 20 / NÚM. 4 / OCTUBRE-DICIEMBRE 2001
INMUNOLOGÍA, 2001; PP 184-195
Determinación semicuantitativa de la expresión
de ARNm de las isoformas de MIP-1α y MIP-1β
mediante un competidor recombinante y RT-AFLP
P. ADREANI 1
, I. GÓMEZ 1
, R. COLOBRAN 1
, P. CARO, F. PELUSA, R. PUJOL-BORRELL, M. JUAN
Laboratori d’Immunobiologia per a la Recerca i les Aplicacions Diagnòstiques. Centre de Transfusió i
Banc de Teixits. Hospital Universitari Germans Trias i Pujol. Universitat Autónoma de Barcelona.
Badalona
RESUMEN
D e n t ro de la amplia familia de las citocinas quimiotácticas,
MIP-1α y MIP-1β son β-quimiocinas de especial interés
por sus efectos sobre linfocitos y monocitos, las principales
células de la inmunidad adquirida. En estudios pre v i o s
hallamos una correlación clara entre los niveles tisulares de
M I P - 1α y MIP-1β y el diagnóstico clínico en los diversos
c u a d ros de enfermedad autoinmune del tiroides. La existencia
de isotipos para estas quimiocinas impone cierta dificultad
en su análisis y evaluación funcional. En este trabajo
p resentamos un protocolo que, aprovechando pequeñas
d i f e rencias a nivel de secuencia nucleotídica, combina RT-
PCR y restricción con MspI para estimar semicuantitativamente
los niveles de ARNm de los loci codificantes para cada
una de estas dos quimiocinas. El aspecto más relevante de
esta técnica es el uso de un fragmento de ADN re c o m b i n a nte
que actúa de estándar interno tanto para MIP-1α c o m o
para MIP-1β, a la vez que contiene un lugar de re s t r i c c i ó n
para MspI. De esta forma actúa como control no sólo de
amplificación (en una RT-PCR competitiva) sino también
de eficiencia de la digestión. La validez técnica de la apro x imación,
se corroboró por la similar cinética de amplificación
del estándar interno y de las dos citocinas mediante
PCR en tiempo real. Un estudio de la inducción de la expresión
de MIP-1β (mediante experimentos de tiempo-re spuesta)
en células U-937 demostró diferencias claras entre
los ARNms de los dos loci indicando que este protocolo puede
contribuir al estudio de la expresión diferencial de productos
génicos similares mediante técnicas disponibles en
la mayoría de los laboratorios.
PALABRAS CLAVE: MIP-1β/ MIP-1α/ Quimiocinas/
RT-PCR semicuantitativa/ Estándar interno.
S E M I Q U A N T I TATIVE ASSESSMENT OF MIP-1α AND MIP-
1β mRNA ISOFORM EXPRESSION BY USING A RECOM-
BINANT COMPETITOR FRAGMENT AND RT- A F L P.
ABSTRACT
Among the broad family of chemotactic cytokines, MIP-1α
and MIP-1β , β-chemokines are of special interest, because of
their central role as chemoattractants for lymphocytes and
m a c rophages, the main cells of the adaptive immune re s p o n s e .
In previous studies, we have found a relationship between tissue
levels of MIP-1α and MIP-1β and clinical diagnosis in autoimmune
thyroid glands. The measurement of these chemokines is
d i fficult because of the existence of diff e rent isotypic forms. Here ,
we present a protocol that, taking advantage of small diff e re nces
in nucleotide sequence, combines RT-PCR and re s t r i c t i o n
with MspI to allow the semiquantitative assessment of mRNAs
f rom the two chemokines. The key feature of our approach is the
i n t roduction of an internal standard common to MIP-1α a n d
M I P - 1β which is co-amplified and contains a MspI re s t r i c t i o n
site. This allows the easy control of both the amplification (competitive
RT-PCR) and the efficiency of the restriction. Real time
PCR experiments demonstrated that the kinetics of the amplifications
of the internal standard of both chemokines were simil
a r, thus validating the approach. A time course of MIP-1βi n d u ction
in U-937 cells showed substantial diff e rences among the
mRNAs derived from the two loci, an indication that this technique
may contribute to study the diff e rential expression of gene
p roducts of similar sequence using techniques available at most
l a b o r a t o r i e s .
KEY WORDS: Chemokines/ MIP-1 . MIP-1 / Chemokines/
Semiquan-titative RT-PCR/ Internal standard.
1
Estos tres autores han contribuido de manera equivalente a la obtención de los resultados presentados, por lo que deberían ser considerados
primeros autores independientemente de la posición que ocupan.

INMUNOLOGÍA P. ADREANI ET AL.
INTRODUCCIÓN
Uno de los elementos definitorios de los procesos
inflamatorios implicados en la mayor
p a rte de las patologías en las que interv i ene
el sistema inmunitario, es el grado y
composición del infiltrado leucocitario. La
migración selectiva de los leucocitos, controla tanto
los procesos de re c i rculación fisiológica continua de
las células del sistema inmunitario, como la llegada
masiva localizada a las zonas lesionadas (inflamación).
En ambos procesos, re c i rculación e inflamación,
intervienen principalmente mecanismos de
adhesión intercelular y del leucocito con la matriz
extracelular (1). En todos estos procesos adhesivos
se utilizan como mediadores moleculares las quimiocinas,
citocinas de pequeño peso molecular que
por su afinidad a la matriz extracelular forman gradientes
de concentración alrededor de las células
p roductoras. Sus similitudes estructurales y funcionales
han llevado a la agrupación de todas estas
pequeñas proteínas bajo el término estructural de
s u p e rfamilia de las quimiocinas.
E n t re las características más relevantes de las
quimiocinas, podríamos decir que son pro t e í n a s
de pequeño tamaño (60-70 aminoácidos, apro x imadamente)
y que se encuentran altamente re l acionadas
en estructura (presentan una homología
de al menos un 25%); así son fundamentales sus 2
p r i m e ros residuos cisteínicos del extremo N-terminal
(2) puesto que son los aminoácidos que permiten
subclasificar esta superfamilia en 4 gru p o s
principales: a) las CXC o α-Quimiocinas que presentan
un aminoácido separando estas 2 primeras
Cisteinas; b) las CC o β- quimiocinas que no presentan
aminoácidos adicionales entre ambas cisteinas
[dentro de este grupo, ha sido identificada
la llamada 6Ckine/SLC, la cual presenta un patrón
inusual de 6 cisteinas en lugar de 4 (3)]; c) las XC
quimiocinas o γ-quimiocinas, que pierden el primer
y tercer residuo de cisteína (4,5) (sólo se ha
descrito la linfotactina en este grupo); y d) las
C X 3C quimiocinas caracterizadas por sus 3 aminoácidos
intercalados entre las 2 cisteínas “clasificadoras”
(6,7) con la fractalcina como re p re s e ntante
único.
En cuanto a sus propiedades biológicas, las quimiocinas
se distinguen por su capacidad de re g ular
la movilidad celular por medio de la unión a
re c e p t o res de membrana que presentan una ciert a
especificidad en el reconocimiento y en su distribución
celular. Su papel en la adhesión es único,
ya que modulan de manera muy precisa las funciones
adhesivas de las células diana, pro m o v i e ndo
la polarización celular (8), la activación funcional
de ciertas moléculas de adhesión (9) e
incluso la inducción de diversos genes efectore s
fundamentales en los mecanismos de adhesión
(10,11). No hay que olvidar que las quimiocinas
d e s a rrollan también efectos más amplios como la
co-estimulación para la proliferación y difere nciación
celular o la definición de patrones de síntesis
de otras citocinas (1,12).
Las quimiocinas actúan, de forma específica y
selectiva sobre las células dianas, a través de sus
re c e p t o res de membrana quienes inducen señales
i n t r a c e l u l a res mediante su acoplamiento a pro t e ínas
G (13,14). Hasta la fecha se han identificado
una veintena de estos re c e p t o res (15-16), aunque,
de acuerdo con evidencias funcionales, contamos
con la existencia de otros re c e p t o res no definidos
molecularmente aún (17).
Estudios recientes de nuestro grupo (7), Ashhab
y cols. in preparation), indican el posible papel de
las β-quimiocinas en los fenómenos autoinmunes,
cosa que coincide con el hecho de que en esta subfamilia
se encuentran las quimiocinas con un mayor
efecto localizador de monocitos y linfocitos (18).
Mediante la aplicación y optimización de la metodología
MOPAC (Mixed Oligonucleotides Primed
Amplification of cDNA) (19), hemos podido demostrar
que en glándulas tiroideas de enfermos de
Graves-Basedow existe una expresión aumentada
de MIP-1α, MIP-1β, MCP-1 y RANTES, mientras
que no se detecta MCP-3. La especial sobre e x p resión
de MIP-1α y MIP-1β en las muestras estudiadas
re a f i rman datos de otros autores que indican la
existencia de factores de regulación conjunta de la
e x p resión de ambas quimiocinas y en concreto en
las enfermedades autoinmunes del tiro i d e s .
N u e s t ro grupo se ha interesado por diversos elementos
de la estructura génica del MIP-1β p u e s t o
que el genoma humano presenta la secuencia no-alélica
de un segundo locus. La existencia de dos loci
para MIP-1β ya había sido postulada por trabajos
p revios (20, 21) donde se les dió el nombre de locus
744,1 (al que llamaremos en este artículo locus A
con la idea de simplificar la terminología) y locus
744,2 (locus B). Aquellos datos basados en estudios
genómicos llevaron a sus autores a sugerir que este
segundo locus podía ser un pseudogén (20), aunque
los trabajos de nuestro grupo (7) indican que el locus
B puede ser codificante. De hecho, esta duplicidad
de loci codificantes para MIP-1β ha sido constada
también para MIP-1α ( S C YA3 y SCYA3L) en la que
el “segundo locus” (SCYA3L, al que también denom
i n a remos a partir de ahora locus B) codifica para
una segunda forma de MIP-1α ( M I P - 1αP o LD78β)
(22). En este trabajo, se expone la apro x i m a c i ó n
metodológica que nos permite valorar la expre s i ó n
de MIP-1α y MIP-1β (tanto del locus A como del
locus B). Esta técnica se ha puesto a punto como
medio para comparar la regulación de la expre s i ó n
de los dos loci de ambas quimiocinas, y para determinar
si contribuyen de forma distinta a los fenómenos
de localización y de modulación de la re s p u e s t a
inmunitaria. Nuestros resultados demuestran la factibilidad
de la aproximación, que se fundamenta en
el uso de un estándar interno como control en una
RT-PCR competitiva y de la discriminación de cada
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DETERMINACIÓN SEMICUANTITATIVA DE LA EXPRESIÓN DE ARNm DE LAS ISOFORMAS DE MIP-1α Y MIP-1β VOL. 20 NÚM. 4 / 2001
uno de los loci de interés gracias al uso de una endonucleasa
de restricción. Esta aproximación metodológica,
debe considerarse como una herr a m i e n t a
simple pero muy útil para la valoración cuantitativa
de la expresión de los ARNm de los loci A y B de las
quimiocinas MIP-1α y MIP-1β.
MATERIAL Y MÉTODOS
Cultivo celular
N u e s t ros estudios se han realizado con ARN de
la línea monocítica U-937 obtenida de la AT C C
(American Tissue Culture Collection). El medio
de cultivo utilizado fue RPMI 1640 suplementado
con 10% FCS y 2 mM L-glutamina (los tres pro d u ctos
de Life Technologies, Merelbeke, Bélgica), además
de gentamicina 40 mM (Sigma, St. Louis, MO,
EE.UU.) y Penicilina 100 UI/ml (Laboratorios Ern ,
B a rcelona, España). Todas las incubaciones y cultivos
se hicieron a 37º C con 5% CO 2 / 95% aire.
Los cultivos se re a l i z a ron en frascos de 75 cm 2
(Costar, Nalge Nunc International, Dinamarca) en
suspensión. Las estimulaciones celulares con
Ionomicina (1µg/ml), LPS (0,1µg/ml) y PMA
(0,1µg/ml) (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) se llevaron
a término a tiempos de 0, 3, 6 y 24 h, respectivamente.
Debido a la inestabilidad intrínseca de
los extremos UA 3’ del ARNm de las quimiocinas,
a g regamos a los cultivos 10 mg/ml de cicloheximida
(Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) 3 h antes de
la recolección para aumentar la estabilidad.
Extracción de ARN
El método empleado fue el descrito pre v i a m e n t e
por Chomczynsky (23) adaptado ligeramente en
n u e s t ro laboratorio. Brevemente, el pellet seco proveniente
de 5.10 6
células cultivadas (y estimuladas),
g u a rdado a –70º C hasta el momento de su utilización,
se homogeneiza agregando 500 µl de solución
de desnaturalización (tiocianato de guanidina 4M;
citrato de sodio 25 mM; 2-β m e rcaptoetanol 0,1M;
N - l a u ro i l s a rcosina 0,5%; antifoam 0,5%) 50 µl acetato
de sodio 2M pH 4 y 500 µl de fenol saturado
con agua, mezclando con vórtex después de la adición
de cada uno de los reactivos. Se incuba en hielo
durante 10 min y se agregan 150 µl de una mezcla
de cloro f o rmo-isoamilalcohol que también se
incuba en hielo por 10 min más. Se centrifuga 20
min a 10.000 rpm (4º C), para separar la fase acuosa
de la orgánica, precipitándola seguidamente con
1 vol de isopropanol (incubación de 1 h a -70º C) y
centrifugando 30 min a 14.000 rpm (4º C). Tras desc
a rtar el sobrenadante, el pellet se resuspende en
300 µl de solución de desnaturalización y 150 µl de
fenol saturado en agua. Se mezcla con un vórt e x ,
a g regando seguidamente 150 ml de una mezcla de
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c l o ro f o rmo-isoamilalcohol. Tras incubar 10 min a
4ºC, se centrifuga a 10.000 rpm durante 20 min
(4ºC), transfiriendo el sobrenadante a otro tubo
donde se re p recipita con 1 vol de acetato potásico y
2 vols de etanol absoluto (post-centrifugación a
14.000 rpm durante 30 min a 4ºC). El pellet obtenido
se lava 3 veces con etanol al 70%, se seca bien
y se resuspende en 20 µl de agua de DEPC (H 2O
destilada tratada 20 h con dietilpiro c a r b o n a t o ,
[Genaxis Botechnology, Saint-Cloud Cedex,
Francia] y posteriormente autoclavada).
La concentración de ARN se determina por
e s p e c t rofotometría a una longitud de onda de 260
nm, evaluando también su pureza (relación entre
las lecturas a 260 y 280 nm; este valor debe encontrarse
entre 1,8 y 2,0 para que podamos considerar
acceptable la extracción). La integridad del ARN se
valora por comparación interna (y con una muestra
de ARN de E. Coli) por medio de un gel de agarosa
teñido con bro m u ro de etidio. Se considera que
el ARN está íntegro, cuando las bandas corre s p o ndientes
a los ribosómicos presentan apro x i m a d amente
una intensidad 2/1 en el ratio 28S/18S.
Tratamiento con DNAsa-I de las preparaciones
de ARN
Para eliminar los residuos de ADN genómico, que
p u d i e ron haber sido extraídos junto con el ARN, las
muestras son tratadas de la siguiente manera: 2µl de
tampón (40mM Tris-HCl pH 7,5; 6mM MgCl 2), 2µl
DNAasaI (Amersham Pharmacia Biotech.
B a rcelona. España), Xml de muestra de ARN y 16-X
µl de H 2O destilada. La mezcla se incuba a 37º C
durante 30 min. Luego se cuantifica nuevamente el
ARN y se re c o m p rueba su integridad. Finalmente,
el ARN se precipita con acetato potásico 3M, glucógeno
20 mg/ml y 1 volumen de isopropanol, lavándolo
con etanol al 75%. El pellet obtenido se diluye
en agua de DEPC y se conserva a -20ºC.
Retrotranscripción
Se desnaturaliza previamente el ARN (1µg diluido
en agua hasta 11,8 ml) incubándolo a 68ºC
durante 5 min. Inmediatamente después se coloca
a 4º C durante 5 min. La reacción de re t ro t r a n s c r i pción
se realiza según las condiciones indicadas por
el proveedor de la Superscript II (Life Te c h n o l o g i e s ,
M e relbeke, Bélgica): 4µl de Tampón de primera
cadena (5X), 1µl de dNTPS (2mM), 2µl DTT
(0,1M), 2µl Oligo-dT24 (500µM), los 11,8µl del
ARN desnaturalizado, 0,5µl RNAsin (40U/µl), y
0,5µl Superscript-II (200U/µl). La reacción se incuba
60 min a 42º C. Para inactivar el proceso las muestras
se calientan hasta 99º C durante 5 min, re e nfriándolas
a 4º C (5 min más). Los 20 µl de re a c c i ó n
se diluyen 4 veces en EE, usando 1µl de este ADNc

INMUNOLOGÍA P. ADREANI ET AL.
diluido para cada 10 µl de reacción de la PCR. To d o s
los reactivos utilizados fueron suministrados por
P romega (Madison, WI, USA) a excepción de la
Superscript-II y su tampón.
RT-PCR. Condiciones generales
Las diversas RT-PCR se han desarrollado bajo las
siguientes condiciones generales de amplificación:
1ml de tampón de PCR (10X, con MgCl2 15 mM);
1µl de mix dNTPs (2mM); 0,5 µl de cebador a n t i s e ns
e (10mµM); 0,5µl cebador antisense (10µM); 2µl
de ADNc; 3µl de H2O. Las muestras se someten a los
cambios de temperatura controlados por el term ociclador
(MJ. Research, modelo Mini Cycler), iniciando
el proceso con un inicio en caliente (H o t
S t a rt) a 80º C, tras lo cual se agregan 500 mU de la
ADN-Polimerasa DynaZyme II (Finnzymes OY-
Finlandia) diluidas en 2µl de agua. Posteriorm e n t e
se aplica el siguiente programa de ciclación: 30 s a
95º C, 30 s a 59º C y 30 s a 72º C, que se repite por
35 ciclos con una extensión final de 5 min a 72º C.
Las secuencias de los cebadores utilizados para la
amplificación de MIP-1α son: Cebador α-S e n s e ⇒
5’ TTCCGTCACCTGCTCAGAAT 3’; Cebador
α-A n t i s e n s e ⇒ 5’ GAAGAGGTA G C T G T G G A G G -
TCAC 3’. Para la amplificación de MIP-1β s o n :
Cebador β-S e n s e ⇒ 5’ CGCAACTTTGTG-GTA-
G AT TA C TAT 3’; Cebador β-A n t i s e n s e ⇒ 5’ AAA-
TA AT G G A A AT G A C A C C TA TA A 3’, todos ellos validadados
en trabajos anteriores de nuestro
l a b o r a t o r i o .
Normalización del ADNc
Para valorar el estado de la muestra y norm a l izar
los resultados a un parámetro común, todas las
muestras fueron amplificadas con cebadores específicos
(Oligo Etc, Wilsonville, OR, USA) para el
gen de la enzima de expresión constitutiva
GAPDH (glutaraldehido-fosfato-deshidro g e n a s a )
diseñados en nuestro laboratorio (24): Cebador
Sense: 5’ CTTCTTTTGCGTCGCCAG 3’; Cebador
A n t i s e n s e: 5’ TCTTCTTTTGCGTCGGCCAG 3’.
Para esta amplificación también se realiza un H o t
S t a rt a 80º C, seguida por 25 ciclos del siguiente
p rograma: 30 s a 94º C, 30 s a 63º C y 30 s a 72º C,
con un extensión final de 5 min a 72º C. La amplificación
se evalua con 5µl del amplímero en un gel
de agarosa al 2% agarosa (Estándar media EEO,
Ecogen, Barcelona, España).
Diseño del Estándar Interno
Para generar el Estándar Interno (EI) se utilizó
una pequeña región del gen de la insulina (zona 3’
no codificante), ya que presenta un tamaño (339 pb)
p a recido al de los amplímeros en estudio [MIP-1a
(404pb) y MIP-1β (316pb), además de presentar en
su secuencia una diana de restricción para la endonucleasa
MspI (CCGG). A partir de los cebadore s
(ILJ3 e ILJ2) utilizados para estudiar el citado fragmento
del gen de la insulina, se diseñaron dos cebad
o res híbridos (IEI1 e IEI2) que manteniendo en 3’
las secuencias de ILJ3 e ILJ2, se les yuxtapuso consecutivamente
en sus extremos 5’ las secuencias de
los cebadores para MIP-1αy para MIP-1β. Para facilitar
su clonación y manipulación, se introdujo también
en estos cebadores híbridos las secuencias diana
de las enzimas de restricción BamHI y NsiI. (Ve r
esquema de la Fig. 1), más 2-3 bases en el extre m o
5’ para que asegurasen una buena eficiencia en la
digestión. Así, IEI1 es el oligonucleótido re s u l t a n t e
de combinar las secuencias de BamHI + β-S e n s e+ α-
S e n s e+ ILJ3, mientras que IEI2 presenta las secuencias
NsiI + β-A n t i s e n s e + α-A n t i s e n s e + ILJ2 (según
d i rección 5’-3’ convencional). En la base del esquema
que se presenta en la figura 1 se detallan las
secuencias concretas de IEI1 e IEI2.
Utilizando los cebadores IE1 e IE2 y las condiciones
optimizadas para la amplificación del gen de la
insulina con ILJ3 e ILJ2 (35 ciclos del siguiente programa:
20 s a 95º C, 30 s a 65º C y 30 s a 72º C, con
un extensión final de 7 min a 72º C) y partiendo de
100 ng de ADN genómico humano, se obtuvo un
a m p l í m e ro de 448 pb. Dicho fragmento se purificó
por electroelución en cámara de Biotrap (Schleicher
& Schuell; Dassel, Germany) tras electro f o resis en
a g a rosa y se clonó por ligación en el vector pZErO-
2 (Invitrogen; Paisley, Scotland). Su fácil cre c i m i e nto
en bacterias permite la obtención de un pre p a r ado
homogéneo que una vez cuantificado posibilita
su utilización como estándar interno en una re a cción
de RT-AFLP (Amplification fragment length polym
o r p h i s m) competitiva.
PCR Semicuantitativa
Debido a la elevada homología existente entre
los locus A y B de las quimiocinas MIP-1α y MIP-
1β a nivel de la secuencia nucleotídica, optamos
por estudiar los niveles de expresión de cada uno
de los loci a través de una RT-PCR competitiva
semicuantitativa, a la que asociamos la capacidad
discriminativa entre loci de los patrones de re stricción
en base a la endonucleasa MspI. MspI es
una enzima de restricción que reconoce la
secuencia CCGG que en el caso de MIP-1α s e
encuentra 3 veces en el producto amplificado del
locus A, pero sólo 1 vez en el locus B; mientras
que en el caso de MIP-1β sólo se encuentra una
única vez presente en la secuencia amplificada
del locus A (ninguna en el locus B). Así, de manera
secuencial utilizamos la siguiente metodología:
Partiendo de 2 µl de ADNc, se añaden a la
reacción 2 µl del Estándar Interno (EI) re c o m b i-
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DETERMINACIÓN SEMICUANTITATIVA DE LA EXPRESIÓN DE ARNm DE LAS ISOFORMAS DE MIP-1α Y MIP-1β VOL. 20 NÚM. 4 / 2001
nante a concentraciones conocidas (en el mismo
tubo). Las amplificaciones de MIP-1α y MIP-1β,
se realizan sobre muestras separadas utilizando
los oligonucleótidos correspondientes. El producto
así obtenido es sometido a digestión (37º
C durante 1h) en tampón (Y +
/ Tango) con 10 U de
la enzima MspI (Fermentas; Vilnius, Lithuania).
P o s t e r i o rmente la definición del patrón de re stricción
se realiza en gel de agarosa al 2 %. La densitometría
de las distintas bandas electro f o r é t icas
permite la cuantificación de las muestras
tanto a nivel relativo (pro p o rción de locus A re specto
a locus B) como absoluto (en relación con
el EI precuantificado). Cabe reseñar aquí, que el
EI no sólo permite controlar la amplificación del
ADNc sino que también a través de su nivel de
digestión (porcentaje de digestión de EI sobre el
no digerido) se obtiene otro parámetro básico en
esta valoración cuantitativa: el control de la
digestión. Este aspecto es fundamental para la
evaluación de MIP-1β, puesto que el locus B, al
no presentar diana de restricción para MspI, puede
confundirse con la parte no digerida del locus
A (las digestiones parciales son habituales) y por
tanto conocer el grado de digestión del EI perm ite
ponderar las cuantificaciones reales de las quimiocinas
de interés.
Real Time PCR
Para comprobar que las cantidades de amplímero
producido por la PCR del EI era equiparables con
las que se producen en la amplificación de las qui-
188
α-s ILJ3 19 b
β-s
20 b
BamHI 24 b
8 b
lEl1
71 b
MspI
Gen Insulina 339 pb
miocinas a estudio, decidimos emplear una apro x imación
basada en la metodología de PCR a tiempo
real (Real Time PCR o rt-PCR). La monitorización
de la rt-PCR se realizó con el fluoro c romo interc alante
SYBRGreen (Roche; Mannheim, Germ a n y )
con el equipo LightCycler® (Roche; Mannheim,
G e rmany). Para ello, utilizamos diluciones seriadas
tanto de amplímeros precuantificados de los loci en
estudio, como del EI (realizando el estudio tres veces
con muestras por duplicado). Los ensayos se desarro
l l a ron bajo los siguientes parámetros: 1µl de la
mezcla de reactivos de rt-PCR 10X (Taq ADN polymerase,
reaction buffer dNTP mix [con dUTP en
lugar de dTTP], SYBR Green I dye y 10 mM MgCl 2) ;
1,2 µl de MgCl 2 25mM (concentración final 4 mM);
0,5 ml de cebador s e n s e (10 µM); 0,5µl cebador
a n t i s e n s e(10 µM); 3 µl de molde-muestra; 4,8 µl de
H 2O. El estudio realizado tanto con MIP-1α c o m o
con MIP-1β, se presenta aquí sólo para MIP-1β.
Las amplificaciones se re a l i z a ron en 35 ciclos
del siguiente programa: 30 s a 95º C, 30 s a 59º C,
30 s a 72º C con una extensión final de 5 min a
72º C. Las lecturas de fluorescencia se re a l i z a ro n
a 72º C en cada ciclo y la evaluación de la temperatura
de fusión de los productos amplificados
durante el período final de desnaturalización entre
45º C y 95º C.
RESULTADOS
lEl2
NsiI
77 b
β-as 9 b
α-as 25 b
23 b
ILJ2 20 b
lEl1: CGGGATCC CGCAACTTTGTGGTAGATTACTAT TTCCGTCACCTGCTCAGAAT TGGAGATGGGTGGGAGTGT
BamHI β-sense α-sense ILJ3
lEl2: CCAATGCAT AAATAATGGAAATGACACCTAATAC GAAGAGGTAGCTGTGGAGGTCAC AGGGCTTTATTCCAT
NsiI β-antisense α-antisense ILJ2
Figura 1. Esquema del estándar interno(EI) utilizado en nuestra aproximación de RT-PCR. En línea gruesa, se pre s e nta
el amplímero del gen de la insulina con el punto de corte para MspI. En trazo más fino asociado al amplímero del gen
de la insulina se re p resentan los cebadores híbridos IEI1 e IEI2, cuya secuencia concreta se precisa en la base del esquema
señalando los nucleótidos correspondientes a las secuencias de los cebadores de la insulina (ILJ3 y ILJ2), MIP-1α (αsense
y α-antisense) y MIP-1β(β-sense y β-antisense) además de las dianas de restricción (BamH1 y NsiI). Las abre v i aturas
b y pb se re f i e ren las longitudes de las diversas regiones expresadas en bases y pares de bases re s p e c t i v a m e n t e .
1. Obtención de un estándar interno co-amplificable
con el ADNc nativo de MIP-1α y MIP-1β c o m o
control de RT-PCR.

INMUNOLOGÍA P. ADREANI ET AL.
La necesidad de controlar el proceso de amplificación
de los loci de MIP-1α y MIP-1β, nos llevó
a diseñar unos cebadores híbridos que tras la
amplificación de un gen no-relacionado nos rind
i e ron un producto de PCR de distinto peso
molecular al de los amplímeros en estudio, pero
que contenía en sus extremos las secuencias de
los cebadores que se pretenden utilizar para
amplificar el ADNc tanto de MIP-α como de MIP-
1β (ver Fig. 1). En el caso de MIP-1α (Fig. 2A),
los productos amplificados en esta RT-PCR competitiva
con los cebadores α-sense y α- a n t i s e n s e
se distinguen por su peso molecular, ya que mientras
el amplímero del gen rinde un producto de
404-407 pb (404 pb según la secuencia de locus
A y 407 pb para el locus B), el producto del amplificado
con el EI es de 382 pb (menor peso molecular
que el gen de interés). En cambio para MIP-
1β (Fig. 2B), la RT-PCR competitiva con los
c e b a d o res β-sense y β-antisense produce sobre el
EI un amplímero de mayor peso molecular (431
pb) que el del MIP-1β (316 pb tanto para locus A
como para locus B). Cabe destacar que en ambos
casos es demostrable durante la reacción de
amplificación la competición entre el ADNc de
interés y el ADN del EI.
→
A. Co-amplificación de E.I.( ) y MIP-1α (→)
–
E.I. 10
cDNA
3
E.I. 10
–
Phix174
RF/Rsal
cDNA
–
3
E.I. 10
cDNA
4
E.I. 10
cDNA
5
Phix174
RF/Rsal
cDNA
B. Co-amplificación de E.I.( ) y MIP-1β ( )
Figura 2. Comparación de las co-amplificaciones de
EI con MIP-1α o MIP-1β de U-937 estimuladas. En A
se muestra la co-amplificación del estándar Intern o
(EI) y el ADNc de MIP-1α donde la banda superior
c o rresponde al amplímero de MIP-1α (404 pb) y la
banda inferior al EI (382 pb). En B se muestra la coamplificación
del EI y el ADNc de MIP-1β, donde la banda
superior corresponde al EI (431 pb) mientras que la
banda inferior corresponde al amplímero del ADNc de
M I P - 1β (316 pb).
2. La PCR competitiva permite la cuantificación
en número de copias del gen de interés.
P a rtiendo de ADNcs, normalizados para GAPDH,
la PCR competitiva permite deducir el número de
copias iniciales (de MIP-1α o MIP-1β) en el ADNc
p roblema, a partir de un número de copias conocidas
en el EI coamplificado. La figura 3 muestra un
ejemplo con una de estas cuantificaciones para MIP-
1β, en una muestra proviniente de células U-937
estimuladas con LPS y tratadas con cicloheximida.
De hecho la metodología atribuye el número de
copias iniciales que la PCR amplifica por comparación
con el número de copias iniciales del EI. Así, en
sentido estricto, sólo si la cantidad del amplímero
obtenido de MIP-1β (que incluye las amplificaciones
de locus A y de locus B) tuviera su concentración
molar igual a la del EI, podríamos deducir que
E.I.
cDNA
40.000
30.000
20.000
10.000
10 5
+
X
10 5
10 4
+
X
10 3
+
10 4 10 3
E.I.
cDNA
cDNA
X
E.I
Copias
Figura 3. Cuantificación de la reacción competitiva. En
el lado izquierdo de la figura se muestra la electro f o resis en
gel de agarosa de una coamplificación del Estándar Intern o
(EI) a concentraciones decrecientes (10 5
, 10 4
y 10 3
) y del
ADNc de las muestras de MIP-1β de U-937 estimuladas
(cantidad fija). En la zona izquierda del lado derecho de la
figura, se muestra la graficación lineal de esta amplificación,
para extrapolar y cuantificar la cantidad de MIP-1β
total de la muestra problema. Para ello se grafican (de
manera logarítmica) las copias iniciales del EI respecto a
las densidades ópticas de sus amplímeros electro f o r é t i c amente
resueltos (unidades arbitrarias) y densitométricamente
evaluados (X de color gris). A partir del valor densitométrico
del ADNc (X de color negro) de la muestra problema
(en su dilución más equivalente a la amplificación
del EI), se extrapola de la gráfica el número de copias iniciales
de la muestra.
189

DETERMINACIÓN SEMICUANTITATIVA DE LA EXPRESIÓN DE ARNm DE LAS ISOFORMAS DE MIP-1α Y MIP-1β VOL. 20 NÚM. 4 / 2001
la concentración inicial también era idéntica.
Cuando los valores no son idénticos (lo habitual),
p rocedemos a graficar la relación que existe entre el
EI y la muestra en la amplificación más semejante
(se grafican los valores densitométricos de las citadas
bandas electroforéticas o si se introduce marc aje
radioactivo la señal radioactiva de dichos amplím
e ros) tal y como se muestra en la figura 3,
deduciendo a partir de la gráfica el número de copias
en el problema. En cualquier caso, la realización del
cálculo de ratios en pro p o rción logarítmica (25) permite
la cuantificación más exacta de los pro d u c t o s
a m p l i f i c a d o s .
3. El estándar interno actúa como control de la
digestión para la evaluación por AFLP posterior de
la pro p o rción de los loci A y B de MIP-1α y
M I P - 1β.
El protocolo de co-amplificación pro p u e s t o
p e rmite, a través de la digestión con MspI, distinguir
el nivel de expresión de los loci A y B tanto
de MIP-1α como de MIP-1β (Fig. 4). Dado que
el EI coamplificado presenta una diana de re s t r i cción,
este estándar nos permite monitorizar esta
digestión al liberar dos fragmentos de re s t r i c c i ó n
de distinto peso molecular (Tabla I). Así tras la
amplificación del ADNc y el EI con los cebadores
de MIP-1α tal y como se ha comentado, se
obtienen dos amplímeros de 404-407 pb por parte
de MIP-1α (404 pb según la secuencia de locus
A y 407 pb para el locus B) y de 382 pb por part e
del EI. La digestión con MspI digiere los 382 pb
del EI en dos fragmentos de 265 y 117 pb que son
p e rfectamente distinguibles de la longitud de los
fragmentos de restricción procedentes de MIP-
1α: 176, 138, 62 y 28 pb por parte del Locus A (4
bandas) y 231 y 176 pb por parte del locus B (2
bandas). Para la amplificación del ADNc y el EI
con los cebadores de MIP-1α, se obtienen un
a m p l í m e ro de 431 pb por parte del EI y otro de
316 pb por parte de MIP-1b. En este caso (Fig. 4),
la digestión con MspI produce fragmentos de 290
y 141 pb provenientes del EI y de 316 (locus B),
190 y 126 pb (correspondientes al locus A) por
lo que se re f i e re a MIP-1β. De hecho es en el estudio
de MIP-1β donde se demuestra la mayor utilidad
del EI como control de la digestión con
MspI, puesto que debido a que la valoración del
locus B es sólo posible por la ausencia de la diana
de MspI en el locus B, es imprescindible un
buen control que permita valorar el nivel de
digestión parcial de la misma. Este nivel de digestión,
calculado como porcentaje de la densidad
restante de la banda de 431 pb respecto a la de
290 pb ponderada por 1,48 (la relación entre las
431 bases y las 290 de ambas bandas), nos permite
re e v a l u a r, con un mayor nivel de pre c i s i ó n ,
la cuantificación densitométrica del locus B, evitando
que se sobre v a l o re su expresión por la prop
o rción de locus A no digerido y a su vez la del
locus A que si no, se vería subvalorado.
190
Estándar Interno
(431 pb)
cDNA
Locus A + Locus B
(316 pb)
No Digerido
Digestivo con Mspl
Digestión parcial E.I.
Locus B (315 pb)
Fragmento 1 Estándar
Interno (290 pb)
Fragmento 1 Locus A
(190 pb)
Fragmento 2 Estándar
Interno (141 pb)
Fragmento 2 Locus A
(126 pb)
Figura 4. Discriminación de los isotipos de MIP-1β.
La figura muestra la resolución electroforética de la
digestión (locus A del MIP-1β y el Estándar Intern o
(EI)) con la enzima de restricción MspI en relación con
la misma muestra sin digerir. El carril izquierdo muestra
el ADNc de MIP-1β y del EI sin digerir, definiéndose
2 bandas: una de 431 pb (correspondiente al EI) y la
otra de 316 pb (que corresponde a los ADNc del locus A
y del locus B). El carril derecho muestra la digestión de
la misma muestra por la enzima MspI, la cual origina
5 bandas: 2 que corresponden al EI (290 pb y 141 pb),
2 al ADNc del locus A (190 pb y 126 pb) y una al ADNc
del locus B (315 pb) que no es digerible por la enzima.
Además se señala con una flecha superior los restos de
EI que permanecen por falta de digestión (digestión
p a rc i a l ) .
Tabla I
Longitud (en pb) de los productos de amplificación
y de los fragmentos de restricción tras
RT-AFLP para MIP-1α y MIP-1β
MIP-1α MIP-1β
Digestión Mspl - + - +
Moldes para PCR
EI 382 431
407 (B) 231 (B)
265 290
117 141
176 (A y B) 316 (B) 316 (B)
cDNA 138 (A) 316 (A) 190 (A)
404 (A) 62 (A) 126 (A)
28 (A)
En la tabla se muestran los pesos moleculares (en pares de bases) de los pro d u ctos
de amplificación con los cebadores específicos para MIP-1α y MIP-1β y de los
subsiguientes fragmentos de restricción obtenidos tras la digestión con Mspl. En
la tabla se separan los productos del EI y de los genes de interés (el molde usado
son los cDNA obtenidos tras re t rotranscripción de los RNA´s extraidos de los
muestras a estudio) aunque en la metodología propuesta los fragmentos de uno
y otro se entremezclan en la electro f o resis convencional sobre gel de agaro s a .
E n t re paréntesis se expresan los loci génicos de los que provienen los amplímeros
y fragmentos discriminados. Las flechas indican la procedencia de los fragm
e n t o s .

INMUNOLOGÍA P. ADREANI ET AL.
4. Uso de la 1a RT-AFLP para la evaluación de la
inducción génica de MIP-1α y MIP-1β.
A partir de la cuantificación densitométrica de los
fragmentos de restricción con MspI, se determ i n a
semicuantitativamente el número de copias trascritas
por el locus A o el locus B de ambas β- q u i m i o c inas,
obteniendo a su vez una información exacta de
la pro p o rción en que ambos loci contribuyen a la síntesis
de cada quimiocina. En la figura 5 se muestra
como esta estrategia aplicada al estudio de MIP-1β
p e rmite discriminar la inducción diferenciable entre
el locus A y el locus B frente a diversos estímulos y
tipos celulares. La figura 5A ejemplifica en uno de
los geles para el estudio de la expresión de MIP-1β
en la línea mielomonocítica U-937 frente a la estimulación
con Ionomicina, LPS y PMA. En la figura
5B, se grafican los resultados densitométricos de este
experimento una vez analizados y ponderados, dis-
A
B
12000
8000
4000
0
PMA
LPS
3h 6h 24h 3h 6h 24h
1. Cuantificación de la expresión
de MIP-1β Locus A
0h 3h 6h 24h
No
estim.
tinguiendo la contribución a la inducción de la
e x p resión de los loci de MIP-1β. De hecho, tanto esta
figura de ejemplo como otros datos propios (en preparación
para su publicación) realizados con esta
estrategia nos han permitido demostrar que los estímulos
inductores actúan a niveles y con cinéticas
muy distintos para locus A y locus B de MIP-1β l o
cual implica diferencias en sus pro m o t o res, que hasta
ahora no han sido estudiados de forma comparativa.
De manera equivalente, la metodología es aplicable
al estudio de los locus A y B de MIP-1α.
5. Comparacación de las cinéticas de la reacción de
amplificación del EI con la de los ADNcs de MIP-1β.
Evaluación conjunta de la cinética de co-amplificación.
Dado que la metodología de la co-amplificación
competitiva respecto a un estándar pre c u a n t i f i c a d o
p resupone que el comportamiento del estándar es
equivalente al del gen que se estudia, planteamos
+ - + - + - + - + - + - + - Dig.Mspl - + - + - +
900
600
300
MIP-1β
GAPDH
0
2. Cuantificación de la expresión
de MIP-1β Locus B
0h 3h 6h 24h
PMA LPS Ionom. No estim.
lonomicina
3h 6h 24h
Figura 5. Análisis semicuantitativo de MIP-1β tras la estimulación de células U-937. En A se muestra la resolución elect
roforética de la cinética (situación basal, 3h, 6h y 24h post-estímulo) de inducción de la expresión tanto del locus A como del
locus B del MIP-1β tras la estimulación de la línea celular U-937 con PMA, LPS e Ionomicina. También se muestra la digestión
(+) y la no digestión (-) con la enzima MspI en cada uno de los casos. Las muestras fueron normalizadas previamente con
GAPDH (imagen inferior de la figura). En B se re p resentan las cuantificaciones normalizadas de la expresión del MIP-1β t a n t o
del locus A (lado izquierdo) como del locus B (lado derecho) tras las citadas estimulaciones con PMA, LPS e Ionomicina.
191

DETERMINACIÓN SEMICUANTITATIVA DE LA EXPRESIÓN DE ARNm DE LAS ISOFORMAS DE MIP-1α Y MIP-1β VOL. 20 NÚM. 4 / 2001
analizar la veracidad de esta afirmación mediante
el uso de la PCR en tiempo real (rt-PCR). Para ello,
comparamos las cinéticas de amplificación de los
ADNcs de los genes a estudio respecto al EI, mediante
la monitorización continuada que ofrece la rt -
PCR. Concretamente, la figura 6 muestra las curv a s
de amplificación para los cebadores de MIP-1β a p l icados
a amplímeros de MIP-1β ( p recuantificados y
diluidos hasta 10 7
y 10 6
copias iniciales) en re l a c i ó n
a las curvas del EI que hemos desarrollado (precuantificados
y diluidos a 3x10 7
, 10 6
y 10 5
c o p i a s
iniciales). Las curvas de amplificación del EI, si bien
no son idénticas a las propias del MIP-1β, sí que son
globalmente equiparables, en especial las pendientes
de las mismas que definen la eficiencia de amplificación
y por tanto la cantidad de copias del molde
de partida. De hecho, el estudio demostró que esta
similitud de comportamiento se produce especialmente
en el rango de 10 7
- 1 0 5
copias iniciales. Por
debajo y por encima de ello existe una mayor divergencia
entre el EI y el producto normal (datos no
mostrados). En cualquier caso, estos resultados nos
demuestran que el EI puede considerarse una aproximación
absolutamente aceptable en la evaluación
semicuantitativa de la expresión de los transcritos
de los genes de MIP-1β.
DISCUSIÓN
Los resultados presentados muestran que el
d e s a rrollo y uso del fragmento competidor
recombinante (EI) permite la valoración semi-
192
35,0
32,5
30,0
27,5
25,0
22,5
20,0
17,5
15,0
12,5
10,0
7,5
5,0
2,5
0,0
-2,5
3x10 7 EI
10 7 MIP-1β
Cycle Number
cuantitativa por RT-PCR del ARNm de las quimiocinas
MIP-1α y MIP-1β, de manera sencilla y
fiable. Conceptualmente, el interés real de esta
a p roximación radica en el estudio de las funciones
de las quimiocinas, al quedar bien establecido
que su expresión define la localización de las
células inmunitarias y, por tanto, el funcionamiento
del sistema inmunitario (26) y de los
ó rganos linfoides (27-28), en situaciones fisiológicas
y patológicas (29-30). Su valoración en
todas estas condiciones, a menudo re q u i e re de la
evaluación de los ácidos nucleicos codificantes.
La cuantificación de los transcritos es necesaria
en las quimiocinas inducibles, como MIP-1α y
M I P - 1β, en las que se conoce que los cambios
relativos se relacionan con comport a m i e n t o s
funcionales distintos (31). El uso de la RT- P C R
sin duda posibilita esta evaluación, aunque la
diversidad de comportamiento de la PCR en las
diversas circunstancias de los ensayos y su cinética
que converge hacia la meseta de máxima
amplificación hacen necesario el uso de controles
del proceso. Existen diversas apro x i m a c i o n e s
para controlar el proceso, pero hasta la re c i e n t e
i rrupción de la PCR en tiempo real, el uso de cont
roles internos (en cada tubo de amplificación)
se ha demostrado como la mejor apro x i m a c i ó n
metodológica.
La existencia de 4 loci genéticos codificantes
(locus A y locus B) de MIP-1α y MIP-1β obliga a
diseñar estrategias para su análisis por separado si
se desea estudiar su contribución individual al conjunto.
Dada la gran similitud entre estas isoform a s
10 6 EI
10 5 MIP-1β
10 6 MIP-1β
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
Figura 6. Comparación de cinéticas de amplificación del EI o fragmento competidor respecto al ADNc de MIP-1β. Se
p resentan las curvas obtenidas por rt-PCR (PCR a tiempo real) que muestran cinéticas de amplificación tanto del MIP-1β
como del EI. Las curvas corresponden a las amplificaciones de las diferentes diluciones del EI (3x10 7
, 10 6
, y 10 5
copias), y
de amplímeros pre-cuantificados de MIP-1β ( 1 0 7
, y 10 5
copias). Merece la pena observar que las cinéticas, si bien no son
idénticas, sí que pueden considerarse equivalentes, en especial respecto a las pendientes de amplificación de las mismas.

INMUNOLOGÍA P. ADREANI ET AL.
(los mensajeros no sólo son prácticamente iguales
en cuanto a longitud, sino que incluso las secuencias
son más de un 99% homólogas), este estudio
re q u i e re la combinación de otra metodología que
se añade a la simple RT-PCR. En nuestro caso, planteamos
como estrategia metodológica el uso de
MspI que posibilita la discriminación de ambos loci
por la longitud de los fragmentos de restricción de
los amplímeros (RT-AFLP). Para poder cuantificarlos,
hay que controlar los dos parámetros que
podrían introducir más variaciones en este doble
p roceso: la diversidad de la cinética de amplificación
del ADNc y la eficiencia de la digestión con
MspI. Con este objetivo, de nuevo el EI será una
h e rramienta imprescindible puesto que permite a)
c o n t rolar la eficiencia de la digestión con la citada
endonucleasa sobre cada tubo, distinguiendo los
fragmentos no digeridos (no presentan esta diana),
y b) recuantificar de manera precisa los valores calculados
por densitometría. De hecho en el caso
c o n c reto de MIP-1β, los loci A y B presentan una
homología muy elevada en su secuencia codificante
(ADNc), aunque difieren en algunas bases. Esta
d i f e rencia es clave para la identificación de cada
locus al utilizar la enzima MspI que reconoce la
secuencia CCGG, presente sólo en el locus A (el
locus B presenta la secuencia CTGG). Cuando se
p roduce el corte, se generan 2 fragmentos en el
locus A; mientras que el locus B queda intacto.
Estos fragmentos son perfectamente visualizables
en un gel de agarosa. Merece la pena destacar aquí,
que en algunos casos también se puede distinguir
una forma truncada del locus B, que presenta 15 pb
menos (datos no mostrados).
Esta aproximación metodológica se demuestra
simple y útil para el estudio de la expresión de las
quimiocinas MIP-1α y MIP-1β, aunque pre s e n t a
algunas limitaciones que podrían cuestionar su
exactitud. Por un lado, tal y como se describe, se
trata de una estrategia que más que cuantitativa
debe adjetivarse como semi-cuantitativa (y así se
cataloga a lo largo del trabajo) El prefijo semi- debe
aplicarse porque los valores de copias iniciales de
transcrito no son absolutos, ya que no se corre l acionan
exactamente con los ARNm de partida. El
c o n t rol que aporta el EI se aplica a partir del ADNc,
por lo que no monitoriza los procesos pre v i o s
(específicamente la extracción de ARN desde las
células y la posterior re t rotranscripción). Si bien
no resulta demasiado atrevido asumir eficiencias
equivalentes para estos procesos previos a la amplificación,
en sentido estricto sería conveniente
i n t roducir el control desde la extracción. Para ello
bastaría con transcribir el EI in vitro a partir del plásmido
recombinante (aprovechando para ello la
secuencia promotora Sp6 del pZErO-2), cuantificar
el ARN producido y añadirlo a la concentración
adecuada en el mismo momento de la extracción.
De este modo, este EI en forma de ARNm controlaría
la eficiencia de todo el proceso. Es obvio que
esta estrategia aunque más precisa, resulta técnicamente
más compleja y delicada, y si bien puede
ser requerida en determinadas aplicaciones (por
ejemplo evaluación de cargas virales para viru s
ARN), en general no suele exigirse en el estudio de
la expresión de genes eucariotas, asumiendo que
la aplicación de un control a partir de la PCR permite
obtener resultados que “sólo pueden considerarse
semicuantitativos” (como es nuestro caso).
En este sentido, el uso de un EI competidor (incluso
en forma de ARN) de distinto peso molecular
p resupone que éste mantiene la misma eficiencia
de amplificación que el ADNc de interés. Y de nuevo
esta presunción, si bien en general es aceptable,
en sentido estricto es como mínimo imprecisa. De
hecho, nuestros resultados (Fig. 6) demuestran
esta imprecisión, puesto que las diferencias de
secuencia de los moldes (en este caso debido al distinto
peso molecular) influyen en la eficiencia de
la amplificación. Por ello, se diseñan EI de peso
molecular muy similar al del producto a estudio,
p refiriendo usar en general, estándares internos de
mayor peso molecular (como MIP-1β) que de
menor peso (como MIP-1α). Con ello, se busca
s o b reestimar el gen de interés (en general los amplím
e ros de menor peso molecular se amplifican
mejor), evitando la infravaloración que un EI
menor que el gen de interés pudiera producir al
competir con mayor eficiencia.
Todas estas limitaciones conceptualmente se
evitan con la aplicación de la RT-PCR a tiempo re a l ,
puesto que el seguimiento continuo de la re a c c i ó n
que permiten estos equipos hace innecesaria la
i n t roducción de un EI de distinto peso en la muestra.
En la rt-PCR, son los parámetros de la cinética
de amplificación (pendiente, señal de fondo, meseta
final, etc.) los que permiten asegurar la cuantificación
por comparación respecto a muestras previamente
cuantificadas que se amplifican en
reacciones simultáneas (e incluso pre v i a m e n t e
almacenadas). Es posible que en aras de una máxima
precisión fuera aconsejable cuantificar globalmente
MIP-1α o MIP-1β por rt-PCR, añadiendo a
posteriori el EI amplificado para que controlara el
nivel de eficacia de la digestión, perm i t i é n d o n o s
así definir la contribución de cada loci a esta cantidad
global de CC-quimiocinas. En cualquier caso,
n u e s t ros resultados con rt-PCR, confirman que la
a p roximación más clásica con el EI parece pro p o rcionar
resultados globalmente equiparables a los
de la rt-PCR y por lo tanto igualmente aceptables,
lo cual sin duda es importante dado que los equipos
de PCR en tiempo real todavía no están disponibles
más que en contados centros. El desarro l l o
p ropuesto se ha diseñado para evaluar pre f e re n t emente
la expresión de los loci A y B de MIP-1β, más
que de los correspondientes de MIP-1α. De hecho
los loci de MIP-1β son mucho más homólogos
e n t re ellos que las secuencias de las isoformas de
M I P - 1α, para las que otras estrategias más simples
193

DETERMINACIÓN SEMICUANTITATIVA DE LA EXPRESIÓN DE ARNm DE LAS ISOFORMAS DE MIP-1α Y MIP-1β VOL. 20 NÚM. 4 / 2001
pueden ser tanto o más útiles. En cualquier caso,
este artículo no pretende definir las peculiaridades
de regulación de ambos loci de MIP-1β, sino ilustrar
la fiabilidad de la metodología desarro l l a d a .
Así pues, en resumen, este trabajo permite afirm a r
que a través de nuestra aproximación es posible
cuantificar de una manera fácil, rápida y económica
la cantidad de mensajero de MIP-1α y MIP-1β,
definiéndose además la participación en esta expresión
de los transcritos codificados por el locus A y
los codificados por el locus B.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha podido ser realizado gracias a la
financiación del Fondo de Investigaciones
Sanitarias (FIS99/1063). Agradecemos especialmente
al Dr. Yaqoub Ashhab y al Dr. Orlando
Domínguez, quienes habiendo realizado trabajos
previos en nuestro laboratorio nos abrieron la línea
de investigación que ha condicionado y guiado el
d e s a rrollo del trabajo presentado en nuestro art ículo.
También quisiéramos extender nuestro agradecimiento
a Pilar Armengol, por su orientación
durante el desarrollo del trabajo, así como su
paciencia y dedicación.
CORRESPONDENCIA:
Manel Juan i Otero
Unitat d´ Immunologia, Lirad-CTBT
Hospital Universitari Germans Trias i Pujol
Ctra. Canyet s/n. P.O. BOX 72
08916 Badalona (Barcelona). España
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