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TEMARIO DE T.E.L.<br />
TEMARIO<br />
TÉCNICOS ESPECIALISTAS EN<br />
LABORATORIO<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
TEMA 1.- GASES SANGUÍNEOS<br />
BASES FISIOLÓGICAS BÁSICAS<br />
La función básica <strong>de</strong>l pulmón es la <strong>de</strong> intercambiar gases. La medición <strong>de</strong> ellos<br />
en sangre arterial, es por lo tanto una buena guía para conocer el estado <strong>de</strong>l<br />
funcionamiento pulmonar.<br />
En cada inspiración, el oxígeno atmosférico llega a los alvéolos pulmonares,<br />
<strong>de</strong>s<strong>de</strong> allí, por difusión, llega a la sangre. Para transportar el oxígeno, se utiliza la<br />
hemoglobina, presente <strong>de</strong> forma abundante en los eritrocitos. Su existencia<br />
permite transportar <strong>de</strong> 30 a 100 veces más oxígeno <strong>de</strong>l que se pudiera<br />
transportar disuelto en sangre.<br />
Como la presión parcial <strong>de</strong>l oxígeno en los alvéolos, es mayor que en el resto <strong>de</strong>l<br />
pulmón, por gradiente <strong>de</strong> presión, el oxígeno pasa <strong>de</strong>s<strong>de</strong> los alvéolos a los<br />
capilares sanguíneos. Las arterias, transportan el oxígeno hasta las células<br />
don<strong>de</strong> la pO2 es menor que en la sangre arterial, produciéndose difusión en<br />
sentido a favor <strong>de</strong> las células.<br />
Con el dióxido <strong>de</strong> carbono, ocurre justamente el proceso contrario, los gradientes<br />
<strong>de</strong> presión, lo van llevando <strong>de</strong>s<strong>de</strong> las células hasta el alvéolo, don<strong>de</strong> es<br />
expulsado en cada espiración.<br />
Los procesos metabólicos, por su parte producen gran<strong>de</strong>s cantida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> ácidos<br />
y <strong>de</strong> dióxido <strong>de</strong> carbono; los volátiles son eliminados por el pulmón, pero los no<br />
volátiles son transportados por la sangre hasta el lugar <strong>de</strong> su eliminación, y dada<br />
su naturaleza, son capaces <strong>de</strong> alterar el equilibrio ácido-base y el pH sanguíneo.<br />
La gasometría arterial permite medir el intercambio <strong>de</strong> O2 y <strong>de</strong> CO2 entre el<br />
pulmón y la sangre, y también el estado <strong>de</strong>l equilibrio ácido-base <strong>de</strong>l organismo.<br />
La medición <strong>de</strong>l pH, pO2, y pCO2 en sangre arterial es imprescindible en el<br />
diagnóstico y control <strong>de</strong> la insuficiencia respiratoria.<br />
TRANSPORTE DE GASES POR LA SANGRE.<br />
TRANSPORTE DE OXÍGENO<br />
El 97% <strong>de</strong>l oxígeno presente en sangre se transporta en combinación con la<br />
hemoglobina, solo el 3% <strong>de</strong>l oxígeno sanguíneo se transporta en el plasma y en<br />
el citoplasma <strong>de</strong>l eritrocito<br />
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La curva <strong>de</strong> disociación <strong>de</strong> la oxihemoglobina en sangre presenta forma<br />
sigmoidal. Si la curva es modificada hacia la <strong>de</strong>recha, la hemoglobina pier<strong>de</strong><br />
afinidad por el oxígeno y necesita una mayor pO2 para llegar a saturarse.<br />
Son factores que modifican la curva hacia la <strong>de</strong>recha:<br />
• El aumento <strong>de</strong> la temperatura.<br />
• El aumento <strong>de</strong> la pCO2.<br />
• La disminución <strong>de</strong>l pH.<br />
• La altura.<br />
Si la curva se modifica hacia la izquierda, la afinidad <strong>de</strong> la hemoglobina por el<br />
oxígeno está aumentada y se llega a la saturación con una menor pO2.<br />
La cantidad <strong>de</strong> oxígeno unido a la Hb, no solo <strong>de</strong>pen<strong>de</strong> <strong>de</strong> la pO2, sino <strong>de</strong> otros<br />
muchos factores entre los que <strong>de</strong>stacan, la pCO2, el pH, los fosfatos, y la altura.<br />
TRANSPORTE DE CO2<br />
La sangre transporta dióxido <strong>de</strong> carbono en las siguientes formas:<br />
• 70 % en forma <strong>de</strong> anión bicarbonato.<br />
• 7 % disuelto en plasma.<br />
• 23 % en forma <strong>de</strong> carbamilo-hemoglobina unido a proteínas plasmáticas.<br />
RECOGIDA DEL ESPÉCIMEN<br />
Existen varios tipos <strong>de</strong> recipientes recomendados para la recogida <strong>de</strong> sangre<br />
arterial. Uno <strong>de</strong> los preferidos es la jeringa <strong>de</strong> vidrio, que <strong>de</strong>be ajustar<br />
perfectamente con su émbolo. Se introduce en la jeringa aproximadamente 1 ml<br />
<strong>de</strong> heparina, con la que se lubrifica el recipiente y posteriormente es expulsada.<br />
De esta forma queda el espacio muerto lleno <strong>de</strong> heparina. La aguja a utilizar<br />
pue<strong>de</strong> ser <strong>de</strong>l calibre 23 o superior, la jeringa <strong>de</strong> vidrio presenta los<br />
inconvenientes <strong>de</strong> su alto coste inicial, la facilidad <strong>de</strong> rotura y la necesidad <strong>de</strong><br />
esterilización.<br />
Otros recipientes <strong>de</strong> recogida, cada vez más utilizados son las jeringas <strong>de</strong><br />
plástico <strong>de</strong>sechables, y los tubos <strong>de</strong> vacío. Las jeringas <strong>de</strong> plástico <strong>de</strong>sechable<br />
presentan sobre las <strong>de</strong> cristal las ventajas, <strong>de</strong> no ser frágiles, no necesitar<br />
esterilización, son baratas y presentan perfecto ajuste émbolo-cuerpo <strong>de</strong> la<br />
jeringa.<br />
En cuanto a los tubos <strong>de</strong> vacío existen distintas opiniones, para muchos autores<br />
(la mayoría) pue<strong>de</strong>n producir alteraciones en la presión parcial <strong>de</strong> los gases<br />
como consecuencia <strong>de</strong> la succión que ejercen. Otros autores los <strong>de</strong>finen como<br />
recipientes satisfactorios.<br />
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La sangre venosa, más fácil <strong>de</strong> obtener, pue<strong>de</strong> dar valores correctos <strong>de</strong> pH<br />
aunque los dará incorrectos para la pCO2 alveolar y la saturación <strong>de</strong> oxígeno<br />
arterial.<br />
La sangre capilar arterializada, como la obtenida <strong>de</strong>l <strong>de</strong>do se pue<strong>de</strong> emplear<br />
para <strong>de</strong>terminar pH y pCO2, pero no para la pO2.<br />
MANIPULACIÓN<br />
Una vez, extraída la sangre, la jeringa es el recipiente <strong>de</strong>finitivo. Para cerrarla<br />
herméticamente, se suele pinchar en un corcho. No se <strong>de</strong>be doblar la aguja, ya<br />
que presenta un riesgo innecesario y no se asegura el cierre hermético, (se le<br />
<strong>de</strong>ben eliminar las burbujas <strong>de</strong> aire, previamente).<br />
Debe ser colocada rápidamente en un recipiente con hielo o en agua helada,<br />
para evitar el consumo <strong>de</strong> oxígeno y la liberación <strong>de</strong> dióxido <strong>de</strong> carbono. No<br />
<strong>de</strong>be nunca transportarse a temperatura ambiente.<br />
La muestra <strong>de</strong> sangre arterial no necesita ninguna manipulación, el estudio <strong>de</strong><br />
gases se realiza en sangre completa, solo hay que realizar el análisis en los<br />
primeros 15 minutos, pues una mayor conservación podría modificar los gases<br />
disueltos.<br />
La <strong>de</strong>terminación es muy <strong>de</strong>licada y pue<strong>de</strong> ser influida por:<br />
• El número <strong>de</strong> leucocitos.<br />
• La temperatura.<br />
• El manejo ina<strong>de</strong>cuado.<br />
• El tiempo.<br />
VALORES CRÍTICOS<br />
OXÍGENO<br />
La cantidad <strong>de</strong> oxígeno presente en sangre, al igual que la <strong>de</strong> CO2, suele<br />
expresarse en unida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> presión parcial. La pO2 mi<strong>de</strong> la cantidad <strong>de</strong> oxígeno<br />
que pasa <strong>de</strong>l pulmón a la sangre y hay varios factores que pue<strong>de</strong>n afectarla<br />
como:<br />
• La correcta circulación sanguínea.<br />
• La capacidad pulmonar.<br />
• El estado <strong>de</strong>l aparato respiratorio.<br />
Los valores <strong>de</strong> referencia <strong>de</strong> pO2, están influenciados, por lo tanto por todos<br />
estos factores, pero en general:<br />
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• Para jóvenes adultos 80 mm Hg. es el límite inferior.<br />
• Para individuos <strong>de</strong> edad avanzada 70 mm <strong>de</strong> Hg. es el límite inferior.<br />
Anoxia es el término general para la oxigenación insuficiente, hipoxemia es la<br />
oxigenación <strong>de</strong>ficiente <strong>de</strong> la sangre y anoxemia u anoxihemia es la disminución<br />
<strong>de</strong>l oxígeno en sangre.<br />
Cualquier grado <strong>de</strong> hipoxemia pue<strong>de</strong> ser compensado temporalmente por el<br />
organismo, pero la privación total <strong>de</strong> oxígeno lleva a la muerte en pocos minutos<br />
al no poseer el organismo reserva alguna. Se han <strong>de</strong>scrito casos <strong>de</strong><br />
supervivencia con pO2 <strong>de</strong> solo 7.5 mm <strong>de</strong> Hg.<br />
DIÓXIDO DE CARBONO<br />
El CO2 es transportado <strong>de</strong>s<strong>de</strong> los tejidos hasta los pulmones, don<strong>de</strong> es<br />
expulsado a través <strong>de</strong> la respiración. Con la pCO2 se refleja la eficacia <strong>de</strong> la<br />
excreción pulmonar y la cantidad <strong>de</strong> CO2 generado por el metabolismo. Los<br />
valores normales <strong>de</strong> pCO2 en sangre arterial son <strong>de</strong> 32 a 45 mm <strong>de</strong> Hg.<br />
HIPOCAPNIA<br />
Es la disminución <strong>de</strong> CO2 en sangre por <strong>de</strong>bajo <strong>de</strong> los valores normales, pue<strong>de</strong><br />
ser consecuencia <strong>de</strong>:<br />
• Fallo en el hígado.<br />
• Shock séptico y hemorrágico.<br />
• Lesión craneal.<br />
• Septicemia.<br />
HIPERCAPNIA<br />
Es el aumento <strong>de</strong> CO2 en sangre por encima <strong>de</strong> los valores normales, pue<strong>de</strong> ser<br />
consecuencia <strong>de</strong>:<br />
• Asma.<br />
• Enfisema.<br />
• Bronquitis crónica.<br />
La relación entre los gases presentes en el pulmón por ventilación y los que<br />
existen en sangre se representa por V/Q y recibe el nombre <strong>de</strong> cociente <strong>de</strong><br />
ventilación-perfusión.<br />
La pO2 arterial disminuye, a la vez que la pCO2 aumenta, en los siguientes<br />
casos:<br />
• Hipoventilación.<br />
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• Desigualdad V/Q.<br />
• Defectos <strong>de</strong> difusión.<br />
ESTUDIO ANALÍTICO<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
Para medir la pCO2 se emplea el electrodo <strong>de</strong> Severinghaus. Se trata <strong>de</strong> un<br />
electrodo <strong>de</strong> pH ro<strong>de</strong>ado <strong>de</strong> una solución electrolítica que está separada <strong>de</strong> la<br />
sangre por una membrana permeable al CO2. El material que compone la<br />
membrana suele ser caucho, teflón o silicona. El pH <strong>de</strong> la solución <strong>de</strong>pen<strong>de</strong> <strong>de</strong> la<br />
pCO2 en equilibrio con la sangre.<br />
Para <strong>de</strong>terminar la pO2 se emplea el método <strong>de</strong>l electrodo polarigráfico <strong>de</strong> Clark<br />
para el oxígeno. Consiste en una solución electrolítica <strong>de</strong> CLK que sumerge<br />
ánodo y cátodo, separada <strong>de</strong> la sangre por una membrana.<br />
En este sistema se aplica un voltaje <strong>de</strong> polarización constante al ánodo <strong>de</strong> platacloruro<br />
<strong>de</strong> plata, y al cátodo, <strong>de</strong> alambre <strong>de</strong> platino. El oxígeno se reduce en el<br />
electrodo y su reducción, modifica el potencial eléctrico, en forma proporcional a<br />
la velocidad <strong>de</strong> reducción. Esta última, claro está, varía en función <strong>de</strong> la tensión<br />
<strong>de</strong> oxígeno presente en la sangre.<br />
Los electrodos <strong>de</strong>l pO2 y <strong>de</strong>l pCO2, <strong>de</strong>ben ser calibrados previamente con un gas<br />
o un líquido <strong>de</strong> presión parcial <strong>de</strong> oxígeno conocida.<br />
INTERPRETACIÓN<br />
La gasometría arterial pue<strong>de</strong> indicar ciertas anomalías, pero no su grado <strong>de</strong><br />
anormalidad, ni tampoco son suficientes para un diagnóstico etiológico<br />
específico. Por ejemplo, pue<strong>de</strong> presentar los mismos valores <strong>de</strong> gases en sangre<br />
una persona con obstrucción crónica <strong>de</strong> las vías respiratorias que un cardiaco<br />
con e<strong>de</strong>ma pulmonar, un asmático que un paciente con neumonía.<br />
EQUILIBRIO ÁCIDO-BASE<br />
Los ácidos son productos que pue<strong>de</strong>n ser ingeridos directamente en la dieta, o<br />
producidos endógenamente por el metabolismo (oxidación <strong>de</strong> lípidos, oxidación<br />
<strong>de</strong> aminoácidos, etc.). Los ácidos volátiles como el H2CO3, pue<strong>de</strong>n ser<br />
eliminados por el pulmón en forma <strong>de</strong> CO2, pero los ácidos no volátiles, no<br />
pue<strong>de</strong>n ser eliminados por el pulmón, y <strong>de</strong>ben excretarse a través <strong>de</strong> la orina.<br />
El organismo, necesita por lo tanto, <strong>de</strong> mecanismos capaces <strong>de</strong> mantener<br />
constante el pH <strong>de</strong> los líquidos intra y extra celulares (<strong>de</strong> 7.35 a 7.45), sin que se<br />
altere por la presencia <strong>de</strong> esos ácidos. Esto se consigue con la presencia <strong>de</strong><br />
tampones (ácidos débiles en solución con su base conjugada, capaces <strong>de</strong><br />
mantener el pH en pequeños márgenes <strong>de</strong> variación).<br />
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El principal tampón extracelular es el bicarbonato, seguido <strong>de</strong> la hemoglobina,<br />
las proteínas plasmáticas y el fosfato, todos ellos actúan <strong>de</strong> forma instantánea en<br />
la reducción <strong>de</strong>l pH pero el equilibrio ácido - base final, lo realizan las células<br />
tubulares renales.<br />
ACIDOSIS<br />
Se produce cuando existe disminución <strong>de</strong>l pH sanguíneo. Pue<strong>de</strong> estar originado<br />
por:<br />
• Acúmulo <strong>de</strong> CO2 en el organismo “acidosis respiratoria“. Como<br />
consecuencia <strong>de</strong> una hipoventilación. Los riñones intentan<br />
compensarlo.<br />
• Acúmulo <strong>de</strong> ácidos fijos, como el CO2 total y tampón, es una “acidosis<br />
metabólica”. En este caso, la frecuencia respiratoria se aumenta para<br />
intentar compensarlo. Aparece en casos <strong>de</strong> shock, uremia, ingestión<br />
<strong>de</strong> tóxicos, etc.<br />
ALCALOSIS<br />
Ocurre cuando el pH sanguíneo es superior a 7.45.<br />
• Alcalosis respiratoria. Ocurre secundariamente a una hiperventilación,<br />
como consecuencia <strong>de</strong>l aumento <strong>de</strong> la concentración <strong>de</strong> la pCO2 en<br />
sangre. Los riñones intentan compensarla, disminuyendo la secreción<br />
<strong>de</strong> ácidos fijos, o la reabsorción <strong>de</strong>l CO3H -<br />
• Alcalosis metabólica. Aparece cuando existen perdidas <strong>de</strong> ácidos fijos<br />
o ganancia <strong>de</strong> bases. Se pue<strong>de</strong> <strong>de</strong>ber a vómitos prolongados,<br />
aspiración nasogástrica, o ingestión excesiva <strong>de</strong> antiácidos, aunque<br />
también aparece asociado al síndrome <strong>de</strong> Cushing, o el<br />
hiperaldosteronismo. Se intenta compensar disminuyendo la<br />
frecuencia respiratoria.<br />
pH SANGUÍNEO<br />
Po<strong>de</strong>mos <strong>de</strong>finir el pH como el logaritmo negativo <strong>de</strong> la concentración <strong>de</strong><br />
protones. Sus valores normales se ven afectados por la presencia <strong>de</strong> sustancias<br />
ácidas o básicas en sangre y es <strong>de</strong> suma importancia mantenerlo <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> unos<br />
márgenes concretos para evitar importantes modificaciones <strong>de</strong> todos los<br />
procesos metabólicos, <strong>de</strong> ahí la importancia <strong>de</strong> los tampones.<br />
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MÉTODOS ANALÍTICOS DE MEDIDA DEL pH<br />
Para <strong>de</strong>terminar el pH se utiliza sangre total o plasma, siendo a<strong>de</strong>cuada para ello<br />
tanto la sangre arterial, como la venosa, o la capilar. Normalmente el pH venoso<br />
es 0.0003 unida<strong>de</strong>s menor que el arterial.<br />
Cuando intentamos medir el pH en el laboratorio, es muy importante tener en<br />
cuenta:<br />
• Almacenar las muestras en frío, pues a temperatura ambiente se<br />
agilizan los procesos metabólicos como la glucólisis que producen<br />
ácidos y disminuyen los valores <strong>de</strong>l pH.<br />
• Añadir a las muestras fluoruro sódico para evitar la actividad glucolítica<br />
<strong>de</strong> los leucocitos.<br />
• Es preferible añadir plasma, pues la actividad anhidrasa carbónica <strong>de</strong><br />
los eritrocitos, también modifica el pH.<br />
• No utilizar oxalatos como anticoagulantes, pues aumentan el pH, ni<br />
tampoco citrato o EDTA, pues lo disminuyen, es preferible heparina.<br />
MÉTODOS ELECTROMÉTRICOS<br />
Para medir el pH se usa un sistema <strong>de</strong> electrodo <strong>de</strong> vidrio, el cual presenta dos<br />
partes:<br />
• El electrodo <strong>de</strong> referencia o <strong>de</strong> calomelanos.<br />
• El electrodo <strong>de</strong> vidrio.<br />
El electrodo <strong>de</strong> referencia, mantiene un potencial constante, y el <strong>de</strong> vidrio<br />
<strong>de</strong>sarrolla un potencial proporcional a la concentración <strong>de</strong>l ión hidrógeno en la<br />
solución problema. La sangre total o el plasma problema, se colocan a un lado<br />
<strong>de</strong> la membrana <strong>de</strong> cristal, y al otro se coloca una solución estándar son<br />
concentración <strong>de</strong> hidrogeniones conocida.<br />
La técnica se basa en medir el potencial creado a través <strong>de</strong> la membrana que<br />
separa ambas concentraciones con concentración <strong>de</strong> hidrogeniones <strong>de</strong>sigual.<br />
MÉTODOS DE TITULACIÓN<br />
Son poco utilizados. Para evaluar el equilibrio ácido-base, hay que cuantificar no<br />
solo el pH, sino:<br />
• La pCO2.<br />
• La pCO2 total.<br />
• El exceso <strong>de</strong> base.<br />
Todo esto nos dará información para evaluar el equilibrio ácido-base e i<strong>de</strong>ntificar<br />
las causas <strong>de</strong> las posibles alteraciones.<br />
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TEMA 2. IONOGRAMA. ESTUDIO<br />
ANALÍTICO<br />
CONCEPTO.<br />
Los electrolitos son iones que existen normalmente en los líquidos corporales.<br />
Un ionograma es la <strong>de</strong>terminación y el registro <strong>de</strong> la concentración <strong>de</strong> los<br />
diversos aniones y cationes <strong>de</strong> un líquido corporal.<br />
PRINCIPALES ELECTROLITOS.<br />
A nivel extracelular, los principales cationes son Na+ y K+, y los principales<br />
aniones Cl- y HCO3.<br />
Las concentraciones <strong>de</strong> estos electrolitos afectan al metabolismo, al estado <strong>de</strong><br />
hidratación, al pH intra y extra celular. A<strong>de</strong>más, la diferente concentración <strong>de</strong><br />
estos electrolitos en los líquidos intra y extra celulares, regula el funcionamiento<br />
<strong>de</strong>l sistema nervioso y <strong>de</strong>l tejido muscular.<br />
Las concentraciones <strong>de</strong> electrolitos se pue<strong>de</strong>n expresar <strong>de</strong> varias formas :<br />
-miliequivalentes por litro = mEq/l.<br />
-milimoles por litro = mmol/l.<br />
*Recordar que 1 mEq equivale a 1mmol, solo en el caso <strong>de</strong> iones monovalentes.<br />
SODIO, POTASIO Y AGUA.<br />
El agua constituye aproximadamente el 60% <strong>de</strong>l peso corporal <strong>de</strong> un adulto,<br />
repartida como sigue:<br />
• Líquido<br />
o extracelular 20% (LEC).<br />
o vascular 5%.<br />
o intersticial 15%.<br />
• Líquido intracelular 40% (LIC).<br />
• Líquido transcelular 1-3%.<br />
Lo que distingue a unos líquidos <strong>de</strong> otros, es simplemente la composición <strong>de</strong><br />
electrolitos.<br />
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Líquido extracelular Líquido intracelular<br />
% Na 95-98% 2-5%<br />
Cationes Na (142 mEq /l) >Ca K (161 mEq /l )>Mg>Ca<br />
Aniones HCO3 (27 mEq /l) Aniones orgánicos (proteínas)<br />
Cl (101 mEq /l)<br />
* 4 veces más proteínas.<br />
pH 7.4 7.0<br />
El LIC y el LEC, a pesar <strong>de</strong> su diferente composición electrolítica, se muestran<br />
siempre en equilibrio osmótico, regulado con la bomba Na-K-ATPasa, que extrae<br />
3Na+ <strong>de</strong>l interior celular e introduce 2K+.<br />
Los dos constituyentes el LEC (plasma y líquido intersticial), presentan una<br />
composición muy similar <strong>de</strong> electrolitos, son la presión hidrostática y la oncótica<br />
las que inducen al intercambio <strong>de</strong> Na+ y agua entre ambos espacios, que se<br />
lleva a cabo a nivel capilar.<br />
Entre LEC y el transcelular, también se intercambia agua y Na+. A nivel <strong>de</strong> tubo<br />
digestivo se intercambian <strong>de</strong> 6-8 l/día <strong>de</strong> agua cuando la [Na+] es menor que la<br />
<strong>de</strong>l espacio transcelular.<br />
BIOQUÍMICA DEL SODIO Y DEL POTASIO.<br />
Los valores normales <strong>de</strong> sodio y potasio en sangre son:<br />
-Na+: 135 a 148 mmol/l.<br />
-K+: 3.8 a 5.5 mmol/l.<br />
El sodio se excreta en orina cuando sus valores en sangre superan los 110<br />
mmol/l. Se excreta <strong>de</strong> 30 a 280 mmol/día.<br />
El potasio excretado en orina es <strong>de</strong> unos 25 -120 mmol/día.<br />
La función biológica más importante <strong>de</strong>l sodio y el potasio, es la <strong>de</strong> regular la<br />
presión osmótica, y asegurar la integridad celular (Son cargas positivas que<br />
retienen aniones).<br />
Otra <strong>de</strong> las funciones <strong>de</strong>l sodio y el potasio es la <strong>de</strong> mantener el balance <strong>de</strong> agua<br />
en el organismo.<br />
El sodio, por su parte, interviene en el equilibrio ácido-base, y el potasio, por la<br />
suya, en la propagación <strong>de</strong>l impulso nervioso y por lo tanto, también en la<br />
actividad muscular.<br />
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TÉCNICAS <strong>UTIL</strong>IZADAS PARA LA DETERMINACIÓN DE SODIO Y<br />
POTASIO, ESTUDIO ANALÍTICO.<br />
FOTOMETRÍA DE LLAMA.<br />
Existen diversas técnicas para <strong>de</strong>terminar el sodio y el potasio en sangre. La<br />
más rápida y simple <strong>de</strong> ellas es la fotometría <strong>de</strong> llama.<br />
La fotometría <strong>de</strong> llama se basa en que al pulverizar una solución <strong>de</strong> una<br />
sustancia sobre una llama, los electrones <strong>de</strong> los átomos <strong>de</strong> dicha sustancia se<br />
excitan y pasan a niveles <strong>de</strong> energía superiores. Este exceso <strong>de</strong> energía es<br />
cedido al ambiente en forma <strong>de</strong> color en la llama. Tras colorear la llama, los<br />
átomos pasan a un estado menor <strong>de</strong> energía.<br />
La coloración aparecida, correspon<strong>de</strong> a la emisión <strong>de</strong> rayos <strong>de</strong> una <strong>de</strong>terminada<br />
longitud <strong>de</strong> onda, característica <strong>de</strong> cada elemento. La intensidad <strong>de</strong>l color<br />
<strong>de</strong>pen<strong>de</strong> directamente <strong>de</strong> la concentración <strong>de</strong> la sustancia.<br />
En la llama se producen los siguientes colores característicos <strong>de</strong> <strong>de</strong>terminados<br />
elementos:<br />
Litio........................color rojo.<br />
Sodio......................color amarillo.<br />
Potasio....................color violeta.<br />
Magnesio ...............color azul.<br />
En un fotómetro <strong>de</strong> llama se distinguen las siguientes partes:<br />
Atomizador: Es la parte encargada <strong>de</strong> disgregar la solución problema en gotas<br />
pequeñitas. Una vez disgregada, sus átomos pue<strong>de</strong>n, más fácilmente absorber<br />
la energía térmica <strong>de</strong> la llama, y excitarse.<br />
Llama: Se encarga <strong>de</strong> excitar los electrones <strong>de</strong> los átomos <strong>de</strong> la sustancia<br />
pulverizada.<br />
Monocromador: Es la parte encargada <strong>de</strong> seleccionar la longitud <strong>de</strong> onda.<br />
Detector; es el medidor <strong>de</strong> la energía radiante emitida.<br />
Normalmente se comparan soluciones <strong>de</strong> concentración conocida <strong>de</strong>l elemento<br />
(Na + o K+) con la muestra problema (suero).<br />
• Se preparan una serie <strong>de</strong> soluciones patrón <strong>de</strong> sodio (2.5; 5.0; 7.5 y 10<br />
microgramos /ml).<br />
• Se preparan otra serie <strong>de</strong> soluciones patrón <strong>de</strong> potasio (5; 10;15 y 20<br />
microgramos /ml). A esta serie hay que añadir Na+ en concentración<br />
similar a la normal en el suero.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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Con las soluciones patrón se obtienen resultados que hay que trasladar a una<br />
curva <strong>de</strong> calibración (una para el sodio y otra para el potasio), colocando en<br />
abscisas las concentraciones en microgramos/ml y en or<strong>de</strong>nadas las<br />
intensida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> emisión leídas por el galvanómetro.<br />
Para la <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong>l Na+ se diluye el suero, normalmente 1:500, y para la<br />
<strong>de</strong>l K+ 1:20. Se leen las intensida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> emisión, y se traslada a la curva<br />
respectiva obtenida anteriormente, para <strong>de</strong> esta forma <strong>de</strong>terminar la<br />
concentración en el suero problema.<br />
Los valores normales suelen ser:<br />
-Na+ en suero ------------------------------135-155 mEq /l.<br />
-K+ en suero-----------------------------------3.6-5.5 mEq /l.<br />
POTENCIOMETRÍA CON ELECTRODO ION -SELECTIVO.<br />
Otra técnica utilizada para <strong>de</strong>tectar Na+ y K + es la <strong>de</strong> la potenciometría con<br />
electrodo ión selectivo:<br />
-Na+..............electrodo = membrana <strong>de</strong> i.iónico <strong>de</strong> vidrio.<br />
-K+................electrodo = membrana transportadora neutra <strong>de</strong> valinomicina.<br />
Las interferencias que se presentan en la aplicación <strong>de</strong> esta técnica son; la<br />
hemólisis, el heparinato, y los anticoagulantes sódicos.<br />
IONES CLORURO.<br />
El principal anión extra celular es el cloruro. El exceso <strong>de</strong> Cl- es excretado con la<br />
orina.<br />
Su concentración normal en suero es <strong>de</strong> 101 mEq /l, excretándose en orina, en<br />
condiciones normales, <strong>de</strong> 110 a 250 mmol /día.<br />
Los iones cloruro tienen una importante función en el mantenimiento <strong>de</strong>l<br />
equilibrio ácido - base.<br />
Los iones cloruro son ingeridos normalmente en la dieta y se reabsorben en el<br />
intestino.<br />
ESTUDIO ANALÍTICO.<br />
Se pue<strong>de</strong> medir a través <strong>de</strong> los siguientes métodos:<br />
• Titulación mercurimétrica.<br />
• Titulación culombimétrica - amperométrica.<br />
• Colorimetría mediante Hg (SCN)2.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
• Uso <strong>de</strong> electrodos específicos <strong>de</strong> este ión.<br />
A) Titulación mercurimétrica:<br />
En ella el cloruro y el Hg++ se unen formando HgCl2. El Hg++ en exceso se<br />
combina con la difenilcarbazona dando un complejo coloreado <strong>de</strong> color azulvioleta.<br />
Un ejemplo <strong>de</strong> técnica mercurimétrica es la <strong>de</strong> Shales-Shales.<br />
2CL- + (NO3)2Hg.........................(indicador).............Cl2Hg + 2NO3-<br />
B) Titulación columbimétrica:<br />
Requiere pequeños volúmenes y es un método muy preciso . Se<br />
utiliza en pediatría y también para <strong>de</strong>terminar los niveles <strong>de</strong> cloruro en el sudor.<br />
C) Método <strong>de</strong>l tiocianato:<br />
Muestra (Cl-) + Hg (SNC)2........................cloruro mercúrico + SNC- Libre.<br />
El tiocianato libre, reacciona con Fe 3+, formando complejos, cuya intensidad <strong>de</strong><br />
color <strong>de</strong>termina fotométricamente, es proporcional a las cantida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> cloro<br />
existentes en la muestra.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
TEMA 3.- BIOQUÍMICA CARDIACA<br />
INTRODUCCIÓN.<br />
Aproximadamente en el 20% <strong>de</strong> los casos <strong>de</strong> cardiopatía isquémica, la primera<br />
manifestación <strong>de</strong> la enfermedad es la muerte súbita. La experiencia obtenida en<br />
países como EE.UU., Australia y Finlandia nos muestra que la Cardiopatía<br />
Isquémica es prevenible al menos en parte.<br />
En España, la mortalidad por Cardiopatía Isquémica es baja, pero en el período<br />
1968-1977 prácticamente se duplicó, pasando <strong>de</strong> la tasa bruta <strong>de</strong> 43 a la <strong>de</strong> 80<br />
por cien mil, existiendo una ten<strong>de</strong>ncia al aumento <strong>de</strong> la tasa <strong>de</strong> mortalidad<br />
estandarizada en relación con otros países europeos.<br />
Estos datos nos hacen ver la importancia <strong>de</strong> la prevención <strong>de</strong> la enfermedad así<br />
como <strong>de</strong>l diagnóstico temprano, para evitar <strong>de</strong>senlaces fatales. Entre las<br />
múltiples técnicas diagnósticas con que contamos, <strong>de</strong>stacaremos en este tema<br />
la valoración bioquímica-enzimática en la fase aguda <strong>de</strong> la isquemia miocárdica<br />
y en la evolución <strong>de</strong> la enfermedad en los primeros días.<br />
Las enzimas catalizadoras orgánicas responsables <strong>de</strong> la mayoría <strong>de</strong> las<br />
reacciones químicas que suce<strong>de</strong>n en el organismo, se encuentran en todos los<br />
tejidos. Algunas se han i<strong>de</strong>ntificado en el plasma, al que llegan <strong>de</strong>s<strong>de</strong> las células<br />
dañadas o quizás incluso <strong>de</strong>s<strong>de</strong> las células intactas.<br />
En la actualidad se han i<strong>de</strong>ntificado en el suero más <strong>de</strong> 50 enzimas. Los niveles<br />
<strong>de</strong> muchas enzimas han sido estudiados con extensión en una gran variedad <strong>de</strong><br />
procesos. Se han aplicado algunas pruebas <strong>de</strong> enzimas séricas con tanta<br />
amplitud en algunos problemas clínicos, que se consi<strong>de</strong>ran procedimientos<br />
habituales en el laboratorio. Otras, aunque muestran claramente ser un reflejo <strong>de</strong><br />
diversas enfermeda<strong>de</strong>s, se llevan a cabo en relativamente pocos laboratorios<br />
clínicos, porque la prueba en sí es técnicamente diferente o porque la<br />
información facilitada se consi<strong>de</strong>ra que ayuda muy poco. Otras pruebas tienen<br />
un interés <strong>de</strong> investigación más que clínico.<br />
El empleo <strong>de</strong> las enzimas séricas como ayuda diagnóstica ha sido muy empírico,<br />
pero los valores observados en circunstancias clínicas y experimentales<br />
permiten un análisis especulativo <strong>de</strong> los factores que controlan los niveles <strong>de</strong> las<br />
enzimas séricas en sujetos normales y enfermos. Los niveles séricos <strong>de</strong> una<br />
enzima particular crecen en las enfermeda<strong>de</strong>s que conducen a un aumento <strong>de</strong><br />
su liberación por el tejido, por un aumento <strong>de</strong> la cantidad disponible para su<br />
liberación o por una disminución <strong>de</strong> esta cantidad. Un aumento <strong>de</strong> la cantidad<br />
liberada es sin duda responsable <strong>de</strong> los elevados niveles séricos <strong>de</strong> las enzimas<br />
que producen necrosis en las enfermeda<strong>de</strong>s hepáticas, pancreáticas y<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
miocárdicas. El tipo <strong>de</strong> anormalidad <strong>de</strong> los valores <strong>de</strong> las enzimas séricas<br />
resultantes <strong>de</strong>pen<strong>de</strong> <strong>de</strong>l contenido enzimático normal <strong>de</strong>l tejido afectado y <strong>de</strong> la<br />
extensión y tipo <strong>de</strong> la necrosis.<br />
La selección <strong>de</strong> las pruebas enzimáticas para su uso clínico ha <strong>de</strong>pendido <strong>de</strong><br />
circunstancias históricas, <strong>de</strong> la experiencia ganada en la correlación <strong>de</strong> los<br />
valores con otras <strong>de</strong>terminaciones patológicas y la facilidad técnica <strong>de</strong> realizar<br />
cada procedimiento respectivo.<br />
MARCADORES BIOQUÍMICOS: VALOR DIAGNÓSTICO Y EVOLUTIVO EN<br />
EL PROCESO ISQUÉMICO.<br />
En el infarto <strong>de</strong>l miocardio hay unos cambios hemáticos inespecíficos que<br />
traducen la inflamación y necrosis, como son una discreta leucocitosis con<br />
<strong>de</strong>sviación izquierda, que aparece en las primeras horas y dura una semana, y<br />
un aumento <strong>de</strong> la VSG, que tiene lugar a partir <strong>de</strong>l cuarto o quinto día y dura<br />
varias semanas. Pero el máximo valor diagnóstico lo representan las elevaciones<br />
<strong>de</strong> ciertas enzimas (contenido fundamental <strong>de</strong> nuestro tema), liberadas en<br />
gran<strong>de</strong>s cantida<strong>de</strong>s a partir <strong>de</strong>l tejido cardiaco necrosado. Difiere la rapi<strong>de</strong>z con<br />
la cual es liberada cada enzima y su esquema temporal <strong>de</strong> liberación tiene cierta<br />
importancia diagnóstica.<br />
Transaminasa glutámico oxalacética (GOT): comienza a elevarse<br />
precozmente, a las doce horas, alcanza su máximo al segundo día y se<br />
normaliza al cuarto o quinto día. Pue<strong>de</strong> elevarse hasta 10 veces su valor normal<br />
(8-20 U/L).<br />
La lista <strong>de</strong> afecciones distintas al infarto <strong>de</strong>l miocardio que pue<strong>de</strong>n elevar la<br />
GOT compren<strong>de</strong>:<br />
• Insuficiencia ventricular <strong>de</strong>recha con congestión hepática<br />
• La administración <strong>de</strong> salicilatos, opiáceos o anticoagulantes<br />
• Enfermedad muscular primaria, incluyendo distrofia muscular y<br />
traumatismo quirúrgico<br />
• Operaciones quirúrgicas<br />
• Pancreatitis aguda<br />
• Daño extenso <strong>de</strong>l sistema nervioso central<br />
• Toxemia <strong>de</strong>l embarazo<br />
• Crisis hemolítica<br />
• Machacamiento o quemaduras<br />
• Infarto <strong>de</strong>l riñón, bazo o intestino<br />
• Hipotiroidismo.<br />
Está presente, a<strong>de</strong>más, en otros tejidos: hígado, músculo, riñón, cerebro, por lo<br />
que enfermeda<strong>de</strong>s <strong>de</strong> estos órganos pue<strong>de</strong>n producir aumentos séricos <strong>de</strong> la<br />
enzima.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
La experiencia confirma que las <strong>de</strong>terminaciones <strong>de</strong> CPK y sus isoenzimas y <strong>de</strong><br />
LDH y sus isoenzimas son indicadores más fiables para el diagnóstico <strong>de</strong><br />
laboratorio <strong>de</strong> necrosis miocárdica.<br />
En pacientes con criterios clínicos <strong>de</strong> insuficiencia coronaria más que <strong>de</strong> infarto<br />
<strong>de</strong> miocardio pue<strong>de</strong>n darse cifras elevadas <strong>de</strong> GOT en suero. No está claro si<br />
esto representa una necrosis miocárdica que no ha podido reconocerse<br />
mediante otros métodos (bastante improbable) o una liberación <strong>de</strong> la enzima al<br />
suero, incluso sin una necrosis clara <strong>de</strong>l miocardio.<br />
Lacto<strong>de</strong>hidrogenasa (LDH): esta enzima cataliza la oxidación reversible <strong>de</strong><br />
lactato a piruvato. Está ampliamente distribuida en tejidos <strong>de</strong> mamíferos y es<br />
más abundante en el miocardio, riñón, hígado y músculo. Se han aplicado para<br />
su análisis métodos espectrofotométricos y colorimétricos.<br />
Los niveles séricos elevados <strong>de</strong> LDH se observan en muchas circunstancias.<br />
Los valores más altos (2 a 40 veces la normalidad) se ven en casos <strong>de</strong> anemia<br />
megaloblástica, en carcinomatosis extensa, en el shock grave y en la anoxia.<br />
Subidas mo<strong>de</strong>radas (2 a 4 veces la normalidad) ocurren en enfermos <strong>de</strong> infarto<br />
<strong>de</strong> miocardio, infarto pulmonar, leucemia granulocítica, anemia hemolítica,<br />
mononucleosis infecciosa y en pacientes con distrofia muscular. Se ven ligeras<br />
elevaciones en casos <strong>de</strong> hepatitis, ictericias obstructivas o cirrosis.<br />
Son bastantes característicos los patrones <strong>de</strong> niveles séricos elevados <strong>de</strong> LDH<br />
en los casos <strong>de</strong> infarto <strong>de</strong> miocardio. En general, aumenta más tar<strong>de</strong>, a las<br />
veinticuatro horas; alcanza el pico a los tres o cuatro días y persiste elevada<br />
cuando el resto <strong>de</strong> las enzimas se han normalizado; vuelve el nivel basal a los<br />
siete o diez días, y la elevación máxima pue<strong>de</strong> ser dos o tres veces los valores<br />
normales (45-90 U/L).<br />
Es menos específica, pues se encuentra prácticamente en todos los tejidos <strong>de</strong>l<br />
organismo. Por ello tiene más valor <strong>de</strong>terminar sus cinco isoenzimas, que<br />
aunque presentes en toda las economía, lo están a concentraciones diferentes<br />
en los diversos tejidos.<br />
Mediante electroforesis se pue<strong>de</strong>n separar cinco isoenzimas comunes a la LDH.<br />
Cada una <strong>de</strong> estas isoenzimas se distingue <strong>de</strong> las otras mediante<br />
procedimientos serológicos, electroforéticos y otros varios <strong>de</strong> or<strong>de</strong>n químico.<br />
Las isoenzimas <strong>de</strong> la LDH se <strong>de</strong>signan en la práctica <strong>de</strong> acuerdo con su<br />
movilidad electroforética. Cada isoenzima es un tetrámero constituido por cuatro<br />
subunida<strong>de</strong>s, cada una con un peso molecular <strong>de</strong> 34.000. Existen dos tipos <strong>de</strong><br />
estas subunida<strong>de</strong>s, <strong>de</strong>signados respectivamente H y M, H para la ca<strong>de</strong>na <strong>de</strong><br />
péptidos <strong>de</strong>l corazón y M para la ca<strong>de</strong>na <strong>de</strong>l músculo estriado.<br />
Los diversos tejidos difieren en cuanto a sus esquemas específicos <strong>de</strong><br />
isoenzimas, la isoenzima que se <strong>de</strong>splaza con mayor rapi<strong>de</strong>z y que es más<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
abundante en el corazón, ha sido <strong>de</strong>signada LDH1, en cambio, en el hígado y en<br />
el músculo estriado predominan isoenzimas <strong>de</strong> <strong>de</strong>splazamiento más lento.<br />
La LDH1 es relativamente específica <strong>de</strong>l corazón, por lo que su elevación y,<br />
sobre todo, la relación LDH1/LDH2 cuando es superior a uno (LDH invertida) es<br />
muy sugerente <strong>de</strong> infarto <strong>de</strong> miocardio, aún cuando la LDH total no haya<br />
aumentado. En casos <strong>de</strong> infarto <strong>de</strong> miocardio, la LDH1 aumenta antes que la<br />
LDH total, y pue<strong>de</strong> incluso aumentar sin que se note todavía ningún cambio <strong>de</strong><br />
LDH total. Por tanto, una elevación <strong>de</strong> la LDH1 constituye un índice <strong>de</strong>l infarto <strong>de</strong><br />
miocardio más sensible que la LDH total. Cabe mencionar una sensibilidad<br />
superior a 95%.<br />
Es difícil la cuantificación <strong>de</strong> las isoenzimas, y las técnicas son <strong>de</strong>masiado<br />
incómodas para su empleo en el estudio <strong>de</strong> numerosos sueros. Sin embargo, la<br />
<strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> LDH1, la isoenzima miocárdica, pue<strong>de</strong> realizarse mediante<br />
técnicas sencillas como el análisis <strong>de</strong> la actividad total <strong>de</strong> LDH.<br />
Creatinfosfoquinasa (CPK): es la enzima que más precozmente se eleva en el<br />
infarto <strong>de</strong> miocardio, ya que hay niveles altos a las cuatro o seis horas, alcanza<br />
el pico máximo a las veinticuatro-treinta horas y se normaliza al tercer o cuarto<br />
día. Pue<strong>de</strong> elevarse hasta cuarenta veces su valor normal (varón 12-70 U/L;<br />
hembra 10-55 U/L).<br />
Es la más específica, pero se encuentra también en el tejido muscular y en el<br />
cerebro y a<strong>de</strong>más se eleva por inyecciones intramusculares, cardioversión,<br />
cirugía, etc.<br />
Reviste una importancia especial, en la clínica, el hecho <strong>de</strong> que una inyección<br />
intramuscular pue<strong>de</strong> ir seguida <strong>de</strong> una elevación al doble o al triple <strong>de</strong> la cifra<br />
sanguínea <strong>de</strong> CK.<br />
Esta particularidad pue<strong>de</strong> significar diagnósticos erróneos <strong>de</strong> infarto <strong>de</strong>l<br />
miocardio en pacientes que recibieron inyecciones intramusculares <strong>de</strong> algún<br />
analgésico para combatir un dolor torácico que no era <strong>de</strong> origen cardiaco. Otras<br />
posibles causas <strong>de</strong> aumento <strong>de</strong> la CK pue<strong>de</strong>n ser:<br />
• la miopatía que acompaña al alcoholismo crónico.<br />
• el tratamiento con clofibrato.<br />
• el cateterismo cardiaco.<br />
• el hipotiroidismo.<br />
• las embolias cerebrales.<br />
• el ejercicio físico.<br />
La CPK tiene tres isoenzimas, cada una constituida por dos subunida<strong>de</strong>s: M<br />
(músculo) o B (cerebro); el cerebro contiene BB; el músculo esquelético MM, y el<br />
miocardio MM y MB. Pues bien, la isoenzima MB (CPK-MB) resulta específica<br />
<strong>de</strong>l músculo cardiaco; su curva <strong>de</strong> elevación es similar a la <strong>de</strong> la CPK total, pero<br />
algo más precoz.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
La presencia <strong>de</strong> CPK-MB en los sueros indica una lesión <strong>de</strong> miocardio y se<br />
observa en todos los pacientes durante el período <strong>de</strong> 48 horas <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> un<br />
infarto agudo <strong>de</strong> miocardio. Sin embargo, también se <strong>de</strong>tecta en menor grado en<br />
individuos con angina e insuficiencia coronaria graves, pero sin indicaciones <strong>de</strong><br />
infarto.<br />
En vista <strong>de</strong> que la elevación <strong>de</strong> la cifra sérica <strong>de</strong> CPK dura poco tiempo, quizá<br />
pase inadvertida si las primeras muestras <strong>de</strong> sangre se recogen <strong>de</strong>spués <strong>de</strong><br />
transcurridas 72 horas. La actividad <strong>de</strong> la CPK-MB nunca supera el 40% <strong>de</strong> la<br />
actividad sérica total <strong>de</strong> la CPK y el resto es CPK-MM.<br />
Las <strong>de</strong>terminaciones <strong>de</strong> la isoenzima <strong>de</strong> la CPK realizadas <strong>de</strong>spués <strong>de</strong>l día 4<br />
sólo revelarán actividad <strong>de</strong> la CPK-MM, y no podrá establecerse su origen en el<br />
corazón o músculo.<br />
Con las técnicas actuales <strong>de</strong> reperfusión precoz, utilizando la administración<br />
intravenosa <strong>de</strong> sustancias fibrinolíticas, para romper la porción fresca <strong>de</strong>l trombo<br />
arterial, los niveles <strong>de</strong> CPK suben espectacularmente, alcanzando hasta mil<br />
veces su valor normal. Esto último no es indicativo <strong>de</strong> gran necrosis miocárdica,<br />
sino consecuencia <strong>de</strong> la <strong>de</strong>strucción, al menos parcial <strong>de</strong>l trombo intraarterial.<br />
Se sabe <strong>de</strong>s<strong>de</strong> hace mucho que el tamaño <strong>de</strong>l infarto tiene cierta relación con la<br />
cantidad <strong>de</strong> enzimas liberadas. Se ha <strong>de</strong>mostrado que pue<strong>de</strong> conocerse la masa<br />
<strong>de</strong> músculo cardiaco infartado a partir <strong>de</strong>l análisis <strong>de</strong> la curva <strong>de</strong> concentracióntiempo<br />
<strong>de</strong> la enzima en cuestión, siempre y cuando se conociera la cinética <strong>de</strong><br />
liberación, <strong>de</strong>sdoblamiento, eliminación, etc. <strong>de</strong> dicha enzima. Si se analiza una<br />
curva <strong>de</strong> tiempo <strong>de</strong> la fracción MB <strong>de</strong> la CK pue<strong>de</strong> calcularse el tamaño <strong>de</strong>l<br />
infarto en términos <strong>de</strong> gramos.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
En más <strong>de</strong>l 95% <strong>de</strong> pacientes con un infarto <strong>de</strong>l miocardio comprobado existen<br />
elevaciones características en la concentración sérica <strong>de</strong> las enzimas.<br />
Existen otros indicadores bioquímicos <strong>de</strong> infarto, como el incremento <strong>de</strong><br />
mioglobina en suero, disminución <strong>de</strong>l Zinc plasmático, etc., no tienen en la<br />
actualidad utilización en la clínica.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
TEMA 4. PRINCIPALES<br />
MARCADORES TUMORALES E<br />
IMPLICACIÓN PRÁCTICA.<br />
INTRODUCCIÓN<br />
Con la <strong>de</strong>tección y tratamiento precoces <strong>de</strong>l cáncer, responsable actualmente <strong>de</strong><br />
una gran mortalidad en la población mundial, se espera se produzca una<br />
marcada disminución en la morbilidad y mortalidad <strong>de</strong> esta enfermedad.<br />
La <strong>de</strong>tección precoz mediante técnicas citológicas han dado resultados muy<br />
positivos en la <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> ciertos tumores (Ej.: cáncer cervical) aunque no<br />
<strong>de</strong>tectan por sí mismas gran cantidad <strong>de</strong> tumores. Es por ello que la<br />
investigación se ha centrado en la investigación <strong>de</strong> productos tumorales en<br />
sangre, orina y otros líquidos corporales.<br />
Así, reciben el nombre <strong>de</strong> MARCADORES TUMORALES a aquellas sustancias<br />
presentes en sangre, orina u otros líquidos corporales (fundamentalmente se<br />
investiga en sangre) proce<strong>de</strong>ntes <strong>de</strong> la célula neoplásica, ya que por sus<br />
especiales características ésta sintetiza compuestos que se distinguen <strong>de</strong> los<br />
aportados por una célula normal, bien en su estructura, bien en su concentración<br />
en los líquidos biológicos.<br />
TUMOR, CÁNCER Y CÉLULAS TUMORALES<br />
Llamamos tumor a la neoformación o nuevo crecimiento <strong>de</strong> tejidos en que la<br />
multiplicación <strong>de</strong> las células no está totalmente controlada por los sistemas<br />
reguladores <strong>de</strong>l organismo.<br />
Denominamos cáncer a un tumor maligno en general. Las características<br />
básicas <strong>de</strong> la malignidad es una anormalidad <strong>de</strong> las células trasmitidas a las<br />
células hijas, que se manifiesta por la reducción <strong>de</strong>l control <strong>de</strong>l crecimiento y la<br />
función celular, conduciendo a una serie <strong>de</strong> fenómenos adversos en el huésped<br />
a través <strong>de</strong> un crecimiento masivo, invasión <strong>de</strong> tejidos vecinos y metástasis.<br />
La característica principal <strong>de</strong> la célula tumoral con respecto a las células<br />
normales es fundamentalmente la pérdida <strong>de</strong> control en los procesos <strong>de</strong><br />
crecimiento y división. Al llevarse estos <strong>de</strong> forma <strong>de</strong>sorganizada, conduce a la<br />
formación <strong>de</strong> una masa tumoral que inva<strong>de</strong> los tejidos circundantes rompiendo<br />
las membranas límites <strong>de</strong> las distintas estructuras. La diseminación y<br />
colonización <strong>de</strong> algunas <strong>de</strong> estas células tumorales pue<strong>de</strong> dar lugar a la<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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aparición <strong>de</strong> metástasis o más focos morbosos secundarios en regiones no<br />
contiguas <strong>de</strong>l punto <strong>de</strong> evolución <strong>de</strong>l foco primitivo.<br />
ALTERACIONES DE LAS CÉLULAS TUMORALES<br />
En las células tumorales o neoplásicas se conocen anomalías tanto estructurales<br />
como genéticas.<br />
DE LA MEMBRANA<br />
En las membranas celulares se <strong>de</strong>tectan modificaciones en las glicoproteínas<br />
transmembrana y en los enlaces entre los distintos componentes moleculares<br />
que ocasionan un crecimiento <strong>de</strong>sor<strong>de</strong>nado <strong>de</strong>l tejido, con la formación <strong>de</strong> la<br />
masa tumoral.<br />
Igualmente aparecen modificaciones en los receptores <strong>de</strong> membrana que<br />
conducen en algunos casos a facilitar el anclaje <strong>de</strong> células tumorales en otros<br />
tejidos.<br />
Aparecen a<strong>de</strong>más proteínas anómalas que dotan a las células neoplásicas <strong>de</strong><br />
una gran respuesta a factores que <strong>de</strong>terminan su crecimiento y multiplicación.<br />
Cabe resaltar la <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> la llamada “proteína P” que dota a las células <strong>de</strong><br />
gran resistencia a las drogas neoplásicas utilizadas en quimioterapia.<br />
DEL NÚCLEO<br />
Respecto a las anomalías que afectan al núcleo, las más fácilmente <strong>de</strong>tectables<br />
afectan al tamaño nuclear, lo que <strong>de</strong>termina un índice mitótico mayor que el<br />
correspondiente a una célula normal.<br />
GENÉTICAS<br />
Las alteraciones más importantes afectan al material genético. Existen una serie<br />
<strong>de</strong> genes normales llamados prooncogenes que por acción <strong>de</strong> <strong>de</strong>terminados<br />
agentes se transforman en oncogenes, lo que se traduce en la mayoría <strong>de</strong> los<br />
casos en la alteración en la composición <strong>de</strong> las proteínas que codifican o<br />
alteraciones en la cantidad induciendo a la mitosis acelerada <strong>de</strong> las células.<br />
Por este mismo mecanismo pue<strong>de</strong> a<strong>de</strong>más <strong>de</strong>saparecer genes protectores,<br />
malignizándose igualmente la célula afectada.<br />
DEL CICLO CELULAR<br />
En un ciclo celular normal la mayor parte <strong>de</strong>l tiempo lo <strong>de</strong>dican las células, una<br />
vez diferenciadas, a sintetizar productos específicos <strong>de</strong> cada tipo celular. Una<br />
vez dividida la célula pue<strong>de</strong> madurar y diferenciarse para continuar <strong>de</strong> nuevo el<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
ciclo celular. Dicho ciclo celular está regulado por una serie <strong>de</strong> proteínas<br />
sintetizadas por la propia célula.<br />
Cuando este ciclo se altera, las células no maduran, no se diferencian, por lo que<br />
no tienen capacidad <strong>de</strong> síntesis y se divi<strong>de</strong>n a gran velocidad constituyendo<br />
rápidamente la masa tumoral.<br />
TIPOS DE MARCADORES TUMORALES<br />
ESPECÍFICOS E INESPECÍFICOS<br />
Las sustancias marcadores se pue<strong>de</strong>n clasificar como específicos <strong>de</strong> un tumor o<br />
asociados a este.<br />
Los antígenos específicos <strong>de</strong>l tumor se piensan que son resultado directo <strong>de</strong> la<br />
oncogénesis; pue<strong>de</strong>n consi<strong>de</strong>rarse como neoantígenos específicos <strong>de</strong> las<br />
células tumorales.<br />
Los antígenos inespecíficos están asociados al tumor, y compren<strong>de</strong>n diversas<br />
enzimas y proteínas que aparecen en sangre y son mediadas por el propio tumor<br />
o su influencia en tejidos no afectados.<br />
EN FUNCIÓN DE SU <strong>UTIL</strong>IDAD CLÍNICA<br />
Po<strong>de</strong>mos clasificar los marcadores tumorales en función <strong>de</strong> su utilidad clínica en:<br />
marcadores diagnósticos, terapéuticos, <strong>de</strong> evolución y genómicos.<br />
La <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> marcadores tumorales en sangre nos proporciona una gran<br />
información, aunque el conocimiento <strong>de</strong> la tasa <strong>de</strong> marcadores tumorales en la<br />
propia masa tumoral nos va a proporcionar también una valiosa información.<br />
Si estos son negativos, nos indica que nos encontramos frente a un tumor <strong>de</strong><br />
células no diferenciadas incapaz <strong>de</strong> sintetizar estos marcadores, y por lo tanto <strong>de</strong><br />
gran agresividad. Por el contrario, si los marcadores son positivos, nos indica<br />
que las células tienen la diferenciación suficiente para sintetizar, y por lo tanto <strong>de</strong><br />
menor agresividad que en el caso anterior.<br />
Así, este tipo <strong>de</strong> <strong>de</strong>terminación nos ayuda a diagnosticar y cuantificar la mayor o<br />
menor agresividad <strong>de</strong> las células tumorales, se <strong>de</strong>nominan por tanto<br />
marcadores diagnósticos.<br />
La <strong>de</strong>terminación basal y la cuantificación periódica <strong>de</strong> los marcadores tumorales<br />
es indicativa <strong>de</strong> la sensibilidad <strong>de</strong> la célula a una <strong>de</strong>terminada terapia<br />
(marcadores terapéuticos) e indicativa igualmente <strong>de</strong> la evolución <strong>de</strong> la<br />
enfermedad y <strong>de</strong> la utilidad <strong>de</strong> la terapia elegida (marcadores <strong>de</strong> evolución).<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Existen a<strong>de</strong>más marcadores genómicos que permiten conocer la inci<strong>de</strong>ncia <strong>de</strong><br />
las alteraciones <strong>de</strong> los prooncogenes al inicio <strong>de</strong> la enfermedad. Habitualmente<br />
se trata <strong>de</strong> proteínas codificadas por los genes alterados.<br />
CARACTERÍSTICAS DE LOS MARCADORES TUMORALES<br />
Para que un marcador tumoral sea consi<strong>de</strong>rado como tal <strong>de</strong>be reunir una serie<br />
<strong>de</strong> características como son:<br />
1. Deben ser producidas por las células tumorales o bien modificar los valores<br />
normales <strong>de</strong> un individuo sano. En el primer caso, entre los marcadores<br />
producidos por una célula neoplásica tenemos por ejemplo los antígenos<br />
oncofetales, o la gonadotropina coriónica en varones o mujeres no<br />
embarazadas. En el segundo caso, hay que fijar previamente los llamados<br />
valores <strong>de</strong> corte o valores a partir <strong>de</strong> los cuales supondremos probable la<br />
existencia <strong>de</strong> una patología.<br />
2. Deben <strong>de</strong>tectarse y cuantificarse fácilmente.<br />
3. Deben ser <strong>de</strong> alta sensibilidad y su tasa ser reflejo <strong>de</strong>l tamaño tumoral.<br />
4. Deben ser específicos.<br />
5. Sus niveles en individuos sanos <strong>de</strong>ben ser muy inferiores a los que se<br />
encuentran en individuos enfermos.<br />
CUALIDADES DE LOS MARCADORES TUMORALES.<br />
Como comentamos anteriormente, un marcador <strong>de</strong>be ser sensible y específico.<br />
Po<strong>de</strong>mos <strong>de</strong>finir los conceptos <strong>de</strong> sensibilidad y especificidad <strong>de</strong> la siguiente<br />
forma:<br />
• Sensibilidad: Es la probabilidad <strong>de</strong> encontrar un valor positivo en<br />
una población <strong>de</strong> enfermos.<br />
• Especificidad: Es la probabilidad <strong>de</strong> hallar un valor negativo en<br />
una población <strong>de</strong> sanos.<br />
Si suponemos dos muestras <strong>de</strong> población, una <strong>de</strong> individuos sanos y otra <strong>de</strong><br />
individuos enfermos, consi<strong>de</strong>raremos un valor verda<strong>de</strong>ramente positivo (VP) a<br />
aquel superior al límite <strong>de</strong> normalidad en un individuo enfermo; un valor<br />
verda<strong>de</strong>ramente negativo (VN) al valor inferior al límite normal en un individuo<br />
sano; un valor falsamente positivo (FP) a un valor superior al límite <strong>de</strong><br />
normalidad en un individuo sano y un valor falsamente negativo (FN) a un valor<br />
inferior al límite <strong>de</strong> normalidad en un individuo enfermo.<br />
En base a esto:<br />
Sensibilidad = (VP/(FP+FN)) x 100<br />
Especificidad = (VN/(FP+VN)) x 100<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Es por ello que se <strong>de</strong>ben asociar marcadores <strong>de</strong> gran sensibilidad con otros <strong>de</strong><br />
gran especificidad.<br />
Así, si tenemos interés en conocer que no se pa<strong>de</strong>ce una <strong>de</strong>terminada<br />
enfermedad, buscaremos una especificidad alta, don<strong>de</strong> los falsos positivos<br />
tiendan a cero; mientras que si queremos tratar una patología <strong>de</strong> gran<br />
agresividad <strong>de</strong>bemos buscar técnicas <strong>de</strong> gran sensibilidad, don<strong>de</strong> los falsos<br />
negativos tiendan a cero,<br />
Po<strong>de</strong>mos <strong>de</strong>finir también respecto a los marcadores tumorales el Valor<br />
Predictivo, que es la probabilidad <strong>de</strong> que un sujeto investigado pa<strong>de</strong>zca o no la<br />
enfermedad. Así, el valor predictivo positivo es la probabilidad <strong>de</strong> que el sujeto<br />
pa<strong>de</strong>zca la enfermedad.<br />
VPP = (VP/(VP+FP)) x 100<br />
El valor predictivo negativo, por tanto, será la probabilidad <strong>de</strong> que el individuo no<br />
pa<strong>de</strong>zca la enfermedad.<br />
VPN = (VN/)VN+FN)) x 100<br />
Un marcador se pue<strong>de</strong> emplear como prueba <strong>de</strong> screening en una población<br />
para <strong>de</strong>tectar un <strong>de</strong>terminado cáncer cuando el VVP sea alto.<br />
DETERMINACIÓN DE MARCADORES<br />
NIVELES DE MARCADORES<br />
Los factores que <strong>de</strong>terminan los niveles <strong>de</strong> marcadores en sangre son:<br />
1. Índice tumoral <strong>de</strong> síntesis: Es la relación entre el número <strong>de</strong> células<br />
productoras <strong>de</strong>l marcador utilizado en el seguimiento y el número total <strong>de</strong><br />
células constitutivas <strong>de</strong> la masa tumoral.<br />
2. Localización <strong>de</strong> la masa tumoral y mecanismo <strong>de</strong> liberación que permite el<br />
paso <strong>de</strong>l marcador a la circulación general.<br />
3. Vida media <strong>de</strong>l marcador en la propia masa tumoral y en sangre periférica.<br />
4. Factores analíticos relacionados con la técnica elegida para su <strong>de</strong>terminación.<br />
TOMA DE MUESTRAS<br />
La obtención <strong>de</strong> la muestra es <strong>de</strong> gran importancia ya que los niveles <strong>de</strong><br />
marcadores se pue<strong>de</strong>n ver afectados por:<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
1. La exploración <strong>de</strong>l paciente previa a la obtención <strong>de</strong> la muestra pue<strong>de</strong><br />
provocar un aumento en la tasa <strong>de</strong> marcadores, especialmente en el caso <strong>de</strong><br />
enfermeda<strong>de</strong>s prostáticas.<br />
2. Los agentes quimioterapéuticos pue<strong>de</strong>n interferir en la <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong>l<br />
marcador, por lo que <strong>de</strong>be esperarse un periodo <strong>de</strong>terminado que va a<br />
<strong>de</strong>pen<strong>de</strong>r <strong>de</strong> la vida media <strong>de</strong> la droga utilizada.<br />
3. La necrosis celular que sigue a un tratamiento radiológico o a la quimioterapia<br />
ocasiona la liberación <strong>de</strong> todos los componentes celulares, con la<br />
consecuente elevación <strong>de</strong> los niveles en sangre.<br />
DETERMINACIÓN DE MARCADORES<br />
Es importante antes <strong>de</strong> iniciar cualquier tratamiento o manipulación <strong>de</strong>terminar<br />
los valores basales, para po<strong>de</strong>r seguir la evolución y eficacia <strong>de</strong>l tratamiento<br />
elegido.<br />
Por otro lado, los marcadores inespecíficos no tienen unas tasas o valores<br />
establecidos en general, por lo que el propio paciente es su propio control, y el<br />
conocimiento <strong>de</strong> los valores basales ayudará en la interpretación <strong>de</strong> las<br />
oscilaciones que tengan dichos valores.<br />
La historia y patología <strong>de</strong> cada paciente, así como la medicación que se<br />
prescriba marcará el número y frecuencia <strong>de</strong> las <strong>de</strong>terminaciones posteriores<br />
para el seguimiento <strong>de</strong>l tratamiento y evolución <strong>de</strong> la enfermedad. La<br />
interpretación <strong>de</strong> las cifras <strong>de</strong> los marcadores ha <strong>de</strong> hacerse con cau<strong>tel</strong>a, pues<br />
están sujetos a muchas variables.<br />
La presencia <strong>de</strong> un valor elevado inesperado y no explicable por una posible<br />
manipulación, medicación, infección, etc., <strong>de</strong>berá ser cuidadosamente<br />
comprobado repitiendo la <strong>de</strong>terminación e incluso la extracción. Esto es<br />
importante ya que este valor elevado nos pue<strong>de</strong> indicar recidivas mucho antes<br />
que estas puedan ser <strong>de</strong>tectadas por otros medios.<br />
MÉTODOS DE DETERMINACIÓN<br />
Los marcadores tumorales pue<strong>de</strong>n ser <strong>de</strong>tectados tanto en tejidos tumorales<br />
como en líquidos biológicos.<br />
La <strong>de</strong>tección en tejidos tumorales se realiza mediante técnicas<br />
inmunicitoquímicas.<br />
La <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> marcadores tumorales en líquidos biológicos se lleva a cabo<br />
mediante técnicas inmunoquímicas, que incluyen entre otras el<br />
radioinmunoanálisis (RIA) y técnicas <strong>de</strong> enzimoinmunoanálisis (ELISA).<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Son técnicas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo, por lo que son <strong>de</strong> gran<br />
sensibilidad, aunque van a influir en la técnica la afinidad y especificidad <strong>de</strong>l<br />
anticuerpo utilizado.<br />
ASOCIACIÓN DE MARCADORES<br />
Los marcadores tumorales se suelen asociar en el estudio <strong>de</strong> una <strong>de</strong>terminada<br />
enfermedad, ya que utilizados asociados aumenta la sensibilidad.<br />
Se recomienda asociar al menos dos marcadores, un marcador <strong>de</strong> celularidad,<br />
habitualmente <strong>de</strong> poca especificidad (CEA), <strong>de</strong> alteración <strong>de</strong> la respuesta<br />
inmunitaria (Neopterina) o <strong>de</strong> proliferación celular (TPS) con otro <strong>de</strong> mayor<br />
especificidad <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> la patología estudiada, habitualmente <strong>de</strong> menor<br />
sensibilidad que los anteriores.<br />
En distintas neoplasias se emplean asociaciones <strong>de</strong> varios marcadores para el<br />
diagnóstico, seguimiento y <strong>de</strong>tección precoz <strong>de</strong> recidivas. Ponemos varios<br />
ejemplos:<br />
1. Cáncer <strong>de</strong> mama: es la primera causa <strong>de</strong> mortalidad por cáncer en las<br />
mújeres. Se emplea como marcadores tumorales para el diagnóstico y<br />
seguimiento el CEA y el Antígeno Ca 153, como marcadores <strong>de</strong> pronóstico y<br />
terapéuticos se utilizan los receptores <strong>de</strong> estrógeno y progesterona.<br />
2. Cáncer <strong>de</strong> próstata: Es la segunda causa <strong>de</strong> mortalidad por cáncer en el<br />
varón <strong>de</strong> edad comprendida entre los 50 y 60 años. En el diagnóstico y<br />
seguimiento se utilizan el PSA y la fosfatasa ácida prostática (PAP).<br />
3. Cáncer <strong>de</strong> hígado: Como marcador se emplea la alfafetoproteína, <strong>de</strong> utilidad<br />
en el diagnóstico y en el control, e incluso con valor pronóstico para enfermos<br />
con hepatocarcinoma. En el estudio <strong>de</strong> las metástasis se emplea el antígeno<br />
carcinoembrionario, sobre todo en el seguimiento <strong>de</strong>l enfermo tratado.<br />
ESTRUCTURA DE LOS MARCADORES<br />
Los marcadores pertenecen a grupos con estructuras químicas muy variadas.<br />
Los antígenos oncofecales se <strong>de</strong>tectan en sangre fetal y prácticamente <strong>de</strong>spués<br />
<strong>de</strong>l parto se reducen a niveles no <strong>de</strong>tectables. A medida que un individuo sano<br />
crece es posible que aparezcan en suero en concentraciones bajas. Dos <strong>de</strong> los<br />
antígenos oncofecales más conocidos son la alfafetoproteína (AFP) y el antígeno<br />
carcinoembrionario (CEA).<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Entre las proteínas que tienen utilidad <strong>de</strong> diagnóstico para la evaluación <strong>de</strong><br />
pacientes con cáncer se encuentran aquellas asociadas al embarazo, tales como<br />
la gonadotropina coriónica humana.<br />
Las enzimas son marcadores útiles <strong>de</strong> procesos malignos.<br />
Muchas hormonas son producidas por los tumores: cuando el tejido no<br />
endocrino es responsable <strong>de</strong> la producción <strong>de</strong> hormonas se habla <strong>de</strong> producción<br />
hormonal ectópica.<br />
Los marcadores celulares, tales como los antígenos <strong>de</strong> las células T o B son<br />
útiles, así como los receptores <strong>de</strong> estrógenos y progesterona.<br />
En la tabla 1 aparecen los marcadores tumorales asociados a las patologías en<br />
que aparecen.<br />
MARCADORES TUMORALES MÁS <strong>UTIL</strong>IZADOS<br />
ANTÍGENO CARCINOEMBRIONARIO (CEA)<br />
Se trata <strong>de</strong> una glicoproteína sintetizada en el tejido fetal, formada por varios<br />
componentes que han <strong>de</strong> tenerse en cuenta, ya que <strong>de</strong>pendiendo <strong>de</strong>l anticuerpo<br />
empleado en la técnica <strong>de</strong> <strong>de</strong>terminación, se reconocerá uno o varios<br />
componentes, lo que se reflejará en la tasa obtenida.<br />
En pacientes adultos con diversos tipos <strong>de</strong> cáncer pue<strong>de</strong>n <strong>de</strong>tectar niveles<br />
elevados en las células y en plasma, aunque no es específico <strong>de</strong> ningún proceso<br />
maligno ni <strong>de</strong> tipo tumoral.<br />
El CEA pue<strong>de</strong> aparecer aumentado es especial en procesos malignos <strong>de</strong>l<br />
aparato digestivo, páncreas, pulmón y mama.<br />
Su mayor aplicación es el diagnóstico y seguimiento postoperatorio <strong>de</strong>l cáncer<br />
colo-rectal y el estudio <strong>de</strong> las metástasis <strong>de</strong>l cáncer <strong>de</strong> hígado.<br />
ALFAFETOPROTEINA (AFP)<br />
Es una glicoproteína presente en el suero <strong>de</strong> individuos sanos a bajas<br />
concentraciones. Valores aumentados se observan en hepatomas y en tumores<br />
germinales. Pequeños incrementos <strong>de</strong> AFP pue<strong>de</strong>n <strong>de</strong>tectarse en relación con<br />
tumores <strong>de</strong>l aparato digestivo o <strong>de</strong>l pulmón.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Tabla 1: Marcadores tumorales y tumores asociados<br />
TIPO MARCADOR TUMOR ASOCIADO<br />
Antígenos CEA<br />
Mama, colon<br />
oncofetales AFP<br />
Hígado, tumores germinales<br />
Glicoproteínas Ca 153<br />
Mama<br />
Ca 549<br />
Mama<br />
Ca 125<br />
Ovario<br />
Proteínas Caseína<br />
Mama, pulmón,<br />
Ferritina<br />
gastrointestinal<br />
Osteocalcina<br />
Leucemia<br />
Metástasis ósea<br />
Enzimas Creatincinasa (BB)<br />
Próstata<br />
Fosfatasa ácida prostática(PAP) Próstata<br />
Fosfatasa alcalina<br />
Pulmón<br />
Antíg. Especif. Prostático(PSA) Próstata<br />
Receptores De estrógeno<br />
Mama<br />
hormonales De progesterona<br />
Mama<br />
Marcadores<br />
celulares<br />
Marcadores <strong>de</strong> las células T, B Linfoma<br />
Poliaminas Espermina, espermidina, Leucemia, linfoma, cáncer<br />
putresceina<br />
colorrectal<br />
Hormonas Calcitonina (CT)<br />
Metástasis óseas<br />
Gonadotropina coriónica(HCG) Tumores germinales<br />
Adrenocorticotropica (ACTH) Pulmón<br />
Paratiroi<strong>de</strong>a (PTH)<br />
Riñón, pulmón, páncreas,<br />
Antidiurética (ADH)<br />
ovario<br />
Del crecimiento (GH)<br />
Pulmón<br />
Eritropoyetina<br />
Pulmón, estómago<br />
Lactógeno placentario humano Cerebro, hígado<br />
Estimulante <strong>de</strong>l tiroi<strong>de</strong>s (TSH) Pulmón<br />
Pulmón, mama<br />
ANTÍGENO Ca 153<br />
Pertenece al grupo <strong>de</strong> las proteínas transmembranas, cuya estructura aún no<br />
está establecida.<br />
Existe una gran dispersión entre los valores encontrados en una población<br />
normal, en una población afectada <strong>de</strong> una patología mamaria benigna y una<br />
población que presenta una enfermedad maligna. Es por ello, que lo interesante<br />
es disponer <strong>de</strong> los valores <strong>de</strong> evolución <strong>de</strong> un mismo paciente con el fin <strong>de</strong><br />
<strong>de</strong>tectar precozmente recidivas.<br />
Sus valores están aumentados en los cánceres que afecten a tejido epi<strong>tel</strong>ial,<br />
fundamentalmente mamarios.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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ANTÍGENO Ca 125<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
Pertenece al grupo <strong>de</strong> las glicoproteínas no i<strong>de</strong>ntificadas.<br />
Es especialmente útil su empleo en carcinomas ginecológicos<br />
(fundamentalmente <strong>de</strong> ovario) aunque también se ve aumentada sus tasas en<br />
carcinomas gastrointestinales, <strong>de</strong> mama y <strong>de</strong> pulmón. Aumenta también en el<br />
embarazo y en patologías como la diabetes y cirrosis.<br />
GONADOTROPINA CORIONICA HUMANA (HCG)<br />
Es una hormona glucoproteica generalmente <strong>de</strong>tectada en suero y orina durante<br />
la gestación. La hormona está compuesta <strong>de</strong> una unidad alfa y <strong>de</strong> una unidad<br />
beta. Se ha puesto <strong>de</strong> manifiesto que una subunidad aislada pue<strong>de</strong> ser<br />
producida por un <strong>de</strong>terminado tumor<br />
Se <strong>de</strong>tecta en tumores <strong>de</strong> células embrionarias y es muy útil en el seguimiento<br />
<strong>de</strong> la evolución <strong>de</strong> las molas tras su evacuación.<br />
ANTÍGENO PROSTÁTICO ESPECÍFICO<br />
Es una glicoproteína secretada exclusivamente por la próstata. Es por tanto un<br />
marcador específico <strong>de</strong> próstata, por lo que tiene interés en el diagnóstico,<br />
pronóstico, <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong>l estadio y seguimiento <strong>de</strong>l cáncer <strong>de</strong> próstata.<br />
Pue<strong>de</strong> encontrarse elevado en afecciones como prostatitis aguda o a<strong>de</strong>nomas.<br />
ANTÍGENO POLIPEPTÍDICO TISULAR (TPA)<br />
Es una proteína aislada <strong>de</strong> muestras tumorales y metástasis.<br />
Es consi<strong>de</strong>rado como un marcador <strong>de</strong> proliferación tumoral, por lo que no es<br />
específico <strong>de</strong> la patología tumoral. Tiene interés en el seguimiento terapéutico<br />
<strong>de</strong>l cáncer <strong>de</strong> vejiga y en la i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> sujetos <strong>de</strong> riesgo, siendo <strong>de</strong> gran<br />
importancia disponer <strong>de</strong> los valores basales <strong>de</strong>l enfermo en particular.<br />
RECEPTORES HORMONALES<br />
Son estructuras proteicas encargadas <strong>de</strong>l reconocimiento <strong>de</strong> las hormonas por<br />
sus células diana.<br />
Se emplean como marcadores tumorales dos tipos <strong>de</strong> receptores: los receptores<br />
<strong>de</strong> estrógeno y los receptores <strong>de</strong> progesterona.<br />
Se utilizan para valorar la sensibilidad <strong>de</strong> los tumores malignos <strong>de</strong> mama a la<br />
respuesta hormonal. Su <strong>de</strong>terminación también permite la correcta aplicación y<br />
selección <strong>de</strong> la terapia en función <strong>de</strong> la hormono<strong>de</strong>pen<strong>de</strong>ncia o no <strong>de</strong>l tumor.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
HORMONAS COMO MARCADORES TUMORALES<br />
La <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> la producción hormonal ectópica pue<strong>de</strong> emplearse como un<br />
marcador bioquímico para la monitorización <strong>de</strong> pacientes con tumores<br />
confirmados o con sospecha.<br />
En aproximadamente dos tercios <strong>de</strong> los pacientes, la producción ectópica <strong>de</strong> la<br />
hormona adrenocorticotrópica (ACTH) se asocia con carcinoma pulmonar<br />
mientras que otros tumores, como los carcinoi<strong>de</strong>s bronquiales y los tumores<br />
pancreáticos y tímicos, son responsables <strong>de</strong>l resto <strong>de</strong> los casos.<br />
El carcinoma <strong>de</strong> células renales y el carcinoma epi<strong>de</strong>rmoi<strong>de</strong> <strong>de</strong> pulmón son<br />
responsables <strong>de</strong> aproximadamente dos tercios <strong>de</strong> los tumores productores <strong>de</strong><br />
hormona paratiroi<strong>de</strong>a (PTH) ectópica, mientras que el resto <strong>de</strong> los tumores se<br />
originan en distintas localizaciones.<br />
Los tumores responsables <strong>de</strong> la producción <strong>de</strong> hormona antidiurética (ADH) son<br />
los pulmonares y pancreáticos.<br />
La producción <strong>de</strong> hormona <strong>de</strong>l crecimiento (GH) ha sido <strong>de</strong>scrita solamente en<br />
asociación con unos pocos tumores, los más frecuentes <strong>de</strong> los cuales son el<br />
carcinoma broncogénico y el gástrico. En pacientes con carcinoma broncogénico<br />
se ha observado el lactógeno placentario humano (LPH) como marcador<br />
tumoral.<br />
La eritropoyetina se ha <strong>de</strong>tectado en relación a la patología neoplásica renal,<br />
pero, dado que el riñón es normalmente responsable <strong>de</strong> su producción, estos<br />
tumores no pue<strong>de</strong>n <strong>de</strong>tectarse como síndromes ectópicos. Sin embargo, dicha<br />
sustancia ha sido secretada por hepatomas y tumores cerebelosos; los tumores<br />
pulmonares son característicos por no secretar esta hormona.<br />
La tirocalcitonina sérica (TCT) aparece aumentada en ciertos pacientes con<br />
carcinoma pulmonar, colónico, mamario, pancreático y gástrico.<br />
MARCADORES TUMORALES ANATOMOPATOLÓGICOS<br />
La cuantificación <strong>de</strong> marcadores tumorales en sangre es sencilla y práctica. Sin<br />
embargo, el conocimiento <strong>de</strong> la propia masa tumoral también nos proporciona<br />
valiosa información.<br />
Para precisar el tipo <strong>de</strong> neoplasia y su posible histogénesis: epi<strong>tel</strong>ial (carcinoma),<br />
mesenquimatoso (sarcoma), linfoi<strong>de</strong> (linfoma) etc. e intentar <strong>de</strong>terminar la<br />
localización primaria ante una neoplasia metastásica, el anatomopatólogo cuenta<br />
con una serie <strong>de</strong> marcadores que resumimos a continuación:<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
A) Marcadores tumorales histoquímicos: En general los marcadores<br />
histoquímicos pue<strong>de</strong>n ser muy útiles en el diagnóstico<br />
anatomopatológico <strong>de</strong> procesos metastáticos en los que no se conoce<br />
la localización <strong>de</strong>l tumor primitivo.<br />
a) Glucógeno: Tiene valor en el diagnóstico general <strong>de</strong> las<br />
neoplasias.<br />
b) Sustancia mucoi<strong>de</strong>s<br />
c) Lípidos<br />
d) Pigmentos melánicos: Es un marcador diagnóstico <strong>de</strong> melanoma<br />
maligno.<br />
B) Marcadores tumorales inmunohistoquímicos <strong>de</strong> carácter general: Las<br />
técnicas inmunohistoquímicas aplicadas a la patología tumoral pue<strong>de</strong>n<br />
contribuir a realizar el diagnóstico diferencial <strong>de</strong> los tumores, i<strong>de</strong>ntificar<br />
probables agentes etiológicos y subclasificarlos diversos tipos <strong>de</strong><br />
tumores.<br />
a) Filamentos intermedios: son un componente importante <strong>de</strong>l<br />
citoesqueleto celular cuya función primordial es mantener la<br />
forma calular y la organización espacial <strong>de</strong> los orgánulos<br />
citoplasmáticos.<br />
a.1) Citoqueratinas<br />
a.2) Vimentina<br />
a.3) Desmina<br />
a.4) Proteina ácida glial fibrilar<br />
a.5) Neurofilamentos<br />
b) Proteína S-100: Se emplea en el diagnóstico <strong>de</strong> tumores<br />
indiferenciados. En ausencia <strong>de</strong> citoqueratinas y antígeno<br />
epi<strong>tel</strong>ial <strong>de</strong> membrana (EMA), la positividad <strong>de</strong> esta proteína es<br />
diagnóstica <strong>de</strong> melanoma maligno.<br />
c) Antígeno epi<strong>tel</strong>ial <strong>de</strong> membrana (EMA): Se emplea<br />
simultáneamente con las citoqueratinas para precisar el origen<br />
epi<strong>tel</strong>ial <strong>de</strong> un tumor indiferenciado.<br />
d) Antígeno leucocitario común (ALC): Este antígeno es positivo en<br />
linfomas.<br />
C) Otros marcadores inmunohistoquímicos<br />
a) Antígenos vasculares: Antígenos útiles en el diagnóstico <strong>de</strong><br />
tumores vasculares.<br />
a.1) Antígeno asociado al factor VIII<br />
a.2) Ulex europeus<br />
b) Antígenos <strong>de</strong> diferenciación neuroendocrina: Antígenos<br />
<strong>de</strong>mostrados en tumores neuroendocrinos y neuroectodérmicos.<br />
b.1) Enolasa específica neuronal<br />
b.2) Sinaptofisina<br />
b.3) Cromograninas<br />
c) Antígenos <strong>de</strong> naturaleza enzimática: Son antígenos poco útiles<br />
<strong>de</strong>bido a su baja sensibilidad que han quedado limitados a<br />
<strong>de</strong>terminados tumores.<br />
c.1) Lisozima<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
c.2) Alfa-1-antitripsina<br />
c.3) Alfa-1-antiquimotripsina<br />
d) Antígenos oncofetales<br />
d.1) AFP<br />
d.2) CEA<br />
e) Antígenos específicos<br />
e.1) Prostáticos (PSA y FAP): Ambos se expresan en procesos<br />
benignos y malignos <strong>de</strong> la glándula prostática.<br />
e.2) HMB 45: <strong>de</strong>tectado en melanomas y en los nevus pigmentocelulares.<br />
e.3) Alfa-lactoalbúmina: Tiene importancia en el diagnóstico <strong>de</strong><br />
carcinoma metastásico axilar en ausencia <strong>de</strong> clínica tumoral en<br />
mama.<br />
e.4) B 72.3: Marcador <strong>de</strong> glándulas apocrinas que se <strong>de</strong>muestra en<br />
la mayor parte <strong>de</strong> los carcinomas <strong>de</strong> mama.<br />
e.5) Ca 125: Glucoproteina <strong>de</strong> superficie observada en los tumores<br />
mucinosos <strong>de</strong> ovario, aunque también se ha evi<strong>de</strong>nciado en otros<br />
a<strong>de</strong>nocarcinomas: endometrio, gastrointestinal y mama.<br />
D) Marcadores ultraestructurales: la mayor parte <strong>de</strong>l diagnóstico<br />
anatomopatológico <strong>de</strong> los tumores se realiza con microscopio óptico y<br />
técnicas <strong>de</strong> inmunohistoquímica, pero en ocasiones, la microscopía<br />
electrónica <strong>de</strong> transmisión contribuye notablemente a i<strong>de</strong>ntificar algunos<br />
aspectos celulares <strong>de</strong> importancia.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
TEMA 5. LÍQUIDOS BIOLÓGICOS:<br />
CITOLOGÍA Y BIOQUÍMICA.<br />
Bajo el término <strong>de</strong> líquidos biológicos po<strong>de</strong>mos <strong>de</strong>finir a todos aquellos líquidos o<br />
fluidos corporales proce<strong>de</strong>ntes <strong>de</strong>l organismo, tales como:<br />
• Líquido cefalorraquí<strong>de</strong>o.<br />
• Líquido pleural.<br />
• Líquido sinovial.<br />
• Líquido pericárdico.<br />
• Líquido amniótico.<br />
A lo largo <strong>de</strong> este tema nos vamos a centrar en los que se consi<strong>de</strong>ran <strong>de</strong> mayor<br />
importancia, líquido cefalorraquí<strong>de</strong>o (LCR), y líquido sinovial.<br />
LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO<br />
El LCR, es el líquido seroso contenido en los ventrículos cerebrales, espacio<br />
subaracnoi<strong>de</strong>o y conducto medular. Se forma principalmente en los plexos<br />
coroi<strong>de</strong>os y espacio subaracnoi<strong>de</strong>o. Su volumen en adulto es <strong>de</strong> unos 150 ml y<br />
en recién nacido <strong>de</strong> 10 a 60 ml. Se renueva cada 2-4 horas y la velocidad a la<br />
que se forma es <strong>de</strong> unos 21 ml /h.<br />
Su aspecto es incoloro, claro y <strong>de</strong> baja viscosidad. No contiene apenas<br />
fibrinógeno, contiene pocas proteínas, principalmente albúmina y globulina, y su<br />
pH oscila entre 7.28 y 7.34.<br />
Se suelen obtener 2 tubos:<br />
Tubo 1: Para Microbiología.<br />
• Centrifugar con rapi<strong>de</strong>z.<br />
• Teñir el sedimento con Gram.<br />
• A la vez sembrar en medio especial.<br />
• Separar 3 ml en tubo estéril con tapón <strong>de</strong> rosca y heparina.<br />
• No conservar en frigorífico, pues algunos gérmenes se dañan.<br />
Tubo 2: Para Citología, Bioquímica y Serología.<br />
• Hacer estudio sin fijar y antes <strong>de</strong> que transcurran 2 horas <strong>de</strong>s<strong>de</strong> la<br />
extracción.<br />
• Centrifugar y usar el sobrenadante.<br />
• Se investiga glucosa y proteínas.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
• No conservar durante más <strong>de</strong> dos horas, pues los leucocitos consumen la<br />
glucosa.<br />
EXAMEN FÍSICO<br />
VOLUMEN<br />
Se mi<strong>de</strong> añadiendo agua a otro tubo <strong>de</strong> ensayo <strong>de</strong> las mismas características,<br />
hasta enrasar para no contaminarlo durante la manipulación.<br />
ASPECTO<br />
Normalmente limpio, claro y sin sedimento. Si se presenta turbio, pue<strong>de</strong> <strong>de</strong>berse<br />
a la presencia <strong>de</strong> leucocitos.<br />
COLOR<br />
Normalmente incoloro. Si el color oscila entre rosa pálido, anaranjado o<br />
amarillento se <strong>de</strong>nomina xantocromía y pue<strong>de</strong> <strong>de</strong>berse a:<br />
• Oxihemoglobina.<br />
• Metahemoglobina.<br />
• Bilirrubina.<br />
• Elevada concentración <strong>de</strong> proteínas (niveles superiores a 150 mg/dl).<br />
Tras una hemorragia subaracnoi<strong>de</strong>a (2-4 horas <strong>de</strong>spués) es normal la<br />
xantocromía, que <strong>de</strong>saparece tras 4 a 8 días.<br />
COÁGULOS Y SEDIMENTOS<br />
No <strong>de</strong>ben aparecer coágulos al <strong>de</strong>jarlo en reposo, pero si lo hacen pue<strong>de</strong>n<br />
indicar:<br />
• Coágulos sedimentados, en caso <strong>de</strong> meningitis purulenta.<br />
• Coágulos floculantes, en caso <strong>de</strong> sífilis.<br />
• Coágulos a modo <strong>de</strong> <strong>tel</strong>a <strong>de</strong> araña con películas suspendidas <strong>de</strong> la<br />
superficie <strong>de</strong>l líquido en meningitis tuberculosa.<br />
EXAMEN BIOQUÍMICO<br />
PROTEÍNAS<br />
El LCR contiene muy pocas proteínas en relación al plasma (14 -45 mg/100 ml),<br />
siendo las principales:<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Proteínas Plasma (mg/l) LCR (mg /l)<br />
Prealbúmina 238 17.3<br />
Albúmina 36600 236<br />
Transferrina 2040 142<br />
Ig G 9870 802<br />
Ig A 1750 1346<br />
Fibrinógeno 2960 4940<br />
Beta-lipoproteína 3726 6213<br />
Albúminas -> prealbúminas -> globulinas.<br />
Un aumento en la concentración <strong>de</strong> proteínas <strong>de</strong>l LCR pue<strong>de</strong> estar causada por:<br />
• Aumento en la permeabilidad <strong>de</strong> la barrera hematoencefálica por<br />
inflamación.<br />
• Meningitis purulenta.<br />
• Meningitis graves.<br />
• Caso <strong>de</strong> esclerosis múltiple u otras enfermeda<strong>de</strong>s <strong>de</strong>generativas <strong>de</strong>l SNC.<br />
• Alteraciones endocrinas, metabólicas, etc.<br />
• Aumento <strong>de</strong> la síntesis <strong>de</strong> proteínas en el SNC.<br />
A) Proteínas totales:<br />
Los métodos utilizados para medir las proteínas totales en LCR se clasifican en:<br />
a) Procedimientos turbidimétricos.<br />
• Ácido sulfosalicílico más sulfato sódico (SAS).<br />
• Ácido tricloroacético (TCA).<br />
b) Espectrofotometría ultravioleta a 210 nm <strong>de</strong>spués <strong>de</strong>:<br />
• Cromatografía en columna.<br />
• Ultra centrifugación.<br />
c) Método <strong>de</strong> Lowry utilizando el reactivo <strong>de</strong> Folin-ciocalteau.<br />
• Con blanco.<br />
• Sin blanco.<br />
d) Procedimientos modificados <strong>de</strong>l Biuret con medición a 330 nm.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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e) Fijación <strong>de</strong> colorante.<br />
• Ponceau.<br />
• Otros colorantes.<br />
f) Métodos inmunológicos.<br />
a) Procedimientos turbidimétricos:<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
Son muy utilizados, en ellos hay que controlar concienzudamente la temperatura,<br />
pues existe relación lineal entre temperatura y turbi<strong>de</strong>z, y la alteración <strong>de</strong> la<br />
primera daría resultados poco fiables. Son sencillos, pero se necesitan 500<br />
microlitros <strong>de</strong> LCR, frente a los 25 - 200 microlitros necesarios para otros<br />
métodos. Presentan interferencias en la xantocromía.<br />
b) La espectrofotometría ultravioleta a 210 nm se basa en que las proteínas<br />
presentan absorbancia intensa entre 210 y 220 nm. Su precisión es mayor que la<br />
<strong>de</strong> los métodos turbidimétricos.<br />
c) El método <strong>de</strong> Lowry con el reactivo <strong>de</strong> Folin, se utiliza mucho y tiene dos<br />
fases:<br />
1. Reacción entre las proteínas y el cobre.<br />
2. Reducción <strong>de</strong> los ácidos fonsfotúnsgico y fosfomolíbdico, con el complejo<br />
proteínas-cobre.<br />
Es un método más largo <strong>de</strong> realizar que los métodos turbidimétricos y presenta<br />
interferencias <strong>de</strong>rivadas <strong>de</strong> los fenoles.<br />
d) Procedimientos modificados <strong>de</strong>l Biuret.<br />
Son más largos y difíciles que los turbidimétricos y presentan interferencias<br />
<strong>de</strong>rivadas <strong>de</strong> polipéptidos <strong>de</strong> ca<strong>de</strong>na corta.<br />
f) Métodos inmunológicos.<br />
Son métodos simples y rápidos. Un aumento sensible en la concentración <strong>de</strong><br />
proteínas totales indica hiperreactividad capilar (inflamación, neoplasia,<br />
diabetes..., etc.). Un aumento en la concentración <strong>de</strong> las globulinas pue<strong>de</strong> indicar<br />
plasmocitoma <strong>de</strong>l SNC o esclerosis múltiple.<br />
B) Glucosa<br />
Los valores normales <strong>de</strong> glucosa en LCR son <strong>de</strong> 40 - 80 mg/dl (50% - 80% <strong>de</strong> la<br />
concentración en sangre, con pacientes en ayunas).<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Una disminución <strong>de</strong> los niveles <strong>de</strong> glucosa pue<strong>de</strong> indicar meningitis purulenta,<br />
abscesos cerebrales, tumores, etc.<br />
La <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> la glucosa en LCR se pue<strong>de</strong> hacer por los métodos<br />
espectrofotométricos <strong>de</strong>:<br />
C) Enzimas<br />
• Folin Wu.<br />
• Glucosa-oxidasa.<br />
• Ortotoluidina.<br />
En LCR están presentes muchas enzimas (GOT, GPT, etc.), pero solo la LDH<br />
(lactato <strong>de</strong>shidrogenasa) parece clínicamente útil. La LDH aumenta en los<br />
siguientes casos:<br />
• Leucemia.<br />
• Hemorragia subaracnoi<strong>de</strong>a.<br />
• Meningitis bacteriana.<br />
• Tumores <strong>de</strong>l SNC.<br />
CITOLOGÍA<br />
EXAMEN MICROSCÓPICO<br />
El LCR apenas presenta células, suele ser normal:<br />
• En adulto, <strong>de</strong> 0 a 0.5 células mononucleadas (linfo y monocitos) por mm 3 .<br />
• En niño <strong>de</strong> 0 a 30.<br />
• La presencia <strong>de</strong> hematíes suele ser anormal.<br />
RECUENTO CELULAR<br />
Debe efectuarse antes <strong>de</strong> 1 hora tras la extracción. Se <strong>de</strong>ben rechazar las<br />
muestras con sangre a simple vista.<br />
Para el recuento se utiliza una cámara cuentaglóbulos como la <strong>de</strong> Neubauer. Un<br />
aumento anormal <strong>de</strong> células se llama pleocitosis y es causada por tumores<br />
cerebrales, meningitis tuberculosa, etc.<br />
CITODIAGNÓSTICO<br />
Recuento diferencial:<br />
El primer paso <strong>de</strong> un recuento diferencial <strong>de</strong> LCR es concentrar los leucocitos a<br />
través <strong>de</strong> distintas técnicas como:<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
• Centrifugación, con tinción <strong>de</strong> Wright <strong>de</strong>l sedimento resuspendido<br />
(también con May-Grumwald-Giemsa).<br />
• Filtración con Millipore o Nucleopore, etc.<br />
El paso siguiente consiste en observar al microscopio (100X), contar las células<br />
y clasificarlas en; linfocitos neutrófilos, segmentados, células endo<strong>tel</strong>iales, etc.,<br />
expresando su concentración en porcentaje.<br />
Los valores normales suelen ser:<br />
Tipo celular Adulto Recién nacido<br />
Linfocitos 62% 20%<br />
Células meso<strong>tel</strong>iales<br />
y monocitos<br />
36% 72%<br />
Neutrófilos 2% 3%<br />
Histocitos raros raros<br />
Eosinófilos raros raros<br />
En las meningitis purulentas aumenta el número <strong>de</strong> neutrófilos segmentados. En<br />
las pielonefritis agudas, primero aumento el número <strong>de</strong> neutrófilos y <strong>de</strong>spués el<br />
<strong>de</strong> linfocitos pequeños.<br />
LIQUIDO SINOVIAL<br />
FUNCIÓN, RECOGIDA DE MUESTRAS Y MANIPULACIÓN<br />
Es un ultrafiltrado <strong>de</strong>l plasma al que se une el ácido hialurónico, elaborado por<br />
las células <strong>de</strong> la membrana sinovial. Proporciona lubricación y nutrientes a las<br />
células cartilaginosas <strong>de</strong> la articulación.<br />
Normalmente la cantidad es <strong>de</strong> 3-4 ml a no ser que exista <strong>de</strong>rrame, enfermedad,<br />
etc.<br />
La técnica <strong>de</strong> extracción se <strong>de</strong>nomina artrocentesis y consiste en aspirar<br />
percutáneamente todo el líquido <strong>de</strong> la cavidad sinovial, mediante jeringa <strong>de</strong><br />
plástico estéril.<br />
El paciente preferentemente estará en ayunas 6-2 horas antes (importante para<br />
los niveles <strong>de</strong> glucosa). Pue<strong>de</strong> dar información sobre:<br />
• Sospecha <strong>de</strong> infección (artritis supurativa).<br />
• Artritis por ácido úrico (gota).<br />
• Artritis por pirofosfato cálcico (pseudogota, etc).<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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Tubo 1, para serología:<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
• De 5-10 ml sin anticoagulante.<br />
• Centrifugar y usar sobrenadante.<br />
Tubo 2, para bacteriología:<br />
• Sin anticoagulante.<br />
• Si se sospecha infección por gonococos, sembrar directamente en<br />
Tayer-Martin.<br />
Tubo 3, para citología/ bioquímica:<br />
• Usar heparina como anticoagulante (25 U/ml).<br />
• No <strong>de</strong>ben formarse coágulos, si los hay indica tardanza o mala ejecución<br />
<strong>de</strong>l mezclado.<br />
Pue<strong>de</strong> conservarse a -4º C, para analizar inmediatamente y a -70º C para<br />
serología.<br />
El examen habitual <strong>de</strong>l líquido sinovial incluye:<br />
• Determinación <strong>de</strong> su aspecto.<br />
• Resultados <strong>de</strong> la prueba <strong>de</strong>l coágulo <strong>de</strong> mucina.<br />
• Estudio microscópico con luz polarizada compensada.<br />
• Tinción <strong>de</strong> Gram.<br />
• Cultivo.<br />
• Nivel <strong>de</strong> glucosa.<br />
Ninguna <strong>de</strong> estas pruebas, excepto la tinción <strong>de</strong> Gram y la i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong><br />
cristales, pue<strong>de</strong> consi<strong>de</strong>rarse altamente específica para <strong>de</strong>terminar el tipo <strong>de</strong><br />
artritis.<br />
EXAMEN MACROSCÓPICO<br />
El aspecto normal <strong>de</strong>l líquido sinovial es transparente y <strong>de</strong> color amarillo pálido.<br />
La turbi<strong>de</strong>z sugiere inflamación, aunque no necesariamente.<br />
PRUEBA DEL COÁGULO DE MUCINA<br />
Sirve para calcular la viscosidad, consiste en colocar una gota <strong>de</strong>l líquido sobre<br />
el <strong>de</strong>do pulgar y tocar con otro <strong>de</strong>do <strong>de</strong> la mano. Al separar los <strong>de</strong>dos, el líquido<br />
<strong>de</strong>be formar un hilo <strong>de</strong> 4-6 cm. <strong>de</strong> longitud. Si el hilo se rompe antes <strong>de</strong> 3 cm..,<br />
<strong>de</strong>be consi<strong>de</strong>rarse viscosidad menor <strong>de</strong> la normal.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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CITOLOGÍA<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
RECUENTO CELULAR DE LEUCOCITOS<br />
Pue<strong>de</strong> hacerse con hemocitómetro, o en cámara <strong>de</strong> Fuchs-Rosenthal.<br />
• Para microscopio óptico normal utilizar diluyente con 0.1% <strong>de</strong> azul <strong>de</strong><br />
metileno (facilita el reconocimiento <strong>de</strong> leucocitos).<br />
• Para microscopio <strong>de</strong> contraste <strong>de</strong> fase no es necesario colorante.<br />
• Si el líquido aparece muy manchado <strong>de</strong> sangre, es necesario lisar los<br />
eritrocitos previamente.<br />
Son valores normales:<br />
• 100.000 leucocitos /microlitro.<br />
• Valores normales indican infección bacteriana normalmente.<br />
RECUENTO DIFERENCIAL<br />
Para calcular el porcentaje <strong>de</strong> neutrófilos pue<strong>de</strong> utilizarse:<br />
• Tinción <strong>de</strong> Wright (sin concentrar).<br />
• Tinción <strong>de</strong> Wright <strong>de</strong>l sedimento centrifugado.<br />
• Tinción <strong>de</strong> Wright <strong>de</strong>l líquido concentrado por citocentrifugación (previa<br />
tinción <strong>de</strong> Papanicolau)<br />
La técnica microscópica elegida casi siempre es la <strong>de</strong> contraste <strong>de</strong> fase. Cuando<br />
se dan los resultados <strong>de</strong> un recuento diferencial, habitualmente solo se hace<br />
mención al porcentaje <strong>de</strong> neutrófilos.<br />
El valor normal <strong>de</strong> estos suele ser <strong>de</strong>l 25%. Un porcentaje muy alto (90% o más)<br />
es indicativo <strong>de</strong> artritis bacteriana.<br />
Morfología celular:<br />
• Células AR; son neutrófilos en cuyo citoplasma aparecen, tanto en<br />
microscopia óptica, como <strong>de</strong> fase, pequeños gránulos (<strong>de</strong> 10 a 20)<br />
citoplasmáticos oscuros con diámetro entre 0.5 y 2 micras. Los gránulos<br />
pue<strong>de</strong>n i<strong>de</strong>ntificarse claramente con contraste <strong>de</strong> fase o inmersión en<br />
aceite, y pue<strong>de</strong> ser <strong>de</strong>mostrada su presencia con técnicas <strong>de</strong><br />
inmunofluorescencia. Aparecen en artritis reumatoi<strong>de</strong>, gota y artritis<br />
séptica.<br />
• Células LE; en el Lupus Eritematoso, aparecen en líquido sinovial unas<br />
células <strong>de</strong> características particulares <strong>de</strong>nominadas células LE.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
• Gran<strong>de</strong>s células histiocíticas con inclusiones citoplasmáticas, aparecen al<br />
teñir con Giemsa y con Papanicolau en el síndrome <strong>de</strong> Reiter.<br />
• Células cartilaginosas multinucleares; se presentan en la osteoartritis,<br />
para i<strong>de</strong>ntificarlas se tiñe con Papanicolau.<br />
Cristales; se han <strong>de</strong>scrito 4 tipos asociados a las siguientes enfermeda<strong>de</strong>s:<br />
Artritis cristales <strong>de</strong> apatita<br />
Gota cristales <strong>de</strong> urato monosódico <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> los neutrófilos y<br />
macrófagos durante el ataque <strong>de</strong> gota, y fuera <strong>de</strong> ellos en<br />
época <strong>de</strong> no ataque<br />
Pseudogota cristales <strong>de</strong> <strong>de</strong>hidrato <strong>de</strong> pirofosfato cálcico<br />
Artritis<br />
crónica<br />
cristales <strong>de</strong> <strong>de</strong>hidrato <strong>de</strong> talco (introducidos en una<br />
intervención quirúrgica)<br />
EXAMEN BIOQUÍMICO. INTERVALOS DE REFERENCIA DEL LÍQUIDO<br />
SINOVIAL.<br />
Líquido Sinovial Plasma<br />
Proteínas 1-3gr/dl 6-8 gr/dl<br />
Albúmina 55-70% 50-65%<br />
Alfa-globulina 5-7% 3-5%<br />
Beta-globulina 8-10% 8-14%<br />
Gamma-globulina 10-14% 12-22%<br />
Glucosa 70-110 mg/dl 70-110 mg/dl<br />
PH 7.3-7.4 7.38-7.44 arterial<br />
7.36-7.42 venoso<br />
Las proteínas presentes en líquido sinovial <strong>de</strong>pen<strong>de</strong>n <strong>de</strong> las presentes en<br />
plasma. Si aumenta el nivel <strong>de</strong> proteínas en plasma, también lo hace en el<br />
líquido sinovial.<br />
La concentración <strong>de</strong> una proteína específica se expresa normalmente como<br />
cociente líquido sinovial/plasma.<br />
La glucosa en plasma y en líquido sinovial presenta valores muy similares. Es<br />
importante obtener la muestra en ayuno <strong>de</strong> 6 a 12 horas.<br />
También se presentan enzimas como la fosfatasa ácida, LDH y transaminasas,<br />
pero su <strong>de</strong>terminación parece tener escaso valor clínico.<br />
La <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> pH y <strong>de</strong> lactato proporciona un índice útil <strong>de</strong> la inflamación,<br />
pero es inespecífico <strong>de</strong> la etiología.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
TEMA 6. ANÁLISIS CUALITATIVO DEL<br />
SEDIMENTO URINARIO<br />
INTRODUCCIÓN<br />
El examen <strong>de</strong>l sedimento urinario compren<strong>de</strong> la investigación e interpretación <strong>de</strong><br />
una serie <strong>de</strong> estructuras <strong>de</strong> distinto origen y composición que pasaremos a ver<br />
<strong>de</strong>tenidamente en este tema.<br />
Realizado en las <strong>de</strong>bidas condiciones el examen microscópico <strong>de</strong>l sedimento<br />
urinario proporciona una ayuda indiscutible en el estudio <strong>de</strong>l diagnóstico y<br />
evolución <strong>de</strong> las enfermeda<strong>de</strong>s renales.<br />
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA<br />
El examen <strong>de</strong>l sedimento urinario es más seguro cuando la orina está<br />
concentrada. Si la muestra está <strong>de</strong>masiado diluida y los elementos celulares<br />
lisados, la cantidad <strong>de</strong>l sedimento obtenida incluso <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> centrifugación<br />
pue<strong>de</strong> no ser representativa.<br />
El examen microscópico se hace generalmente con el sedimento obtenido por<br />
centrifugación <strong>de</strong> la orina.<br />
Un sedimento pue<strong>de</strong> prepararse <strong>de</strong> la siguiente forma (la técnica, en la<br />
actualidad, no se encuentra totalmente estandarizada):<br />
1. Mezclar bien la muestra <strong>de</strong> orina y transferir un volumen<br />
aproximadamente <strong>de</strong> 10 ml a un tubo <strong>de</strong> centrífuga cónico.<br />
2. Centrifugar a 1500 rpm durante 5 minutos.<br />
3. Decantar la muestra. Volver a suspen<strong>de</strong>r el sedimento en unas gotas <strong>de</strong><br />
orina.<br />
4. Colocar la gota <strong>de</strong> sedimento sobre un porta y taparla con un cubre. La<br />
gota no ha <strong>de</strong> ser <strong>de</strong>masiado gran<strong>de</strong>, <strong>de</strong>biendo evitarse la formación <strong>de</strong><br />
burbujas.<br />
5. Examinar la preparación antes <strong>de</strong> que se produzca evaporación.<br />
6. Examinar en primer lugar un área gran<strong>de</strong> con poco aumento. Luego<br />
reducir la intensidad <strong>de</strong> luz al mínimo y examinar varios campos en busca<br />
<strong>de</strong> cilindros. Finalmente, enfocar con mayor aumento (40x). Examinar<br />
varios campos para evaluar células y otros.<br />
El sedimento obtenido mediante centrifugación <strong>de</strong> la orina contiene todos<br />
aquellos materiales insolubles (<strong>de</strong>nominados también elementos formes) que se<br />
han acumulado en la orina durante el proceso <strong>de</strong> formación (células,<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
microorganismos, cilindros, etc.) contiene también cristales <strong>de</strong> distintas formas y<br />
tamaños <strong>de</strong>pendiendo <strong>de</strong>l pH <strong>de</strong> la orina, y generalmente (salvo excepciones) <strong>de</strong><br />
poca importancia clínica.<br />
Muchos laboratorios utilizan la microscopía <strong>de</strong> contraste <strong>de</strong> fases para la<br />
interpretación <strong>de</strong>l sedimento urinario, en especial la observación <strong>de</strong> cilindros.<br />
IDENTIFICACIÓN DE ELEMENTOS ESPECÍFICOS<br />
EN EL SEDIMENTO<br />
Clasificación:<br />
Sedimento organizado<br />
Hematíes<br />
Leucocitos<br />
Células epi<strong>tel</strong>iales<br />
o Células escamosas<br />
o Células <strong>de</strong> transición<br />
o Células renales<br />
Microorganismos<br />
o Bacterias<br />
o Levaduras<br />
o Protozoos<br />
o Parásitos<br />
Espermatozoi<strong>de</strong>s<br />
Cilindros<br />
o Hialinos<br />
o Epi<strong>tel</strong>iales<br />
o Granulosos<br />
o Eritrocitarios<br />
o Leucocitarios<br />
o Céreos<br />
o Cilindroi<strong>de</strong>s<br />
Sedimento no organizado<br />
Cristales<br />
o pH ácido<br />
Uratos<br />
Ácido úrico<br />
o pH alcalino<br />
Fosfatos triples<br />
Fosfatos amorfos<br />
Carbonato cálcico<br />
o pH variable<br />
Oxalato cálcico<br />
Cistina<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Colesterol<br />
Tirosina<br />
Leucina<br />
GLÓBULOS ROJOS<br />
Aparecen en el sedimento como formas circulares, carecen <strong>de</strong> núcleo y refractan<br />
un poco la luz. Presenta aspecto <strong>de</strong> disco transparente. Son <strong>de</strong> menor tamaño<br />
que los leucocitos y las células epi<strong>tel</strong>iales.<br />
No <strong>de</strong>be consi<strong>de</strong>rarse patológica la aparición <strong>de</strong> 2/3 hematíes por campo, en el<br />
estudio <strong>de</strong>l sedimento. Cuando la orina contiene un número elevado <strong>de</strong><br />
hematíes y aparezcan a<strong>de</strong>más cilindros hemáticos hay que consi<strong>de</strong>rar que la<br />
hematuria es <strong>de</strong> origen renal. El aumento <strong>de</strong> glóbulos rojos en orina se conoce<br />
como hematuria.<br />
GLÓBULOS BLANCOS<br />
Son más gran<strong>de</strong>s que los rojos. Contienen uno o más núcleos. Su presencia en<br />
orina indica generalmente<br />
inflamación. Son valores<br />
normales en el hombre<br />
menos <strong>de</strong> 3/campo y en la<br />
mujer menos <strong>de</strong> 5/campo.<br />
En la mayoría <strong>de</strong> los<br />
trastornos renales o <strong>de</strong>l<br />
tracto urinario se produce<br />
un incremento <strong>de</strong> la cifra<br />
<strong>de</strong> leucocitos en orina,<br />
que afecta principalmente<br />
a los neutrófilos. También<br />
pue<strong>de</strong> observarse un<br />
aumento temporal en caso<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
<strong>de</strong> fiebre y <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> un ejercicio intenso. Si su presencia va acompañada <strong>de</strong><br />
cilindros leucocitarios o que contengan leucocitos y células epi<strong>tel</strong>iales, la<br />
elevación <strong>de</strong> la cifra <strong>de</strong> leucocitos presentes en la orina se consi<strong>de</strong>ra <strong>de</strong> origen<br />
renal. Su aumento en orina se conoce como Leucocituria o piuria.<br />
CÉLULAS EPITELIALES<br />
Son varias veces más gran<strong>de</strong>s que los glóbulos rojos o blancos. Según su origen<br />
tienen diferentes formas, pero la i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong>l origen <strong>de</strong> estas células pue<strong>de</strong><br />
ser en ocasiones dificultoso. Cuando la distinción es posible, po<strong>de</strong>mos encontrar:<br />
Células epi<strong>tel</strong>iales escamosas. Proce<strong>de</strong>n <strong>de</strong> la porción distal <strong>de</strong>l tracto urinario<br />
inferior y <strong>de</strong>l tracto genital femenino. Son las <strong>de</strong> mayor tamaño. Se trata <strong>de</strong><br />
células planas con un gran citoplasma y núcleo simple. Son poco significativas,<br />
a menos que su presencia sea muy abundante.<br />
Células <strong>de</strong> transición (pelvis renal). Su forma es redon<strong>de</strong>ada u oval. En<br />
ocasiones parecen tener una proyección en forma <strong>de</strong> cola (células en raqueta)<br />
La orina normal pue<strong>de</strong> contener cierto numero <strong>de</strong> estas células como resultado<br />
<strong>de</strong>l proceso normal <strong>de</strong> <strong>de</strong>scamación. Cuando aparecen en gran número indica la<br />
existencia <strong>de</strong> un proceso patológico causante <strong>de</strong> exfoliación anormal.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
• Células renales (pelvis y túbulos renales). Son células pequeñas y<br />
redon<strong>de</strong>adas. La presencia <strong>de</strong> más <strong>de</strong> dos células epi<strong>tel</strong>iales <strong>de</strong>l túbulo<br />
renal por campo <strong>de</strong> gran aumento indica un daño activo o una lesión<br />
tubular renal.<br />
MICROORGANISMOS<br />
Bacterias. La orina normal fresca no contiene microorganismos. Debemos tener<br />
en cuenta que si la orina no ha sido recogida en condiciones a<strong>de</strong>cuadas pue<strong>de</strong><br />
tener contaminación. A<strong>de</strong>más si la orina permanece a temperatura ambiente<br />
durante algún tiempo, las bacterias pue<strong>de</strong>n proliferar rápidamente y se ven en<br />
gran número. Una orina muy alcalina con muchas bacterias y muy pocos<br />
glóbulos blancos es característica <strong>de</strong> muestras contaminadas.<br />
La bacteriuria pue<strong>de</strong> informarse como escasa, mo<strong>de</strong>rada o intensa.<br />
Generalmente en caso <strong>de</strong> que aparezca <strong>de</strong>be realizarse un estudio<br />
microbiológico <strong>de</strong> la orina.<br />
Levaduras. La más común en el sedimento es la Cándida Albicans.<br />
Frecuentemente su presencia en mujeres es consecuencia <strong>de</strong> una<br />
contaminación <strong>de</strong> la orina. Las levaduras se diferencian <strong>de</strong> los hematíes en que<br />
no se pue<strong>de</strong>n teñir con eosina.<br />
Parásitos. La presencia <strong>de</strong><br />
parásitos en la orina suele<br />
indicar contaminación genital<br />
o fecal. El flagelado<br />
Trichomonas Vaginalis es el<br />
parásito más común hallado<br />
en la orina. La inci<strong>de</strong>ncia <strong>de</strong><br />
este tipo <strong>de</strong> parasitismo es<br />
muy elevada en las mujeres<br />
y pue<strong>de</strong> ser causa <strong>de</strong><br />
vaginitis intensa.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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ESPERMATOZOIDES<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
La presencia <strong>de</strong> espermatozoi<strong>de</strong>s en la orina es un hecho bastante frecuente y<br />
carece <strong>de</strong> significación patológica. Están formados por una cabeza ovoi<strong>de</strong> y por<br />
una larga cola.<br />
CILINDROS<br />
Son conglomerados alargados <strong>de</strong> material proteico formados en los túbulos<br />
renales o en los conductos colectores. La formación <strong>de</strong> cilindros es mayor<br />
cuando el pH es bajo y existe obstrucción <strong>de</strong> la nefrona provocada por restos<br />
celulares o células.<br />
Normalmente el sedimento urinario no contiene cilindros, aunque su <strong>de</strong>tección<br />
no indica forzosamente la existencia <strong>de</strong> una patología renal. Sin embargo,<br />
generalizando, podríamos <strong>de</strong>cir que la presencia numerosa <strong>de</strong> cilindros en un<br />
sedimento urinario es indicativa <strong>de</strong> enfermedad renal.<br />
El tamaño y la forma <strong>de</strong> los cilindros <strong>de</strong>pen<strong>de</strong>n <strong>de</strong>l lugar en que se forman. Los<br />
más gran<strong>de</strong>s proce<strong>de</strong>n <strong>de</strong> los túbulos dilatados, los más finos <strong>de</strong> los túbulos<br />
comprimidos o se <strong>de</strong>ben a una <strong>de</strong>sintegración. A veces son contorneados y<br />
ocasionalmente muestran ramificaciones.<br />
Hialinos. Se trata <strong>de</strong> cilindros compuestos fundamentalmente <strong>de</strong> proteínas sin<br />
inclusiones. Son pálidos y transparentes. Difíciles <strong>de</strong> visualizar. Su aparición en<br />
gran<strong>de</strong>s cantida<strong>de</strong>s pue<strong>de</strong> indicar una alteración importante <strong>de</strong>l parénquima<br />
renal.<br />
Epi<strong>tel</strong>iales. Son más cortos que los hialinos y más fáciles <strong>de</strong> ver. Indican<br />
inflamación aguda <strong>de</strong>l riñón. Contiene <strong>de</strong>ntro células epi<strong>tel</strong>iales. En las unida<strong>de</strong>s<br />
<strong>de</strong> trasplante, estos cilindros son uno <strong>de</strong> los criterios más fiables para el<br />
diagnóstico <strong>de</strong> rechazo agudo a partir <strong>de</strong>l tercer día <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> la intervención.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Granulosos. Pue<strong>de</strong>n ser <strong>de</strong>bidos a una evolución <strong>de</strong> los cilindros <strong>de</strong> células<br />
epi<strong>tel</strong>iales en los que ha existido una <strong>de</strong>generación celular. Presentan un<br />
aspecto granular con granulaciones más o menos finas (cilindros granulosos<br />
finos o gruesos). Su presencia implica un trastorno crónico <strong>de</strong>l riñón.<br />
Eritrocitarios. Contienen glóbulos rojos en su interior. Tienen un aspecto muy<br />
variable. Suelen ser indicativo <strong>de</strong> glomerulonefritis por causa diversa.<br />
Leucocitarios. Se caracterizan por la aparición <strong>de</strong> leucocitos i<strong>de</strong>ntificables en el<br />
interior <strong>de</strong> la matriz proteica. Acompaña a las infecciones <strong>de</strong>l tracto urinario. Su<br />
presencia exige una investigación bacteriológica <strong>de</strong> la orina.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Céreos. Se caracterizan por un alto índice <strong>de</strong> refracción y una coloración<br />
amarillenta. Su composición no es bien conocida. Se ven asociados a procesos<br />
crónicos.<br />
Cilindroi<strong>de</strong>s, fibrina, células epi<strong>tel</strong>iales, leucocitos, eritrocitos o bacterias<br />
pue<strong>de</strong>n agruparse dando formas semejantes a los cilindros. Generalmente se<br />
distinguen <strong>de</strong> los cilindros verda<strong>de</strong>ros por sus contornos variables e irregulares.<br />
No se conoce con exactitud su lugar <strong>de</strong> proce<strong>de</strong>ncia ni la causa <strong>de</strong> su formación.<br />
CRISTALES<br />
Cristales <strong>de</strong> muy diferentes formas y tamaños se ven habitualmente en la orina,<br />
aunque solo ocasionalmente su presencia tiene algún significado. La cristaluria<br />
pue<strong>de</strong> ser asintomática o ir asociada a la formación <strong>de</strong> cálculos, dando lugar a<br />
las manifestaciones clínicas que acompañan a una obstrucción completa o<br />
parcial <strong>de</strong>l flujo urinario.<br />
El pH <strong>de</strong> la orina tiene importancia en la aparición <strong>de</strong> los distintos tipos <strong>de</strong><br />
cristales.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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pH ácido:<br />
Uratos<br />
Ácido úrico<br />
pH alcalino:<br />
Fosfatos triples<br />
Fosfatos amorfos<br />
Carbonato cálcico<br />
pH variable:<br />
Oxalato cálcico<br />
Cistina<br />
Colesterol<br />
Tiroxina<br />
Leucina<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
Uratos. Los uratos amorfos aparecen como granulaciones oscuras, dando al<br />
sedimento una coloración rosada, amarillenta o anaranjada. Pue<strong>de</strong>n proce<strong>de</strong>r <strong>de</strong><br />
la alimentación aunque tambien aumentan en estados febriles.<br />
Cristales <strong>de</strong> Urato<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Ácido úrico. Toma formas diferentes como pesa, prisma, roseta, placas<br />
irregulares. No poseen significación clínica a menos que se presenten en gran<br />
cantidad en orinas recién emitidas. Los cálculos <strong>de</strong> ácido úrico o <strong>de</strong> uratos se<br />
encuentran aproximadamente en el 16% <strong>de</strong> los pacientes con gota.<br />
Fosfatos. Los cristales <strong>de</strong> fosfato triple (amónico, magnésico y cálcico) son<br />
incoloros y presentan forma típica <strong>de</strong> ataúd. Se encuentran en orinas alcalinas.<br />
Los cristales <strong>de</strong> fosfato cálcico son amorfos o tienen forma <strong>de</strong> prisma, roseta,<br />
aguja etc.<br />
Cristales <strong>de</strong> Fosfato<br />
Los fosfatos amorfos aparecen como granulaciones que confieren al sedimento<br />
una coloración blanquecina. Pue<strong>de</strong>n aparecer tras la ingestión <strong>de</strong> <strong>de</strong>terminados<br />
alimentos como la fruta.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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Cristales <strong>de</strong> Fosfato amónico-magnésico
TEMARIO DE T.E.L.<br />
Carbonato cálcico. Su forma característica es la <strong>de</strong> pesa, ocho, esfera. No<br />
tienen interés clínico.<br />
Oxalato cálcico. Suelen aparecer en forma <strong>de</strong> octaedro y presentan un<br />
característico cuadrado cruzado diagonalmente (se dice que tienen forma <strong>de</strong><br />
sobre). Pue<strong>de</strong>n producirse en caso <strong>de</strong> dietas ricas en oxalato (tomates, repollo<br />
espárragos, naranjas...)<br />
El oxalato cálcico, muchas veces mezclado con sales <strong>de</strong> fosfato, está presente<br />
en una gran parte <strong>de</strong> los cálculos urinarios.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Cistina. Son placas hexagonales. Su presencia es poco habitual y son<br />
indicativos <strong>de</strong> cistinuria (error metabólico congénito poco frecuente).<br />
Colesterol. Aparecen como placas transparentes <strong>de</strong> forma irregular. Su<br />
presencia es rara. Pue<strong>de</strong>n aparecer en nefritis e infecciones graves <strong>de</strong>l tracto<br />
urinario.<br />
Leucina y tirosina. Los cristales <strong>de</strong> estos dos aminoácidos suelen aparecer<br />
juntos en la orina como consecuencia generalmente <strong>de</strong> una grave enfermedad<br />
hepática. Suelen ser <strong>de</strong> color amarillento <strong>de</strong>bido a la presencia <strong>de</strong> bilirrubina<br />
(ictericia).<br />
Un conjunto <strong>de</strong> material no significativo pue<strong>de</strong> formar parte <strong>de</strong>l sedimento<br />
urinario. Son los <strong>de</strong>sechos o artefactos. A veces se <strong>de</strong>be a material <strong>de</strong> vejiga o<br />
uretra, pero otras se <strong>de</strong>be a contaminación. Es frecuente encontrar hilos<br />
mucosos, pelos, fibras diversas, etc. Su presencia pue<strong>de</strong> sugerir una recogida<br />
<strong>de</strong>fectuosa.<br />
SEDIMENTO NORMAL<br />
El sedimento normal no está libre <strong>de</strong> células o cilindros, pero contiene un número<br />
limitado <strong>de</strong> elementos formes. Una <strong>de</strong>finición precisa <strong>de</strong> la normalidad es difícil<br />
<strong>de</strong> obtener, pero la presencia <strong>de</strong> uno o más glóbulos rojos por campo <strong>de</strong> alto<br />
po<strong>de</strong>r, uno o dos leucocitos y algunas células epi<strong>tel</strong>iales no se consi<strong>de</strong>rarán<br />
necesariamente anormales. La orina <strong>de</strong> mujeres maduras pue<strong>de</strong> tambien<br />
contener un gran número <strong>de</strong> células epi<strong>tel</strong>iales escamosas proce<strong>de</strong>ntes <strong>de</strong> las<br />
pare<strong>de</strong>s vaginales.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
TEMA 7. ESTUDIO DE HECES:<br />
DIGESTIÓN, SANGRE OCULTA Y<br />
CUERPOS REDUCTORES.<br />
INTRODUCCIÓN<br />
Las materias fecales están constituidas en unas tres cuartas partes por agua.<br />
Las sustancias sólidas <strong>de</strong>l cuarto restante compren<strong>de</strong>n:<br />
• 30% <strong>de</strong> bacterias muertas.<br />
• 10 - 20% <strong>de</strong> grasa.<br />
• 2 - 3% <strong>de</strong> proteínas.<br />
• 10 - 20% <strong>de</strong> sustancias inorgánicas.<br />
• 30% <strong>de</strong> restos no digeribles, componentes sólidos <strong>de</strong>l jugo digestivo como<br />
pigmentos biliares y <strong>de</strong>tritus celulares.<br />
El estudio <strong>de</strong> laboratorio <strong>de</strong> muestras fecales <strong>de</strong> origen humano, permite obtener<br />
datos que nos sirve para <strong>de</strong>terminar:<br />
1.- La situación <strong>de</strong>l funcionalismo digestivo.<br />
2.- Infecciones intestinales causadas por virus, bacterias y hongos.<br />
3.- Infecciones causadas por parásitos intestinales.<br />
Este estudio tiene su máxima indicación en las diarreas crónicas, y compren<strong>de</strong> la<br />
observación macroscópica y microscópica <strong>de</strong> las heces, así como su análisis<br />
químico, bacteriológico y parasitológico.<br />
ESTUDIO DEL FUNCIONALISMO DIGESTIVO<br />
Con este estudio procuramos saber la digestión <strong>de</strong> los principios inmediatos. La<br />
digestión es el conjunto <strong>de</strong> fenómenos mecánicos y bioquímicos que<br />
transforman los constituyentes orgánicos más o menos complejos <strong>de</strong> los<br />
alimentos en sustancias simples directamente asimilables.<br />
Los alimentos son triturados en la boca sufriendo una división física. Luego<br />
comienza una disgregación química mediante fermentos digestivos y elementos<br />
bacterianos, siendo absorbidas, las sustancias transformadas, por la mucosa<br />
intestinal y por último los residuos no aprovechables <strong>de</strong> la digestión son<br />
expulsados fuera <strong>de</strong>l organismo.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
ALIMENTACIÓN PREVIA AL ANÁLISIS<br />
Se <strong>de</strong>be seguir con el régimen habitual <strong>de</strong> comidas, pero hay que añadir<br />
aquellos elementos que nos pue<strong>de</strong>n suministrar una base para el diagnóstico,<br />
como son:<br />
• Carne: Se investiga el tejido conjuntivo y fibras musculares. Debe<br />
comerse lo más cruda posible.<br />
• Patatas: Se investiga la digestión <strong>de</strong> almidón.<br />
• Grasa: Se tomará en forma <strong>de</strong> leche, mantequilla o carne.<br />
Este plan se sigue durante 3 días y luego se recoge la muestra <strong>de</strong> heces.<br />
TOMA DE MUESTRA<br />
Se recogerán las heces en un frasco limpio con cierre hermético, no es<br />
necesaria la esterilidad. El análisis se hará en las 12 horas siguientes a la<br />
<strong>de</strong>posición, guardando la muestra en el frigorífico a 4-10º C.<br />
Si el análisis se pospone más <strong>de</strong> 24 horas se añadirá un volumen igual al <strong>de</strong> las<br />
heces <strong>de</strong> una solución acuosa al 5% <strong>de</strong> formol comercial.<br />
CARACTERES ORGANOLÉPTICOS<br />
A) OLOR:<br />
a) Según la ingesta:<br />
o Inodoro: Meconio.<br />
o Aumentado: Comidas ricas en carne y pescado.<br />
o Débil: Dieta vegetariana y láctea.<br />
o Ligeramente agrio: Niños <strong>de</strong> pecho.<br />
b) Fecaloi<strong>de</strong> normal.<br />
c) Pútrido (olor a amoniaco)<br />
Debido a la flora proteolítica aumentada. Provoca diarreas <strong>de</strong><br />
putrefacción (heces alcalinas y gases).<br />
d) Agrio penetrante o rancio<br />
Debido a la flora sacarolítica aumentada. Provoca diarreas <strong>de</strong><br />
fermentación (heces ácidas y gases).<br />
e) Nauseabundo<br />
Debido a la <strong>de</strong>scomposición <strong>de</strong> tejidos, ocasionada por carcinoma,<br />
úlceras...<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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B) COLOR:<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
a) Marrón: Es el color habitual.<br />
b) Ver<strong>de</strong>:<br />
Pue<strong>de</strong> ser <strong>de</strong>bido a la ingesta (verduras, medicamentos...) o a la<br />
presencia <strong>de</strong> biliverdina (rapi<strong>de</strong>z <strong>de</strong>l tránsito intestinal, diarreas<br />
infantiles).<br />
c) Rojo:<br />
Debido a la ingesta (remolacha) o a la existencia <strong>de</strong> hemorragias<br />
próximas al ano.<br />
d) Negro:<br />
Debido a la ingesta (sangre, morcilla, espinacas), a los medicamentos<br />
(carbón, hierro, bismuto) o a hemorragias internas (heces pastosas,<br />
melenas).<br />
e) Blanco:<br />
Debido a la ingesta (leche, bario, caolín...) o a la ausencia <strong>de</strong> bilis<br />
fundamentalmente.<br />
f) Amarillo:<br />
Debido a la ingesta (régimen lácteo) o a diarreas <strong>de</strong> fermentación<br />
hidrocarbonada.<br />
C) CONSISTENCIA:<br />
Pue<strong>de</strong> ser dura, normal, pastosa, líquida...<br />
D) FORMA: Varía con la consistencia<br />
a) Cilíndrica: Es la normal.<br />
b) Laminada o en cinta: Debido a papilomas.<br />
c) Bolitas secas y duras: Estreñimiento.<br />
d) Bolitas en masas: Se presenta en la Salmonelosis.<br />
e) Bola maleable <strong>de</strong>l tamaño <strong>de</strong> un puño: Se presenta en la atonía <strong>de</strong>l<br />
recto (personas ancianas).<br />
E) VISCOSIDAD:<br />
Se <strong>de</strong>termina tocando las diferentes partes <strong>de</strong> las heces con un agitador<br />
<strong>de</strong> vidrio.<br />
a) Viscosas (pastosas): Se adhieren al agitador.<br />
b) Poco viscosas: No se adhieren al agitador.<br />
c) Grasas: Tienen gran maleabilidad mol<strong>de</strong>ándose en ellas el agitador,<br />
como tierra amasada.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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EXAMEN MACROSCÓPICO<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
Para este examen se tritura ligeramente en un mortero con agua una cantidad <strong>de</strong><br />
heces <strong>de</strong>l tamaño <strong>de</strong> una nuez. Luego se pasa a una placa <strong>de</strong> Petri y colocamos<br />
esta sobre una cartulina blanca y negra. Los fragmentos <strong>de</strong> carne aparecen <strong>de</strong><br />
color gris o marrón.<br />
El tejido conectivo tiene forma <strong>de</strong> membranas o paquetes filamentosos. Se<br />
pue<strong>de</strong> confundir con moco. Para diferenciarlo se añadirá ácido acético al 30% y<br />
si <strong>de</strong>saparece es tejido conectivo.<br />
El moco se pue<strong>de</strong> presentar <strong>de</strong> varias formas: amorfo, transparente, opaco (con<br />
restos celulares) y membranoso (en forma <strong>de</strong> paquetes o mol<strong>de</strong>s <strong>de</strong> la mucosa).<br />
La presencia <strong>de</strong> moco es importante, salvo en los recién nacidos, y siempre<br />
<strong>de</strong>berá resaltarse en el informe.<br />
SI<br />
OBSERVAMOS<br />
FRAGMENTOS<br />
DE CARNE<br />
FRAGMENTOS<br />
DE FÉCULAS<br />
(PATATAS,<br />
REMOLACHA)<br />
TEJIDO<br />
CONJUNTIVO<br />
PUEDE SER INDICATIVO<br />
INSUFICIENCIA GÁSTRICA:<br />
- Falta <strong>de</strong> secreción.<br />
- Tránsito acelerado.<br />
INDIVIDUO GASTRECTOMIZADO<br />
INSUFICIENCIA GÁSTRICA Y PANCREÁTICA<br />
ESCASA PERMANENCIA EN EL COLON<br />
INSUFICIENCIA GÁSTRICA<br />
MOCO INFLAMACIÓN DE LA MUCOSA INTESTINAL<br />
MOCO<br />
AMORFO,<br />
SANGRE, PUS<br />
MOCO<br />
MEMBRANOSO<br />
FALSAS<br />
MEMBRANAS<br />
COLITIS ULCEROSA<br />
DISENTERÍA BACILAR<br />
ENTEROCOLITIS PSEUDOMEMBRANOSA<br />
MIXORREAS NERVIOSAS<br />
ARTEFACTOS: Piel <strong>de</strong> embutidos, chicle...<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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ANÁLISIS MICROSCÓPICO<br />
Nos aporta datos más<br />
fi<strong>de</strong>dignos acerca <strong>de</strong> los<br />
trastornos <strong>de</strong> la<br />
digestión. Para ello<br />
habrá que instaurar la<br />
alimentación explicada<br />
anteriormente, si no se<br />
hace así la significación<br />
<strong>de</strong>l estudio es muy<br />
limitada.<br />
Para este estudio se<br />
hace una suspensión <strong>de</strong><br />
heces en agua <strong>de</strong>stilada<br />
o suero fisiológico.<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
1. Se coge una cantidad <strong>de</strong> heces, <strong>de</strong>l tamaño <strong>de</strong> una castaña, y se coloca<br />
en un mortero, copa, vaso <strong>de</strong> precipitado o tubo <strong>de</strong> ensayo.<br />
2. Se aña<strong>de</strong> agua o suero fisiológico y mezclar con una varilla hasta formar<br />
una papilla homogénea y fina, ni muy fluida ni muy espesa.<br />
3. Se coloca una gota <strong>de</strong> esta suspensión en un portaobjetos y se pone un<br />
cubreobjetos encima, cuidando que se extienda formando una capa<br />
<strong>de</strong>lgada, homogénea, sin burbujas <strong>de</strong> aire. No se <strong>de</strong>be aplastar el cubre.<br />
Se observará con el objetivo <strong>de</strong> x10 aumentos, obteniendo una visión <strong>de</strong><br />
conjunto, y luego se enfoca con el <strong>de</strong> x40 aumentos.<br />
Cuando se trata <strong>de</strong> heces líquidas, se <strong>de</strong>be hacer una mezcla homogénea y se<br />
coloca una gota directamente al portaobjeto.<br />
Podremos observar:<br />
A) CÉLULAS: Normalmente epi<strong>tel</strong>iales <strong>de</strong> las últimas porciones <strong>de</strong>l intestino.<br />
No son patológicas.<br />
B) LEUCOCITOS: Se observarán <strong>de</strong>formados. Si se encuentran en poca<br />
cantidad no es patológico. Se observan mejor mezclando la gota <strong>de</strong> la<br />
suspensión fecal con otra <strong>de</strong> azul <strong>de</strong> metileno <strong>de</strong> Loefler.<br />
C) HEMATÍES: Es muy raro observarlos ya que se digieren. Si aparecen<br />
será a causa <strong>de</strong> evacuación muy rápida o hemorragias en tramos<br />
intestinales bajos.<br />
D) CRISTALES: Presentan el mismo aspecto que en el sedimento urinario.<br />
Hay unos, característicos <strong>de</strong>l parasitismo intestinal, llamados cristales <strong>de</strong><br />
Charcot-Ley<strong>de</strong>n, presentando una forma típica <strong>de</strong> agujas <strong>de</strong> brújula.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
E) FIBRAS MUSCULARES: Se pue<strong>de</strong>n observar <strong>de</strong> diferentes formas<br />
<strong>de</strong>pendiendo <strong>de</strong>l grado <strong>de</strong> digestión:<br />
a) Mal digeridas:<br />
Fragmentos rectangulares estriados, débilmente amarillos. Las estrías<br />
son transversales y longitudinales. Los bor<strong>de</strong>s <strong>de</strong>l rectángulo son<br />
rectos.<br />
b) Parcialmente digeridas:<br />
Trozos más pequeños con los bor<strong>de</strong>s redon<strong>de</strong>ados y las estrías<br />
longitudinales.<br />
c) Bien digeridas:<br />
Trozos muy pequeños con los bor<strong>de</strong>s redon<strong>de</strong>ados y sin estrías.<br />
La presencia <strong>de</strong> fibras musculares mal digeridas se llama CREATORREA. Se<br />
pue<strong>de</strong> <strong>de</strong>ber a una insuficiencia gástrica o pancreática.<br />
F) TEJIDO CONJUNTIVO. Se observa como fibras o filamentos que se<br />
reúnen en fascículos y se entremezclan entre si. Son incoloros y no<br />
poseen estriación. Se podría confundir con el moco, pero se distinguen<br />
porque se transparentan al añadirle ácido acético al 30 %.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
G) ALMIDÓN. Para su investigación se aña<strong>de</strong> a la gota <strong>de</strong> emulsión fecal<br />
una gota <strong>de</strong> lugol. Los gránulos <strong>de</strong> almidón tomarán un u otro<br />
<strong>de</strong>pendiendo <strong>de</strong>l grado <strong>de</strong> digestión. También podrán estar <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong><br />
células o aislados:<br />
a) No digeridos: Azul oscuro, casi negro.<br />
b) Parcialmente digeridos: Rojo o rosa.<br />
c) Digeridos: Amarillos o color arenilla.<br />
El tejido muscular, al añadir almidón a la preparación toma un color rojo-caoba.<br />
La presencia <strong>de</strong> almidón no digerido en las heces se llama AMILORREA.<br />
H) LÍPIDOS.<br />
Para observarlas mejor usaremos el reactivo Sudam III. Una gota <strong>de</strong> este<br />
colorante se mezclará con una gota <strong>de</strong> la suspensión fecal. Los lípidos o<br />
grasas se encuentran en las heces en forma <strong>de</strong>:<br />
a) Ácidos grasos: Tienen aspecto cristalino,<br />
en forma <strong>de</strong> escamas o agujas finas<br />
rectas o curvadas. Difícilmente se tiñen.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
b) Grasa neutra: Aparece como gotitas <strong>de</strong><br />
color rojo o naranja<br />
Si la temperatura es fría (< 20º C) las<br />
gotas se transforman en masas o placas<br />
algo amarillentas o rojas.<br />
c) Jabones: Difíciles <strong>de</strong> reconocer al microscopio. No se tiñen. Se presentan<br />
como masas amorfas o cristales en forma <strong>de</strong> agujas cortas. En la<br />
observación lo mas importante son las grasa neutras. Se informa<br />
positivamente a partir <strong>de</strong> 15-20 gotas/campo (objetivo x40). El aumento<br />
patológico <strong>de</strong> grasas en heces se llama ESTEATORREA. Si en el<br />
microscopio se observa mas <strong>de</strong> 60 gotas /campo es seguro esteatorrea<br />
.<br />
Algunas veces, para observar las grasas se calienta el portaobjetos<br />
suavemente a la llama. De esta forma todas las grasas (ácidos grasos,<br />
neutros y jabones) se transforman en gotitas <strong>de</strong> color rojo-anaranjado<br />
(con Sudam III). En el estudio <strong>de</strong> las grasas en heces pue<strong>de</strong> inducirnos a<br />
error, los supositorios, los enemas oleosos y los portaobjetos y<br />
cubreobjetos mal <strong>de</strong>sengrasados.<br />
ANÁLISIS MICROSCÓPICO<br />
SI OBSERVAMOS INDICA<br />
FIBRAS<br />
MUSCULARES<br />
TEJIDO<br />
CONJUNTIVO<br />
CÉLULAS<br />
AMILÁCEAS<br />
Bien digeridas.<br />
Medianamente<br />
digeridas<br />
Poco o nada<br />
digeridas<br />
Unido o no a<br />
fibras musculares<br />
Células <strong>de</strong>sgastadas<br />
sin granos <strong>de</strong><br />
almidón.<br />
Células sin digerir<br />
llenas <strong>de</strong> almidón.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 61 <strong>de</strong> 287<br />
DIGESTIÓN<br />
PRÓTIDOS<br />
NORMAL DE<br />
ALTERACIÓN<br />
MEDIANA<br />
INTESTINAL<br />
ALTERACIÓN INTENSA<br />
INSUFICIENCIA GÁSTRICA<br />
DIGESTIÓN NORMAL DE<br />
GLÚCIDOS<br />
TRANSITO INTESTINAL<br />
ACELERADO<br />
O INSUFICIENCIA<br />
PANCREÁTICA<br />
Neutras. INSUFICIENCIA PANCREÁTICA<br />
GRASAS<br />
Ácidos grasos.<br />
INSUFICIENCIA BILIAR O MALA<br />
ABSORCIÓN<br />
Jabones.<br />
PRESENCIA <strong>de</strong> Ca y Mg en EL<br />
INTESTINO<br />
MOCO, LEUCOCITOS,<br />
ALTERACIONES DE LA<br />
HEMATÍES, EPITELIO<br />
MUCOSA
TEMARIO DE T.E.L.<br />
ESTUDIO FÍSICO-QUÍMICO<br />
pH<br />
Varía entre 6,8 y 7,2 <strong>de</strong>pendiendo <strong>de</strong>l régimen alimenticio. Los valores normales<br />
se van a modificar según el proceso digestivo. La medición se hace impregnando<br />
un papel indicador con una varilla <strong>de</strong> vidrio que contenga heces. La lectura se<br />
efectúa por el reverso <strong>de</strong>l papel.<br />
SANGRE<br />
También se llama este análisis investigación <strong>de</strong> hemorragias ocultas. Se pue<strong>de</strong><br />
observar sangre en heces, <strong>de</strong> color rojo, proveniente <strong>de</strong> fisuras anales o<br />
hemorroi<strong>de</strong>s. Esto no se consi<strong>de</strong>ra importante.<br />
Cuando proviene <strong>de</strong> hemorragias gástricas, duo<strong>de</strong>nales, cáncer <strong>de</strong> colon, etc., la<br />
sangre se digiere, tomando las heces un color oscuro, casi negro. Esta sangre si<br />
es importante.<br />
Para este análisis es importantísimo que el paciente durante los 2-3 días<br />
anteriores a la toma <strong>de</strong> muestras se someta a un régimen riguroso (“blanco”), sin<br />
carne, pescados, embutidos, lentejas, espinacas, plátanos etc., es <strong>de</strong>cir<br />
alimentos ricos en peroxidasas. Tampoco <strong>de</strong>berá tomar medicamentos que<br />
contengan hierro o hemoglobina, o que puedan provocar pérdidas sanguíneas<br />
como salicilatos o esteroi<strong>de</strong>s. La alimentación permitida consiste en: Huevos,<br />
patatas, cebolla, arroz, garbanzos, pan y leche.<br />
La mayoría <strong>de</strong> las pruebas para <strong>de</strong>tectar hemorragias ocultas en heces se basan<br />
en la <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> peroxidasas como indicativo <strong>de</strong>l contenido <strong>de</strong><br />
hemoglobina. Las más importantes son:<br />
A) REACCIÓN DE LA BENCIDINA:<br />
Sobre un papel <strong>de</strong> filtro manchado <strong>de</strong> heces, se ponen unas gotas <strong>de</strong><br />
bencidina y agua oxigenada <strong>de</strong> 10 volúmenes. Si el resultado es (+),<br />
como resultado <strong>de</strong> la presencia <strong>de</strong> peroxidasa, se formará un halo <strong>de</strong><br />
color ver<strong>de</strong>-azulado en torno a la mancha.<br />
B) REACCIÓN DE WEBER O DEL GUAYACO:<br />
La prueba es igual que la anterior pero en lugar <strong>de</strong> poner bencidina se<br />
pone guayaco. La reacción es la siguiente:<br />
HEMOGLOBINA + H2O2 H2O + O2›<br />
BENCIDINA<br />
O2 + o Color Azul-verdoso<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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GUAYACO<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
Estas pruebas son muy inespecíficas y dan habitualmente falsos<br />
positivos. La reacción <strong>de</strong> la bencidina es más sensible que la <strong>de</strong>l guayaco.<br />
Actualmente existe una técnica que no se basa en la peroxidasa:<br />
C) PRUEBA DEL CROMO RADIOACTIVO:<br />
Tiene más sensibilidad y especificidad que las anteriores. Se basa en la<br />
capacidad <strong>de</strong>l Cr radioactivo (Cr 51 ) para ser fijado por los hematíes y por<br />
el hecho <strong>de</strong> no ser reabsorbido en el tracto gastrointestinal. Así pues, es<br />
excretado por las heces en las que pue<strong>de</strong> ser medido por<br />
espectrofotometría <strong>de</strong> rayos ã.<br />
PIGMENTOS BILIARES<br />
Investigaremos en las heces la presencia <strong>de</strong> bilirrubina y estercobilinógeno<br />
mediante 2 métodos:<br />
A) PRUEBA DEL SUBLIMADO:<br />
Más sensible para Estercobilina. Se hace poniendo en un tubo <strong>de</strong> ensayo:<br />
• Dilución <strong>de</strong> heces.................................... 5 ml.<br />
• Sublimado (ClHg).................................... 5 ml.<br />
Se agita y se incuba a 37º C durante 1-2 horas y se observan los<br />
resultados:<br />
• ROJO.............................. ESTERCOBILINA o ESTERCOBILINÓGENO<br />
• VERDE............................ BILIRRUBINA.<br />
• BLANCO......................... Ausencia <strong>de</strong> Pigmentos.<br />
B) PRUEBA DE GRIGAUT:<br />
Más sensible para bilirrubina. Se hace poniendo en un tubo <strong>de</strong> ensayo:<br />
• ClH concentrado...................................... 5 ml.<br />
• Cl3Fe (10%)............................................. 2 gotas.<br />
• Dilución <strong>de</strong> heces.................................... 5 ml.<br />
Se agita y se calienta ligeramente observando los resultados:<br />
• VERDE..................................... BILIRRUBINA.<br />
• ROJO........................................ ESTERCOBILINÓGENO.<br />
Las 2 pruebas se hacen simultáneamente, <strong>de</strong>bido a su diferente sensibilidad, y<br />
los resultados se interpretan así:<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
SUBLIMADO GRIGAUT<br />
ESTERCOBILINOGENO + + Heces normales<br />
BILIRRUBINA + + Tránsito intestinal acelerado<br />
ESTERCOBILINÓGENO + - Tránsito intestinal medianamente<br />
acelerado<br />
BILIRRUBINA -<br />
-<br />
ENZIMAS PROTEOLÍTICAS:<br />
+<br />
-<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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Obstrucción biliar<br />
Se intenta comprobar la presencia <strong>de</strong> Tripsina, Quimiotripsina, etc. Las heces<br />
normales (hasta una dilución 1/100) licuan la gelatina.<br />
La prueba se realiza aplicando una gota <strong>de</strong> diferentes diluciones (1/5, 1/10, 1/50,<br />
1/100) <strong>de</strong> la heces a estudiar <strong>de</strong> heces sobre una película <strong>de</strong> gelatina. Se<br />
consi<strong>de</strong>ra un resultado positivo si la gelatina queda disuelta en ½ hora.<br />
• Positivo hasta una dilución 1/100........................... Digestión normal.<br />
• Positivo hasta una dilución 1/50............................. Digestión media.<br />
• Positivo hasta una dilución 1/10..............................Digestión <strong>de</strong>ficiente.<br />
DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE GRASA EN HECES<br />
Una persona normal digiere y reabsorbe casi toda la grasa <strong>de</strong> su dieta. Para<br />
valorar cuantitativamente esta grasa tendremos que pesar las heces <strong>de</strong>l paciente<br />
durante varios días. El paciente <strong>de</strong>be llevar una dieta estricta durante seis días.<br />
Hay varios métodos.<br />
A) REACCIÓN DE AZUL DE NILO PARA GRASA FECAL:<br />
Técnica:<br />
1. Diluir en un tubo <strong>de</strong> ensayo una porción <strong>de</strong> muestra con 9 volúmenes <strong>de</strong><br />
agua.<br />
2. Añadir:<br />
• 1 ml. <strong>de</strong> esta suspensión fecal.<br />
• 1 ml. <strong>de</strong> agua.<br />
• 3 gotas <strong>de</strong> ClH al 10 %.<br />
• 3 gotas <strong>de</strong> Oxalato amónico saturado.<br />
3. Calentar a ebullición durante unos segundos. Enfriar.<br />
4. Echar el líquido en un vaso <strong>de</strong> precipitado.<br />
5. Lavar el tubo <strong>de</strong> ensayo con 2,5 ml. <strong>de</strong> solución <strong>de</strong> CO3Na2 al 20 % y<br />
añadirlos al contenido <strong>de</strong>l vasito.
TEMARIO DE T.E.L.<br />
6. Agregar 15 ml. <strong>de</strong> agua y 1 ml. <strong>de</strong> solución <strong>de</strong> Azul <strong>de</strong> Nilo (0,05 % en<br />
agua) <strong>de</strong>jando resbalar por las pare<strong>de</strong>s.<br />
7. Leer los resultados inmediatamente:<br />
NEGATIVO: Rosado que vira a gris (aproximadamente < 7 g./día)<br />
DUDOSO: Gris azulado.<br />
POSITIVO: Azul (aproximadamente > 7 g./día)<br />
Cuando la reacción <strong>de</strong> azul <strong>de</strong> Nilo es negativa, la grasa fecal no exce<strong>de</strong><br />
nunca <strong>de</strong> 5% en peso. Una reacción claramente positiva correspon<strong>de</strong> a<br />
más <strong>de</strong>l 5 % <strong>de</strong> grasa.<br />
B) MÉTODO DE VAN DE KAMER:<br />
Se separan los lípidos <strong>de</strong> las heces mediante tratamiento <strong>de</strong> estas con<br />
una solución <strong>de</strong> hidróxido potásico alcohólico y que contenga pequeñas<br />
cantida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> alcohol amílico. De ésta manera se produce la formación<br />
<strong>de</strong> jabones.<br />
Posteriormente se hidrolizan los jabones con ClH y se convierten en<br />
ácidos grasos, extrayéndose estos a continuación con éter <strong>de</strong> petróleo.<br />
Por último se titulan los ácidos grasos con NaOH 0,1 N<br />
g. <strong>de</strong> grasa =<br />
Peso total <strong>de</strong> heces x Vol. cc. NaOH<br />
Peso <strong>de</strong> la muestra<br />
CUERPOS REDUCTORES O AZÚCARES REDUCTORES EN HECES<br />
Las heces <strong>de</strong>ben <strong>de</strong> ser recientes, no <strong>de</strong>be <strong>de</strong>jarse pasar más <strong>de</strong> una hora<br />
<strong>de</strong>s<strong>de</strong> que son emitidas hasta que se realiza el examen.<br />
Hay que diluir una parte <strong>de</strong> heces en dos partes <strong>de</strong> agua <strong>de</strong>stilada, mezclar bien<br />
y centrifugar a un número bajo <strong>de</strong> revoluciones (1.500 rpm.). Se toman 15 gotas<br />
<strong>de</strong>l sobrenadante, se colocan en un tubo <strong>de</strong> vidrio y se le aña<strong>de</strong>n dos gotas <strong>de</strong><br />
ClH 1 N. Luego calentamos para <strong>de</strong>sdoblar la sacarosa.<br />
Una vez que ha enfriado el líquido anterior, se aña<strong>de</strong> una tableta <strong>de</strong><br />
CLINITEST® (Ames) para azúcares reductores y se <strong>de</strong>ja disolver. A<br />
continuación comparamos con la escala <strong>de</strong> colores que lleva el reactivo.<br />
El resultado se da en g./litro. El resultado será negativo si es inferior a 2,5 g./l.<br />
Entre 2,5 y 5 es dudoso y será positivo si es mayor <strong>de</strong> 5 g./l.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
TEMA 8.- HEMOGRAMA. RECUENTO<br />
CELULAR Y FÓRMULA<br />
LEUCOCITARIA.<br />
RECUENTOS CELULARES Y VALORES HEMATOLÓGICOS<br />
NORMALES.<br />
Glóbulos rojos:<br />
Plaquetas:<br />
Leucocitos:<br />
Neonatos.................4.0-5.6x10 12 /l.<br />
Hombres.................4.5-6.5x10 12 / l.<br />
Mujeres...................3.8-5.6x10 12 /l.<br />
150-400 x10 9 / l.<br />
Niños <strong>de</strong> un año.........6-18x10 9 /l.<br />
Adultos....................4-10x10 9 /l.<br />
Recuento leucocitario diferencial:<br />
Relativo Absoluto por 7000 leucocitos<br />
Adultos:<br />
Neutrófilos..................40-75%..................................2800-5250.<br />
Linfocitos...................20-45%...................................1400-3150.<br />
Monocitos..................2-10%.....................................1400-3150.<br />
Eosinófilos..................1-6%.......................................70-420.<br />
Basófilos.....................
Consi<strong>de</strong>rando cada tipo <strong>de</strong> leucocito:<br />
Neutropenia.<br />
Eosinopenia.<br />
Basopenia.<br />
Monocitopenia.<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
Pue<strong>de</strong> aparecer leucopenia en los siguientes casos:<br />
• infección vírica (rubéola, varicela, gripe).<br />
• infección bacteriana (brucelosis).<br />
• intoxicación por metales pesados (bismuto).<br />
• intoxicación medicamentosa por benzol, sulfamidas, terapia<br />
citostática.<br />
• comienzo <strong>de</strong> una mononucleosis.<br />
• consecuencia <strong>de</strong> exposición a material radiactivo....etc.<br />
Oligocitemia; recibe este nombre la disminución <strong>de</strong>l número <strong>de</strong> glóbulos rojos<br />
sobre las cifras normales.<br />
En hombre valores menores <strong>de</strong> 4.5x10 12 /l.<br />
En mujeres valores menores <strong>de</strong> 3.8x10 12 /l.<br />
La disminución <strong>de</strong>l número normal <strong>de</strong> glóbulos rojos es frecuente en anemias<br />
carenciales posthemorrágicas, hemolíticas, etc.<br />
Trombopenia; recibe este nombre la disminución <strong>de</strong>l número <strong>de</strong> plaquetas por<br />
<strong>de</strong>bajo <strong>de</strong> los valores normales, es <strong>de</strong>cir, valores inferiores a 150000/ mm 3 .<br />
Es frecuente la aparición <strong>de</strong> trombopenia asociada a:<br />
REVISIÓN DE LAS TÉCNICAS.<br />
• la acción tóxica <strong>de</strong> medicamentos.<br />
• radiación.<br />
• infecciones víricas (paperas, varicela, rubéola)<br />
• infecciones bacterianas (meningitis meningocócica).<br />
• alcoholismo agudo.<br />
Ante la aparición <strong>de</strong> algún tipo <strong>de</strong> citopenia en el recuento hematológico, hay que<br />
comprobar, en primer lugar el utillaje y las técnicas utilizadas, prestando especial<br />
atención en contadores electrónicos a:<br />
• comprobar que no ha habido bloqueo parcial <strong>de</strong>l orificio <strong>de</strong> contaje<br />
(100 micras).<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
• comprobar que se ha realizado el recuento <strong>de</strong> leucocitos <strong>de</strong>spués<br />
<strong>de</strong> completarse la hemólisis, pero en un periodo inferior a 30<br />
minutos.<br />
• la recogida y manipulación <strong>de</strong> sangre ha sido la a<strong>de</strong>cuada (no hay<br />
coágulos).<br />
• el electrodo exterior estará completamente inmerso en líquido.<br />
• se lava correctamente el tubo entre sucesivas mediciones.<br />
• no hay pequeñas burbujas <strong>de</strong> aire en el propio tubo.<br />
• el manómetro estará limpio interiormente.<br />
Si en la técnica manual, el recuento <strong>de</strong> leucocitos nos da valores inferiores a<br />
3000/mm 3 , hay que volver a repetir el contaje, pero en vez <strong>de</strong> diluir 1:20, como<br />
es habitual, la dilución se hará 1:10.<br />
En pacientes anémicos, para el recuento <strong>de</strong> hematíes en cámara, la dilución en<br />
vez <strong>de</strong> hacerse al 1:200, se hará al 1:100.<br />
Igualmente si en el contaje <strong>de</strong> plaquetas, por ejemplo por el método <strong>de</strong> Rees-<br />
Ecker, se sospecha una cifra muy reducida, la dilución, en vez <strong>de</strong> 1:200 se hará<br />
al 1:100 y se repetirá el recuento.<br />
PREPARACIÓN DE UN FROTIS.<br />
Tras comprobar lo anterior, y ante la persistencia <strong>de</strong> citopenia en el hemograma,<br />
el siguiente paso a realizar, es la preparación <strong>de</strong> un frotis.<br />
El frotis se pue<strong>de</strong> realizar por una <strong>de</strong> las siguientes técnicas:<br />
TINCIÓN.<br />
• técnica <strong>de</strong>l portaobjetos.<br />
• técnica <strong>de</strong>l cubreobjetos.<br />
Para la tinción <strong>de</strong>l frotis, en los estudios <strong>de</strong> sangre, suelen utilizarse colorantes<br />
<strong>de</strong> anilina <strong>de</strong> dos tipos:<br />
-básicos como las tiacinas (azul <strong>de</strong> metileno).<br />
-ácidos como la eosina.<br />
El método <strong>de</strong> Romanowsky se basa en combinar colorantes ácidos y básicos<br />
que tiñen diferencialmente las estructuras sanguíneas. En general utilizan<br />
eosinatos <strong>de</strong> tiacinas.<br />
Entre los métodos <strong>de</strong> este tipo más conocidos <strong>de</strong>stacamos:<br />
• La tinción <strong>de</strong> Wright.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
• La tinción <strong>de</strong> Giemsa (i<strong>de</strong>al para teñir parásitos y protozoos<br />
<strong>de</strong>l paludismo).<br />
• La tinción <strong>de</strong> May-Grümwald.<br />
PATOLOGÍAS DE LAS CÉLULAS SANGUÍNEAS.<br />
En el estudio <strong>de</strong> la extensión sanguínea se buscan anormalida<strong>de</strong>s que ayu<strong>de</strong>n a<br />
indicar la naturaleza <strong>de</strong> la citopenia, sea <strong>de</strong>l tipo que sea.<br />
Toda célula sanguínea que no coincida con los mo<strong>de</strong>los <strong>de</strong> normalidad, <strong>de</strong>be<br />
consi<strong>de</strong>rarse atípica. La mayor variabilidad en la morfología <strong>de</strong> las células<br />
hemáticas tiene lugar en las <strong>de</strong>generaciones neoplásicas.<br />
ALTERACIONES EN LA SERIE ROJA.<br />
VARIACIONES DE TAMAÑO.<br />
En general se conocen bajo el término <strong>de</strong> anisocitosis.<br />
• Macrocitosis; hematíes con tamaño <strong>de</strong> 8 a 11 micras (déficit <strong>de</strong> vitamina<br />
B12 y <strong>de</strong> ácido fólico).<br />
• Microcitosis; hematíes con tamaño 11 micras (fisiológico en recién<br />
nacidos y también en anemia perniciosa).<br />
ALTERACIONES DE COLOR.<br />
• Anisocromía; <strong>de</strong>sigual distribución <strong>de</strong> a hemoglobina<br />
(trasfusiones).<br />
• Hipocromía; mucha zona pálida central por disminución <strong>de</strong> la<br />
concentración <strong>de</strong> hemoglobina (anemia ferropénica).<br />
• Hipercromía; aumento <strong>de</strong> la intensidad <strong>de</strong>l color por aumento <strong>de</strong> la<br />
concentración <strong>de</strong> hemoglobina.<br />
• Policromasía; anormal coloración (azul, gris, rosa) indica<br />
inmadurez por producción acelerada.<br />
ALTERACIONES DE FORMA.<br />
• Acantocitos; hematíes esféricos con prominencias que les dan aspecto <strong>de</strong><br />
erizo<br />
• (Uremia, acantocitosis )<br />
• Dacriocitos; forma <strong>de</strong> lágrima (alteraciones eritropoyéticas)<br />
• Dianocitos; aspecto <strong>de</strong> diana por acúmulo <strong>de</strong> hemoglobina en el centro<br />
(talasemia).<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
• Drepanocitos o células falciformes; forma <strong>de</strong> hoz o <strong>de</strong> media luna<br />
(anemia falciforme).<br />
• Eliptocitos; forma oval o en elipse.<br />
• Esquizocitos; restos <strong>de</strong> hematíes tras su ruptura.<br />
• Estomatocitos; presentan hendidura en parte central.<br />
• Hematíes crenados; forma <strong>de</strong> sierra o rueda <strong>de</strong>ntada.<br />
ALTERACIONES ESTRUCTURALES, PRESENCIA DE INCLUSIONES<br />
INTRAERITROCITARIAS.<br />
Punteado basófilo; son acúmulos <strong>de</strong> ARN que se tiñen <strong>de</strong> azul con Giemsa<br />
(saturnismo).<br />
Corpúsculos <strong>de</strong> Heinz; son zonas <strong>de</strong> hemoglobina <strong>de</strong>snaturalizada, <strong>de</strong> más <strong>de</strong> 3<br />
micras que se tiñen <strong>de</strong>:<br />
• azul oscuro con sulfato <strong>de</strong> Nilo.<br />
• azul claro con azul cresil brillante.<br />
• púrpura oscura con cristal violeta.<br />
Se presentan en alfa-talasemia y también en anemias tóxicas.<br />
Anillos <strong>de</strong> cabot; son restos <strong>de</strong> membrana nuclear que toman forma <strong>de</strong> anillo. Se<br />
observan en anemia perniciosa e intoxicaciones con plomo.<br />
Granulación azurófila; pue<strong>de</strong>n ser restos <strong>de</strong>l núcleo tras su <strong>de</strong>strucción, o<br />
eritroblastos. Se tiñen violeta púrpura.<br />
Corpúsculos <strong>de</strong> Howell-Jolly; son restos <strong>de</strong> cromatina que se tiñen con Giemsa<br />
<strong>de</strong> rojo brillante. Indican anemia megaloblástica u otra forma anormal <strong>de</strong><br />
eritropoyesis.<br />
SERIE BLANCA.<br />
POLIMORFONUCLEARES NEUTRÓFILOS.<br />
Los neutrófilos sufren alteraciones morfológicas cualitativas, algunas <strong>de</strong> las<br />
cuales son adquiridas y <strong>de</strong>saparecen <strong>de</strong>spués que el estímulo que las provoca lo<br />
ha hecho.<br />
Aumento <strong>de</strong> los lóbulos nucleares; (anemia).<br />
Núcleo en anteojo (Pelger-Huet); núcleo con dos segmentos. Es una alteración<br />
autosómica dominante.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Corpúsculos <strong>de</strong> Döhle; son restos <strong>de</strong> ribosomas libres, o <strong>de</strong>l R.E.R. que se tiñen<br />
<strong>de</strong> color azul pálido en el citoplasma.<br />
Granulaciones tóxicas; son gránulos citoplasmáticos <strong>de</strong> mayor volumen y con<br />
coloración más intensa <strong>de</strong> lo normal, que aparecen asociados a procesos<br />
infecciosos severos.<br />
Gránulos violeta; son gránulos citoplasmáticos azurófilos que están presentes en<br />
la anomalía <strong>de</strong> Al<strong>de</strong>r-Reilly.<br />
LINFOCITOS.<br />
Linfocito activado, presenta mayor tamaño y basofília clara, sin gránulos<br />
(estimulación linfocitaria).<br />
Célula Turk; linfocito hiperbasófilo (infección vírica).<br />
MONOCITOS.<br />
A veces aparecen con núcleo gran<strong>de</strong> escotado y presentan vacuolas don<strong>de</strong> está<br />
lo que han fagocitado, otras veces se presentan <strong>de</strong>generados. Pue<strong>de</strong> <strong>de</strong>berse a<br />
los anticoagulantes.<br />
A veces se observan otras células como:<br />
Células <strong>de</strong> Rei<strong>de</strong>r.<br />
Células <strong>de</strong> Turk.<br />
Células en cesto, etc.<br />
SERIE TROMBOCÍTICA.<br />
A. Alteraciones <strong>de</strong> tamaño, po<strong>de</strong>mos encontrar:<br />
• microtrombocitos.<br />
• macrotrombocitos.<br />
• megacariocitos.<br />
B. Alteraciones <strong>de</strong> forma o dismorfias plaquetarias, aparecen en las<br />
trombopatías.<br />
C. Alteraciones <strong>de</strong> distribución:<br />
• sa<strong>tel</strong>itismo plaquetario; fenómeno en el que se presentan<br />
varias plaquetas ro<strong>de</strong>ando a los segmentados. Se da a<br />
veces al utilizar EDTA como anticoagulante.<br />
• agregados plaquetarios; son el comienzo <strong>de</strong> un trombo.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
OTROS TIPOS ANORMALES DE CÉLULAS.<br />
CÉLULAS “LE “, O DE HARGRAVES.<br />
Son leucocitos polimorfonucleares neutrófilos que presentan un gran cuerpo <strong>de</strong><br />
inclusión, que <strong>de</strong>splaza su propio núcleo. Este cuerpo <strong>de</strong> inclusión es otro núcleo<br />
leucocitario <strong>de</strong>struido por una Ig G o factor LE. Aparecen entre otras<br />
enfermeda<strong>de</strong>s en el Lupus Eritematoso.<br />
SIDEROCITOS.<br />
Son hematíes que contienen gránulos <strong>de</strong> hemosi<strong>de</strong>rina. Estos hematíes son<br />
normales en las células precursoras <strong>de</strong> los hematíes <strong>de</strong> médula ósea, pero no<br />
<strong>de</strong>ben aparecer en sangre periférica. Su presencia en un frotis <strong>de</strong> sangre indica<br />
proceso patológico.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
FÓRMULA LEUCOCITARIA SANGUÍNEA: DIFERENCIACIÓN<br />
CELULAR Y RECUENTOS<br />
INTRODUCCIÓN<br />
Nos po<strong>de</strong>mos encontrar diferentes tipos <strong>de</strong> leucocitos o glóbulos blancos en<br />
sangre según sus características morfológicas:<br />
A) Polimorfonucleares o granulocitos<br />
a) Neutrófilos<br />
b) Eosinófilos<br />
c) Basófilos<br />
B) Mononucleares o agranulocitos<br />
a) Linfocitos<br />
b) Monocitos<br />
El estudio <strong>de</strong>l porcentaje <strong>de</strong> cada uno <strong>de</strong> ellos es lo que se <strong>de</strong>nomina fórmula<br />
leucocitaria. A partir <strong>de</strong> ella y conociendo el número total <strong>de</strong> leucocitos por<br />
milímetro cúbico <strong>de</strong> sangre se pue<strong>de</strong> calcular el numero <strong>de</strong> cada tipo <strong>de</strong><br />
leucocitos por volumen <strong>de</strong> sangre.<br />
La fórmula leucocitaria o<br />
recuento diferencial leucocitario<br />
se pue<strong>de</strong> hacer <strong>de</strong> forma manual<br />
o <strong>de</strong> forma automática.<br />
MORFOLOGÍA DE LOS<br />
LEUCOCITOS<br />
Vamos a estudiar la morfología<br />
<strong>de</strong> los leucocitos sobre una<br />
extensión sanguínea teñida. La<br />
figura 1 es una representación<br />
arbitraria <strong>de</strong> un frotis <strong>de</strong> sangre<br />
periférica, siendo el número <strong>de</strong><br />
leucocitos con relación a los<br />
eritrocitos y trombocitos mayor<br />
<strong>de</strong> lo que suele observarse en un<br />
campo microscópico real. En la<br />
figura aparecen las siguientes<br />
células:<br />
A: Eritrocitos<br />
B: Linfocito gran<strong>de</strong><br />
C y E: Neutrófilos segmentados<br />
D: Eosinófilo<br />
F: Monocito<br />
Figura 1. Tipos <strong>de</strong> células en un frotis <strong>de</strong> sangre periférica.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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G: Trombocitos<br />
H: Linfocito<br />
I: Neutrófilo en banda<br />
J: Basófilo.<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
NEUTRÓFILOS, POLIMORFONUCLEADOS NEUTRÓFILOS (PMN),<br />
GRANULOCITOS NEUTRÓFILOS.<br />
Son células redon<strong>de</strong>adas <strong>de</strong> aproximadamente 12 micras <strong>de</strong> diámetro, más<br />
pequeños que los monocitos y eosinófilos y ligeramente mayores que los<br />
basófilos.<br />
El citoplasma es abundante y se tiñe <strong>de</strong> color rosado. En él hay numerosas<br />
granulaciones neutrófilas que se tiñen <strong>de</strong> color rosa-azulado y son <strong>de</strong> pequeño<br />
tamaño.<br />
El núcleo se tiñe intensamente <strong>de</strong> azul, es irregular y polilobulado, variando el<br />
número <strong>de</strong> lóbulos <strong>de</strong> 2 a 5. Con frecuencia parece que hay varios núcleos<br />
separados, pero un análisis <strong>de</strong>tallado permite observar los finos hilos <strong>de</strong><br />
cromatina que los une. Esta sería la morfología <strong>de</strong> un neutrófilo segmentado.<br />
El estadío anterior es el neutrófilo en banda o cayado, en los que el núcleo no<br />
está todavía lobulado y presenta aspecto <strong>de</strong> S o C.<br />
Pue<strong>de</strong> aparecer en sangre, aunque no con frecuencia, algún metamielocito, que<br />
es el estadío anterior al cayado. Es <strong>de</strong> mayor tamaño y el núcleo presenta forma<br />
arriñonada. Lo normal es que en la fórmula aparezca un 0%.<br />
Se pue<strong>de</strong> hacer un recuento <strong>de</strong> las lobulaciones, <strong>de</strong> forma que las proporciones<br />
normales son:<br />
Células con 1 lóbulo: 6%<br />
Células con 2 lóbulos: 34%<br />
Células con 3 lóbulos: 41%<br />
Células con 4 lóbulos: 17%<br />
Células con 5 lóbulos: 2%<br />
Cuando aumenta el número <strong>de</strong> células con núcleos polilobulados se habla <strong>de</strong><br />
una <strong>de</strong>sviación a la <strong>de</strong>recha, mientras que cuando aumentan las formas en<br />
cayado, metamielocitos o incluso estadios anteriores, se habla <strong>de</strong> una <strong>de</strong>sviación<br />
a la izquierda.<br />
El neutrófilo se origina en la médula ósea y <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> diferentes estadios <strong>de</strong><br />
maduración pasa al torrente circulatorio, don<strong>de</strong> permanecen unas pocas horas<br />
(aproximadamente siete) antes <strong>de</strong> pasar a los tejidos don<strong>de</strong> realizan su función y<br />
mueren.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
La función principal <strong>de</strong> los neutrófilos es la <strong>de</strong>fensa <strong>de</strong>l organismo contra las<br />
infecciones mediante el fenómeno <strong>de</strong> fagocitosis (motivo por el cual la<br />
membrana <strong>de</strong>l neutrófilo emite pseudópodos)<br />
La neutrofilia o leucocitosis neutrofílica constituye un aumento <strong>de</strong>l resultado<br />
absoluto, mientras que la neutropenia representa una disminución.<br />
EOSINÓFILOS, POLIMORFONUCLERES EOSINÓFILOS (PME),<br />
GRANULOCITOS EOSINÓFILOS.<br />
Los eosinófilos tienen un diámetro medio <strong>de</strong> 13 micras. La estructura <strong>de</strong> estas<br />
células se parece a la <strong>de</strong> los neutrófilos segmentados, pero con algunas<br />
diferencias.<br />
El núcleo se tiñe algo menos y tiene 2 ó 3 lóbulos, normalmente 2 dispuestos <strong>de</strong><br />
forma característica.<br />
Las granulaciones citoplasmáticas son <strong>de</strong> mayor tamaño, redondas u ovaladas,<br />
y con gran afinidad por los colorantes ácidos, tiñéndose por tanto <strong>de</strong> color rojoanaranjado<br />
con un colorante que contenga eosina. Los gránulos poseen<br />
numerosas enzimas, entre las que <strong>de</strong>staca la mieloperoxidasa.<br />
Los eosinófilos se forman en la médula ósea y <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> diferentes estadios <strong>de</strong><br />
maduración pasan a sangre periférica don<strong>de</strong> sólo permanecen algunas horas<br />
(aproximadamente ocho), ya que la mayor parte <strong>de</strong> la población corporal <strong>de</strong><br />
eosinófilos se encuentra bajo la capa epi<strong>tel</strong>ial en los tejidos expuestos al<br />
ambiente externo, como son los conductos nasales, piel y vías urinarias.<br />
El papel biológico <strong>de</strong> estas células es el <strong>de</strong> modular las reacciones anafilácticas<br />
y las reacciones antígeno-anticuerpo en el proceso alérgico. También intervienen<br />
en el control <strong>de</strong> la infestación por ciertos parásitos, cuyo ataque no se hace por<br />
fagocitosis, sino por adherencia y subsiguiente citotoxicidad al segregar diversas<br />
sustancias nocivas.<br />
La disminución <strong>de</strong> los eosinófilos o eosinopenia sólo pue<strong>de</strong> <strong>de</strong>tectarse por<br />
recuento <strong>de</strong> gran número <strong>de</strong> células. Un aumento en los valores <strong>de</strong> eosinófilos<br />
representa una eosinofilia.<br />
BASÓFILOS, POLIMORFONUCLEARES BASÓFILOS (PMB),<br />
GRANULOCITOS BASÓFILOS.<br />
En general, los granulocitos basófilos son semejantes en tamaño a los<br />
anteriores. El núcleo es menos irregular y ligeramente lobulado. Las<br />
granulaciones <strong>de</strong>l citoplasma son gran<strong>de</strong>s y muy abundantes. Tienen gran<br />
afinidad por los colorantes básicos, apareciendo <strong>de</strong> color azul oscuro o<br />
prácticamente negro. Recubren normalmente toda la célula, por lo que el núcleo<br />
resulta difícil <strong>de</strong> distinguir.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Los basófilos son los menos numerosos <strong>de</strong> los leucocitos en la sangre normal.<br />
Los basófilos se originan en la médula ósea y, <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> diferentes procesos<br />
<strong>de</strong> maduración, pasan a la sangre periférica don<strong>de</strong> realizan su función. Los<br />
basófilos que se encuentran en los tejidos se <strong>de</strong>nominan células cebadas o<br />
mastocitos y presentan ciertas diferencias en la composición <strong>de</strong> sus gránulos<br />
con respecto a los basófilos sanguíneos.<br />
La función <strong>de</strong> los basófilos es actuar como mediadores en las respuestas<br />
inflamatorias, en especial las <strong>de</strong> hipersensibilidad.<br />
El aumento <strong>de</strong>l número absoluto <strong>de</strong> basófilos lo constituye una basofilia o<br />
leococitosis basofílica, mientras que el menor recuento absoluto <strong>de</strong> basófilos lo<br />
constituye una basopenia.<br />
LINFOCITOS<br />
Los linfocitos son células mononucleadas pequeñas, <strong>de</strong> aproximadamente 10<br />
micras <strong>de</strong> diámetro, que carecen <strong>de</strong> gránulos citoplasmáticos específicos.<br />
El linfocito típico presenta un núcleo bien <strong>de</strong>finido que contiene bloques pesados<br />
<strong>de</strong> cromatina. El núcleo ocupa prácticamente toda la célula y tiene forma<br />
redonda o un poco <strong>de</strong>ntada. Se tiñe <strong>de</strong> color azul oscuro.<br />
El citoplasma es escaso y se tiñe <strong>de</strong> un color azul pálido, exceptuando una zona<br />
perinuclear clara, pudiendo aparecer en algunas granulaciones <strong>de</strong> color rojizo.<br />
Se pue<strong>de</strong>n observar linfocitos <strong>de</strong> mayor tamaño, <strong>de</strong> 12 a 15 micras <strong>de</strong> diámetro,<br />
con núcleos menos <strong>de</strong>nsos y citoplasma más abundante, especialmente en la<br />
sangre <strong>de</strong> los niños, y pue<strong>de</strong> ser difícil <strong>de</strong> distinguir <strong>de</strong> los monocitos.<br />
Los linfocitos son las principales células implicadas en la respuesta inmunitaria,<br />
reconociendo por sus receptores <strong>de</strong> membrana los <strong>de</strong>terminantes antigénicos<br />
con la colaboración <strong>de</strong> otras células, como los macrófagos.<br />
Un aumento <strong>de</strong> los valores absolutos se <strong>de</strong>nomina linfocitosis, mientras que una<br />
disminución <strong>de</strong> estos valores se <strong>de</strong>nomina linfocitopenia.<br />
MONOCITOS<br />
El monocito es la célula <strong>de</strong> mayor tamaño <strong>de</strong> la sangre normal con un diámetro<br />
medio <strong>de</strong> 16 micras.<br />
Contiene un único núcleo, generalmente excéntrico y con forma redon<strong>de</strong>ada,<br />
lobulada o en forma <strong>de</strong> herradura. Se tiñe <strong>de</strong> un azul más débil que los linfocitos.<br />
El citoplasma es abundante y se tiñe <strong>de</strong> un color azul grisáceo conteniendo a<br />
veces gránulos finos <strong>de</strong> color entre rojo y púrpura, menos diferenciados y<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
pequeños que los gránulos <strong>de</strong> los leucocitos neutrófilos. Ocasionalmente pue<strong>de</strong>n<br />
<strong>de</strong>tectarse gránulos <strong>de</strong> color azul.<br />
Los monocitos se producen en la médula ósea para <strong>de</strong>spués pasar a sangre<br />
periférica, don<strong>de</strong> permanecen entre 4 y 10 horas antes <strong>de</strong> migrar a los tejidos,<br />
convirtiéndose en ellos en las células llamadas macrófagos o histiocitos, don<strong>de</strong><br />
cumplen su función.<br />
La función principal <strong>de</strong> los monocitos y macrófagos es la fagocitosis, que realiza<br />
<strong>de</strong> manera semejante a los neutrófilos. Actúan como <strong>de</strong>fensa contra<br />
microorganismos, en el proceso <strong>de</strong> la formación antigénica y en la eliminación <strong>de</strong><br />
células viejas, dañadas o tumorales. A<strong>de</strong>más, el sistema monocito-macrófago<br />
<strong>de</strong>sempeña un papel principal en la iniciación y regulación <strong>de</strong> la respuesta<br />
inmunitaria.<br />
El aumento y disminución <strong>de</strong> sus valores se <strong>de</strong>nominan monocitosis y<br />
monocitopenia respectivamente.<br />
VALORES DE REFERENCIA.<br />
El número total <strong>de</strong> leucocitos oscila en condiciones normales según la edad,<br />
variando <strong>de</strong>s<strong>de</strong> el nacimiento hasta los 16 años, a partir <strong>de</strong> los cuales las cifras<br />
se estabilizan <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> unos márgenes <strong>de</strong> normalidad. Asimismo, el porcentaje<br />
normal <strong>de</strong> los distintos tipos <strong>de</strong> leucocitos varía también con la edad (Tabla 1)<br />
RN 1 MES 4 AÑOS 6 AÑOS ADULTO<br />
Neutrófilo 37-57% 25-35% 25-45% 45-50% 50-65%<br />
Cayados 0-4% 0-4% 0-4% 0-4% 0-4%<br />
Eosinófilos 1-5% 1-5% 1-5% 1-5% 1-5%<br />
Basófilos 0-2% 0-2% 0-2% 0-2% 0-2%<br />
Monocitos 4-10% 4-10% 4-10% 4-10% 4-10%<br />
Linfocitos 25-35% 45-65% 40-60% 40-45% 25-40%<br />
Leucocitos/mm 3 9.000- 5.000- 5.500- 5.000- 4.000-<br />
30.000 21.000 15.500 14.500 10.000<br />
Tabla 1. Valores <strong>de</strong> leucocitos en sangre periférica.<br />
FÓRMULA LEUCOCITARIA O RECUENTO DIFERENCIAL LEUCOCITARIO<br />
(RDL)<br />
El recuento diferencial leucocitario se pue<strong>de</strong> realizar <strong>de</strong> forma manual al<br />
microscopio o <strong>de</strong> forma automática.<br />
RECUENTO DIFERENCIAL LEUCOCITARIO MANUAL<br />
Consiste en <strong>de</strong>terminar el porcentaje <strong>de</strong> cada tipo <strong>de</strong> leucocitos por observación<br />
directa al microscopio <strong>de</strong> un frotis sanguíneo teñido. Cuanto mayor sea el<br />
número <strong>de</strong> células contadas, mayor será la exactitud <strong>de</strong>l resultado.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Se entien<strong>de</strong> por frotis o extensión sanguínea la formación <strong>de</strong> una fina película <strong>de</strong><br />
sangre sobre una superficie, generalmente un portaobjetos, <strong>de</strong> forma que pueda<br />
ser observada al microscopio sin que las células se superpongan entre sí. Una<br />
vez preparado y secado el frotis, <strong>de</strong>be ser fijado y teñido para po<strong>de</strong>r diferenciar<br />
los distintos tipos celulares.<br />
Los colorantes más comúnmente utilizados para las tinciones hematológicas son<br />
los <strong>de</strong>rivados <strong>de</strong> la anilina, colorantes <strong>de</strong> Romanowsky, que pue<strong>de</strong>n combinar<br />
colorantes ácidos (eosina), básicos (azul <strong>de</strong> metileno) y neutros. Las distintas<br />
estructuras celulares se teñirán con el colorante <strong>de</strong> pH antagónico. Así, los<br />
colorantes ácidos teñirán las estructuras básicas como la hemoglobina o los<br />
gránulos <strong>de</strong> los leucocitos eosinófilos y los colorantes básicos teñirán estructuras<br />
ácidas como el ADN o los gránulos citoplasmáticos basófilos. Las estructuras<br />
neutrófilas serán aquellas que tienen afinidad por ambos tipos <strong>de</strong> colorantes.<br />
Existen diversos métodos <strong>de</strong> tinción, como por ejemplo: el método <strong>de</strong> Wright, el<br />
método <strong>de</strong> Giemsa, el método <strong>de</strong> May-grümwald-Giensa o el método <strong>de</strong>l<br />
panóptico rápido.<br />
A la hora <strong>de</strong> hacer el recuento diferencial <strong>de</strong> leucocitos hay que tener en cuenta<br />
que la distribución <strong>de</strong> las células no es uniforme. Las células gran<strong>de</strong>s (monocitos<br />
y neutrófilos) se sitúan en los bor<strong>de</strong>s, mientras que las células pequeñas<br />
(linfocitos) lo hacen en el centro <strong>de</strong> la extensión. Por esta razón, en el recuento<br />
se <strong>de</strong>be seguir una trayectoria que cubra todas las partes <strong>de</strong> la extensión.<br />
Antes <strong>de</strong> comenzar el recuento se evalúa si la extensión ha sido bien realizada,<br />
si la distribución <strong>de</strong> las células es uniforme, y su tinción, satisfactoria. Se<br />
examina la extensión al microscopio con bajo aumento, para observar si la<br />
distribución celular y la tinción es buena; se cambiará a un objetivo <strong>de</strong> inmersión<br />
para la i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> los distintos tipos celulares.<br />
El registro <strong>de</strong> los distintos tipos <strong>de</strong> leucocitos se pue<strong>de</strong> realizar utilizando<br />
aparatos registradores específicos para fórmulas leucocitarias o bien<br />
manualmente, anotando cada una <strong>de</strong> las células aparecidas en un papel.<br />
A medida que se va viendo un leucocito, éste se clasifica, hasta haber contado<br />
un número <strong>de</strong>terminado <strong>de</strong> leucocitos. Cuanto más elevado es este número,<br />
mayor es la precisión, aunque por razones prácticas normalmente se realizan<br />
recuentos <strong>de</strong> 100 ó 200 células.<br />
Todos los leucocitos que no puedan clasificarse <strong>de</strong>berían agruparse<br />
conjuntamente en un grupo no i<strong>de</strong>ntificado. En algunas alteraciones,<br />
especialmente en la leucemia, pue<strong>de</strong>n <strong>de</strong>tectarse muchos <strong>de</strong> estos leucocitos no<br />
i<strong>de</strong>ntificados.<br />
Con el número total <strong>de</strong> leucocitos por mm 3 y el tanto por ciento <strong>de</strong> cada tipo, se<br />
pue<strong>de</strong> hallar el valor absoluto para cada uno <strong>de</strong> ellos.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
RECUENTO DIFERENCIAL LEUCOCITARIO AUTOMATIZADO<br />
El recuento diferencial leucocitario es una <strong>de</strong> las <strong>de</strong>terminaciones más<br />
solicitadas al laboratorio <strong>de</strong> análisis clínicos, por ello, unos resultados exactos y<br />
precisos son <strong>de</strong> vital importancia.<br />
Actualmente, la automatización permite mejorar la especificidad, la exactitud,<br />
disminuir los errores y abaratar los costes <strong>de</strong> los recuentos diferenciales <strong>de</strong><br />
leucocitos<br />
En los sistemas disponibles hasta la fecha, se han utilizado dos principios<br />
generales:<br />
a) los sistemas <strong>de</strong> elaboración digital <strong>de</strong> la imagen, que i<strong>de</strong>ntifican por<br />
or<strong>de</strong>nador las células sobre extensiones sanguíneas teñidas.<br />
b) los sistemas <strong>de</strong> flujo continuo, que analizan las células suspendidas en<br />
un líquido y utilizan la medida <strong>de</strong> diferentes propieda<strong>de</strong>s <strong>de</strong> los<br />
leucocitos. Se basan en:<br />
• Medida <strong>de</strong> la impedancia y <strong>de</strong> la conductividad celular que<br />
informarán sobre el tamaño <strong>de</strong> la partícula y su estructura celular<br />
interna.<br />
• Medida <strong>de</strong> la dispersión <strong>de</strong> la luz láser o halógena.<br />
• Utilización <strong>de</strong> técnicas citoquímicas sobre la suspensión<br />
leucocitaria y estudio <strong>de</strong> las distintas poblaciones leucocitarias<br />
por métodos ópticos.<br />
ANÁLISIS DIGITAL DE IMAGEN<br />
Se basa en la i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> los leucocitos mediante análisis con or<strong>de</strong>nador <strong>de</strong><br />
las imágenes, <strong>de</strong> frotis sanguíneos teñidos, obtenidas al microscopio.<br />
La extensión <strong>de</strong> sangre, uniformemente teñida, se coloca sobre la platina <strong>de</strong> un<br />
microscopio. El movimiento <strong>de</strong> la platina es controlado mediante or<strong>de</strong>nador. De<br />
esta forma se recorre la superficie <strong>de</strong>l frotis y el or<strong>de</strong>nador <strong>de</strong>tiene el movimiento<br />
cuando encuentra un leucocito en su campo <strong>de</strong> visión.<br />
Las imágenes ópticas (tamaño, color, gránulos citoplasmáticos, etc.) son<br />
registradas por una cámara <strong>de</strong> <strong>tel</strong>evisión y digitalizadas por el or<strong>de</strong>nador, que<br />
compara las características <strong>de</strong> la célula con una memoria en la que se incluyen<br />
las características correspondientes a los distintos tipos celulares. Si las<br />
características “coinci<strong>de</strong>n”con las <strong>de</strong> un tipo celular normal, se i<strong>de</strong>ntifica como<br />
tal; <strong>de</strong> lo contrario, se clasifica como <strong>de</strong>sconocido. Las coor<strong>de</strong>nadas <strong>de</strong> estas<br />
últimas células son archivadas, para que el técnico las pueda clasificar.<br />
Los leucocitos son clasificados en cinco categorías: polinucleares neutrófilos<br />
(segmentados y no segmentados), linfocitos, monocitos, polinucleares<br />
eosinófilos y polinucleares basófilos. Algunos sistemas son capaces <strong>de</strong> captar<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
otros elementos celulares que eventualmente pue<strong>de</strong>n aparecer en sangre<br />
periférica como mielocitos, metamielocitos, promielocitos, células plasmáticas,<br />
linfocitos atípicos o blastos.<br />
Estos sistemas i<strong>de</strong>ntifican los leucocitos en base a aspectos morfológicos, por lo<br />
que a<strong>de</strong>más <strong>de</strong> requerir células perfectamente conservadss necesitan una muy<br />
pequeña variación tintorial para evitar la clasificación errónea <strong>de</strong> células. Es por<br />
ello <strong>de</strong> gran importancia el empleo <strong>de</strong> sistemas <strong>de</strong> realización <strong>de</strong> frotis<br />
sanguíneos a<strong>de</strong>cuados, para la obtención <strong>de</strong> preparaciones homogéneas y con<br />
la mayor similitud tintorial. Se recomienda, por ello, la utilización <strong>de</strong> sistemas<br />
automáticos <strong>de</strong> tinción.<br />
Junto a la fórmula leucocitaria, muchos <strong>de</strong> estos contadores proporcionan<br />
a<strong>de</strong>más información sobre morfología <strong>de</strong> glóbulos rojos y cuantificación <strong>de</strong><br />
plaquetas.<br />
Este método es el más parecido al método microscópico convencional, pero<br />
tiene gran<strong>de</strong>s inconvenientes como su bajo rendimiento, tanto por el número <strong>de</strong><br />
células analizadas, como por su escasa velocidad en la clasificación <strong>de</strong> las<br />
mismas, aunque actualmente se están consiguiendo velocida<strong>de</strong>s aceptables.<br />
SISTEMAS DE FLUJO CONTINUO<br />
El recuento y análisis <strong>de</strong> células sanguíneas se hacen en aparatos cuyo principio<br />
<strong>de</strong> funcionamiento se basa en uno o en los dos principios que señalamos:<br />
a) Resistencia eléctrica por impedancia.<br />
Con el método <strong>de</strong> la resistencia<br />
eléctrica, las células en<br />
suspensión pasan a través <strong>de</strong> una<br />
apertura situada entre dos<br />
electrodos, entre los que existe<br />
una corriente eléctrica continua <strong>de</strong><br />
intensidad constante; cada célula<br />
al pasar produce un incremento<br />
momentáneo <strong>de</strong> la resistencia<br />
eléctrica que se traduce en un<br />
impulso eléctrico. El número <strong>de</strong><br />
pulsos generados es proporcional<br />
al <strong>de</strong> células que pasan. La<br />
amplitud <strong>de</strong> cada pulso es<br />
proporcional al volumen celular<br />
(Figura 2.)<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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Figura 2. Dispositivo <strong>de</strong> recuento por impedancia
TEMARIO DE T.E.L.<br />
b) Difracción <strong>de</strong> la luz en citometría <strong>de</strong> flujo, con o son citoquímica.<br />
El método <strong>de</strong> la difracción <strong>de</strong> la luz en citometría <strong>de</strong> flujo se basa en iluminar con<br />
un haz <strong>de</strong> luz láser o halógena un flujo por el que pasan alineadas una<br />
suspensión celular. El paso <strong>de</strong> las células dispersa la luz. La medida <strong>de</strong> la<br />
dispersión <strong>de</strong> la luz en dos ángulos diferentes hace posible la <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong>l<br />
volumen celular (Figura 3.)<br />
Figura 3. Métodos <strong>de</strong> dispersión <strong>de</strong> la luz.<br />
Todos los aparatos, sea cual fuere el método <strong>de</strong> medida empleado, están<br />
dotados <strong>de</strong> un sistema <strong>de</strong> preparación <strong>de</strong> las muestras: realizan una aspiración<br />
<strong>de</strong> sangre total (0,2-0,3 l) que es alicuotada, diluida y distri buida en dos<br />
circuitos in<strong>de</strong>pendientes: uno para el análisis <strong>de</strong> hematíes y plaquetas y otro<br />
para leucocitos y hemoglobina.<br />
El recuento <strong>de</strong> leucocitos se realiza al medir en el circuito correspondiente, con<br />
los hematíes lisados, los volúmenes <strong>de</strong> las partículas y en algunos instrumentos<br />
también al medir la actividad mieloperoxidasa.<br />
Vamos a estudiar a continuación los siguientes sistemas <strong>de</strong> flujo continuo:<br />
a) Sistemas <strong>de</strong> análisis <strong>de</strong>l volumen leucocitario<br />
b) Métodos <strong>de</strong> difracción <strong>de</strong> la luz en citometría <strong>de</strong> flujo<br />
c) Analizadores que incorporan modificaciones <strong>de</strong> una o ambas<br />
tecnologías<br />
d) Analizador NE-800<br />
SISTEMAS DE ANÁLISIS DEL VOLUMEN LEUCOCITARIO<br />
Los autoanalizadores diferenciales basados en este principio pue<strong>de</strong>n obtener las<br />
poblaciones leucocitarias por análisis <strong>de</strong> los volúmenes <strong>de</strong>l núcleo previa<br />
eliminación <strong>de</strong>l citoplasma mediante un agente lisante (Sistemas Coulter) o<br />
mediante análisis <strong>de</strong> los volúmenes <strong>de</strong> las células intactas (serie ELT <strong>de</strong> Ortho).<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Generalmente, el histograma <strong>de</strong> distribución <strong>de</strong> los glóbulos blancos no<br />
representa el volumen <strong>de</strong> los leucocitos en la sangre circulante, sino el resultante<br />
tras la acción <strong>de</strong> un agente lisante. Este agente actúa al mismo tiempo sobre la<br />
membrana y el citoplasma <strong>de</strong> las células, lo que provoca alteraciones diferentes<br />
según el tipo <strong>de</strong> célula. Los linfocitos aparecen más pequeños que los monocitos<br />
y estos más pequeños que los granulocitos. De hecho, la posición <strong>de</strong> las células<br />
en la curva <strong>de</strong> distribución viene <strong>de</strong>terminada por la morfología <strong>de</strong>l núcleo:<br />
a) A la izquierda las células con un núcleo esférico: los linfocitos.<br />
b) En la zona central los monocitos, cuyo núcleo suele presentar una o<br />
varias hendiduras.<br />
c) A la <strong>de</strong>recha, los granulocitos con el núcleo menos segmentado<br />
seguido <strong>de</strong> los polinucleares.<br />
En el histograma <strong>de</strong> distribución pue<strong>de</strong>n diferenciarse tres picos, cada uno <strong>de</strong> los<br />
cuales correspon<strong>de</strong>n a un tipo celular. De aquí que se les conozca también como<br />
sistemas <strong>de</strong> tres poblaciones (Figura 4).<br />
a) Linfocitos: en el pico comprendido entre 35 y 90 fl.<br />
b) Mononucleares: entre 90 y 160 fl.<br />
c) Granulocitos: entre 160 y 450 fl. El aparato proporciona una cifra global<br />
<strong>de</strong> granulocitos, ya que no pue<strong>de</strong> distinguir entre neutrófilos, eosinófilos<br />
y basófilos.<br />
Esta fórmula <strong>de</strong> tres poblaciones pue<strong>de</strong> consi<strong>de</strong>rarse como una fórmula<br />
orientativa. Cuando el aparato advierte una distribución celular anómala, lo indica<br />
señalando unas alarmas.<br />
Figura 4. Histograma normal <strong>de</strong> la serie blanca.<br />
METODOS DE DIFRACCION DE LA LUZ EN CITOMETRIA DE FLUJO<br />
Los aparatos que usan este procedimiento son los <strong>de</strong>nominados H1, H2 y H3 <strong>de</strong><br />
la casa Technicon. Estos sistemas obtienen el análisis diferencial <strong>de</strong> leucocitos<br />
<strong>de</strong> acuerdo con su tamaño, su comportamiento citoquímico ante <strong>de</strong>terminados<br />
colorantes y su actividad mieloperoxidasa.<br />
Estos aspectos son analizados y comparados por la parte informática <strong>de</strong>l aparato<br />
para producir unos resultados precisos, exactos y fiables.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
De estos parámetros se obtienen los datos referentes a cuatro poblaciones<br />
leucocitarias: linfocitos, monocitos, neutrófilos y eosinófilos. Y adicionalmente<br />
dos poblaciones más: las gran<strong>de</strong>s células inmaduras (LUC) y los linfocitos<br />
atípicos (Figura 5.)<br />
Figura 5. Citograma <strong>de</strong> peroxidasa.<br />
En la figura 5 aparece un citograma <strong>de</strong> peroxidasa, don<strong>de</strong> en la casilla A<br />
aparecen los linfocitos, los más pequeños y <strong>de</strong>sprovistos <strong>de</strong> actividad<br />
peroxidasa. En la casilla B se encuentran los monocitos, ligeramante mayores y<br />
con ligera actividad peroxidasa. En la casilla C se encuentra la población más<br />
numerosa, los neutrófilos, mayores y cargados <strong>de</strong> peroxidasa. Los eosinófilos,<br />
<strong>de</strong> menor tamaño y muy cargados <strong>de</strong> peroxidasa se encuentran en la casilla D.<br />
Y por último, en la casilla E aparece un tipo celular adicional, son los LUC o<br />
gran<strong>de</strong>s células no teñidas: son<br />
células normalmente presentes en la<br />
sangre en una pequeña proporción,<br />
como linfocitos gran<strong>de</strong>s hiperactivos y<br />
todas las células patológicas sin<br />
actividad peroxidasa (linfoblastos,<br />
mieloblastos, tricoleucocitos,…)<br />
Los basófilos son <strong>de</strong>tectados en un<br />
canal in<strong>de</strong>pendiente (canal <strong>de</strong><br />
lobularidad). Mediante un reactivo<br />
lisante, son <strong>de</strong>struidas las membranas<br />
<strong>de</strong> todos los leucocitos excepto las <strong>de</strong><br />
los basófilos (Figura 6.)<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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Figura 6. Citograma <strong>de</strong> basófilos<br />
La peroxidasa es una enzima contenida en el citoplasma <strong>de</strong> todos los leucocitos,<br />
en cantidad variable, excepto en los linfocitos, y esta característica es utilizada<br />
para la obtención <strong>de</strong> la fórmula leucocitaria clásica.
TEMARIO DE T.E.L.<br />
Para la correcta comprensión <strong>de</strong> los histogramas por esta tecnología, se ha <strong>de</strong><br />
tener en cuenta que las células linfoi<strong>de</strong>s son peroxidasa negativas y <strong>de</strong> volumen<br />
pequeño.<br />
Los monocitos son mayores que los linfocitos y más ricos en peroxidasa. Los<br />
neutrófilos son mayores que los linfocitos y con mucha peroxidasa. La<br />
peroxidasa aparece en los promielocitos y aumenta progresivamente conforme<br />
se completa la maduración <strong>de</strong> la serie mieloi<strong>de</strong>. Los eosinófilos poseen mucha<br />
peroxidasa. Los basófilos son peroxidasa negativos.<br />
En el citograma <strong>de</strong> peroxidasa los linfocitos se sitúan abajo y a la izquierda. Los<br />
monocitos arriba <strong>de</strong> los linfocitos y hacia la <strong>de</strong>recha. Los neutrófilos ocupan la<br />
parte central <strong>de</strong>l citograma. Los eosinófilos se sitúan <strong>de</strong>bajo <strong>de</strong> los neutrófilos.<br />
Las células LUC ocupan la zona superior izquierda <strong>de</strong>l citograma.<br />
En el citograma <strong>de</strong> basófilos en la zona <strong>de</strong>recha se sitúa los neutrófilos. En la<br />
zona izquierda los mononucleares y en la zona <strong>de</strong> arriba los basófilos. Las<br />
células blásticas se situarían a la izquierda <strong>de</strong> las mononucleares.<br />
ANALIZADORES QUE INCORPORAN MODIFICACIONES DE UNA O AMBAS<br />
TECNOLOGÍAS<br />
Es el caso <strong>de</strong>l analizador Coulter STKS, que mi<strong>de</strong>:<br />
1. Volumen celular por el principio <strong>de</strong> la variación <strong>de</strong> la impedancia<br />
2. Conductividad celular por medio <strong>de</strong> una corriente <strong>de</strong> alta frecuencia<br />
3. Estructura celular por la difracción <strong>de</strong> la luz láser monocromático<br />
4. Estos tres parámetros son integrados y analizados conjuntamente en<br />
un sistema <strong>de</strong> tres ejes.<br />
De esta manera se consigue una diferenciación celular en cinco poblaciones:<br />
linfocitos, monocitos, basófilos, neutrófilos y eosinófilos, así como <strong>de</strong>tectar<br />
poblaciones anormales: blastos, linfocitos atípicos, granulocitos inmaduros,<br />
bandas,…<br />
La tecnología VCS mantiene los leucocitos en un estado casi nativo y efectúa<br />
una lectura en tres dimensiones. Los resultados se pue<strong>de</strong>n examinar en tres<br />
planos: DF1, DF2 y DF3, siendo el más usado el DF1, por ser don<strong>de</strong> se<br />
visualizan mejor todas las poblaciones. En la figura 7 se aprecian los resultados<br />
vistos <strong>de</strong>s<strong>de</strong> tres ángulos, don<strong>de</strong> 1: Neutrófilos, 2: Linfocitos, 3: Monocitos, 4:<br />
Eosinófilos y 5: Basófilos.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Figura 7. Resultados vistos <strong>de</strong>s<strong>de</strong> tres ángulos<br />
La localización <strong>de</strong> poblaciones anormales se aprecia en la figura 32.8,<br />
don<strong>de</strong>: 1: Sospecha <strong>de</strong> blastos; 2: Granulocitos inmaduros, 3: Neutrófilos<br />
envejecidos, 4: Plaquetas gigantes, 5: Eritroblastos, 6: Linfocitos atípicos, 7:<br />
Sospecha <strong>de</strong> blastos, 8: Linfocitos no <strong>de</strong>finidos y 9: Sospecha <strong>de</strong> blastos.<br />
ANALIZADOR NE-800<br />
Figura 8. Localización <strong>de</strong> poblaciones anormales.<br />
En el analizador NE-800 se sustituye el haz <strong>de</strong> luz por una corriente eléctrica,<br />
bien directa o <strong>de</strong> radiofrecuencia. Este analizador utiliza tres canales y tres<br />
hemolizantes diferentes, específicos para separar cinco poblaciones celulares.<br />
Estas células son analizadas por los métodos <strong>de</strong> Radio Frecuencia (RF) y<br />
Corriente Directa (CD) que realiza un scattegrama tridimensional que se<br />
visualiza en pantalla, expresándose los datos <strong>de</strong> RF en el eje <strong>de</strong> or<strong>de</strong>nadas y los<br />
<strong>de</strong> CD en el <strong>de</strong> abcisa, discriminándose las poblaciones celulares <strong>de</strong> los<br />
hematíes lisados y separándose tres poblaciones: linfocitos, monocitos y<br />
granulocitos. La <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> neutrófilos y basófilos se hacen por canales<br />
in<strong>de</strong>pendientes, utilizándose hemolizantes diferentes y selectivos para cada una<br />
<strong>de</strong> estas poblaciones, controlándose el tiempo y temperatura <strong>de</strong> la reacción con<br />
el hemolizante. Los neutrófilos se <strong>de</strong>terminan mediante la fórmula:<br />
Neutrófilos = granulocitos - (eosinófilos + basófilos).<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Los hematíes y plaquetas se analizan mediante el método <strong>de</strong> corriente directa.<br />
Este analizador proporciona <strong>de</strong> cada muestra un mensaje positivo o negativo. El<br />
mensaje negativo significa que todos los parámetros <strong>de</strong> cada muestra están<br />
<strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> los límites consi<strong>de</strong>rados normales, no necesitando la muestra ninguna<br />
verificación adicional.<br />
Un mensaje positivo indica que la muestra exce<strong>de</strong> los límites aceptables y<br />
requiere posterior investigación y estudio<br />
El analizador proporciona un scattegrama, don<strong>de</strong> se representan los linfocitos,<br />
monocitos, granulocitos y células anormales, en áreas diferentes, según la figura<br />
8 don<strong>de</strong>:<br />
L: Linfocitos normales<br />
M: Monocitos<br />
G: Granulocitos<br />
1. Blastos: por <strong>de</strong>bajo <strong>de</strong> la situación normal <strong>de</strong> linfocitos y granulocitos<br />
2. Granulocitos inmaduros: por <strong>de</strong>bajo y hacia la <strong>de</strong>recha <strong>de</strong> la situación<br />
normal <strong>de</strong> los granulocitos.<br />
3. Cayados: por <strong>de</strong>bajo y hacia la <strong>de</strong>recha <strong>de</strong> los granulocitos normales.<br />
4. Eritroblastos: en la zona <strong>de</strong> los estromas <strong>de</strong> los hematíes.<br />
5. Linfocitos atípicos: entre la zona <strong>de</strong> linfocitos normales y monocitos.<br />
6. Agregados plaquetarios: Siguiendo, por arriba, la línea divisoria <strong>de</strong>l<br />
scattegrama.<br />
Figura 8. Analizador NE-800<br />
Junto al scattegrama, también nos presenta tres histogramas: <strong>de</strong> WBC, <strong>de</strong><br />
eosinófilos y <strong>de</strong> basófilos.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
TEMA 9. COAGULACIÓN:<br />
REALIZACIÓN TÉCNICA Y MEDICIÓN<br />
DEL TIEMPO DE PROTROMBINA,<br />
TIEMPO DE TROMBOPLASTINA<br />
PARCIAL ACTIVADA Y FIBRINÓGENO<br />
INTRODUCCIÓN<br />
CONCEPTO DE HEMOSTASIA<br />
La hemostasia es el proceso encargado <strong>de</strong> prevenir la extravasación sanguínea<br />
espontánea, evitar la hemorragia excesiva a nivel <strong>de</strong> los vasos lesionados y<br />
mantener la flui<strong>de</strong>z <strong>de</strong> la sangre circulante.<br />
El mantenimiento <strong>de</strong> una hemostasia normal requiere el correcto funcionamiento<br />
<strong>de</strong> cuatro factores: a) pared vascular; b) función plaquetaria; c) coagulación<br />
sanguínea; y d) fibrinolisis. La alteración <strong>de</strong> uno sólo <strong>de</strong> ellos es siempre causa<br />
<strong>de</strong> patología.<br />
De forma resumida, el proceso <strong>de</strong> la hemostasia es como sigue: Al producirse la<br />
lesión vascular, el vaso afectado se contrae transitoriamente, disminuyendo el<br />
paso <strong>de</strong> sangre a su través (reacción vascular). A continuación, las plaquetas<br />
circulantes se adhieren al colágeno <strong>de</strong>l tejido subendo<strong>tel</strong>ial, que queda expuesto<br />
<strong>de</strong>bido a la lesión, y liberan a<strong>de</strong>nosín-difosfato (ADP), lo que facilita la<br />
agregación y formación <strong>de</strong> un trombo plaquetario (función plaquetaria). Este<br />
trombo <strong>de</strong>tiene momentáneamente la hemorragia, siendo primero reforzado y<br />
luego sustituido por la formación <strong>de</strong> fibrina (coagulación sanguínea o<br />
plasmática). Finalmente se inicia la cicatrización <strong>de</strong> la herida vascular, a la vez<br />
que la fibrina es <strong>de</strong>gradada por un sistema enzimático (fibrinolisis).<br />
COAGULACIÓN PLASMÁTICA<br />
El proceso <strong>de</strong> coagulación sanguínea consiste en una serie <strong>de</strong> reacciones<br />
enzimáticas don<strong>de</strong> cada factor <strong>de</strong> la coagulación es la enzima <strong>de</strong>l<br />
inmediatamente inferior y el sustrato <strong>de</strong>l inmediatamente superior (reacción en<br />
cascada). Este proceso continua hasta que el fibrinógeno se transforma en<br />
fibrina, lo que provoca la modificación <strong>de</strong>l estado físico <strong>de</strong> la sangre, que pasa <strong>de</strong><br />
un estado líquido a un estado <strong>de</strong> gel (la red <strong>de</strong> fibrina insoluble encierra entre<br />
sus mallas a los elementos formes <strong>de</strong> la sangre y refuerza el trombo plaquetario<br />
para <strong>de</strong>tener <strong>de</strong> forma <strong>de</strong>finitiva la hemorragia).<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 87 <strong>de</strong> 287
TEMARIO DE T.E.L.<br />
En la coagulación sanguínea se pue<strong>de</strong>n distinguir tres gran<strong>de</strong>s etapas: a)<br />
activación <strong>de</strong> la protrombina; b) formación <strong>de</strong> la trombina; y c) formación <strong>de</strong> la<br />
fibrina.<br />
El activador <strong>de</strong> la protrombina es un complejo lipoprotéico formado por el factor<br />
X, el factor V, el factor 3 plaquetario (fosfolípido) y los iones Ca ++ . La activación<br />
previa <strong>de</strong>l factor X pue<strong>de</strong> realizarse a través <strong>de</strong> 2 vías diferentes: vía extrínseca<br />
y vía intrínseca.<br />
VÍA INTRÍNSECA VÍA EXTRÍNSECA<br />
FOSFOLÍPIDOS<br />
F XII<br />
FXI<br />
La coagulación se limita a la zona <strong>de</strong> la lesión vascular gracias a la existencia <strong>de</strong><br />
inhibidores fisiológicos, que neutralizan a los factores <strong>de</strong> la coagulación<br />
activados. Los más importantes son antitrombina III o cofactor <strong>de</strong> la heparina,<br />
α2-macroglobulina, α1-antitripsina, y proteínas C y S.<br />
Fibrinolisis<br />
F XIIa<br />
FXIa<br />
FIX FIXa<br />
Una vez que el trombo <strong>de</strong> fibrina ha cumplido su función hemostática, es<br />
<strong>de</strong>struido mediante la fibrinolisis, proceso fisiológico que se realiza gracias a la<br />
plasmina, proteasa activa que se origina a partir <strong>de</strong> un precursor plasmático<br />
inactivo: el plasminógeno.<br />
FX<br />
FXa<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 88 <strong>de</strong> 287<br />
TROMBOPLASTINA TISULAR<br />
FVIIa<br />
FVII<br />
PROTROMBINA F<br />
II<br />
F IIa TROMBINA<br />
FIBRINÓGENO<br />
Ca ++<br />
FVII<br />
FV<br />
FIBRINA
t-<br />
u-<br />
Plasmina<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
Plasminógeno<br />
EXPLORACIÓN DE LA COAGULACIÓN PLASMÁTICA<br />
Toda trastorno <strong>de</strong> la hemostasia primaria, <strong>de</strong>bido generalmente a una<br />
plaquetopenia, estando el tiempo <strong>de</strong> sangría excesivamente alargado. Si el<br />
recuento <strong>de</strong> plaquetas y el tiempo <strong>de</strong> sangría son normales, hay que consi<strong>de</strong>rar<br />
la posible existencia <strong>de</strong> hemorragia es el resultado <strong>de</strong> una alteración vascular,<br />
plaquetaria o <strong>de</strong> los factores plasmáticos <strong>de</strong> la coagulación. En el diagnóstico <strong>de</strong><br />
los trastornos hemorrágicos es fundamental la orientación clínica, que dirigirá la<br />
exploración hacia uno <strong>de</strong> los factores citados. Ante un paciente que sangra se<br />
<strong>de</strong>be pensar en la existencia <strong>de</strong> un <strong>de</strong>fecto en algún factor <strong>de</strong> la coagulación.<br />
La exploración <strong>de</strong> la coagulación sanguínea se basa en la realización <strong>de</strong> dos<br />
pruebas globales: el tiempo <strong>de</strong> protrombina (TP) y el tiempo <strong>de</strong> tromboplastina<br />
parcial activada (TTPA), que se complementan con una valoración <strong>de</strong> la<br />
fibrinoformación mediante la <strong>de</strong>terminación funcional <strong>de</strong>l fibrinógeno o la<br />
realización <strong>de</strong>l tiempo <strong>de</strong> trombina (TT). Sobre la base <strong>de</strong> los resultados <strong>de</strong> estas<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 89 <strong>de</strong> 287<br />
Plasmina<br />
FIBRINA<br />
Productos <strong>de</strong> <strong>de</strong>gradación<br />
<strong>de</strong> la Fibrina. (D-D)
TEMARIO DE T.E.L.<br />
pruebas po<strong>de</strong>mos realizar una aproximación diagnóstica, cuya confirmación<br />
pue<strong>de</strong> requerir la <strong>de</strong>terminación específica <strong>de</strong> factores <strong>de</strong> la coagulación.<br />
Aunque actualmente la casi totalidad <strong>de</strong> las pruebas <strong>de</strong> coagulación se realizan<br />
mediante coagulómetros semiautomáticos, las técnicas las <strong>de</strong>scribiremos <strong>de</strong> una<br />
forma general aplicable a cualquier método.<br />
Todas ellas se realizan a partir <strong>de</strong>l plasma, en el que se ha bloqueado el<br />
<strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> la coagulación mediante un agente capaz <strong>de</strong> eliminar el Ca ++ :<br />
citrato u oxalato. Las pruebas se inician mediante la adición <strong>de</strong> la suficiente<br />
cantidad <strong>de</strong> Ca ++ y <strong>de</strong>l agente activador <strong>de</strong> la coagulación correspondiente a la<br />
etapa <strong>de</strong> ésta que se <strong>de</strong>see explorar, midiendo el tiempo necesario para la<br />
formación <strong>de</strong>l coágulo.<br />
Una anomalía en alguna <strong>de</strong> estas pruebas básicas pue<strong>de</strong> <strong>de</strong>berse a dos tipos <strong>de</strong><br />
causas: presencia <strong>de</strong> un anticoagulante circulante y/o déficit <strong>de</strong> uno o varios<br />
factores <strong>de</strong> la coagulación.<br />
OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS PARA PRUEBAS DE COAGULACIÓN<br />
1. La toma <strong>de</strong> sangre se realizará por punción venosa limpia, no <strong>de</strong>biendo<br />
existir un éxtasis prolongado por torniquete.<br />
2. Se pue<strong>de</strong> emplear jeringuilla o dispositivos para tubos al vacío. Si hay que<br />
extraer más <strong>de</strong> una jeringuilla o tubo, se aconseja que el <strong>de</strong>stinado al<br />
estudio <strong>de</strong> la coagulación no sea el primero.<br />
3. Se utilizarán tubos <strong>de</strong> plástico o <strong>de</strong> vidrio siliconado que contengan citrato<br />
sódico a concentración <strong>de</strong> 0,1 mol/L, una parte <strong>de</strong> citrato por cada 9<br />
partes <strong>de</strong> sangre. Una vez introducida la sangre, se mezclan suavemente<br />
sin producir espuma.<br />
4. La sangre anticoagulada se centrifuga durante 10-15 minutos a 3.000<br />
r.p.m. El plasma sobrenadante se pipetea cuidadosamente en otro tubo<br />
<strong>de</strong> plástico o siliconado.<br />
5. Debe analizarse en las 2 horas siguientes a la extracción (aunque pue<strong>de</strong><br />
conservarse hasta 4 horas a 4º C). Si no, congelar a -20º C hasta su<br />
procesamiento. La conservación prolongada a temperatura ambiente<br />
conlleva una inactivación parcial <strong>de</strong> los factores V y VIII, mientras que la<br />
refrigeración prolongada activa el factor VII.<br />
Normas generales para la realización manual <strong>de</strong> las pruebas <strong>de</strong> coagulación:<br />
A) MATERIAL<br />
1. Baño María a 37º C muy preciso.<br />
2. Tubos estándar <strong>de</strong> hemólisis <strong>de</strong> plástico (70 × 10 mm).<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 90 <strong>de</strong> 287
TEMARIO DE T.E.L.<br />
3. Pipetas automáticas <strong>de</strong> 100 y 200 μL.<br />
4. Cronómetros contrastados.<br />
B) REALIZACIÓN DE LA PRUEBA<br />
1. Introducir el plasma en dos tubos <strong>de</strong> hemólisis e incubar 2 minutos a<br />
37º C en el baño María.<br />
2. Añadir los reactivos en el or<strong>de</strong>n y con los intervalos que señalen las<br />
técnicas concretas, agitando suavemente el tubo para su mezcla.<br />
3. La adición <strong>de</strong>l último reactivo a la mezcla <strong>de</strong>be ser brusca e<br />
instantánea, poniendo simultáneamente en marcha el cronómetro.<br />
Inmediatamente agitar suavemente para mezclar y <strong>de</strong>jar el tubo en el<br />
baño un breve tiempo, variable según la duración normal <strong>de</strong> la prueba;<br />
luego mover rítmicamente el tubo, bajo una correcta fuente <strong>de</strong> luz,<br />
hasta ver aparecer la fibrina, momento en el que se <strong>de</strong>tiene el<br />
cronómetro.<br />
4. Las pruebas se realizarán por duplicado y la diferencia entre dos<br />
<strong>de</strong>terminaciones será siempre inferior a 1 segundo; <strong>de</strong> lo contrario se<br />
realizará una nueva <strong>de</strong>terminación.<br />
5. Simultáneamente a la valoración <strong>de</strong> la muestra <strong>de</strong>be realizarse la <strong>de</strong><br />
un plasma control obtenido <strong>de</strong> una mezcla <strong>de</strong> plasmas frescos <strong>de</strong> 15 -<br />
20 sujetos sanos o <strong>de</strong> una mezcla similar liofilizada (comercial).<br />
Causas <strong>de</strong> error<br />
A) EN LA OBTENCIÓN DEL PLASMA:<br />
a) Éxtasis venoso <strong>de</strong>masiado prolongado. Favorece la fibrinolisis local.<br />
b) Punción venosa ina<strong>de</strong>cuada.<br />
c) Dilución errónea <strong>de</strong>l plasma. Proporción sangre-anticoagulante<br />
inexacta.<br />
d) Tiempo <strong>de</strong> centrifugación ina<strong>de</strong>cuado.<br />
e) Presencia <strong>de</strong> hemólisis en el plasma.<br />
f) Conservación muy prolongada <strong>de</strong>l plasma antes <strong>de</strong> realizar la prueba.<br />
B) EN LA REALIZACIÓN DE LA TÉCNICA:<br />
a) Errores <strong>de</strong> pipeteo<br />
b) Empleo <strong>de</strong> reactivos ina<strong>de</strong>cuados o caducados<br />
c) Empleo <strong>de</strong> reactivos mal preparados<br />
d) Empleo <strong>de</strong> una temperatura ina<strong>de</strong>cuada<br />
e) Tiempos <strong>de</strong> incubación inexactos<br />
f) Empleo <strong>de</strong> agua no <strong>de</strong>stilada<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 91 <strong>de</strong> 287
TEMARIO DE T.E.L.<br />
g) Errores en la realización <strong>de</strong> la técnica<br />
TIEMPO DE PROTROMBINA:<br />
Valoración global <strong>de</strong> la vía extrínseca:<br />
A) PRINCIPIO<br />
El tiempo <strong>de</strong> Quick o <strong>de</strong> protrombina (TP) es el tiempo necesario para la<br />
coagulación <strong>de</strong> un plasma recalcificado en presencia <strong>de</strong> un exceso <strong>de</strong><br />
tromboplastina hística. Explora fundamentalmente la función <strong>de</strong> la vía<br />
extrínseca <strong>de</strong> la coagulación (específicamente el factor VII y también los<br />
factores V y X), así como la función <strong>de</strong> la protrombina (factor II) y <strong>de</strong>l<br />
fibrinógeno (Factor I).<br />
B) MATERIAL<br />
a) Tromboplastina cálcica comercial.<br />
b) Plasma citratado <strong>de</strong>l paciente.<br />
c) Plasma citratado control.<br />
d) Coagulómetro o equipo para la <strong>de</strong>terminación manual.<br />
La tromboplastina hística se prepara a partir <strong>de</strong> extractos <strong>de</strong> cerebro o pulmón<br />
humanos o <strong>de</strong> tejidos animales, fundamentalmente <strong>de</strong> conejo. Existen muchas<br />
tromboplastinas comerciales preparadas a partir <strong>de</strong> tejidos animales, cuya<br />
sensibilidad suele variar según la firma comercial que la prepara, por lo que la<br />
OMS elaboró un patrón <strong>de</strong> referencia internacional a partir <strong>de</strong> cerebro humano<br />
(actualmente consi<strong>de</strong>rado como patrón primario), y también patrones a partir <strong>de</strong><br />
tejidos bovino y <strong>de</strong> conejo.<br />
Estos últimos <strong>de</strong>ben utilizarse para verificar la calidad y sensibilidad <strong>de</strong> los<br />
diferentes preparados comerciales, en los que a<strong>de</strong>más <strong>de</strong>be venir indicado su<br />
índice internacional <strong>de</strong> sensibilidad (ISI), calculado en relación al <strong>de</strong>l patrón <strong>de</strong><br />
referencia internacional, que se consi<strong>de</strong>ra <strong>de</strong> 1,0.<br />
El Índice Internacional <strong>de</strong> Sensibilidad (ISI) es el valor <strong>de</strong> la recta <strong>de</strong> regresión <strong>de</strong><br />
los tiempos <strong>de</strong> protrombina <strong>de</strong> pacientes anticoagulados obtenidos con la<br />
tromboplastina comercial y con la tromboplastina <strong>de</strong> referencia internacional.<br />
Para los estudios <strong>de</strong> carácter diagnóstico es conveniente utilizar una<br />
tromboplastina simple <strong>de</strong> buena sensibilidad (ISI cercano a 1). Para el control <strong>de</strong>l<br />
tratamiento anticoagulante esta recomendación se hace imperativa, existiendo<br />
tromboplastinas simples o combinadas (aportan fibrinógeno y factor V) <strong>de</strong> muy<br />
alta sensibilidad.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 92 <strong>de</strong> 287
C) MÉTODO<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
Precalentar la tromboplastina reconstituida, a 37º C durante 10-15 minutos.<br />
Introducir 0,1 mL (100 mL) <strong>de</strong> PPP <strong>de</strong>l paciente en un fibrotubo, y 0,1 mL <strong>de</strong><br />
PPP control en otro fibrotubo, e incubar 2 minutos a 37º C.<br />
*Añadir 0,2 mL <strong>de</strong> tromboplastina cálcica, a la vez que se dispara el<br />
cronómetro.<br />
Medir en segundos el tiempo que tarda en aparecer el coágulo.<br />
D) INTERPRETACIÓN DEL RESULTADO<br />
Los resultados se expresan en segundos, acompañados <strong>de</strong>l TPNM, y se<br />
aconseja añadir la razón o cociente “tiempo <strong>de</strong>l paciente /TPNM”, para<br />
una más fácil interpretación. El Tiempo <strong>de</strong> Protrombina Normal Medio<br />
(TPNM) es el valor correspondiente al plasma control.<br />
También es conveniente indicar la marca <strong>de</strong> la tromboplastina utilizada<br />
por la gran variabilidad en la sensibilidad entre dos distintos reactivos<br />
comerciales. Cuando la tromboplastina tiene una calidad idónea, <strong>de</strong>be<br />
suministrar un tiempo <strong>de</strong> Quick para plasmas normales (plasma testigo)<br />
<strong>de</strong> 12 a 14 segundos.<br />
La aplicación <strong>de</strong> la prueba a un número elevado <strong>de</strong> sujetos<br />
presuntamente libres <strong>de</strong> alteraciones <strong>de</strong> la coagulación, como ocurre en<br />
los gran<strong>de</strong>s laboratorios, permite corregir ligeras <strong>de</strong>sviaciones en el<br />
TPNM. Para ello se toma el valor <strong>de</strong> la razón <strong>de</strong> un mínimo <strong>de</strong> 50<br />
individuos sin patología coagulativa, se eliminan los resultados que se<br />
hallen fuera <strong>de</strong> ± 2DE, se establece <strong>de</strong> nuevo la media y se calcula el<br />
número por el cual ésta <strong>de</strong>bería multiplicarse para que su valor fuera<br />
exactamente 1,0.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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Valor inverso <strong>de</strong> las diluciones<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
6<br />
5<br />
4<br />
3<br />
2<br />
1<br />
10 20 30 40 50 60<br />
Tiempo <strong>de</strong> coagulación (segundos)<br />
Figura 1<br />
Este número es el factor por el que <strong>de</strong>berán multiplicarse todos los resultados<br />
que se obtengan (mientras no se cambien las condiciones <strong>de</strong> trabajo o el lote <strong>de</strong>l<br />
reactivo) para que realmente se adapten a la población atendida en dicho<br />
laboratorio.<br />
Para expresar el resultado en porcentaje <strong>de</strong> actividad hay que elaborar una<br />
curva <strong>de</strong> calibración (Figura 1) a partir <strong>de</strong> diluciones en tampón citratado <strong>de</strong>l<br />
plasma testigo, consi<strong>de</strong>rando como 100% el plasma sin diluir (Tabla 1).<br />
El tiempo en segundos obtenido <strong>de</strong>l plasma problema se lleva a la curva <strong>de</strong><br />
calibración y obtenemos la actividad global en % (actividad protrombínica). El<br />
plasma testigo empleado para realizar la curva está generalmente constituido por<br />
una mezcla <strong>de</strong> plasmas normales obtenidos a partir <strong>de</strong> 15 a 20 donantes sanos.<br />
La curva <strong>de</strong>be volver a realizarse cada vez que se emplee un nuevo lote <strong>de</strong><br />
tromboplastina, ya que ésta pue<strong>de</strong> hacer variar ligeramente el valor <strong>de</strong> los<br />
testigos.<br />
concentración 100 % 50 % 25 % 12,5 %<br />
suero<br />
fisiológico o<br />
tampón Owren<br />
0 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL<br />
plasma control 1 mL 0,5 mL 0,5 mL <strong>de</strong> la 0,5 mL <strong>de</strong> la<br />
dilución anterior dilución anterior<br />
Tabla 1: Llevando los tiempos y las concentraciones a un papel semilogarítmico<br />
se obtiene una recta (Curva <strong>de</strong> calibración: Figura 1).<br />
La <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong>l TP se utiliza:<br />
Para comprobar la normalidad <strong>de</strong> la vía extrínseca y común <strong>de</strong> la coagulación.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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20<br />
25<br />
33<br />
50<br />
100<br />
Actividad <strong>de</strong> Protrombina (%)
TEMARIO DE T.E.L.<br />
Como indicador <strong>de</strong> la función hepática (ya que la mayor parte <strong>de</strong> los factores <strong>de</strong><br />
la coagulación son <strong>de</strong> síntesis hepática).<br />
Para controlar los tratamientos con anticoagulantes orales.<br />
Si el TP está alargado, se realiza un TP <strong>de</strong> la mezcla a partes iguales <strong>de</strong> plasma<br />
<strong>de</strong>l paciente con plasma control. Si “corrige” (es <strong>de</strong>cir, si el TP se normaliza),<br />
indica un déficit <strong>de</strong> factores. Si “no corrige” indica la presencia <strong>de</strong> anticoagulante<br />
(heparina, endógena o exógena, o PDF).<br />
TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA:<br />
Valoración global <strong>de</strong> la vía intrínseca:<br />
A) PRINCIPIO<br />
El tiempo <strong>de</strong> cefalina o TTP es el tiempo necesario para la coagulación <strong>de</strong><br />
un PPP recalcificado en presencia <strong>de</strong> cefalina (mezcla <strong>de</strong> fosfolípidos). Si<br />
a<strong>de</strong>más <strong>de</strong> la cefalina se aña<strong>de</strong> una sustancia que facilite la activación <strong>de</strong>l<br />
sistema <strong>de</strong> contacto (caolín, celite u otras), se le <strong>de</strong>nomina tiempo <strong>de</strong><br />
cefalina activado o TTPA.<br />
El TTPA explora la vía intrínseca y común <strong>de</strong> la coagulación (factores XII,<br />
XI, IX, VIII, V, X y II).<br />
B) MATERIAL<br />
a) Cefalina activada (extracto fosfolipídico para la realización <strong>de</strong>l TTPA<br />
que contiene un activador <strong>de</strong>l sistema <strong>de</strong> contacto: silicato en<br />
suspensión o ácido elágico).<br />
b) Solución <strong>de</strong> cloruro cálcico 25 mmol/L.<br />
c) Plasma citratado <strong>de</strong>l paciente.<br />
d) Plasma citratado control (mezcla <strong>de</strong> 10 ó más plasmas <strong>de</strong> donantes<br />
sanos) preparado en el laboratorio o comercial.<br />
e) Coagulómetro o equipo para la <strong>de</strong>terminación manual.<br />
C) MÉTODO<br />
En dos tubos <strong>de</strong> hemólisis se introducen 0,1 mL <strong>de</strong> PPP <strong>de</strong>l paciente y <strong>de</strong>l<br />
control, respectivamente.<br />
A continuación se aña<strong>de</strong>n 0,1 mL <strong>de</strong> la suspensión <strong>de</strong> cefalina y la mezcla<br />
se <strong>de</strong>ja incubar durante 2 ó 3 minutos a 37º C (según las instrucciones <strong>de</strong>l<br />
reactivo).<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Finalmente se aña<strong>de</strong>n 0,1 mL <strong>de</strong> CaCl2 (equilibrado a 37º C) a la vez que se<br />
dispara el cronómetro<br />
Se mi<strong>de</strong> el tiempo necesario para el inicio <strong>de</strong> la formación <strong>de</strong>l coágulo.<br />
D) INTERPRETACIÓN DEL RESULTADO<br />
Se da el resultado <strong>de</strong>l tiempo en segundos <strong>de</strong> paciente y control y se<br />
aconseja acompañarlo <strong>de</strong>l cociente paciente/control para una más fácil<br />
interpretación, especialmente cuando se <strong>de</strong>stina al control <strong>de</strong>l tratamiento<br />
con heparina.<br />
El tiempo normal varía según la mezcla <strong>de</strong> cefalina-activador utilizado y<br />
generalmente oscila entre 30 y 35 segundos para el plasma normal. Para<br />
corregir pequeñas <strong>de</strong>sviaciones en el valor <strong>de</strong>l plasma control se proce<strong>de</strong><br />
<strong>de</strong> forma similar a como se indicó en el TP.<br />
El TTPA se utiliza:<br />
Para el estudio global <strong>de</strong> la coagulación, junto al TP.<br />
Para valorar la existencia <strong>de</strong> déficit <strong>de</strong> factores <strong>de</strong> la coagulación: Un<br />
alargamiento respecto al control indica una alteración <strong>de</strong> los factores<br />
antihemofílicos (VIII y IX), <strong>de</strong> los <strong>de</strong>l sistema <strong>de</strong> contacto (XI y XII) o <strong>de</strong> los<br />
factores pertenecientes a la vía común (V, X y II).<br />
Para monitorización <strong>de</strong> la terapia con heparina.<br />
Si el TTPA está alargado, hay que realizar un nuevo TTPA <strong>de</strong> una mezcla<br />
apartes iguales <strong>de</strong> plasma <strong>de</strong>l paciente y plasma control. Si “no corrige” significa<br />
la presencia <strong>de</strong> heparina o anticoagulante circulante. Si “corrige” indica un déficit<br />
factorial, y entonces hay que valorar conjuntamente TP y TTPA:<br />
TP TTPA Factor <strong>de</strong>ficitario<br />
Normal Alterado VIII, IX, XI, XII<br />
Alterado Normal VII<br />
Alterado Alterado X, V, II<br />
Si el TP y el TTPA están alargados, hay que valorar el Nº <strong>de</strong> plaquetas y el<br />
fibrinógeno para <strong>de</strong>scartar una coagulopatía <strong>de</strong> consumo.<br />
Dosificación <strong>de</strong>l fibrinógeno:<br />
Pue<strong>de</strong> realizarse mediante tres procedimientos: pon<strong>de</strong>ral, precipitación por el<br />
calor y medida <strong>de</strong>l tiempo <strong>de</strong> coagulación. Este último es el más preciso y el más<br />
utilizado, valorando el fibrinógeno funcional.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
La <strong>de</strong>terminación inmunológica por inmunodifusión radial ofrece una buena<br />
precisión y existen dispositivos comerciales que hacen muy simple la prueba.<br />
La valoración turbidimétrica a partir <strong>de</strong>l coágulo obtenido en el TP, que ofrecen<br />
algunos coagulómetros, proporciona resultados aceptables en el screening,<br />
especialmente <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong>l intervalo <strong>de</strong> normalidad.<br />
MÉTODO PONDERAL: PRINCIPIO E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS<br />
Se coagula el fibrinógeno contenido en un volumen <strong>de</strong>terminado <strong>de</strong> plasma. El<br />
coágulo se lava, se seca y se pesa, obteniéndose la cifra <strong>de</strong> fibrinógeno en g/L.<br />
La cifra normal <strong>de</strong> fibrinógeno varía entre 2 y 4 g/L, consi<strong>de</strong>rándose que existe<br />
hipofibrinogenemia cuando es inferior a 1,5 g/L, e hiperfibrinogenemia si es<br />
superior a 6 g/L.<br />
MÉTODO DE LA PRECIPITACIÓN MEDIANTE CALOR: PRINCIPIO E<br />
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS<br />
El fibrinógeno humano precipita a 56º C. La medida <strong>de</strong> la altura <strong>de</strong>l precipitado<br />
<strong>de</strong>spués <strong>de</strong> su centrifugación es proporcional a su concentración en el plasma.<br />
Es un método poco preciso, pero rápido y orientativo. Es importante tener en<br />
cuenta que los productos <strong>de</strong> <strong>de</strong>gradación <strong>de</strong> la fibrina (PDF) precipitan también a<br />
56º C y pue<strong>de</strong>n falsear los resultados.<br />
MÉTODO DE LA MEDIDA DEL TIEMPO DE COAGULACIÓN<br />
(Método <strong>de</strong> Von Clauss)<br />
A) PRINCIPIO<br />
En presencia <strong>de</strong> concentraciones elevadas <strong>de</strong> trombina y baja<br />
concentración <strong>de</strong> fibrinógeno, el tiempo <strong>de</strong> coagulación es proporcional a<br />
la tasa <strong>de</strong> fibrinógeno.<br />
B) MATERIAL<br />
a) PPP <strong>de</strong>l paciente (sangre total con citrato sódico 0,1 mol/L,<br />
centrifugada 10-15 min. a 3.000 r.p.m.). Se pue<strong>de</strong> guardar refrigerada<br />
no más <strong>de</strong> 3-4 horas.<br />
b) Tampón veronal-acetato, pH 7,35 (Tampón <strong>de</strong> Michaelis), o tampón <strong>de</strong><br />
Owren.<br />
c) Solución <strong>de</strong> trombina bovina liofilizada a concentración <strong>de</strong> 100<br />
NIH/mL.<br />
d) Solución <strong>de</strong> CaCl2 mol/L.<br />
e) Plasma citratado control con tasa <strong>de</strong> fibrinógeno previamente<br />
conocida.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
f) Coagulómetro o equipo para la <strong>de</strong>terminación manual. La lectura<br />
manual <strong>de</strong> esta prueba es difícil por simple observación <strong>de</strong> la<br />
formación <strong>de</strong>l coágulo y requiere el uso <strong>de</strong> un gancho o asa <strong>de</strong> platino.<br />
Todos los coagulómetros <strong>de</strong> lectura mecánica y la mayoría <strong>de</strong> los<br />
mo<strong>de</strong>los mo<strong>de</strong>rnos <strong>de</strong> lectura óptica son a<strong>de</strong>cuados para la<br />
realización <strong>de</strong> la prueba.<br />
C) MÉTODO<br />
Diluir el plasma problema en tampón <strong>de</strong> Michaelis o en tampón Owren<br />
(dilución 1/10).<br />
Introducir en la cubeta <strong>de</strong>l fibrómetro 0,2 mL <strong>de</strong> la dilución 1/10 y esperar 2<br />
minutos para equilibrar la muestra (37º C).<br />
Añadir 0,1 mL <strong>de</strong> la solución <strong>de</strong> trombina concentrada, al mismo tiempo<br />
que se dispara el cronómetro <strong>de</strong>l fibrómetro.<br />
Determinar el tiempo necesario para la coagulación.<br />
Las cifras obtenidas se transforman en valores <strong>de</strong> concentración <strong>de</strong><br />
fibrinógeno (g/L) mediante el empleo <strong>de</strong> una curva <strong>de</strong> calibración elaborada<br />
previamente: se <strong>de</strong>termina el fibrinógeno <strong>de</strong> un plasma control por otro<br />
método (preferentemente pon<strong>de</strong>ral) y se mi<strong>de</strong> el tiempo <strong>de</strong> coagulación<br />
correspondiente a diferentes diluciones <strong>de</strong> este plasma (1/5, 1/10, 1/20,<br />
1/30, 1/40, 1/50) en presencia <strong>de</strong> una solución <strong>de</strong> trombina (según lo<br />
indicado anteriormente).<br />
Tampón 0,8 mL 0,9 mL 1,9 mL 2,9 mL<br />
Patrón 0,2 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL<br />
Dilución 1/5 1/10 1/20 1/30<br />
En la línea <strong>de</strong> abscisas se colocan las concentraciones <strong>de</strong> fibrinógeno en g/L<br />
y en la <strong>de</strong> or<strong>de</strong>nadas los tiempos <strong>de</strong> coagulación obtenidos (en segundos)<br />
(Figura 2).<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
D) INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS<br />
En las hipofibrinogenemias, la dilución 1/10 es prácticamente<br />
incoagulable; mientras que en las hiperfibrinogenemias hay que aumentar<br />
el número <strong>de</strong> diluciones hasta entrar en la zona <strong>de</strong> sensibilidad <strong>de</strong> la recta<br />
<strong>de</strong> calibración.<br />
Si la tasa <strong>de</strong> fibrinógeno es superior a 500 mg/dL, se hace una dilución<br />
1/20 (0,1 mL <strong>de</strong> plasma problema y 1,9 mL <strong>de</strong>l tampón), se realiza una<br />
nueva <strong>de</strong>terminación y el resultado se multiplica por 2 para obtener la cifra<br />
real <strong>de</strong> fibrinógeno. Si la cifra <strong>de</strong> fibrinógeno es inferior a 100 mg/dL se<br />
realiza la prueba en plasma diluido 1/5 (0,1 mL <strong>de</strong> plasma y 0,4 mL <strong>de</strong><br />
tampón, y el resultado se divi<strong>de</strong> por 2.<br />
La presencia <strong>de</strong> un inhibidor <strong>de</strong> acción antitrombina (heparina o PDF)<br />
pue<strong>de</strong>n falsear los resultados por alargamiento <strong>de</strong>l tiempo <strong>de</strong> coagulación,<br />
in<strong>de</strong>pendientemente <strong>de</strong> la tasa <strong>de</strong> fibrinógeno.<br />
TIEMPO DE TROMBINA<br />
Figura 2<br />
Es el tiempo que tarda en coagular un PPP citratado al añadir un exceso<br />
<strong>de</strong> trombina. El valor normal oscila entre 12 y 16 segundos. Si el TT<br />
exce<strong>de</strong> más <strong>de</strong> 3 segundos al tiempo control (que se realiza<br />
simultáneamente), hay que sospechar patología <strong>de</strong>l fibrinógeno. La<br />
prueba se alarga también por la presencia <strong>de</strong> heparina, PDF o fibrinógeno<br />
anormal, por lo que ante un tiempo <strong>de</strong> trombina largo se recomienda la<br />
realización <strong>de</strong> un tiempo <strong>de</strong> Reptilase, y si éste está también alargado,<br />
<strong>de</strong>ben dosificarse el fibrinógeno y los PDF.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TIEMPO DE REPTILASE<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
Mi<strong>de</strong> el tiempo que tarda en coagular un PPP citratado al añadir reptilase<br />
(<strong>de</strong>rivado <strong>de</strong>l veneno <strong>de</strong> víbora), que actúa directamente sobre el<br />
fibrinógeno, escindiendo el fibrinopéptido A por un mecanismo<br />
in<strong>de</strong>pendiente <strong>de</strong> la trombina, por lo que no se altera por la presencia <strong>de</strong><br />
heparina.<br />
El tiempo <strong>de</strong> reptilase permite diferenciar si el alargamiento <strong>de</strong>l tiempo <strong>de</strong><br />
trombina se <strong>de</strong>be a un trastorno en la formación <strong>de</strong> fibrina o a la presencia<br />
<strong>de</strong> heparina.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
TEMA 10. GRUPOS SANGUÍNEOS:<br />
ABO Y RHO. REALIZACIÓN, TÉCNICA E<br />
INTERPRETACIÓN. TÉCNICA DE LA<br />
ANTIGLOBULINA HUMANA (COOMBS<br />
DIRECTO): PRINCIPIO, REALIZACIÓN<br />
TÉCNICA E INTERPRETACIÓN. ESTUDIO DE<br />
LA COMPATIBILIDAD SANGUÍNEA: PRUEBA<br />
CRUZADA MAYOR, FASES DE LECTURA E<br />
INTERPRETACIÓN<br />
ABO Y RHO. REALIZACIÓN, TÉCNICA E<br />
INTERPRETACIÓN.<br />
INTRODUCCIÓN<br />
En épocas anteriores al siglo XX se habían realizado transfusiones entre seres<br />
humanos e incluso entre animales <strong>de</strong> otras especies y el hombre, aunque los<br />
resultados adversos frecuentes se consi<strong>de</strong>raban ocasionados por enfermeda<strong>de</strong>s<br />
transmitidas <strong>de</strong>l donante al receptor.<br />
Hasta 1901 con Landsteiner, no se inicia un estudio riguroso al mezclar plasma y<br />
hematíes <strong>de</strong> diferentes personas, analizando la existencia o no <strong>de</strong> aglutinación,<br />
llegando a clasificar las sangres en los diferentes grupos. En 1928, la Comisión<br />
<strong>de</strong> Higiene <strong>de</strong> la Sociedad <strong>de</strong> Naciones acepta la nomenclatura que hoy en día<br />
se utiliza para el sistema ABO, conocido también comúnmente como grupo<br />
sanguíneo.<br />
A partir <strong>de</strong> entonces, se va avanzando en el conocimiento <strong>de</strong> otros componentes<br />
antigénicos <strong>de</strong> la membrana <strong>de</strong>l hematíe, estableciéndose numerosos sistemas<br />
eritrocitarios que, hoy en día, nos permiten evitar cualquier reacción <strong>de</strong><br />
incompatibilidad al poner en contacto dos tipos <strong>de</strong> sangre.<br />
CONCEPTOS GENERALES<br />
Un antígeno eritrocitario es toda aquella sustancia presente en la membrana <strong>de</strong>l<br />
hematíe que reúne las características necesarias <strong>de</strong> tamaño, complejidad,<br />
accesibilidad, etc... para que, al ponerse en contacto con las células<br />
inmunocompetentes <strong>de</strong> un sistema inmunitario, <strong>de</strong> lugar a la activación <strong>de</strong> dichas<br />
células, siendo una <strong>de</strong> las respuestas la formación <strong>de</strong> anticuerpos; estos<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
anticuerpos formados se unen a los antígenos correspondientes, iniciándose la<br />
<strong>de</strong>strucción <strong>de</strong> la célula portadora. La <strong>de</strong>strucción <strong>de</strong> la célula se consigue por<br />
activación <strong>de</strong>l complemento y/o por fagocitosis<br />
Los antígenos eritrocitarios pue<strong>de</strong>n estar pegados a la membrana <strong>de</strong>l hematíe o<br />
formando parte <strong>de</strong> ella. Si forman parte integral <strong>de</strong> la membrana, suelen estar<br />
menos accesibles para conectar con los receptores específicos <strong>de</strong> los antígenos<br />
<strong>de</strong> las células inmunocompetentes, disminuyendo por este motivo su capacidad<br />
antigénica.<br />
La capacidad antigénica va a <strong>de</strong>pen<strong>de</strong>r, por tanto, <strong>de</strong>l número <strong>de</strong> veces que se<br />
repite el antígeno en la membrana <strong>de</strong>l hematíe. Esta característica se <strong>de</strong>nomina<br />
<strong>de</strong>nsidad <strong>de</strong> puntos antigénicos.<br />
A los antígenos eritrocitarios se les pue<strong>de</strong>n <strong>de</strong>nominar factores. Cuando varios<br />
factores son regulados por una serie <strong>de</strong> genes interrelacionados, forman un<br />
sistema (ABO, Rh...)<br />
SISTEMA ABO<br />
SUSTANCIAS QUE COMPONEN EL SISTEMA<br />
El sistema ABO está formado por los antígenos A y B, que pue<strong>de</strong>n estar<br />
presentes en la membrana <strong>de</strong>l hematíe, en otras células y en las secreciones<br />
(saliva, líquido amniótico, líquido seminal...) <strong>de</strong>pendiendo su existencia y<br />
localización <strong>de</strong> un control genético.<br />
Las sustancias A y B empiezan a formarse en las primeras semanas <strong>de</strong>l<br />
<strong>de</strong>sarrollo fetal, pero no adquieren toda su potencia inmunológica hasta pasados<br />
varios meses, incluso 18-20 meses <strong>de</strong>spués <strong>de</strong>l parto. Esto es <strong>de</strong>bido a que el<br />
número <strong>de</strong> veces que se repite la sustancia en la membrana <strong>de</strong>l hematíe al<br />
principio es reducido, adquiriendo la <strong>de</strong>nsidad máxima <strong>de</strong> una forma progresiva.<br />
La <strong>de</strong>nsidad <strong>de</strong> estos puntos antigénicos pue<strong>de</strong> llegar, para las sustancias A y B,<br />
hasta casi un millón por célula. La localización <strong>de</strong> estas sustancias es<br />
extramembranosa y en su composición po<strong>de</strong>mos diferenciar dos partes:<br />
Oligosacáridos: don<strong>de</strong> se presentan las variaciones antigénicas y, otra menos<br />
conocida;<br />
Glucoproteínas (o soporte): cuando está fijado a la membrana <strong>de</strong> hematíes,<br />
leucocitos u otras células epi<strong>tel</strong>iales o endo<strong>tel</strong>iales.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
FORMACIÓN Y CONTROL <strong>de</strong> LAS SUSTANCIAS A y B<br />
Antígenos.<br />
Los antígenos que componen el sistema ABO y el sistema Lewis proce<strong>de</strong>n <strong>de</strong><br />
sustancias precursoras muy similares. Hay dos tipos <strong>de</strong> sustancias precursoras:<br />
tipo I y tipo II,<br />
La sustancia precursora tipo I posee todas las uniones entre sus monosacáridos<br />
por los carbonos que se encuentran en las posiciones 1 y 3, y el soporte está<br />
formado por glucoproteínas.<br />
La sustancia precursora tipo II posee todas las uniones entre sus monosacáridos<br />
por los carbonos que se encuentran en posición 1 y 3, excepto entre la Nacetilglucosamina<br />
y la galactosa final, que se produce entre los carbonos en<br />
posición 1 y 4. El soporte está formado por glucolípidos.<br />
Sobre estas sustancias van a actuar un conjunto <strong>de</strong> transferasas, controladas<br />
por genes que se encuentran en el brazo corto <strong>de</strong>l cromosoma 9, dando lugar a<br />
los distintos componentes <strong>de</strong> los sistemas ABO y Lewis.<br />
Los genes que controlan el sistema ABO son el H, A, B y Se. Los genes A y B<br />
son codominantes entre sí y dominantes sobre el O.<br />
La sustancia precursora tipo II es el origen <strong>de</strong> los antígenos A y B unidos al<br />
eritrocito y otras células.<br />
El proceso se <strong>de</strong>sarrolla <strong>de</strong> la siguiente forma: el gen H controla la formación y la<br />
acción <strong>de</strong> una fucosil-transferasa, que cataliza la unión <strong>de</strong> una fucosa a la<br />
galactosa final <strong>de</strong> la sustancia precursora tipo II, formándose la sustancia H.<br />
A continuación, si el gen A está presente, controlará la formación y la acción <strong>de</strong><br />
una N-acetilgalactosaminil-transferasa, catalizando la unión <strong>de</strong> una N-acetilgalactosamina<br />
a la sustancia H; formándose la sustancia A.<br />
En cambio si es el gen B el presente, controla la formación y la acción <strong>de</strong> una<br />
galactosil transferasa, uniéndose una galactosa a la sustancia H, formándose la<br />
sustancia B.<br />
Si en la dotación genética se encuentran los genes A y B, sobre el hematíe<br />
aparecen las dos sustancias A y B y si en la dotación genética no se encuentran<br />
los genes A y B, por ser homocigótico OO, sobre el hematíe no habrá sustancia<br />
ni A ni B. El gen O se consi<strong>de</strong>ra un “gen mudo” ya que no controla ninguna<br />
transferasa que actúe sobre la sustancia H.<br />
Los hematíes que tienen los antígenos A y B poseen menos cantidad <strong>de</strong><br />
sustancia H en su membrana que los hematíes carentes <strong>de</strong> dichos antígenos, ya<br />
que parte <strong>de</strong> la sustancia H se utiliza en la formación <strong>de</strong> los antígenos A y B.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
En la especie humana, siempre que no haya alteraciones genéticas, las<br />
sustancias precursoras y la sustancia H son isoantígenos, ya que las poseen<br />
todos los individuos <strong>de</strong> la especie. Sin embargo, las sustancias A y B son<br />
aloantígenos porque no se encuentran en todos los individuos <strong>de</strong> dicha especie.<br />
Hay <strong>de</strong>terminados casos, aunque poco frecuentes, en los que el hematíe no<br />
presenta en su membrana la sustancia H; como consecuencia <strong>de</strong> ello tampoco<br />
hay en la membrana <strong>de</strong>l hematíe sustancias A y/o B, aunque en la dotación<br />
genética estén los genes A y/o B. Esto pue<strong>de</strong> ser <strong>de</strong>bido a varias causas:<br />
La persona posee el genotipo homocigoto hh y, por lo tanto, no forma la<br />
sustancia H ni en el hematíe ni en las secreciones. Esta sangre se tipifica como<br />
Bombay.<br />
El gen H está parcialmente reprimido, formándose muy poca sustancia H, que<br />
resulta insuficiente para actuar como sustrato para las enzimas controladas por<br />
los genes A y B, no produciéndose, por tanto, las sustancias correspondientes.<br />
Este tipo <strong>de</strong> sangre se <strong>de</strong>nomina para-Bombay serie 1ª.<br />
Hay un fallo en los genes reguladores que mantienen fijas las sustancias H, A y<br />
B al hematíe. El individuo posee sustancia H y las sustancias A y B que le<br />
correspondan genéticamente, pero no fijadas al hematíe. Esta sangre se tipifica<br />
como para-Bombay serie 2ª.<br />
Esta alteración genética hace que, para las personas con sangre tipificada como<br />
Bombay, la sustancia H sea un aloantígeno. No suce<strong>de</strong> así en los casos <strong>de</strong><br />
sangre para-Bombay series 1ª y 2ª, ya que las personas que poseen este tipo <strong>de</strong><br />
sangre tienen sustancia H (en poca cantidad o fuera <strong>de</strong>l hematíe) siendo por lo<br />
tanto isoantígeno para ellas.<br />
El último gen regulador es el Se (ya sea <strong>de</strong> forma homocigótica: Se/Se ó<br />
heterocigótica Se/se), este gen controla la formación y acción <strong>de</strong> una<br />
fucosiltransferasa, permitiendo la unión <strong>de</strong> una fucosa a la galactosa final <strong>de</strong> la<br />
sustancia precursora tipo I. Así se forma la sustancia H, sobre la que pue<strong>de</strong>n<br />
actuar los genes A y/o B con formación <strong>de</strong> sustancias A y B en secreciones.<br />
Por lo tanto, para que un individuo sea secretor <strong>de</strong> sustancias A o B necesita<br />
poseer el gen Se <strong>de</strong> forma homocigótica o heterocigota.<br />
La frecuencia <strong>de</strong> los diferentes tipos <strong>de</strong> sangre en personas <strong>de</strong> raza blanca es la<br />
siguiente: O (43-47%), A1 (34-41%), A2 (10%), B (8-9%) y AB (3%)<br />
Anticuerpos <strong>de</strong>l sistema ABO.<br />
Al nacer, una persona posee en la membrana <strong>de</strong> sus hematíes los antígenos<br />
que le correspon<strong>de</strong>n <strong>de</strong>pendiendo <strong>de</strong> su dotación genética. En su plasma no<br />
existe ningún tipo <strong>de</strong> anticuerpos respecto a las sustancias A o B, pero <strong>de</strong> forma<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
progresiva, se inicia la formación <strong>de</strong> anticuerpos contra los antígenos hemáticos<br />
que ella no posee. Estos anticuerpos se <strong>de</strong>nominan naturales. Hoy en día se<br />
piensa que estos anticuerpos se forman como respuesta a sustancia que se<br />
encuentran en la membrana <strong>de</strong> <strong>de</strong>terminadas bacterias, neumococos o que<br />
forman parte <strong>de</strong> algunos jugos vegetales.<br />
Estas sustancias son muy parecidas a los antígenos que componen el sistema<br />
ABO. Los anticuerpos naturales reaccionan con antígenos A o B por reacción<br />
cruzada. Estos anticuerpos son preferentemente <strong>de</strong> tipo IgM y no atraviesan la<br />
placenta. Se les <strong>de</strong>nomina también completos o aglutinantes porque al unirse al<br />
hematíe lo aglutinan con facilidad en medio salino.<br />
Los títulos <strong>de</strong> anticuerpos naturales anti-A o anti-B pue<strong>de</strong>n variar a lo largo <strong>de</strong> la<br />
vida. En términos generales, sangres tipificadas como O, tienen títulos <strong>de</strong> anti-A<br />
y anti-B naturales más altos que las <strong>de</strong> los grupos A y B.<br />
Cuando los hematíes tipificados como A, B o AB se transfun<strong>de</strong>n a otra persona<br />
que no posea algunos <strong>de</strong> estos antígenos, el sistema inmunocompetente <strong>de</strong> ésta<br />
se estimula formando anticuerpos contra el antígeno <strong>de</strong>sconocido. Este tipo <strong>de</strong><br />
anticuerpos se <strong>de</strong>nominan inmunológicos ya que el estimulante es<br />
perfectamente conocido (el antígeno hemático) y la unión antígeno-anticuerpo no<br />
tiene lugar por reacción cruzada.<br />
La mayoría <strong>de</strong> estos anticuerpos inmunológicos son <strong>de</strong> tipo IgG, atraviesan la<br />
placenta y se les <strong>de</strong>nomina también incompletos porque para <strong>de</strong>tectarlos en el<br />
laboratorio es necesario facilitar la aglutinación <strong>de</strong> diferentes formas, ya que en<br />
medio salino no se consigue.<br />
Es importante diferenciar entre anticuerpos anti-A y anti-B naturales e<br />
inmunológicos. La existencia <strong>de</strong> anticuerpos inmunológicos anti A y anti B<br />
pue<strong>de</strong>n ser causa <strong>de</strong> anemia hemolítica en el recién nacido. Sangre con títulos<br />
altos <strong>de</strong> anticuerpos naturales y/o inmunológicos no es a<strong>de</strong>cuada para realizar<br />
transfusiones.<br />
Grupos y subgrupos <strong>de</strong>l sistema ABO.<br />
El sistema ABO está formado por cuatro grupos diferentes<br />
Grupo sanguíneo Antígenos hemáticos Anticuerpos en suero<br />
A<br />
B<br />
AB<br />
O<br />
A<br />
B<br />
A y B<br />
Ninguno<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 105 <strong>de</strong> 287<br />
Anti-A<br />
Anti-B<br />
Ninguno<br />
Anti-A y Anti-B<br />
Cada grupo presenta en el hematíe, en otras células y en secreciones (si está<br />
presente el gen Se), el antígeno correspondiente a la <strong>de</strong>nominación <strong>de</strong>l grupo, y<br />
en el plasma, el anticuerpo contra el antígeno que no posee.
TEMARIO DE T.E.L.<br />
En grupo AB, al tener los dos antígenos, no presenta ni anti-A ni anti-B (se<br />
conoce tradicionalmente como receptor universal)<br />
En el grupo O, al no tener ninguno <strong>de</strong> los dos antígenos, presenta anti-A y anti-B,<br />
expresando toda la sustancia H sin utilizar (se conoce tradicionalmente como<br />
donante universal)<br />
Se conocen algunas variaciones antigénicas que dan lugar a diferentes<br />
subgrupos, solo los subgrupos A1, A2, A1B y A2B tienen interés, ya que el resto<br />
son muy poco frecuentes y sus antígenos tienen muy poca capacidad antigénica.<br />
Los fenotipos-genotipos <strong>de</strong>l sistema son los siguientes:<br />
Fenotipos Genotipos<br />
O OO<br />
A1 A1A1<br />
A1A2<br />
A1O<br />
A2 A2A2<br />
A2O<br />
B BB<br />
BO<br />
A1B A1B<br />
A2B A2B<br />
El gen A1 es dominante sobre el gen A2, siendo los genes A y B codominantes y<br />
dominantes sobre el O.<br />
Características <strong>de</strong>l sistema ABO<br />
Grupo Ag hemáticos Ac plasma<br />
A1 A1 y A Anti-B<br />
A2 A Anti-A1 y anti-B<br />
B B Anti-A1 y anti-A<br />
A1B A1, A, B -<br />
A2B A y B Anti-A1<br />
O - Anti-A1, anti-A y anti-B<br />
El subgrupo A1 es mucho más frecuente que el A2, siendo su capacidad<br />
antigénica más elevada. Una persona con sangre A2, si recibe hematíes A1, es<br />
posible que forme anticuerpos anti-A1<br />
En cambio los anticuerpos anti-A1 proce<strong>de</strong>ntes <strong>de</strong> sangres A2 y A2B suelen ser<br />
débiles y por lo tanto poco útiles para su utilización in vitro para tipificar hematíes<br />
A1.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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Determinación <strong>de</strong>l grupo ABO.<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
La tipificación <strong>de</strong> la sangre con respecto al grupo ABO es la más importante a<br />
realizar <strong>de</strong>bido a las graves consecuencias que pue<strong>de</strong> tener un error en su<br />
realización en caso <strong>de</strong> transfusiones.<br />
Esta importancia va a radicar en la existencia <strong>de</strong> anticuerpos naturales muy<br />
potentes que diferencian este sistema <strong>de</strong> otros (por ejemplo el Rh), provocando<br />
una incompatibilidad <strong>de</strong>s<strong>de</strong> la primera transfusión (el Rh necesita una transfusión<br />
sensibilizante previa).<br />
Tipos <strong>de</strong> muestra y conservación:<br />
Sangre total con ácido cítrico, citrato y <strong>de</strong>xtrosa (ACD): se conserva unos 21 días<br />
a 2-10º C.<br />
Sangre total con etilen-diamino-tetraacético (EDTA): se conserva 48 horas a 2-<br />
10º C.<br />
Sangre coagulada: se conserva 5 días a 2-10º C.<br />
La toma <strong>de</strong> muestra por punción dactilar o en el lóbulo <strong>de</strong> la oreja no es<br />
aconsejable, ya que en caso <strong>de</strong> duda no permite la comprobación por medio <strong>de</strong><br />
otra técnica.<br />
Tipos <strong>de</strong> suero:<br />
La mayoría <strong>de</strong> los sueros para el diagnostico son <strong>de</strong> origen humano,<br />
preparándose <strong>de</strong> mezclas <strong>de</strong> sueros seleccionados.<br />
Los sueros son: anti-A, anti-B y anti-AB. Este último se utiliza <strong>de</strong> sangre <strong>de</strong><br />
paciente <strong>de</strong> grupo O, y se utiliza para confirmar los resultados obtenidos con los<br />
anti-A y anti-B o bien cuando la respuesta obtenida es muy débil.<br />
Para diferenciar los grupos A1, A2, A1B y A2B se utiliza principalmente el suero<br />
anti-A1, compuesto por una lectina <strong>de</strong> las semillas <strong>de</strong>l Dolichus biflorus y para la<br />
i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> la sustancia H un suero anti-H vegetal (lectina <strong>de</strong>l Ulexz<br />
europaeus).<br />
También pue<strong>de</strong>n emplearse sueros formados por anticuerpos monoclonales <strong>de</strong><br />
origen murino (hibridación <strong>de</strong> células B productoras <strong>de</strong> anticuerpos con células<br />
<strong>de</strong> mieloma <strong>de</strong> ratón) o humano (hibridación <strong>de</strong> células B infectadas con EBV y<br />
células <strong>de</strong> mieloma). Los anticuerpos policlonales captan mejor los antígenos<br />
débiles que los monoclonales.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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Técnicas.<br />
Prueba en porta.<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
o En un porta colocar una gota <strong>de</strong> sangre problema y una gota <strong>de</strong> suero<br />
anti-A y en otro diferente otra gota <strong>de</strong> sangre con suero anti-B.<br />
o Mezclar. Aunque la aglutinación <strong>de</strong>be ser inmediata, conviene mover dos<br />
minutos a temperatura ambiente para po<strong>de</strong>r captar los antígenos débiles.<br />
o Si no aglutina ni con anti-A ni con anti-B el grupo es el O (se pue<strong>de</strong><br />
confirmar con la negatividad <strong>de</strong> la prueba al anti-AB).<br />
o Si aglutina con anti-B es B y si lo hace sólo con el anti-A será A. En este<br />
ultimo caso se <strong>de</strong>berá diferenciar el grupo A1 <strong>de</strong>l A2. Si aglutina con los<br />
dos, el grupo será el AB.<br />
En aquellos casos en los que el paciente tenga la VSG elevada o el plasma sea<br />
lipémico, es posible que existan dudas en la interpretación <strong>de</strong> la prueba. Para<br />
solucionarlo <strong>de</strong>ben lavarse los hematíes o bien realizar la prueba en tubo.<br />
Prueba en tubo.<br />
o Lavar aproximadamente 0.2 ml <strong>de</strong> sangre con solución salina isotónica 2-<br />
3 veces. Centrifugar y eliminar el sobrenadante.<br />
o Tomar 0.1 ml <strong>de</strong>l concentrado <strong>de</strong> hematíes y mezclar con 2 ml <strong>de</strong> solución<br />
salina isotónica (concentración aproximada: 4%), a continuación <strong>de</strong>positar<br />
una gota <strong>de</strong> la dilución en dos tubos, añadiendo a uno suero anti-A y al<br />
otro anti-B. Mezclar y centrifugar 1 minuto a 1000 rpm, resuspen<strong>de</strong>r y<br />
comprobar la aglutinación.<br />
EL SISTEMA RHESUS (Rh)<br />
En 1940 Landsteiner <strong>de</strong>scubre otro antígeno en los hematíes, que era el<br />
responsable <strong>de</strong> que los recién nacidos <strong>de</strong> madres que no tenían ese antígeno en<br />
sus hematíes pero si el anticuerpo correspondiente en su plasma, murieran<br />
<strong>de</strong>ntro <strong>de</strong>l útero durante el embarazo o pa<strong>de</strong>cieran una enfermedad muy grave<br />
tras el nacimiento (enfermedad hemolítica <strong>de</strong>l recién nacido). A este antígeno lo<br />
<strong>de</strong>nominó “Rh” por haberse realizado los primeros <strong>de</strong>scubrimientos en el mono<br />
“MACACO RHESSUS”. Observó que al introducir hematíes humanos a estos<br />
monos, estos fabricaban un anticuerpo que era capaz <strong>de</strong> “aglutinar” los hematíes<br />
<strong>de</strong>l 85% <strong>de</strong> la población blanca. Llamó “ Rh positivos “ a los hematíes que eran<br />
aglutinados por ese anticuerpo, (llevaban el antígeno Rh en su superficie) y “Rh<br />
negativos” a los que no eran aglutinados (no tenían antígeno Rh en su<br />
superficie).<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
El sistema Rhesus está constituido por unos cuarenta antígenos distintos cinco<br />
<strong>de</strong> los cuales revisten una importancia especial. Para <strong>de</strong>signar los diferentes<br />
antígenos <strong>de</strong>l sistema Rh existen dos nomenclaturas principales que se utilizan<br />
indistintamente la <strong>de</strong> Fisher-Race y la <strong>de</strong> Wiener.<br />
La terminología <strong>de</strong> Fisher-Race se basa en la suposición <strong>de</strong> que se heredan <strong>de</strong><br />
cada progenitor tres genes situados en loci muy próximos. Los alelos más<br />
comunes que pue<strong>de</strong>n ocupar dichos loci se <strong>de</strong>signan con los símbolos D y d, C<br />
y, E y e. Cada gen (con excepción <strong>de</strong>l d) codifica un antígeno específico, que<br />
pue<strong>de</strong> ser <strong>de</strong>tectado en la membrana <strong>de</strong>l hematíe. Es posible que sea una alelo<br />
silencioso. La presencia o ausencia <strong>de</strong>l antígeno D es la que <strong>de</strong>termina si un<br />
individuo es Rh positivo o negativo.<br />
La nomenclatura <strong>de</strong> Wiener se basa en la herencia <strong>de</strong> un solo gen proce<strong>de</strong>nte<br />
<strong>de</strong> cada progenitor. Cada gen tendría una estructura en mosaico, que<br />
compren<strong>de</strong>ría un número variable <strong>de</strong> antígenos sanguíneos. Así, el gen R1<br />
codificaría factores que correspon<strong>de</strong>rían a C, D, y e <strong>de</strong> la nomenclatura <strong>de</strong><br />
Fisher-Race. El gen reproduciría los antígenos c y e pero no D, C ni E.<br />
El 85% <strong>de</strong> los individuos caucasoi<strong>de</strong>s expresan el antígeno D y se les <strong>de</strong>nomina<br />
Rh positivos. Si el antígeno D no se expresa se <strong>de</strong>nomina al individuo Rh<br />
negativo, estos heredan los antígenos C o E pero no el D. El genotipo <strong>de</strong> la<br />
mayoría <strong>de</strong> los individuos Rh negativos es rr (dce/dce).<br />
El antígeno D es un potente inmunógeno. Aproximadamente el 70% <strong>de</strong> los<br />
individuos Rh negativos producen anti-D si reciben sangre Rh positiva. Los<br />
antígenos C y E no son tan inmunógenos.<br />
TEORIA DE FISHER-RACE TEORIA DE WIENER<br />
3 GENES ESTRECHAMENTE<br />
UNIDOS, HEREDADOS<br />
DE CADA PROGENITOR<br />
GEN EN MOSAICO<br />
QUE CODIFICA MULTIPLES<br />
FACTORES SANGUÍNEOS<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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1 GEN Rh<br />
HEREDADO DE<br />
CADA PROGENITOR<br />
Finalmente, Rosenfield, tan solo propone una nomenclatura, en la cual cada uno<br />
<strong>de</strong> los diversos antisueros Rh recibe un número Rh1, Rh2, etc. Este sistema<br />
hace posible una <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong>l fenotipo basada tan solo en los resultados<br />
observados con los antisueros empleados.
TEMARIO DE T.E.L.<br />
NOMENCLATURA ANTIGENOS DEL SISTEMA Rh<br />
FISHER-RACE WIENER ROSENFIELD<br />
D Rh Rh1<br />
C rh Rh2<br />
E rh” Rh3<br />
C hr Rh4<br />
E hr” Rh5<br />
Tabla 1.<br />
ANTÍGENOS DEL SISTEMA Rh<br />
Los antígenos <strong>de</strong>l sistema Rh son proteínas que forman parte integrante <strong>de</strong> la<br />
membrana <strong>de</strong> los eritrocitos únicamente. (No se encuentran en otras células o en<br />
las secreciones.<br />
A parte <strong>de</strong>l antígeno D, que permite clasificar a los individuos en Rh positivos y<br />
Rh negativos, existen otros antígenos en el sistema Rh. De estos los principales<br />
son C, c, E, e. Anticuerpos hacía cualquiera <strong>de</strong> estos antígenos pue<strong>de</strong>n ser<br />
producidos por un individuo cuyos glóbulos rojos carecen <strong>de</strong> los mismos.<br />
EL D<br />
El D es una variante débil <strong>de</strong>l antígeno D poco frecuente entre los individuos<br />
caucasoi<strong>de</strong>s, pero común entre los individuos <strong>de</strong> raza negra (22%). Los<br />
hematíes D generalmente dan reacciones débiles o negativas con el anti-D,<br />
siendo generalmente <strong>de</strong>tectados gracias a la prueba indirecta <strong>de</strong> la antiglobulina<br />
(prueba D). Los hematíes D pue<strong>de</strong>n ser clasificados en tres categorías.<br />
D ADQUIRIDO. La herencia <strong>de</strong>l gen C en posición trans con relación al gen D<br />
(dce/DcE) tiene como resultado una expresión débil <strong>de</strong>l antígeno D en los<br />
hematíes (D). Los individuos que representan estas características no producen<br />
anti-D si reciben sangre Rh positiva.<br />
D DEPRIMIDO<br />
GENOTIPO Dce/dce Dce/dCe<br />
C en posición cis con<br />
respecto a D<br />
Expresión normal <strong>de</strong>l<br />
antígeno D<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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C en posición trans con<br />
respecto a D<br />
Fenotipo como D
TEMARIO DE T.E.L.<br />
VARIANTE D. El antígeno D presenta una estructura que consta como mínimo<br />
<strong>de</strong> cuatro partes. Si faltan una o más partes <strong>de</strong>l antígeno el resto <strong>de</strong> este pue<strong>de</strong><br />
tener una expresión débil. Un individuo con la variante D pue<strong>de</strong> producir<br />
aloanticuerpos contra la parte <strong>de</strong>l antígeno D que le falta. Estos <strong>de</strong>ben ser<br />
transfundidos con sangre Rh negativa.<br />
VARIANTE D<br />
Antígeno D Normal<br />
Variante D falta parte <strong>de</strong>l antígeno D<br />
D HEREDITARIO. Algunos individuos D no pue<strong>de</strong>n ser clasificados como D<br />
adquirido ni como variante D, puesto que, si bien poseen el antígeno D completo,<br />
éste está débilmente expresado, <strong>de</strong>sconociéndose la causa <strong>de</strong> este hecho.<br />
Antígeno D Normal<br />
D Hereditario<br />
HEMATÍES CON DELECCIÓN Rh (- D -) y Rh nulo<br />
De los hematíes que no poseen los antígenos <strong>de</strong>pendientes <strong>de</strong> los loci C ni E se<br />
dice que presentan <strong>de</strong>lección (- D -). El número <strong>de</strong> lugares antigénicos D está<br />
muy aumentado en estos hematíes y por tanto el anti-D <strong>de</strong> tipo IgG pue<strong>de</strong><br />
aglutinarlos.<br />
De los individuos que no expresan ninguno <strong>de</strong> los antígenos <strong>de</strong>l sistema Rh en<br />
sus hematíes se dice que tiene Rh nulo (- - -). Los hematíes <strong>de</strong> éstos tienen<br />
alterado el transporte <strong>de</strong> sodio y potasio. Esto da lugar a una anemia hemolítica<br />
caracterizada por estomatocitosis, esferocitosis y aumento <strong>de</strong> la fragilidad<br />
osmótica.<br />
ANTICUERPOS DEL SISTEMA Rh<br />
Los anticuerpos <strong>de</strong>l sistema Rh son casi siempre IgG, siendo estimulada su<br />
producción por transfusión o por embarazo (Enfermedad hemolítica <strong>de</strong>l recién<br />
nacido). No activan el complemento <strong>de</strong>bido a que la situación <strong>de</strong> los antígenos<br />
Rh <strong>de</strong> la membrana <strong>de</strong>l hematíe no permite la formación <strong>de</strong> dobletes <strong>de</strong> IgG<br />
necesarios para la activación <strong>de</strong>l mismo.<br />
Los anticuerpos anti-D se emplean para prevenir la inmunización <strong>de</strong> las<br />
personas Rh negativas que han recibido hematíes Rh positivos a través <strong>de</strong> una<br />
transfusión o <strong>de</strong> un embarazo. La administración antes <strong>de</strong> 72 horas <strong>de</strong><br />
inmunoglobulina anti-D consigue <strong>de</strong>struir los hematíes Rh positivos circulantes<br />
antes <strong>de</strong> que el sistema inmune <strong>de</strong>l receptor se active.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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GENOTIPO<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
El término Rh positivo se refiere tan sólo a la presencia <strong>de</strong>l antígeno D en los<br />
glóbulos rojos. No indica si la formación genética <strong>de</strong> la persona es homocigota<br />
(D/D) o heterocigota (D/d). En cualquier persona pue<strong>de</strong> <strong>de</strong>terminarse el genotipo<br />
presuntivo.<br />
DETERMINACION DEL Rho<br />
TIPOS DE MUESTRAS Y CONSERVACIÓN:<br />
Ver el apartado referido a la <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong>l grupo ABO.<br />
TÉCNICAS:<br />
Se emplean anticuerpos anti-D <strong>de</strong> tipo IgG conseguidos a partir <strong>de</strong> una mezcla<br />
<strong>de</strong> sueros humanos obtenida <strong>de</strong> donantes inmunizados.<br />
Prueba en porta.<br />
• Se toman dos portaobjetos convenientemente rotulados. En uno<br />
ponemos una gota <strong>de</strong> suero anti-D, en el otro una gota <strong>de</strong>l CD (Control<br />
negativo).<br />
• Añadimos dos gotas <strong>de</strong> sangre total, a cada uno <strong>de</strong> los dos portas.<br />
• Se mezcla bien la sangre y el reactivo con distintos palillos<br />
mezcladores.<br />
• Se colocan los portas sobre el visualizador precalentado.<br />
• Conviene mover el visualizador durante dos minutos. A continuación<br />
se observa macroscópicamente la presencia <strong>de</strong> aglutinación.<br />
La lectura <strong>de</strong> cada uno <strong>de</strong> los portaobjetos admite dos posibilida<strong>de</strong>s.<br />
o Reacción negativa: no hay ningún signo visible <strong>de</strong> aglutinación, <strong>de</strong>be ser<br />
confirmada con la prueba <strong>de</strong>l D.<br />
o Reacción positiva: la sangre con anti-D muestra aglutinación visible, y el<br />
control negativo no.<br />
Prueba en tubo.<br />
• Rotular dos tubos, uno para el anti-D, y el otro para el control negativo<br />
(CD).<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
• Preparar una suspensión <strong>de</strong> hematíes <strong>de</strong>l paciente al 5%. Lavar tres<br />
veces con salino, centrifugando durante un minuto a 3.500 r.p.m.<br />
• En el tubo <strong>de</strong>l D poner una gota <strong>de</strong> anti-D, y añadir una gota <strong>de</strong> la<br />
suspensión <strong>de</strong> hematíes, en el tubo <strong>de</strong>l control poner una gota <strong>de</strong>l control<br />
negativo y una gota <strong>de</strong> la suspensión <strong>de</strong> hematíes.<br />
• Agitar ligeramente los dos tubos y centrifugar 15 segundos.<br />
• Leer los resultados macroscópicamente en el visualizador.<br />
Siempre que resulte, el control <strong>de</strong>l D, positivo, hacer test <strong>de</strong> Coombs Directo.<br />
A todo Rho negativo se le efectuará un D y un CDE.<br />
TEST PARA EL D<br />
CDE<br />
1. Incubar a 37° C durante media hora, el mismo tubo en el que se haya<br />
realizado el anti-D, que dio negativo.<br />
2. Lavamos 3 veces, los hematíes con solución salina isotónica.<br />
Decantamos el último sobrenadante.<br />
3. Se aña<strong>de</strong> una gota e suero antiglobulina humana y se mezclan.<br />
4. Se centrifuga durante 30 segundos. Leemos macroscópica y<br />
microscópicamente.<br />
5. Si no hay aglutinación se dará como D (-) y D (-).<br />
6. Si hay aglutinación se hará un anti-D salino, para ello:<br />
o Echar en un tubo 1 gota <strong>de</strong> anti-D salino, más una gota <strong>de</strong><br />
suspensión <strong>de</strong> hematíes al 5%.<br />
o Incubar a 37° C durante 15 minutos.<br />
o Centrifugar y leer macroscópicamente. Sólo si el anti-D salino da<br />
negativo se consi<strong>de</strong>ra D positivo. En caso contrario se dará como<br />
D positivo.<br />
1. Rotular un tubo CDE y poner en el mismo una gota <strong>de</strong> anti-CDE.<br />
2. Añadirle una gota <strong>de</strong> suspensión <strong>de</strong> hematíes al 5% <strong>de</strong>l paciente.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
3. Incubar a 37° C durante 15 minutos.<br />
4. Centrifugar 15 segundos y leer microscópicamente si hay aglutinación.<br />
GENOTIPO<br />
1. Rotular cuatro tubos: C, E, c, e.<br />
2. Preparar una suspensión <strong>de</strong> hematíes al 5% <strong>de</strong>l sujeto a genotipar.<br />
3. Poner en cada tubo, una gota <strong>de</strong> la suspensión <strong>de</strong> hematíes, y una gota<br />
<strong>de</strong>l antisuero correspondiente. (anti-C, anti-E, anti-c, anti-e).<br />
4. Incubar durante 15 minutos, los cuatro tubos, a 37° C en baño María.<br />
5. Centrifugar 15 segundos a 3.500 r.p.m., y leer macroscópicamente.<br />
6. Apuntar resultados, ver en tablas genotipo correspondiente.<br />
Rho positivo<br />
D C E c e Genotipo Símbolo<br />
+ + - + + Dce/dce Rr<br />
Rho negativo<br />
D C E c e Genotipo Símbolo<br />
- + - - + dCe/dCe rr<br />
Tabla. 2<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
TÉCNICA DE LA ANTIGLOBULINA HUMANA<br />
(COOMBS DIRECTO) PRINCIPIO, REALIZACIÓN<br />
TÉCNICA E INTERPRETACIÓN<br />
PRINCIPIO<br />
La fijación <strong>de</strong> anticuerpos <strong>de</strong> tipo IgM a los hematíes generalmente produce<br />
aglutinación, a diferencia <strong>de</strong> los anticuerpos IgG (<strong>de</strong>nominados anticuerpos<br />
“bloqueantes” o “incompletos”), que no suelen producir aglutinación.<br />
La prueba <strong>de</strong> Coombs sirve para poner <strong>de</strong> manifiesto estos anticuerpos<br />
incompletos. Esta prueba pue<strong>de</strong> aplicarse básicamente <strong>de</strong> dos formas: directa e<br />
indirecta. Ambas tienen el mismo fundamento: las dos <strong>de</strong>tectan el anticuerpo o el<br />
complemento unido a la célula.<br />
La Prueba Directa <strong>de</strong> la Antiglobulina es positiva cuando los hematíes han sido<br />
sensibilizados en su propio organismo (sensibilización in vivo).<br />
La Prueba Indirecta <strong>de</strong> la Antiglobulina <strong>de</strong>tecta la existencia <strong>de</strong> anticuerpos<br />
antieritrocíticos en el suero <strong>de</strong> un enfermo, que provocan la sensibilización <strong>de</strong><br />
hematíes in vitro, por lo que aglutinan al añadirles el suero <strong>de</strong> Coombs.<br />
En ambos casos, el anticuerpo sensibilizante o el complemento actúan como<br />
antígeno para el reactivo antiglobulina humana (suero <strong>de</strong> Coombs). Dicho<br />
reactivo se prepara inmunizando animales (conejos generalmente) con IgG y<br />
complemento (C3) humanos. La aglutinación se produce porque el anti-IgG y el<br />
anti-C3 se unen al antígeno correspondiente (IgG y C3, respectivamente), que a<br />
su vez está unido a hematíes colindantes, actuando así como puente (Fig. 1).<br />
REALIZACIÓN TÉCNICA<br />
Se llama “directa” porque los hematíes se toman directamente <strong>de</strong>l paciente y son<br />
examinados sin manipulación intermedia. Antes <strong>de</strong>l examen es importante lavar<br />
los glóbulos rojos para que que<strong>de</strong>n libres <strong>de</strong> proteínas plasmáticas, que podrían<br />
reaccionar con el suero antiglobulina y dar falsos positivos.<br />
MATERIAL<br />
• Centrífuga.<br />
• Tubos <strong>de</strong> hemólisis (12 × 75 mm).<br />
• Pipetas <strong>de</strong> Pasteur.<br />
• Solución salina fisiológica.<br />
• Sangre <strong>de</strong>l paciente anticoagulada con EDTA.<br />
• Eritrocitos control (Coombs-control).<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Suero antiglobulina (suero <strong>de</strong> Coombs) estandarizado. Algunos anticuerpos <strong>de</strong><br />
tipo IgG y la mayoría <strong>de</strong> los IgM pue<strong>de</strong>n fijar el complemento a los hematíes in<br />
vivo. El componente <strong>de</strong>l complemento <strong>de</strong>tectado en dichos hematíes es C3d,<br />
razón por la cual el reactivo antiglobulina utilizado para la prueba <strong>de</strong> Coombs<br />
directa <strong>de</strong>be contener anti-IgG y anti C3d.<br />
MÉTODO<br />
a) Centrifugar la sangre <strong>de</strong>l paciente 5 minutos a 3.000 r.p.m. y separar el<br />
plasma.<br />
b) Lavar cuatro veces los eritrocitos con solución salina fisiológica, teniendo<br />
cuidado <strong>de</strong> <strong>de</strong>cantar completamente <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> cada lavado.<br />
c) Preparar una suspensión <strong>de</strong> eritrocitos al 2-5 % en un tubo <strong>de</strong> hemólisis.<br />
d) Colocar una gota <strong>de</strong> los eritrocitos <strong>de</strong>l paciente y una gota <strong>de</strong>l suero<br />
antiglobulina humana.<br />
e) Mezclar y centrifugar 1 minuto a 1.000 r.p.m.<br />
f) Resuspen<strong>de</strong>r suavemente el botón <strong>de</strong> células (sin sacudir, usando sólo<br />
una suave agitación por medio <strong>de</strong> un suave temblor <strong>de</strong>l tubo) y girar los<br />
tubos cuidadosamente para la lectura macroscópica.<br />
Fig. 1: Test <strong>de</strong> Coombs directo<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Una reacción positiva mostrará aglutinados visibles macroscópicamente (Fig. 1).<br />
Una reacción negativa se reconocerá por la suspensión homogénea <strong>de</strong> todos los<br />
hematíes. Las reacciones negativas <strong>de</strong>ben leerse también microscópicamente<br />
<strong>de</strong>spués <strong>de</strong> hacer una extensión en porta.<br />
Puntuación <strong>de</strong> las aglutinaciones:<br />
Símbolo Aglutinados Puntuación<br />
C Un único aglutinado 12<br />
+++ Varios aglutinados gran<strong>de</strong>s 10<br />
++ Aglutinados más pequeños 8<br />
+ Gránulos 5<br />
(+) Gránulos pequeños 3<br />
w Lectura microscópica; aglutinados<br />
pequeños<br />
1<br />
o Lectura microscópica: negativa 0<br />
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS<br />
Una prueba <strong>de</strong> Coombs directa positiva suele significar la presencia <strong>de</strong><br />
inmunoglobulinas fijadas en la superficie <strong>de</strong> los eritrocitos, <strong>de</strong>l tipo:<br />
1. Autoanticuerpos contra antígenos intrínsecos <strong>de</strong> los hematíes (con o sin<br />
anemia hemolítica autoinmune).<br />
2. Aloanticuerpos en un receptor reciente <strong>de</strong> una transfusión que reacciona<br />
con los hematíes transfundidos.<br />
3. Anticuerpos presentes en el plasma <strong>de</strong>l donante que reaccionan con<br />
antígenos <strong>de</strong> los hematíes <strong>de</strong>l receptor (poco frecuente).<br />
4. Aloanticuerpos maternos que atraviesan la placenta y se fijan a los<br />
hematíes <strong>de</strong>l hijo (suelen provocar EHRN).<br />
Sin embargo, esta prueba no sólo pue<strong>de</strong> ser positiva en presencia <strong>de</strong><br />
anticuerpos antieritrocitarios, sino que también pue<strong>de</strong> indicar:<br />
a) Adsorción sobre la superficie eritrocitaria <strong>de</strong> complejos inmunes formados<br />
por ciertos medicamentos y su correspondiente anticuerpo (penicilina,<br />
quinidina, fenacetina).<br />
b) Alteración <strong>de</strong> la superficie eritrocitaria por efecto <strong>de</strong> ciertos medicamentos<br />
como la cefalotina, la metildopa y otros.<br />
c) Fijación inespecífica <strong>de</strong> inmunoglobulinas a los hematíes en pacientes<br />
con hipergammaglobulinamia (por ejemplo: cirróticos) o en pacientes<br />
tratados con dosis altas <strong>de</strong> Ig vía IV.<br />
Por tanto, la prueba <strong>de</strong> Coombs está indicada siempre que exista sospecha<br />
clínica o biológica <strong>de</strong> hemólisis por mecanismo inmune:<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
1. Anemia hemolítica autoinmune (hematíes sensibilizados por<br />
autoanticuerpos).<br />
2. Anemia hemolítica inducida por fármacos.<br />
3. Enfermedad hemolítica <strong>de</strong>l recién nacido (hematíes sensibilizados por<br />
anticuerpos anti-Rh producidos por la madre).<br />
4. Reacción hemolítica postransfusional.<br />
Cuando la prueba <strong>de</strong> Coombs sea positiva, <strong>de</strong>be proce<strong>de</strong>rse a investigar si lo<br />
que recubre la superficie eritrocitaria es una inmunoglobulina, el complemento o<br />
ambos simultáneamente. Asimismo, <strong>de</strong>be investigarse la naturaleza <strong>de</strong>l<br />
autoanticuerpo existente (IgG, IgM).<br />
Por otra parte, no hay que olvidar la posibilidad <strong>de</strong> errores capaces <strong>de</strong><br />
enmascarar el resultado <strong>de</strong> la prueba <strong>de</strong> Coombs, dando lugar en la práctica a<br />
falsos positivos y falsos negativos, cuyas causas generales son:<br />
1. Falsos positivos:<br />
• Sensibilización eritrocitaria in vitro por efecto <strong>de</strong> anticuerpos naturales o<br />
<strong>de</strong>l complemento cuando se mantiene la sangre durante cierto tiempo a 4<br />
º C antes <strong>de</strong> su análisis.<br />
• Lavado insuficiente <strong>de</strong> los hematíes.<br />
• Fijación ina<strong>de</strong>cuada <strong>de</strong> suero antiglobulínico que contiene anticuerpos<br />
capaces <strong>de</strong> unirse a hematíes no sensibilizados.<br />
• Reacción con la sílice coloidal <strong>de</strong> los tubos <strong>de</strong> cristal.<br />
• Elevada reticulocitosis en la muestra <strong>de</strong> sangre analizada.<br />
2. Falsos negativos:<br />
• Tiempo insuficiente <strong>de</strong> incubación, que no permite alcanzar la aglutinación<br />
eritrocitaria.<br />
• Dilución incorrecta <strong>de</strong>l suero antiglobulina.<br />
• Suero antiglobulina <strong>de</strong> mala calidad.<br />
• Cuando el antisuero es <strong>de</strong> naturaleza IgA (<strong>de</strong>bido a que los sueros<br />
antiglobulina normalmente empleados carecen <strong>de</strong> anti-IgA).<br />
• Alteración <strong>de</strong>l suero antiglobulina <strong>de</strong>bido a mala conservación o<br />
contaminación bacteriana.<br />
• Lavado ina<strong>de</strong>cuado <strong>de</strong> los hematíes, que facilita la neutralización <strong>de</strong> los<br />
anticuerpos fijados sobre ellos por las inmunoglobulinas plasmáticas o el<br />
complemento.<br />
• Eliminación <strong>de</strong> los anticuerpos fijados sobre la superficie eritrocitaria<br />
mediante el lavado.<br />
• Empleo <strong>de</strong> sangre caducada.<br />
• Empleo <strong>de</strong> placas o portaobjetos sucios, húmedos o con residuos <strong>de</strong><br />
jabón.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
El <strong>de</strong>nominado Coombs-control se utiliza para <strong>de</strong>tectar los falsos negativos.<br />
Consiste en hematíes sensibilizados con IgG, que se aña<strong>de</strong>n a los tubos con<br />
resultado negativo (sin aglutinación). Dichos hematíes control sólo serán<br />
aglutinados si el suero <strong>de</strong> Coombs está libre (lo que confirma la negatividad <strong>de</strong>l<br />
test). Si los tubos negativos no aglutinan con el suero Coombs-control, el test no<br />
es fiable y hay que repetirlo.<br />
Un test <strong>de</strong> Coombs positivo no indica necesariamente un acortamiento <strong>de</strong> la<br />
supervivencia <strong>de</strong> los hematíes. Este acortamiento que aparece cuando existe<br />
hemólisis se <strong>de</strong>muestra mediante el correspondiente estudio eritropatológico:<br />
haptoglobina, recuento <strong>de</strong> reticulocitos, <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> bilirrubina y LDH, etc.<br />
El resultado <strong>de</strong> estas pruebas es lo que confirmará la existencia o no <strong>de</strong><br />
hemólisis.<br />
PRUEBA DE COOMBS DIRECTO EN TARJETA<br />
Las tarjetas son un mo<strong>de</strong>rno método <strong>de</strong> rutina utilizado actualmente en los<br />
bancos <strong>de</strong> sangre para los estudios pretransfusionales.<br />
El sistema está formado por tarjetas que llevan varias microcolumnas, que<br />
constan <strong>de</strong>:<br />
Una zona superior don<strong>de</strong> se <strong>de</strong>positan los hematíes con o sin los sueros o<br />
antisueros (según la técnica), y en la que se originará la reacción <strong>de</strong><br />
aglutinación.<br />
Una zona inferior que contiene un gel filtrante <strong>de</strong> <strong>de</strong>xtrano (don<strong>de</strong> va el suero <strong>de</strong><br />
Coombs o los antisueros específicos, según la técnica), que durante la<br />
centrifugación permitirá el paso <strong>de</strong> los hematíes libres, pero no el <strong>de</strong> los<br />
aglutinados, que serán retenidos por su mayor tamaño. Cuanto mayor sean los<br />
aglutinados, menos hematíes atravesarán el gel, lo que indica una mayor<br />
intensidad <strong>de</strong> reacción, que se expresa en cruces.<br />
Existen varios tipos <strong>de</strong> tarjetas:<br />
a) Tarjetas que llevan un medio salino inerte con o sin enzimas (se utilizan<br />
para estudio ABO, pruebas cruzadas en frío, etc) y<br />
b) Tarjetas que llevan suero antiglobulina humano, también <strong>de</strong>nominado <strong>de</strong><br />
Liss-Coombs (el medio tiene un potencial iónico bajo que facilita la<br />
sensibilización), y que se utilizan para el Coombs directo, para pruebas<br />
cruzadas en fase <strong>de</strong> Coombs indirecto, etc.<br />
Material<br />
• Tarjetas <strong>de</strong> Liss-Coombs.<br />
• Diluyente 2 ó Liss.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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Procedimiento<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
• Se diluyen 10 μL <strong>de</strong>l sedimento <strong>de</strong> la sangre <strong>de</strong>l paciente<br />
(anticoagulada con EDTA) en 1 mL <strong>de</strong>l diluyente 2 y se mezcla.<br />
• Coger 50 μL <strong>de</strong> la mezcla y echar en un microtubo.<br />
• Incubar 2 minutos a temperatura ambiente.<br />
• Centrifugar y leer.<br />
• Si es positivo, montar la técnica con sueros monoespecíficos (anti-IgG,<br />
anti-IgM, anti-IgA, anti-C3).<br />
Interpretación<br />
La misma que la <strong>de</strong> la técnica en tubo.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
ESTUDIO DE LA COMPATIBILIDAD<br />
SANGUÍNEA:<br />
PRUEBA CRUZADA MAYOR, FASES DE<br />
LECTURA E INTERPRETACIÓN<br />
INTRODUCCIÓN<br />
La inmunohematología es la parte <strong>de</strong> la hematología que estudia los procesos<br />
inmunitarios que tienen lugar en el organismo en relación con los elementos<br />
sanguíneos. Uno <strong>de</strong> los aspectos más importantes compren<strong>de</strong> el estudio y la<br />
cuantificación <strong>de</strong> los llamados grupos sanguíneos eritrocitarios (componentes<br />
antigénicos presentes en la superficie <strong>de</strong> los eritrocitos) ya que están<br />
relacionados directamente con la terapéutica transfusional y la prevención <strong>de</strong><br />
acci<strong>de</strong>ntes hemolíticos graves secundarios a ella.<br />
Todas las pruebas pretransfusionales intentan <strong>de</strong>tectar reacciones antígenoanticuerpo<br />
potenciales antes <strong>de</strong> que la sangre sea transfundida. Para <strong>de</strong>scartar<br />
incompatibilida<strong>de</strong>s entre el donante y el receptor, las premisas generales son las<br />
siguientes:<br />
1. Asegurar la compatibilidad ABO. Pue<strong>de</strong>n usarse concentrados <strong>de</strong><br />
hematíes ABO-compatibles si no se dispone <strong>de</strong> sangre ABO-específica.<br />
2. Utilizar sangre <strong>de</strong>l mismo grupo Rh0 (D), lo que es especialmente<br />
importante en mujeres antes <strong>de</strong> la menopausia. En una gran emergencia<br />
pue<strong>de</strong> transfundirse sangre Rh0 (D) positiva a un paciente Rh0 (D)<br />
negativo no sensibilizado, pero ésta es una <strong>de</strong>cisión que <strong>de</strong>be tomar el<br />
director médico y el clínico <strong>de</strong>l banco <strong>de</strong> sangre, porque existe un 60-70<br />
% <strong>de</strong> riesgo <strong>de</strong> formar anti-Rh0 (D). Pue<strong>de</strong> darse inmunoglobulina anti<br />
Rh0 (D), sobre todo si el paciente es una mujer en edad fértil. Cuando el<br />
donante y el receptor pertenecen al mismo grupo ABO y RH0 (D), la<br />
transfusión será compatible en el 98 % <strong>de</strong> los casos.<br />
3. Para asegurar la compatibilidad <strong>de</strong>l 2 % restante, son fundamentales:<br />
a) El estudio <strong>de</strong> anticuerpos irregulares clínicamente importantes en el<br />
suero <strong>de</strong>l receptor.<br />
b) La prueba <strong>de</strong> compatibilidad directa entre el suero <strong>de</strong>l receptor y los<br />
hematíes <strong>de</strong>l donante.<br />
No <strong>de</strong>be olvidarse que la i<strong>de</strong>ntificación inequívoca <strong>de</strong> las muestras <strong>de</strong> sangre,<br />
tanto <strong>de</strong>l receptor como <strong>de</strong>l componente o componentes a transfundir, es un<br />
aspecto fundamental, dado que la mayor parte <strong>de</strong> las reacciones hemolíticas<br />
tienen su origen en errores <strong>de</strong> i<strong>de</strong>ntificación y/o <strong>de</strong> trascripción. Por ello, el banco<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
<strong>de</strong> sangre <strong>de</strong>be disponer <strong>de</strong> un sistema que garantice la i<strong>de</strong>ntificación correcta<br />
<strong>de</strong>l paciente y el etiquetado correcto <strong>de</strong> la sangre que ha sido objeto <strong>de</strong> la<br />
prueba cruzada.<br />
La clasificación ABO, las pruebas Rh0 (D) y la <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> anticuerpos<br />
irregulares se hacen con cada nueva muestra <strong>de</strong> paciente. No es posible confiar<br />
en registros anteriores para esta información, aunque todos los resultados <strong>de</strong><br />
pruebas <strong>de</strong> laboratorio <strong>de</strong>ben conservarse para po<strong>de</strong>r comparar los actuales con<br />
los anteriores. Cualquier discrepancia <strong>de</strong>be resolverse antes <strong>de</strong> entregar la<br />
sangre al paciente.<br />
Mientras las pruebas cruzadas se están realizando, aplicar a la unidad <strong>de</strong> sangre<br />
un rótulo con los datos <strong>de</strong> i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong>l posible receptor, y colocarla en la<br />
zona <strong>de</strong>l refrigerador reservada a “sangre <strong>de</strong> pruebas cruzadas”.<br />
Las pruebas <strong>de</strong> compatibilidad se efectúan antes <strong>de</strong> transfundir la sangre, para<br />
asegurarse <strong>de</strong> que los hematíes <strong>de</strong>l donante son compatibles con el paciente.<br />
Compren<strong>de</strong> las siguientes <strong>de</strong>terminaciones:<br />
1) Tipaje correcto <strong>de</strong>l grupo ABO y Rh <strong>de</strong>l receptor. El grupo sanguíneo y Rh<br />
<strong>de</strong> una persona no cambian, pero siempre existe el peligro <strong>de</strong><br />
i<strong>de</strong>ntificación incorrecta <strong>de</strong> las muestras sanguíneas.<br />
2) Determinación <strong>de</strong> anticuerpos irregulares en el suero <strong>de</strong>l receptor, para<br />
po<strong>de</strong>r administrar sangre solamente <strong>de</strong> aquellos donantes que carecen <strong>de</strong><br />
los antígenos específicos.<br />
3) Tipaje correcto <strong>de</strong> los grupos ABO y Rh <strong>de</strong>l donante.<br />
4) Realización <strong>de</strong> un autocontrol <strong>de</strong> los hematíes <strong>de</strong>l receptor. Si es positivo<br />
(los hematíes autólogos en diluyente Liss muestran aglutinación), se<br />
realiza un Coombs directo con los hematíes <strong>de</strong>l receptor.<br />
5) Pruebas cruzadas. Son el último estudio que se realiza en busca <strong>de</strong><br />
incompatibilidad entre la sangre <strong>de</strong>l donante y <strong>de</strong>l receptor. Aún cuando<br />
no es posible efectuar un estudio completamente exhaustivo en busca <strong>de</strong><br />
incompatibilidad antes <strong>de</strong> cada transfusión, la prueba cruzada <strong>de</strong>be ser lo<br />
más completa posible, a fin <strong>de</strong> proteger al paciente. Hay que tener en<br />
cuenta que, excepto en las transfusiones entre gemelos univi<strong>tel</strong>inos y en<br />
las transfusiones autólogas, ninguna sangre pue<strong>de</strong> ser 100 % compatible.<br />
PRUEBA CRUZADA MAYOR<br />
Las pruebas cruzadas son importantes, ya que confirman “in vitro” que la<br />
transfusión prevista será bien tolerada y probablemente eficaz. Se distinguen:<br />
a) Prueba cruzada mayor: Consiste en enfrentar suero <strong>de</strong>l paciente con<br />
hematíes <strong>de</strong>l donante bajo condiciones óptimas para la actividad <strong>de</strong> los<br />
anticuerpos en el laboratorio. Se realiza para <strong>de</strong>mostrar la posible<br />
existencia en el suero <strong>de</strong>l paciente <strong>de</strong> anticuerpos hemolizantes, <strong>de</strong><br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
revestimiento (incompletos) y/o aglutinantes contra los hematíes <strong>de</strong>l<br />
donante.<br />
b) Prueba cruzada menor: El suero <strong>de</strong>l donante se enfrenta con los hematíes<br />
<strong>de</strong>l paciente. Debido al empleo generalizado <strong>de</strong> concentrados <strong>de</strong><br />
hematíes, esta prueba ya no se utiliza en muchos hospitales. Y aunque<br />
toda unidad con investigación <strong>de</strong> anticuerpos irregulares positiva es<br />
rechazada por el banco <strong>de</strong> sangre, pue<strong>de</strong> ocurrir que posea anticuerpos a<br />
bajo título o <strong>de</strong> baja inci<strong>de</strong>ncia no <strong>de</strong>tectados por los reactivos habituales,<br />
por lo que cuando se administre un gran volumen <strong>de</strong> plasma es<br />
aconsejable la realización <strong>de</strong> esta prueba cruzada menor, para <strong>de</strong>tectar la<br />
posible existencia en el donante <strong>de</strong> estos anticuerpos contra los hematíes<br />
<strong>de</strong>l receptor.<br />
Para la prueba cruzada <strong>de</strong>be utilizarse suero <strong>de</strong>l receptor y no plasma, ya que la<br />
mayoría <strong>de</strong> los anticoagulantes actúan quelando los iones calcio, lo que impi<strong>de</strong><br />
la activación <strong>de</strong>l complemento, por lo que algunos anticuerpos que fijan el<br />
complemento no podrán ser <strong>de</strong>tectados si se emplea sangre anticoagulada.<br />
A<strong>de</strong>más las muestras <strong>de</strong> sangre <strong>de</strong>ben estar completamente coaguladas, pues<br />
si no los restos <strong>de</strong> fibrina atrapan los hematíes <strong>de</strong>l donante y la diferenciación<br />
entre coágulos y aglutinados es difícil <strong>de</strong> establecer.<br />
Para preparar la suspensión <strong>de</strong> hematíes <strong>de</strong>l donante se <strong>de</strong>be usar sangre <strong>de</strong><br />
los segmentos herméticamente sellados <strong>de</strong>rivados <strong>de</strong> la bolsa hemática (tubo<br />
colector).<br />
Los hematíes y el suero han <strong>de</strong> ser incubados durante el tiempo suficiente para<br />
que puedan reaccionar incluso los anticuerpos muy poco potentes. En general,<br />
sólo los anticuerpos reactivos a 37º C y/o en fase <strong>de</strong> antiglobulina serán<br />
importantes <strong>de</strong>s<strong>de</strong> el punto <strong>de</strong> vista clínico. Por ello es necesario añadir suero<br />
antiglobulina <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> la incubación, para <strong>de</strong>tectar los anticuerpos que<br />
recubren a los hematíes pero que no llegan a aglutinarlos. La prueba <strong>de</strong>be<br />
comprobarse mediante controles.<br />
Es muy importante para la sensibilidad <strong>de</strong> la prueba el cociente suero/células,<br />
por lo que siempre que sea posible la proporción <strong>de</strong>be ser <strong>de</strong> 4 volúmenes <strong>de</strong><br />
suero por cada volumen <strong>de</strong> la suspensión <strong>de</strong> hematíes al 2-5 % en suero salino<br />
isotónico.<br />
La prueba cruzada mayor pue<strong>de</strong> hacerse usando uno o dos tubos. Cuantos<br />
menos tubos se usen en el procedimiento sanguíneo cruzado, menos son las<br />
posibilida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> confusión y error. La prueba <strong>de</strong>be ser lo más sencilla posible<br />
para evitar las equivocaciones.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Debe usarse en todo el banco <strong>de</strong> sangre una forma única <strong>de</strong> clasificación <strong>de</strong> los<br />
resultados en grados, para facilitar su comparación. Un sistema comúnmente<br />
utilizado es el siguiente:<br />
4+ 1 agregado sólido<br />
3+ Varios agregados gran<strong>de</strong>s<br />
2+ Agregados <strong>de</strong> tamaño mediano con fondo claro<br />
1+ Agregados pequeños con fondo rojizo<br />
W+ Agregados diminutos, con fondo rojizo turbio<br />
0- Suspensión lisa sin agregados<br />
H Hemólisis, que <strong>de</strong>be interpretarse como reacción positiva<br />
También pue<strong>de</strong> hacerse una “prueba cruzada titulada” empleando diluciones<br />
dobles progresivas.<br />
REALIZACIÓN<br />
1. Colocar en un tubo <strong>de</strong> hemólisis rotulado 2 gotas <strong>de</strong> suero <strong>de</strong>l<br />
paciente y 1 gota <strong>de</strong> la suspensión salina al 5 % <strong>de</strong> los hematíes <strong>de</strong>l<br />
donante (Fig. 1).<br />
2. Incubar a temperatura ambiente (22 - 24 ºC) durante 15 minutos.<br />
Centrifugar a unas 1.500 r.p.m. durante 1 ó 2 minutos.<br />
Fig. 1: Prueba cruzada mayor.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
3. Leer la reacción (fase salina) con ayuda <strong>de</strong> un espejo <strong>de</strong> aumento<br />
iluminado, rotando suavemente las células <strong>de</strong>l botón <strong>de</strong> hematíes, y<br />
registrar los resultados en ese mismo momento (no confiar en la<br />
memoria, pues aumenta las posibilida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> error).<br />
4. Agregar 2 ó 3 gotas <strong>de</strong> albúmina bovina 20 -30 % al tubo anterior.<br />
5. Incubar a 37º C durante 30 minutos. Centrifugar.<br />
6. Leer (fase albuminosa) y registrar los resultados como en el punto 3.<br />
7. Lavar 3 ó 4 veces los hematíes con solución salina isotónica y<br />
<strong>de</strong>spués <strong>de</strong>l último lavado <strong>de</strong>cantar completamente.<br />
8. Agregar 2 gotas <strong>de</strong> suero antiglobulina al tubo. Centrifugar.<br />
9. Leer (fase <strong>de</strong> antiglobulina o fase <strong>de</strong> Coombs) y registrar los<br />
resultados como en el punto 3. Si la prueba cruzada es negativa:<br />
10. Agregar una gota <strong>de</strong> hematíes <strong>de</strong> control <strong>de</strong> Coombs a cada tubo<br />
negativo. Centrifugar, leer y registrar.<br />
Pue<strong>de</strong>n aplicarse diversas modificaciones <strong>de</strong> la Prueba Indirecta <strong>de</strong> la<br />
Antiglobulina para favorecer la <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> anticuerpos:<br />
Hematíes tratados con enzimas: Los hematíes que se utilizan en la fase <strong>de</strong><br />
antiglobulina <strong>de</strong> las pruebas cruzadas pue<strong>de</strong>n tratarse con enzimas proteolíticas<br />
(papaína, ficina, bromelina o tripsina), que separan <strong>de</strong> la membrana <strong>de</strong>l hematíe<br />
las proteínas portadoras <strong>de</strong> ácido siálico, cargado negativamente. Por ejemplo,<br />
la bromelina resulta útil como prueba cruzada “adicional” en el estudio <strong>de</strong><br />
receptores que han sufrido reacciones transfusionales. Esto favorece la<br />
sensibilización y la aglutinación por algunos anticuerpos clínicamente<br />
significativos (como Rhesus y Kidd). Algunos antígenos (como M, N, S y Duffy)<br />
son <strong>de</strong>struidos por el tratamiento enzimático, por lo que sus anticuerpos no son<br />
<strong>de</strong>tectados.<br />
El tratamiento enzimático también aumenta la reacción <strong>de</strong> algunos<br />
autoanticuerpos <strong>de</strong> frío que clínicamente carecen <strong>de</strong> importancia, como el anti-I.<br />
Solución salina <strong>de</strong> bajo potencial iónico (LISS): Cuando la técnica <strong>de</strong> la<br />
antiglobulina se efectúa con los hematíes <strong>de</strong>l donante suspendido en solución<br />
salina normal, se necesita un tiempo <strong>de</strong> incubación <strong>de</strong> 30-60 minutos para lograr<br />
un máximo <strong>de</strong> fijación <strong>de</strong> los anticuerpos a los antígenos <strong>de</strong> los hematíes. Si los<br />
hematíes se suspen<strong>de</strong>n en una solución LISS, el período <strong>de</strong> incubación pue<strong>de</strong><br />
reducirse a 5-10 minutos.<br />
Albúmina: La adición <strong>de</strong> albúmina a los hematíes suspendidos en medio salino<br />
normal aumenta la tasa <strong>de</strong> sensibilización, permitiendo un tiempo <strong>de</strong> incubación<br />
más corto.<br />
Después <strong>de</strong> completar las pruebas sanguíneas cruzadas, si hay compatibilidad<br />
consignarlo en el rótulo <strong>de</strong> la unidad y completar el registro <strong>de</strong> compatibilidad.<br />
Este rótulo o etiqueta <strong>de</strong>be permanecer unido a la bolsa <strong>de</strong> sangre hasta<br />
completar la transfusión.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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INTERPRETACIÓN<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
La aglutinación indica que algún anticuerpo <strong>de</strong>l suero <strong>de</strong>l receptor se ha unido a<br />
hematíes <strong>de</strong>l donante, por lo que se dice que la prueba cruzada es incompatible.<br />
La prueba cruzada es compatible si no existe aglutinación, pues indica que no<br />
hay anticuerpos eritrocitarios en el suero <strong>de</strong>l receptor. Como ya se ha indicado,<br />
todas las pruebas <strong>de</strong> antiglobulina negativas <strong>de</strong>ben ser comprobadas para<br />
asegurar que la técnica se ha realizado correctamente. Si los resultados son<br />
correctos, los hematíes <strong>de</strong>l control <strong>de</strong> Coombs <strong>de</strong>ben ser aglutinados; si esto no<br />
ocurre, la prueba no es válida y <strong>de</strong>be repetirse.<br />
Entre las causas <strong>de</strong> una prueba falsamente negativa están:<br />
Olvidarse <strong>de</strong> añadir el suero antiglobulina humana.<br />
Reactivo <strong>de</strong> antiglobulina carente <strong>de</strong> anticomplemento.<br />
Lavado incorrecto <strong>de</strong> los hematíes reaccionantes (se <strong>de</strong>jan residuos <strong>de</strong> proteínas<br />
plasmáticas humanas que neutralizan el suero antiglobulina, invalidándolo).<br />
Uso <strong>de</strong> suero viejo. La muestra empleada no <strong>de</strong>be tener más <strong>de</strong> 48 horas,<br />
conservada en refrigeración.<br />
Uso <strong>de</strong> una suspensión celular <strong>de</strong>nsa (<strong>de</strong>be ser <strong>de</strong>l 2-4 %).<br />
Centrífugas mal calibradas.<br />
Incubador a temperatura inapropiada.<br />
Investigación<br />
<strong>de</strong> anticuerpos<br />
irregulares<br />
+<br />
_<br />
+<br />
_<br />
_<br />
+<br />
+<br />
_<br />
Prueba<br />
cruzada<br />
Causa <strong>de</strong> la aglutinación<br />
*El Ac reacciona con algún<br />
Ag <strong>de</strong> los hematíes reactivo,<br />
pero no reacciona con los<br />
hematíes <strong>de</strong>l donante<br />
*El Ac reacciona con un Ag<br />
<strong>de</strong> baja inci<strong>de</strong>ncia<br />
*Los hematíes <strong>de</strong>l donante<br />
son Coombs directo positivo<br />
*Error <strong>de</strong> técnica→ repetir<br />
*El Ac reacciona con algún<br />
Ag <strong>de</strong> los hematíes <strong>de</strong>l<br />
donante y <strong>de</strong> los hematíes<br />
reactivo<br />
*No se <strong>de</strong>tecta Ac<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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Compatible para la<br />
transfusión<br />
Posiblemente (fenotipar los<br />
hematíes <strong>de</strong>l donante para<br />
confirmar la compatibilidad)<br />
No<br />
No<br />
Sí
TEMARIO DE T.E.L.<br />
Los anticuerpos solamente serán <strong>de</strong>tectados mediante la prueba cruzada si los<br />
hematíes <strong>de</strong>l donante poseen el antígeno correspondiente. Para asegurar la<br />
<strong>de</strong>tección <strong>de</strong> todos los anticuerpos clínicamente significativos, el suero <strong>de</strong>l<br />
paciente se incuba con 2 ó 3 muestras seleccionadas <strong>de</strong> sangre <strong>de</strong>l grupo 0, que<br />
expresen los antígenos más corrientes <strong>de</strong> los principales sistemas <strong>de</strong> grupos<br />
sanguíneos. Esto se <strong>de</strong>nomina investigación <strong>de</strong> anticuerpos irregulares.<br />
La aglutinación <strong>de</strong> alguna <strong>de</strong> las muestras <strong>de</strong> hematíes reactivo empleadas<br />
significa la presencia <strong>de</strong> un anticuerpo específico. Dicho anticuerpo pue<strong>de</strong><br />
i<strong>de</strong>ntificarse enfrentando el suero <strong>de</strong>l receptor con un panel <strong>de</strong> hematíes<br />
fenotipados (el mismo procedimiento que se utiliza en la prueba cruzada, pero<br />
sustituyendo los hematíes <strong>de</strong>l donante por hematíes <strong>de</strong>l grupo 0 extensamente<br />
fenotipados). Los anticuerpos dirigidos contra antígenos <strong>de</strong> baja frecuencia que<br />
no están en los hematíes reactivo, no serán <strong>de</strong>tectados. Si los hematíes <strong>de</strong>l<br />
donante en potencia poseen dicho antígeno <strong>de</strong> baja frecuencia, la<br />
incompatibilidad sería <strong>de</strong>tectada en la prueba cruzada.<br />
OBSERVACIONES GENERALES SOBRE LAS PRUEBAS CRUZADAS:<br />
Un factor que pue<strong>de</strong> confundir las pruebas cruzadas es el fenómeno “rouleaux”,<br />
don<strong>de</strong> los hematíes aparecen formando como pilas <strong>de</strong> monedas. Para<br />
comprobar que no se trata <strong>de</strong> una aglutinación, se usa la técnica <strong>de</strong>l reemplazo<br />
salino:<br />
1. Después <strong>de</strong> incubación y resuspensión, volver a centrifugar la mezcla<br />
suero-células y remover el suero.<br />
2. Reemplazar el suero con 2 gotas <strong>de</strong> solución salina y mezclar.<br />
3. Centrifugar la mezcla <strong>de</strong> células salinas.<br />
4. Volver a suspen<strong>de</strong>r la mezcla <strong>de</strong> células salinas y observar la<br />
aglutinación. Los rouleaux se dispersan pero la verda<strong>de</strong>ra aglutinación<br />
permanece.<br />
Una prueba cruzada negativa no asegura una supervivencia normal <strong>de</strong> los<br />
eritrocitos <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> transfundir la unidad. Los pacientes pue<strong>de</strong>n tener<br />
anticuerpos muy débiles (concentración menor <strong>de</strong>l nivel <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección) en el<br />
momento <strong>de</strong> la prueba cruzada, pero al transfundir, el antígeno específico queda<br />
expuesto al sistema inmune, y a menudo el anticuerpo reaparece con título y<br />
avi<strong>de</strong>z mayores (respuesta inmune secundaria), y la supervivencia <strong>de</strong> los<br />
glóbulos rojos se acorta <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> la transfusión.<br />
Cada vez que un paciente es transfundido existe la posibilidad <strong>de</strong> que esos<br />
hematíes produzcan una estimulación secundaria. Por ello, tras 24 horas <strong>de</strong> la<br />
transfusión, si se precisa otra, se <strong>de</strong>be extraer una nueva muestra <strong>de</strong> sangre <strong>de</strong>l<br />
receptor y realizar una nueva prueba cruzada. Con esto se podrá poner en<br />
evi<strong>de</strong>ncia cualquier anticuerpo recién adquirido, a la vez que se asegura la<br />
presencia <strong>de</strong> complemento en la prueba cruzada (los niveles <strong>de</strong> complemento en<br />
suero viejo son muy bajos, por lo que las reacciones Ag-Ac que fijen el<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
complemento no podrán ponerse <strong>de</strong> manifiesto, y esa incompatibilidad no será<br />
<strong>de</strong>tectada).<br />
Como medida <strong>de</strong> precaución, se <strong>de</strong>ben conservar en el refrigerador muestras <strong>de</strong>l<br />
donante y <strong>de</strong>l receptor al menos hasta 4 días <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> la transfusión.<br />
Las pruebas realizadas en fase salina a temperatura ambiente son capaces <strong>de</strong><br />
<strong>de</strong>scubrir varios tipos <strong>de</strong> incompatibilida<strong>de</strong>s en el sistema ABO, anticuerpos anti-<br />
P, anti-MNSs, anti-Lewis y algunos otros anticuerpos aglutinantes fríos.<br />
Las pruebas realizadas en fase albuminosa a 37 ºC se realizan tras la <strong>de</strong><br />
temperatura ambiente si ésta ha sido negativa. Estas pruebas permiten evitar “in<br />
vivo” reacciones <strong>de</strong>bidas a anticuerpos aglutinantes <strong>de</strong> los sistemas Rhesus y<br />
Lewis fundamentalmente.<br />
Las pruebas en fase <strong>de</strong> antiglobulina <strong>de</strong>tectan anticuerpos <strong>de</strong> clase IgG, es<br />
<strong>de</strong>cir, inmunoglobulinas no aglutinantes. Esta prueba <strong>de</strong>tecta prácticamente la<br />
totalidad <strong>de</strong> anticuerpos Rhesus y algunos otros anticuerpos dirigidos contra<br />
antígenos <strong>de</strong> los sistemas Duffy, Kell y Kidd.<br />
La responsabilidad final <strong>de</strong> la calidad <strong>de</strong> la sangre que se transfun<strong>de</strong> recae en la<br />
persona que efectúe la prueba cruzada. Por ello es muy importante recordar:<br />
Leer cuidadosamente las etiquetas.<br />
No utilizar nunca muestras contaminadas o <strong>de</strong> fechas atrasadas.<br />
Examinar siempre la unidad <strong>de</strong> sangre que se va a transfundir, para <strong>de</strong>scartar la<br />
presencia <strong>de</strong> coágulos, ictericia, turbi<strong>de</strong>z anormal y hemólisis (cualquiera <strong>de</strong><br />
estas situaciones es causa <strong>de</strong> rechazo <strong>de</strong> la bolsa hemática, por lo que no podrá<br />
transfundirse).<br />
Indicar el nombre <strong>de</strong>l receptor en la etiqueta, <strong>de</strong> modo que pueda leerse sin<br />
confusión.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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INTRODUCCION<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
TEMA 11. DIAGNÓSTICO<br />
SEROLÓGICO. PRINCIPIOS,<br />
TÉCNICAS Y <strong>UTIL</strong>IDAD.<br />
Inmunología es la rama <strong>de</strong> la ciencia que estudia la inmunidad. Esta se<br />
consi<strong>de</strong>ra como la resistencia <strong>de</strong>l organismo a las agresiones que pueda sufrir,<br />
sean <strong>de</strong> microorganismos, venenos, etc.<br />
El hombre, como cualquier otro animal, posee unos sistemas que ante la<br />
invasión <strong>de</strong> sustancias extrañas al organismo, generalmente microorganismos,<br />
las reconoce y posteriormente las <strong>de</strong>struye.<br />
Los animales vertebrados tienen dos gran<strong>de</strong>s tipos <strong>de</strong> sistemas que confieren la<br />
resistencia o el estado <strong>de</strong> inmunidad frente a los agentes patógenos:<br />
A) Uno, <strong>de</strong>l que forman parte elementos celulares como fagocitos<br />
(macrófagos), células NK (natural killer o asesinas naturales), factores humorales<br />
bactericidas o bacteriostáticos (lisozima, PCR, complemento, interferón).<br />
• Este sistema es natural, es <strong>de</strong>cir, sus componentes están siempre<br />
presentes y dispuestos para actuar inmediatamente sin requerir<br />
ningún fenómeno que induzca su generación.<br />
• Carece <strong>de</strong> especificidad, es <strong>de</strong>cir actúan sobre gran variedad <strong>de</strong><br />
microorganismos sin que posean un mecanismo <strong>de</strong> reconocimiento<br />
que les permita distinguir selectivamente unos <strong>de</strong> otros.<br />
• Tampoco presenta memoria, es <strong>de</strong>cir que no aumentan su eficacia<br />
al respon<strong>de</strong>r al mismo microorganismo en un segundo contacto<br />
con él.<br />
B) El segundo sistema inmunitario es mas complejo y eficaz. Son<br />
responsables <strong>de</strong> este sistema los linfocitos y los anticuerpos. Aquellos se unen a<br />
las sustancias extrañas (Antígenos) provocando su <strong>de</strong>strucción. Asimismo<br />
producen unas sustancias, llamadas anticuerpos, que también se unen a las<br />
sustancias extrañas provocando una serie <strong>de</strong> reacciones ten<strong>de</strong>ntes a eliminar el<br />
antígeno <strong>de</strong>l organismo.<br />
• Este segundo sistema tiene la capacidad <strong>de</strong> memoria. Es <strong>de</strong>cir que en un<br />
futuro contacto con el mismo antígeno, se repite el mismo proceso<br />
inmunitario pero con mayor intensidad y en un tiempo mucho más corto.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
• También es específico, es <strong>de</strong>cir, las células y las sustancias (Ac.) que<br />
forman parte <strong>de</strong> él, reconocen a las sustancias extrañas (antígenos)<br />
actuando sobre ellas. Es <strong>de</strong>cir tienen receptores específicos por cada uno<br />
<strong>de</strong> los antígenos que puedan existir.<br />
• Finalmente, y al contrario que el primer sistema, los anticuerpos necesitan<br />
un estímulo antigénico para que se produzcan en el organismo.<br />
Los dos sistemas el innato y el adaptativo no actúan separadamente sino que<br />
interaccionan ayudándose uno a otro<br />
REACCION ANTIGENO - ANTICUERPO<br />
Las técnicas inmunológicas se basan, casi todas, en las reacciones Ag.-Ac. y<br />
enlas manifestaciones que <strong>de</strong> dicha reacción se <strong>de</strong>rivan.<br />
Definiremos los conceptos <strong>de</strong> antígeno y anticuerpo.<br />
ANTÍGENO:<br />
Es una sustancia extraña al organismo capaz <strong>de</strong> inducir una respuesta<br />
inmunitaria, es <strong>de</strong>cir, capaz <strong>de</strong> provocar la aparición <strong>de</strong> anticuerpos o <strong>de</strong> células<br />
que actúan sobre ella.<br />
En la superficie <strong>de</strong>l antígeno existen unas estructuras, trozos o fragmentos<br />
moleculares, que son las que verda<strong>de</strong>ramente van a reaccionar con el<br />
anticuerpo y con las células que las van a atacar. Estos fragmentos se llaman<br />
<strong>de</strong>terminantes antigénicos o epítopos. Un Ag. es más inmunogénico cuanto<br />
mayor número <strong>de</strong> <strong>de</strong>terminantes antigénicos posea.<br />
Pue<strong>de</strong> haber en un Ag. varios <strong>de</strong>terminantes antigénicos <strong>de</strong>l mismo tipo o<br />
diferentes. Pue<strong>de</strong>n reaccionar todos con el Ac. o Acs. o no.<br />
El nº <strong>de</strong> <strong>de</strong>terminantes antigénicos presentes en un Ag. es la valencia total <strong>de</strong>l<br />
antigeno. El nº <strong>de</strong> moléculas <strong>de</strong> Ac. que se pue<strong>de</strong>n unir al mismo tiempo con el<br />
Ag., o lo que es lo mismo, el nº <strong>de</strong> <strong>de</strong>terminantes antigénicos expuestos, es la<br />
valencia efectiva o funcional <strong>de</strong>l antígeno.<br />
La composición química <strong>de</strong>l Ag. pue<strong>de</strong> ser variada. En general son proteínas,<br />
aunque también pue<strong>de</strong>n ser lípidos o glúcidos, pero tienen menor po<strong>de</strong>r<br />
antigénico o inmunogénico.<br />
Los antígenos particulados, como virus, bacterias o hematíes extraños, son<br />
altamente inmunogénicos.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
A) FACTORES QUE AFECTAN LA ANTIGENICIDAD:<br />
Naturaleza química: Dependiendo <strong>de</strong> si son proteinas, hidratos <strong>de</strong> carbono o<br />
lípidos, son mas o menos antigénicos.<br />
Tamaño: Cuanto mayor sea la molécula <strong>de</strong> antígeno mas po<strong>de</strong>r inmunogénico<br />
tendrá. Ejemplo, si el Ag. tiene 25 aminoácidos será mas inmunogénico que si<br />
tiene 6.<br />
Complejidad: Cuanto mas complejo sea el antígeno mayor po<strong>de</strong>r<br />
inmunogénico. Ej., Si el Ag. está formado por ca<strong>de</strong>nas polipeptídicas <strong>de</strong> un sólo<br />
aminoácido, será menos inmunogénico que las <strong>de</strong> varios aminoácidos<br />
diferentes.<br />
Conformación: La configuración espacial (tridimensional), es <strong>de</strong>cir, la estructura<br />
3º <strong>de</strong> las moléculas influyen en su antigenicidad. Ej. Ags. que químicamente son<br />
iguales tienen diferente po<strong>de</strong>r antigénico cuando varía la situación espacial <strong>de</strong><br />
algunos <strong>de</strong>terminantes antigénicos.<br />
Accesibilidad: Cuanto mas soluble es un Ag. mas po<strong>de</strong>r antigénico tendrá, ya<br />
que será mas accesible a todas las partes <strong>de</strong>l organismo.<br />
Concepto <strong>de</strong> extraño: Generalmente las sustancias extrañas son las que<br />
provocan respuestas inmunes. Serán mas inmunogénicas las sustancias mas<br />
distantes, evolutivamente hablando, entre el Ag. y el huesped. Ej., si la albúmina<br />
<strong>de</strong> un ratón se inyecta a un hombre tendrá más po<strong>de</strong>r inmunogénico que si<br />
inyectamos la albúmina <strong>de</strong> un primate.<br />
Genética: La respuesta inmune está bajo control genético. Ej., a ratones se le<br />
inyecta un Ag., y respon<strong>de</strong>n fuertemente, a otros ratones, con otra base<br />
genética, al inyectarle ese mismo Ag. no respon<strong>de</strong>n <strong>de</strong> la misma forma o no<br />
respon<strong>de</strong>n.<br />
Modo <strong>de</strong> administrar los antígenos: El hecho <strong>de</strong> que un Ag. induzca una<br />
respuesta inmunitaria <strong>de</strong>pen<strong>de</strong> <strong>de</strong> la dosis y <strong>de</strong> la forma <strong>de</strong> administración.<br />
B) HAPTENOS:<br />
Hay sustancias <strong>de</strong> estructura química muy simple que son capaces <strong>de</strong> unirse a<br />
los Acs., una vez formados estos, ya que por si mismas son incapaces <strong>de</strong><br />
provocar su formación. Son los llamados HAPTENOS.<br />
Para que sean inmunogénicas (que provoquen la producción <strong>de</strong> Acs.) hay que<br />
unirlas a otras sustancias más complejas, generalmente proteínas. Estas<br />
sustancias se <strong>de</strong>nominan transportadores o "carrier".<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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ANTICUERPOS:<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
Son moléculas sintetizadas por los linfocitos B, en respuesta a un estímulo<br />
antigénico, que tienen la propiedad <strong>de</strong> unirse específicamente al Ag. que indujo<br />
su formación.<br />
Son proteínas <strong>de</strong> peso molecular elevado a las que se les llama<br />
Inmunoglobulinas (Ig.), ya que migran en la electroforesis a la fracción<br />
globulínica.<br />
Existen 5 tipos <strong>de</strong> Igs.: Ig. G, Ig. A, Ig. M, Ig. D, Ig. E. Dentro <strong>de</strong> estos tipos<br />
existen una gran variedad <strong>de</strong> subtipos, clases, subclases etc. Difieren según su<br />
carga, tamaño, composición <strong>de</strong> aminoácidos, contenido en carbohidratos,<br />
enlaces entre ca<strong>de</strong>nas, etc.<br />
Dado que un animal pue<strong>de</strong> fabricar Acs. específicos contra todas las moléculas<br />
que existen en la naturaleza, el nº <strong>de</strong> Acs. específicos que puedan hallarse en un<br />
momento dado pue<strong>de</strong> ser <strong>de</strong>l or<strong>de</strong>n <strong>de</strong> varios millones.<br />
Los Acs. pue<strong>de</strong>n encontrarse libres y circulante por el plasma, pero algunos,<br />
como las Ig.E se encuentran asociadas a células.<br />
Normalmente el organismo no <strong>de</strong>sarrola Acs. contra sus propios componentes.<br />
Cuando lo hace estamos ante una enfermedad autoinmune.<br />
Cuando un Ac. entra en contacto con un Ag. contra el que está dirigido, ambos<br />
se unen formándose un complejo Ag-Ac o complejo inmune o inmunocomplejo.<br />
Esta unión es reversible y su permanencia <strong>de</strong>pen<strong>de</strong> <strong>de</strong>l grado <strong>de</strong> adaptación<br />
entre ambas moléculas y <strong>de</strong> la fuerza y estabilidad <strong>de</strong> los enlaces que las unen.<br />
Una característica <strong>de</strong> la reacción Ag.-Ac. es la especificidad. Cuando un Ac. solo<br />
es capaz <strong>de</strong> reaccionar contra un Ag., se dice que ese Ac. es muy específico. La<br />
reacción Ag.-Ac. pue<strong>de</strong> mostrar un alto grado <strong>de</strong> especificidad distinguiendo<br />
pequeñas variaciones <strong>de</strong> la estructura <strong>de</strong>l Ag., carga, configuración óptica,<br />
conformación espacial, etc.<br />
METODOS SEROLOGICOS<br />
Se llaman así porque el suero sanguíneo es el vehículo habitual <strong>de</strong> los Acs.<br />
Estos métodos están basados generalmente en la reacción Ag.-Ac. Otros<br />
métodos se basan en el aislamiento <strong>de</strong> las diferentes poblaciones linfocitarias.<br />
Son muy útiles ya que po<strong>de</strong>mos estudiar un Ag. disponiendo <strong>de</strong> su Ac.<br />
correspondiente o viceversa.<br />
Las pruebas serológicas se caracterizan por su:<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
A) Especificidad: Es la capacidad que presenta la prueba <strong>de</strong> distinguir entre<br />
Ags. o Acs. (<strong>de</strong>pen<strong>de</strong> <strong>de</strong> lo que busquemos) <strong>de</strong> estructura muy similar.<br />
B) Sensibilidad: Es la cantidad <strong>de</strong> Ag. o Ac. (<strong>de</strong>pen<strong>de</strong> <strong>de</strong> lo que busquemos)<br />
que es capaz <strong>de</strong> <strong>de</strong>tectar.<br />
Fines <strong>de</strong> las pruebas serológicas:<br />
A) Cualitativos: Cuando sólo se persigue conocer si en una muestra existe o no<br />
Ag. o Ac., no nos interesa la cantidad.<br />
B) Cuantitativos: Cuando preten<strong>de</strong>mos saber la cantidad <strong>de</strong> Ag. o Ac. presente<br />
en la muestra. Lo po<strong>de</strong>mos saber:<br />
• Semicuantitativamente: Se logra saber <strong>de</strong> manera aproximada la<br />
cantidad <strong>de</strong> Ag. o Ac. presente en la muestra. Esto se consigue mediante<br />
el título <strong>de</strong> Ac.: La inversa <strong>de</strong> la máxima dilución <strong>de</strong> la muestra que<br />
enfrentada a una cantidad standard <strong>de</strong>l Ag. sigue manifestando<br />
positividad.<br />
• De una manera exacta: o cuantitativas propiamente dichas, en los que el<br />
resultado se expresa <strong>de</strong> una manera exacta. Se dará en mg, ml, ìg, ìl.<br />
etc.<br />
INMUNOANALISIS CON MARCADORES<br />
Se basan en utilizar moléculas indicadoras unidas al Anticuerpo o al Antígeno<br />
con el fin <strong>de</strong> <strong>de</strong>mostrar que ha tenido lugar la reacción Ag- Ac., es <strong>de</strong>cir<br />
<strong>de</strong>mostrar la existencia <strong>de</strong>l Ag. o el Ac. buscado.<br />
Estas pruebas se caracterizan por:<br />
• Utilizar cantida<strong>de</strong>s pequeñas <strong>de</strong> reactivos, se <strong>de</strong>cir son<br />
microtécnicas.<br />
• Ser muy rápidas en ofrecer los resultados (<strong>de</strong>s<strong>de</strong> minutos a horas,<br />
generalmente menos <strong>de</strong> 24 horas.<br />
• Poseen una máxima sensibilidad, es <strong>de</strong>cir <strong>de</strong>tectan cantida<strong>de</strong>s<br />
muy pequeñas <strong>de</strong> Ac. o Ag.<br />
• Son automatizables.<br />
Se clasifican según las moléculas indicadoras utilizadas:<br />
• ENZIMOINMUNOANALISIS ( E.L.I.S.A. o E.I.A.): Se usa una enzima.<br />
• INMUNOFLUORESCENCIA (I.F.): Se usa un fluorocromo (colorante<br />
fluorescente)<br />
• RADIOINMUNOANALISIS (R.I.A.): Se usa un isótopo radioactivo.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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INMUNOFLUORESCENCIA (I.F.)<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
Son pruebas que utilizan sustancias fluorescentes (fluorocromos) unidas al Ac o<br />
al Ag. para <strong>de</strong>mostrar que ha tenido lugar la reacción Ag.- Ac., es <strong>de</strong>cir para<br />
<strong>de</strong>mostrar que existe el Ac. o el Ag. buscado.<br />
Los fluorocromos son sustancias que sometidas a una fuente luminosa absorben<br />
luz a una <strong>de</strong>terminada longitud <strong>de</strong> onda y emiten luz a una longitud <strong>de</strong> onda<br />
mayor. Absorben luz ultravioleta y emiten fluorescencia (luz visible).<br />
Los fluorocromos usados habitualmente son:<br />
• Fluoresceína: emiten fluorescencia <strong>de</strong> color ver<strong>de</strong>.<br />
• Rodamina: " " " " anaranjada.<br />
Para <strong>de</strong>tectar la fluorescencia emitida se usarán:<br />
• Microscopio <strong>de</strong> fluorescencia.<br />
• Fluorímetros.<br />
TIPOS DE REACCIONES DE INMUNOFLUORESCENCIA:<br />
A) INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA:<br />
Se utiliza para la <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> Antígenos con ayuda <strong>de</strong> un Ac. marcado. Se usa<br />
para i<strong>de</strong>ntificar microrganismos en un material clínico (líquidos, tejidos, etc.).<br />
Fases:<br />
1.- Fijación <strong>de</strong> la muestra (Ag.) en un portaobjetos.<br />
2.- Se cubre la preparación con el Ac. específico marcado.<br />
3.- Se lava para eliminar el exceso <strong>de</strong> Ac: fluorescente.<br />
4.- Se observa al microscopio <strong>de</strong> fluorescencia.<br />
La observación <strong>de</strong> microorganismos fluorescentes indica que se ha producido la<br />
reacción Ag.- Ac.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Es una técnica rápida, pero su uso está limitado por la necesidad <strong>de</strong> disponer <strong>de</strong><br />
un Ac. específico marcado por cada Ag. que queramos <strong>de</strong>tectar.<br />
Se usa esta técnica en la <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> diferentes gérmenes en las muestras<br />
biológicas. Ejemplo para el bacilo <strong>de</strong> Koch.<br />
B) INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA:<br />
Se utiliza para la i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> Ac. libres presentes en el suero.<br />
Fases:<br />
1. 1. Fijamos en una fase sólida (portaobjetos) Ags. específicos <strong>de</strong> los<br />
Acs. que buscamos.(Estos portaobjetos se obtienen en el mercado<br />
con sus correspondientes Ags.)<br />
2. Se aña<strong>de</strong> la muestra problema (Ac buscado).<br />
3. Se aña<strong>de</strong> Antisuero marcado (Antiglobulina marcada) uniéndose<br />
<strong>de</strong> esta forma con el Ac. <strong>de</strong> la muestra causando la fluorescencia<br />
<strong>de</strong>l Ag.<br />
Este método es mas sensible que el anterior y a<strong>de</strong>más tiene la ventaja <strong>de</strong> que<br />
para la investigación <strong>de</strong> Acs. en suero humano solo requiere un Ac. marcado, la<br />
antiglobulina marcada. Tiene muchísimas aplicaciones. Ejemplo, para <strong>de</strong>tectar<br />
Acs. contra los toxoplasmas, contra el virus <strong>de</strong> Epstein-Barr (mononucleosis<br />
infecciosa),para el diagnóstico <strong>de</strong> la sífilis, etc.<br />
C) MÉTODO SANDWICH:<br />
Se usa para <strong>de</strong>tectar Acs. unidos a células.<br />
Fases:<br />
1.- Se fija el material clínico en un portaobjetos.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
2.- Se aña<strong>de</strong> el Ag. específico <strong>de</strong>l Ac. buscado.<br />
3.- Se aña<strong>de</strong> un Ac., igual al buscado, pero marcado.<br />
4.- Observación al microscopio <strong>de</strong> fluorescencia.<br />
Este último método, al igual que otro que usa el complemento, no se usa<br />
frecuentemente.<br />
ENZIMOINMUNOANALISIS (ELISA)<br />
Son pruebas que se basan en la <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> la reacción Ag.-Ac. mediante el<br />
empleo <strong>de</strong> Ags. o Acs. marcados con una enzima. La presencia <strong>de</strong> la enzima en<br />
el inmunocomplejo es <strong>de</strong>tectada por una reacción coloreada que se produce al<br />
añadir un sustrato.<br />
Una sola molécula <strong>de</strong> enzima pue<strong>de</strong> convertir millones <strong>de</strong> moléculas <strong>de</strong> sustrato<br />
en moléculas <strong>de</strong> producto. De ahí la alta sensibilidad <strong>de</strong> este procedimiento.<br />
Las enzimas usadas habitualmente como marcadoras son: peroxidasa, glucosa<br />
oxidasa, fosfatasa, etc.<br />
La medición <strong>de</strong> los cambios <strong>de</strong> color, como resultado <strong>de</strong> la conversión<br />
enzimática <strong>de</strong>l sustrato a producto, se lleva a cabo habitualmente mediante un<br />
espectrofotómetro. Actualmente, al ser casi todas las técnicas automatizadas, se<br />
utilizan lectores <strong>de</strong> placas que llevarán un espectrofotómetro incorporado.<br />
Se pue<strong>de</strong>n dividir los ensayos <strong>de</strong> ELISA en:<br />
* ELISA homogéneos, en los que la interacción antígeno-anticuerpo modula la<br />
actividad <strong>de</strong> la enzima por lo que no hay que separar los componentes marcados<br />
enzimáticamente <strong>de</strong> los no marcados.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
* ELISA heterogéneos, en los que la reacción antígeno-anticuerpo no modifica la<br />
actividad <strong>de</strong>l marcador enzimático. Estos métodos requieren la separación física<br />
<strong>de</strong>l inmunocomplejo Ag.-Ac. <strong>de</strong> los constituyentes no fijados. Son los más<br />
usados<br />
Aunque se pue<strong>de</strong>n hacer estas pruebas en fase líquida casi siempre se harán en<br />
fase sólida, es <strong>de</strong>cir se utilizará un soporte para fijar el Ac. o el Ag. Los soportes<br />
pue<strong>de</strong>n ser placas <strong>de</strong> microtiter, tubos <strong>de</strong> plástico, perlas <strong>de</strong> vidrio, etc.<br />
TIPOS DE REACCIONES DE ELISA EN FASE SÓLIDA:<br />
I) METODOS PARA DETECTAR ANTIGENOS:<br />
A) MÉTODO SANDWICH:<br />
Sirve para <strong>de</strong>tectar Ags. gran<strong>de</strong>s ( virus <strong>de</strong> la hepatitis, gonococo ...). Tienen que<br />
ser polivalentes ya que se tienen que unir a dos moléculas <strong>de</strong> Ac.<br />
Habrá varias etapas:<br />
1. Se fija el Ac. específico <strong>de</strong>l Ag. buscado en un soporte.<br />
2. Se aña<strong>de</strong> la muestra problema (con o sin el Ag. buscado).<br />
3. Se aña<strong>de</strong> el Ac. específico <strong>de</strong>l Ag. buscado pero marcado con una<br />
enzima.<br />
4. Se aña<strong>de</strong> un sustrato incoloro, específico <strong>de</strong> la enzima empleada,<br />
y se mi<strong>de</strong> el cambio <strong>de</strong> color producido al transformarse el sustrato<br />
en producto.<br />
La intensidad <strong>de</strong>l color medido será directamente proporcional a la cantidad <strong>de</strong><br />
Ag. que haya en la muestra.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Los resultados se compararán con soluciones patrones.<br />
B) MÉTODO DE UNIÓN COMPETITIVA:<br />
Se utiliza para <strong>de</strong>tectar drogas, hormonas, etc, en líquidos biológicos.<br />
Etapas:<br />
1. Se fija el Ac. específico <strong>de</strong>l Ag. buscado a un soporte:<br />
2. Se aña<strong>de</strong> una mezcla que contiene la muestra problema (Ag.<br />
buscado) y una solución con Ag.( igual al que queremos estudiar)<br />
marcado con una enzima<br />
3. Se mi<strong>de</strong> la cantidad <strong>de</strong> Ag. marcado que se ha fijado al Ac. unido<br />
al soporte, mediante la adición <strong>de</strong> un sustrato:<br />
La concentración <strong>de</strong>l Ag. problema será inversamente proporcional a la<br />
intensidad <strong>de</strong>l color medido.<br />
Se compararán los resultados con soluciones patrones.<br />
II) METODOS PARA DETECTAR ANTICUERPOS:<br />
A) MÉTODO INDIRECTO:<br />
Etapas:<br />
1. Fijamos a un soporte el Ag. específico <strong>de</strong>l Ac. que buscamos.<br />
2. Se aña<strong>de</strong> la muestra problema( tendrá o no el Ac. buscado).<br />
3. Se aña<strong>de</strong> la antiglobulina marcada con una enzima.<br />
4. Se mi<strong>de</strong> el cambio <strong>de</strong> color producido al añadir un sustrato incoloro.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
La intensidad <strong>de</strong>l color medido será directamente proporcional a la cantidad <strong>de</strong><br />
Ac. presente en la muestra. Los resultados se compararán con soluciones<br />
patrones.<br />
Es la técnica <strong>de</strong> mayor aplicación para <strong>de</strong>tectar Acs. por su elevada sensibilidad<br />
y especificidad, a la vez que por su posibilidad <strong>de</strong> automatización. Se utiliza, por<br />
ejemplo, para diagnosticar la rubéola, SIDA, citomegalovirus, etc.<br />
B) MÉTODO SANDWICH:<br />
Etapas:<br />
1.- Se fija al soporte una antiglobulina <strong>de</strong>l Ac que buscamos.<br />
2.- Se aña<strong>de</strong> la muestra problema (con o sin el Ac que buscamos).<br />
3.- Se aña<strong>de</strong> un Ag. específico <strong>de</strong>l Ac. que buscamos.<br />
4.- Se aña<strong>de</strong> un Ac., igual al buscado pero marcado con una enzima.<br />
5.- Se mi<strong>de</strong> el cambio <strong>de</strong> color al añadir un sustrato incoloro.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
La intensidad <strong>de</strong>l color medido será directamente proporcional a la cantidad <strong>de</strong><br />
Ac. presente en la muestra.<br />
Se compara los resultados con soluciones patrones.<br />
C) MÉTODO DE UNIÓN COMPETITIVA:<br />
Se usan sobre todo para <strong>de</strong>tectar Ac <strong>de</strong>l tipo Ig.M.<br />
Etapas:<br />
1. Se fija a un soporte el Ag. específico <strong>de</strong>l Ac. que buscamos.<br />
2. Se aña<strong>de</strong> el suero problema (con el Ac. buscado) mezclado con<br />
Ac. (igual al buscado) marcado con enzima:<br />
3. Se mi<strong>de</strong> la cantidad <strong>de</strong> Ac. marcado que se ha fijado al Ag.,<br />
midiendo la cantidad <strong>de</strong> color que se forma cuando se aña<strong>de</strong> un<br />
sustrato incoloro.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
La concentración <strong>de</strong> Ac. en la muestra será inversamente proporcional al color<br />
medido por el espectrofotómetro.<br />
Se compararán los resultados con soluciones patrones.<br />
RADIOINMUNOENSAYO (R.I.A.)<br />
Son pruebas que <strong>de</strong>tectan el complejo Ag. - Ac. formado mediante el marcaje<br />
con isótopos radiactivos <strong>de</strong>l Ag. o <strong>de</strong>l Ac.<br />
Los isótopos radiactivos usados habitualmente son:<br />
- Carbono 14 ( 14 C), Fósforo 32 ( 32 P), Tritio ( 3 H). Emiten radiación â.<br />
- Iodo 125 ( 125 I), Iodo 131 ( 131 I), Cobalto 57 ( 57 Co). Emiten radiación ã.<br />
Los aparatos <strong>de</strong>tectores <strong>de</strong> la reacción son los contadores <strong>de</strong> cen<strong>tel</strong>leo <strong>de</strong> rayos<br />
ã o â, según el radioisótopo usado como marcador. Estos aparatos mi<strong>de</strong>n la<br />
radiactividad.<br />
Aunque son las pruebas más sensibles, presentan una serie <strong>de</strong> <strong>de</strong>sventajas:<br />
o Hay que manipular radioisótopos, con el peligro que esto<br />
conlleva.<br />
o Hay que tener una serie <strong>de</strong> normas <strong>de</strong> seguridad muy<br />
estrictas. No todos los laboratorios pue<strong>de</strong>n aplicarlas..<br />
o El instrumental que hay que utilizar es complicado y caro.<br />
o La vida media <strong>de</strong> los isótopos usados habitualmente es muy<br />
corta, en comparación a la <strong>de</strong> las enzimas. 57 Co: 271,3 días,<br />
125 I: 60 días.<br />
Hay métodos en los que se inmoviliza el Ag. o el Ac. en una fase sólida y otros<br />
en los que no (fase líquida). Los más utilizados son los primeros.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Los métodos <strong>de</strong>l RIA son los mismos <strong>de</strong>l ELISA, los que mas se utilizan son los<br />
<strong>de</strong> unión competitiva.<br />
REACCIONES DE PRECIPITACION.<br />
Son unos métodos serológicos que se basan en <strong>de</strong>tectar la reacción Ag.-Ac. por<br />
la formación <strong>de</strong> un precipitado visible y reversible. Es <strong>de</strong>cir, si existe el Ag. o el<br />
Ac. buscado se produce la unión <strong>de</strong>l Ag. con el Ac. y como consecuencia <strong>de</strong> esta<br />
unión se forma el precipitado.<br />
Es un efecto "in vitro" <strong>de</strong> la reacción Ag.-Ac., es <strong>de</strong>cir solo se produce en el<br />
laboratorio para poner <strong>de</strong> manifiesto la reacción Ag.-Ac. Para que se produzca la<br />
reacción <strong>de</strong> precipitación es necesario que los Ags. y los Acs. sean<br />
multivalentes, ya que se tiene que formar una malla o red que finalmente<br />
precipita. Habrá unos Acs. que precipiten mejor que otros.<br />
El Ag. tiene que ser soluble, no particulado, por lo que se tendrá que formar una<br />
gran red antes <strong>de</strong> que el precipitado sea visible, requiriendo esto una gran<br />
cantidad <strong>de</strong> anticuerpos. Es pues una reacción poco sensible. Sin embargo es<br />
una prueba muy específica.<br />
Si a una solución con exceso <strong>de</strong> Acs. le vamos añadiendo concentraciones<br />
crecientes <strong>de</strong> Ag., y se representa el porcentaje <strong>de</strong> precipitación frente a la<br />
cantidad <strong>de</strong> Ag., se obtiene la curva siguiente:<br />
Vemos que existen 3 zonas bien diferenciadas:<br />
1. Prozona (Exceso <strong>de</strong> Ac.): Inicialmente no se forma precipitado. Se forman<br />
uniones Ag.-Ac. pero son altamente solubles <strong>de</strong>bido al exceso <strong>de</strong> Acs.<br />
Cada molécula <strong>de</strong> Ag. está saturada <strong>de</strong> Acs. La formación <strong>de</strong> precipitado<br />
aumenta conforme aumenta la concentración <strong>de</strong> Ag.<br />
2. Zona <strong>de</strong> equivalencia: Es la zona <strong>de</strong> máxima precipitación. Cada Ag. está<br />
ligado a un Ac., que a su vez está ligado por su otra(s) valencia(s) a otro<br />
Ag. formándose <strong>de</strong> esta forma una gran red que precipita.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
3. Postzona (Exceso <strong>de</strong> Ag.): La adición continuada <strong>de</strong> Ag. da como<br />
resultado la solubilización <strong>de</strong>l precipitado <strong>de</strong>bido a la formación <strong>de</strong><br />
pequeños complejos con exceso <strong>de</strong> Ag. Cada molécula <strong>de</strong> Ac. está<br />
saturada <strong>de</strong> Ag., se une con varias moléculas <strong>de</strong> Ag., tantas como<br />
valencia tenga el Ac.; por tanto no se pue<strong>de</strong> formar la malla necesaria<br />
para que se produzca la precipitación.<br />
Para una mejor cuantificación <strong>de</strong>l Ac. o Ag. es conveniente que la zona <strong>de</strong><br />
equivalencia sea lo mas estrecha posible. Esto se conseguirá utilizando Ags.<br />
fácilmente solubles, así como que la muestra no tenga una mezcla excesiva <strong>de</strong><br />
Acs. similares, ya que si no se producen diferentes uniones Ag.-Ac.<br />
ensanchando la zona <strong>de</strong> equivalencia.<br />
Aparte <strong>de</strong> la relación <strong>de</strong> proporción Ag.-Ac., existen otros factores que pue<strong>de</strong>n<br />
afectar la precipitación:<br />
- Especificidad y afinidad <strong>de</strong>l Ac.<br />
- pH y la fuerza iónica <strong>de</strong>l buffer en el que se <strong>de</strong>sarrolle la reacción.<br />
- temperatura a que se incube la reacción.<br />
- peso molecular <strong>de</strong> los reactantes.<br />
TIPOS DE REACCIONES DE PRECIPITACION:<br />
Las reacciones <strong>de</strong> precipitación se pue<strong>de</strong>n realizar en un medio sólido o en<br />
medio líquido. Atendiendo a este criterio las vamos a clasificar.<br />
PRECIPITACION EN MEDIO LÍQUIDO:<br />
A) PRUEBA DEL ANILLO:<br />
La mezcla <strong>de</strong> un Ag. soluble y su Ac. correspondiente en un tubo da lugar a un<br />
precipitado visible unicamente si la proporción <strong>de</strong> Ag. y Ac. son las apropiadas.<br />
Se pue<strong>de</strong> hacer la prueba <strong>de</strong> una manera cualitativa o cuantitativa.<br />
Cualitativa: Nos permite i<strong>de</strong>ntificar un Ag. disponiendo <strong>de</strong> su Ac. específico, y<br />
viceversa. Las etapas <strong>de</strong> la reacción son:<br />
1.- Colocar el Ac. en el fondo <strong>de</strong>l tubo<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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2.- Añadir el Ag. problema<br />
3.- Reacción <strong>de</strong> precipitación<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
En caso <strong>de</strong> que exista el Ag. problema se<br />
formará, en la interfase <strong>de</strong> ambos<br />
líquidos, un disco <strong>de</strong> precipitado <strong>de</strong> color<br />
blanquecino.<br />
Esta reacción se usa para <strong>de</strong>tectar la<br />
PCR, i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> los grupos <strong>de</strong><br />
Lancefield <strong>de</strong> los Streptococcus.<br />
La prueba cuantitativa se hace <strong>de</strong> la misma forma pero utilizando varios tubos<br />
con Ac y añadiendo a ellos cantida<strong>de</strong>s crecientes <strong>de</strong> Ag. Se mi<strong>de</strong> la cantidad <strong>de</strong><br />
precipitado que se forma en cada tubo. Los resultados se llevan a una gráfica,<br />
como la anterior. En el tubo don<strong>de</strong> aparezca más cantidad <strong>de</strong> precipitado se<br />
cuantifica el Ag. problema, tubo que correspon<strong>de</strong>, en la gráfica a la zona <strong>de</strong><br />
equivalencia.<br />
PRECIPITACION EN MEDIO SÓLIDO:<br />
Los Ags. y los Acs. pue<strong>de</strong>n incorporarse a un medio gelificado (sólido) don<strong>de</strong><br />
podrán difundir. En el lugar don<strong>de</strong> se encuentren en sus proporciones óptimas<br />
aparecerá una línea <strong>de</strong> precipitado.<br />
Se utiliza, fundamentalmente, para el estudio <strong>de</strong> Ags, disponiendo <strong>de</strong> Acs<br />
a<strong>de</strong>cuados. Cada unión Ag.- Ac. da una línea <strong>de</strong> precipitado diferente e<br />
in<strong>de</strong>pendiente.<br />
Se pue<strong>de</strong>n hacer las pruebas <strong>de</strong> una manera cualitativa o cuantitativa. Las más<br />
importantes son:<br />
A) INMUNODIFUSIÓN SIMPLE EN TUBO (MÉTODO DE OUDIN):<br />
1. El Ac., específico <strong>de</strong>l Ag. que buscamos, se incorpora al agar fundido a 45ºC.<br />
Se introduce en tubos <strong>de</strong> pequeño diámetro<br />
don<strong>de</strong> solidifica.<br />
2. Se <strong>de</strong>posita encima una solución a<strong>de</strong>cuada<br />
<strong>de</strong>l Ag..<br />
3. El Ag. difun<strong>de</strong> a traves <strong>de</strong>l agar encontrandose<br />
con el Ac., que está repartido por todo el medio.<br />
En la zona don<strong>de</strong> el Ag. y el Ac. se encuentren<br />
en las proporciones a<strong>de</strong>cuadas aparecerá una<br />
línea <strong>de</strong> precipitado.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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Es una prueba cualitativa.<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
B) INMUNODIFUSIÓN RADIAL SIMPLE (MÉTODO DE MANCINI):<br />
Es una prueba cuantitativa. Las etapas son:<br />
1. Se incorpora el Ac., específico <strong>de</strong>l Ag. que buscamos, al agar<br />
fundido, que se <strong>de</strong>posita en placas <strong>de</strong> Petri o en láminas <strong>de</strong> vidrio.<br />
Una vez solidificado, se realiza sobre el agar diferentes pocillos.<br />
2. Se aña<strong>de</strong>n a los pocillos el Ag. a <strong>de</strong>terminar. Se añadirán varios<br />
Standard y las muestras problemas. El Ag. difundirá por el medio<br />
sólido.<br />
3. Don<strong>de</strong> se encuentren el Ac. (que está repartido por todo el medio)<br />
y el Ag. en las proporciones a<strong>de</strong>cuadas se producirá una línea <strong>de</strong><br />
precipitado circular (anillo <strong>de</strong> precipitado).<br />
El diámetro <strong>de</strong>l anillo, su cuadrado, será<br />
proporcional a la cantidad <strong>de</strong> Ag. presente<br />
en cada pocillo.<br />
Se hará una curva <strong>de</strong> referencia con los<br />
Standards. En el eje <strong>de</strong> abcisa pondremos<br />
el cuadrado <strong>de</strong>l diámetro <strong>de</strong> los anillos, y<br />
en el eje <strong>de</strong> or<strong>de</strong>nadas la concentración<br />
<strong>de</strong>l Ag. Una vez hecha la curva se calcula<br />
la concentración <strong>de</strong> Ag. <strong>de</strong> la muestra problema.<br />
Se usa para cuantificar las diferentes proteínas plasmáticas.<br />
C) INMUNODIFUSIÓN RADIAL DOBLE (MÉTODO DE OUCHTERLONY):<br />
Este método cualitativo se realiza tambien en placa, pero a diferencia <strong>de</strong>l<br />
anterior, don<strong>de</strong> solo se <strong>de</strong>splazaba el Ag., se <strong>de</strong>splazan tanto el Ag. como el Ac.<br />
en el medio soporte (agar).<br />
1. Añadir a una placa o lámina <strong>de</strong> vidrio una capa <strong>de</strong> agar virgen fundido.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Una vez solidificado se le hacen 2 pocillos a<strong>de</strong>cuadamente separados,<br />
uno para el Ac. y otro para elAg.<br />
2. El Ag. y el Ac. difun<strong>de</strong>n radialmente en el seno <strong>de</strong>l agar. Don<strong>de</strong> se<br />
encuentren en las proporciones a<strong>de</strong>cuadas se formará una línea <strong>de</strong><br />
precipitado.<br />
La precipitación se produce en el punto <strong>de</strong> equivalencia Ag.- Ac.<br />
La posición y forma <strong>de</strong> la línea <strong>de</strong> precipitado están dictadas por la<br />
concentración y el ta-maño <strong>de</strong>l Ag. y <strong>de</strong>l Ac.. La línea estará mas cerca <strong>de</strong>l<br />
pocillo con el reactante <strong>de</strong> menor concentración, ya que la distancia recorrida es<br />
directamente proporcional a la concentración. Se suele utilizar para la <strong>de</strong>tección<br />
<strong>de</strong> infecciones por Candidas y Aspergillus.<br />
D) ELECTROINMUNODIFUSIÓN SIMPLE O INMUNOELECTROFORESIS EN<br />
COHETE (ROCKET):<br />
Este método se basa en la aplicación <strong>de</strong> la<br />
corriente eléctrica a la inmunodifusión simple,<br />
obteniéndose resultados que también se<br />
pue<strong>de</strong>n cuantificar.<br />
Un medio gelificado que contenga Acs. se<br />
introduce en un campo eléctrico, perpendicularmente<br />
al sentido <strong>de</strong> la corriente eléctrica<br />
se disponen pocillos que contienen las<br />
muestras problemas y los Standards. La<br />
difusión electroforética <strong>de</strong>l Ag. a través <strong>de</strong>l gel que contiene el Ac. permite la<br />
aparición <strong>de</strong> líneas <strong>de</strong> precipitado en forma <strong>de</strong> conos o cohetes.<br />
La distancia entre el pocillo y la punta <strong>de</strong>l cono (altura <strong>de</strong>l cohete) esm<br />
directamente proporcional al logaritmo <strong>de</strong> la concentración <strong>de</strong> Ag. que haya en la<br />
muestra.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
E) ELECTROINMUNODIFUSIÓN DOBLE<br />
El Ac. y el Ag. se colocan en pocillos próximos, como en una inmunodifusión<br />
doble. A continuación se aplica una<br />
corriente eléctrica <strong>de</strong> tal forma que el Ag.<br />
vaya a encontrarse con el Ac.<br />
Si se utiliza un pH óptimo (8) y un bajo<br />
voltaje permite que el Ac se <strong>de</strong>splace<br />
linealmente hacia el cátodo arrastrado por<br />
la fuerza endosmótica, en una dirección<br />
contraria a la corriente eléctrica,<br />
encontrándose con el Ag. que migra hacia<br />
el ánodo arrastrado por la fuerza eléctrica.<br />
En la zona don<strong>de</strong> el Ag. y el Ac. se encuentren en las proporciones optimas se<br />
formará una línea <strong>de</strong> precipitado.<br />
Es un método cualitativo muy rápido y más sensible que la inmunodifusión radial<br />
doble.<br />
F) INMUNOELECTROFORESIS:<br />
Es un procedimiento que se utiliza para i<strong>de</strong>ntificar diferentes Ags. <strong>de</strong> una<br />
muestra.<br />
Esta técnica consta <strong>de</strong> 2 fases:<br />
1º.- Electroforesis: Separación <strong>de</strong> los diferentes componentes (Ags.) <strong>de</strong> una<br />
muestra a estudiar, por su migración diferencial cuando se somete la muestra a<br />
un campo eléctrico. La diferente velocidad <strong>de</strong> migración <strong>de</strong>pen<strong>de</strong>rá <strong>de</strong> la carga<br />
<strong>de</strong> la partícula, pH <strong>de</strong>l tampón, fuerza iónica <strong>de</strong>l tampón, tamaño y forma <strong>de</strong> la<br />
partícula y el potencial <strong>de</strong>l campo eléctrico aplicado.<br />
2º.- Inmunodifusión: Los Ags separados se enfrentarán a sus Acs. específicos en<br />
el mismo medio soporte don<strong>de</strong> se han separado. Difundirán ambos; don<strong>de</strong> se<br />
encuentren en las proporciones optimas, se formarán tantas líneas <strong>de</strong><br />
precipitado como uniones Ag.-Ac. haya.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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Pasos a seguir:<br />
TEMARIO DE T.E.L.<br />
1. Colocar la muestra en un medio soporte<br />
y separarla electroforéticamente.<br />
2. Colocar los Acs., específicos <strong>de</strong> los Ags.<br />
buscados, paralelamente al eje <strong>de</strong><br />
migra-ción <strong>de</strong> los Ags.<br />
3. Difusión <strong>de</strong> los Ags. y los Acs. Don<strong>de</strong> se<br />
encuentren en las proporciones óptimas<br />
se formarán las líneas <strong>de</strong> precipitado,<br />
que revelarán la presencia <strong>de</strong> los Ags<br />
buscados.<br />
Se usa esta técnica, sobre todo, para<br />
i<strong>de</strong>ntificar anomalías cualitativas <strong>de</strong><br />
proteínas específicas o para analizar la<br />
composición <strong>de</strong> una mezcla <strong>de</strong> proteínas en líquidos biológicos.<br />
G) INMUNOELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL:<br />
Este método se utiliza como técnica <strong>de</strong> investigación para la separación analítica<br />
<strong>de</strong> Ags. estrechamente relacionados, con propieda<strong>de</strong>s electroforéticas afines<br />
(variantes genéticas <strong>de</strong> algunas proteínas, heterogeneidad <strong>de</strong>l factor VIII <strong>de</strong><br />
coagulación etc.).<br />
Este procedimiento se realiza en 2 etapas y en ambas se emplea la<br />
electroforesis.<br />
1. La mezcla <strong>de</strong> Ags., normalmente suero, orina, LCR, se somete a<br />
electroforesis en agarosa para separar sus componentes según su<br />
carga.<br />
2. La tira <strong>de</strong> agarosa que contiene las proteínas separadas se transfiere a<br />
una placa <strong>de</strong> soporte mayor. Sobre esta se vierte agarosa líquida que<br />
llevará disuelta Acs. contra todos los Ags. a analizar, haciendo contacto<br />
en un extremo con la tira <strong>de</strong> agarosa que contienen los Ags.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
3. Una vez solidificada la agarosa que contiene los Acs. se aplica una<br />
corriente eléctrica en dirección perpendicular a la primera separación<br />
electroforética a fin <strong>de</strong> que los Ags. migren hacia la agarosa que contiene<br />
los Acs. Se obtienen <strong>de</strong> esta forma unos arcos <strong>de</strong> precipitado nítidos, en<br />
forma <strong>de</strong> picos.<br />
REACCIONES DE AGLUTINACIÓN<br />
Es una reacción serológica que compren<strong>de</strong> la agregación <strong>de</strong> una suspensión <strong>de</strong><br />
Ags particulados cuando se unen a sus Acs. específicos. Es un método<br />
secundario ya que primero se une el Ag. y el Ac. que van formando agregados,<br />
estos empiezan a aumentar y finalmente se <strong>de</strong>positan.<br />
Cuando los Ags. que intervienen en la reacción son particulados "per se" la<br />
reacción se llama: aglutinación directa o activa. Como ejemplos <strong>de</strong> estos Ags.<br />
están las bacterias y los hematíes.<br />
Cuando los Ags., para que se produzca la reacción <strong>de</strong> aglutinación, tienen que<br />
ser acoplados a la superficie <strong>de</strong> células o partículas inertes (látex, bentonita...) la<br />
reacción se llama: aglutinación indirecta o pasiva.<br />
Cuando un Ac. se une a su Ag. particulado específico y se produce la<br />
aglutinación, se llama: Anticuerpo completo.<br />
Cuando un Ac. se une a su Ag. específico particulado y no se produce<br />
aglutinación se llama: Anticuerpo incompleto.<br />
Características <strong>de</strong> las reacciones <strong>de</strong> aglutinación:<br />
o Son bastantes sensibles, ya que <strong>de</strong>tectan cantida<strong>de</strong>s<br />
pequeñas <strong>de</strong> Ag. o Ac.<br />
o Son menos específicas que las reacciones <strong>de</strong> precipitación.<br />
o Son métodos cualitativos o semicuantitativos.<br />
o Son pruebas muy útiles, ya que se pue<strong>de</strong> acoplar el Ag. o el<br />
Ac. <strong>de</strong>seado a una partícula y así <strong>de</strong>tectar su Ac. o Ag.<br />
específico.<br />
o Se pue<strong>de</strong>n observar a simple vista.<br />
Factores que influyen en la reacción <strong>de</strong> aglutinación:<br />
* Carga <strong>de</strong> las partículas: Las partículas poseen en suspensión una carga<br />
superficial negativa (potencial zeta) repeliéndose entre ellas. La unión con el Ac.<br />
ayuda a establecer puentes <strong>de</strong> unión entre las diferentes partículas<br />
produciéndose la aglutinación. Algunas veces no es suficiente y habrá que<br />
emplear diferentes sistemas para disminuir el potencial zeta. Uno <strong>de</strong> ellos es<br />
aumentar la viscosidad añadiendo sustancias como la albúmina. Otro es el<br />
tratamiento con enzimas proteolíticas cuando las partículas son hematíes.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Tambien el buffer empleado pue<strong>de</strong> disminuir las cargas (-) superficiales <strong>de</strong> las<br />
partículas.<br />
* Tipo <strong>de</strong> anticuerpo: Las Inmunoglobulinas <strong>de</strong>l tipo Ig.M, <strong>de</strong>bido a su tamaño,<br />
siempre van a aglutinar. Las <strong>de</strong>l tipo Ig.G podrán aglutinar o no <strong>de</strong>pendiendo <strong>de</strong><br />
la subclase o <strong>de</strong> otros factores. En caso <strong>de</strong> no aglutinar se llamarían Acs.<br />
incompletos.<br />
* Concentración <strong>de</strong> electrolitos: Ya hemos comentado la influencia <strong>de</strong>l buffer<br />
en las cargas (-) superficiales <strong>de</strong> las partículas. Para una mejor aglutinación será<br />
conveniente que la fuerza iónica <strong>de</strong>l buffer sea lo mas baja posible.<br />
* pH: Debe ser el mas próximo al fisiológico.<br />
* Viscosidad: Cuanto mas viscoso sea el medio mejor se produce la reacción <strong>de</strong><br />
aglutinación. Esto se pue<strong>de</strong> conseguir añadiendo sustancias como la albúmina o<br />
el <strong>de</strong>xtrano.<br />
* Antígenos: Un Ag. con un solo <strong>de</strong>terminante antigénico nunca podrá aglutinar.<br />
Cuantos más <strong>de</strong>terminantes antigénicos posea un Ag. la aglutinación se<br />
producirá mejor.<br />
* Temperatura y tiempo <strong>de</strong> incubación: La temperatura <strong>de</strong>be ser lo mas<br />
próxima a la fisiológica, aunque hay algunos casos en que la tª optima es 4º C.<br />
El tiempo <strong>de</strong> incubación será el mayor posible.<br />
* Agitación: Las técnicas que facilitan el contacto Ag. -Ac. como la agitación o la<br />
centrifugación facilitan la aglutinación.<br />
Tipos <strong>de</strong> reacciones <strong>de</strong> aglutinacion:<br />
A) AGLUTINACION DIRECTA:<br />
Se produce cuando se unen el Ac. y su Ag. específico particulado "per se", es<br />
<strong>de</strong>cir <strong>de</strong> forma natural.<br />
Se pue<strong>de</strong> utilizar esta reacción <strong>de</strong> manera cualitativa o cuantitativa.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
a) Cualitativa: Se realiza en un portaobjetos o en un tubo, enfrentando un Ac. a<br />
una suspensión <strong>de</strong> Ags., <strong>de</strong> los que uno <strong>de</strong> ellos es <strong>de</strong>sconocido. Tras una breve<br />
agitación se observa si hay aglutinación. Es una reacción <strong>de</strong> uso común para la<br />
i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> bacterias y la <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> grupos sanguíneos.<br />
b) Cuantitativa: Nos permite una estimación aproximada <strong>de</strong> los Acs. presentes<br />
en el suero, mediante la <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong>l título <strong>de</strong> Ac. Esta técnica <strong>de</strong> utiliza<br />
habitualmente para el diagnóstico serológico <strong>de</strong> las infecciones por Brucella y<br />
Salmonella. Hay que tener en cuenta el efecto zona, es <strong>de</strong>cir, cuando hay un<br />
exceso <strong>de</strong> Acs. en el suero problema se pue<strong>de</strong> solubilizar el aglutinado. Esto se<br />
evitará empleando una batería amplia <strong>de</strong> tubos.<br />
B) AGLUTINACION INDIRECTA:<br />
Es la reacción <strong>de</strong> los Acs. con sus Ags. específicos solubles pero que han sido<br />
acoplados a la superficie <strong>de</strong> partículas. Se usan con frecuencia eritrocitos,<br />
humanos o no, bacterias, partículas inertes como látex o bentonita.<br />
Así un Ag. soluble al adsorberse en<br />
una partícula convierte la reacción<br />
Ag.-Ac. <strong>de</strong> precipitación a<br />
aglutinación, incrementándose<br />
enormemente la sensibilidad <strong>de</strong> la<br />
prueba. Son más sensibles las<br />
pruebas que usan como partículas<br />
portadoras <strong>de</strong> Ags. los eritrocitos<br />
que las que usan látex o bentonita.<br />
También se pue<strong>de</strong> utilizar esta<br />
reacción <strong>de</strong> manera cualitativa o<br />
cuantitativa.<br />
Para <strong>de</strong>tectar antígenos solubles se utiliza una variación <strong>de</strong> esta técnica, la<br />
aglutinación indirecta inversa, en la que en lugar <strong>de</strong> acoplar el antígeno a la<br />
+partícula acoplamos el anticuerpo específico <strong>de</strong>l antígeno buscado.<br />
Esta técnica es la más utilizada en serología, por su bajo coste, su rapi<strong>de</strong>z y su<br />
buena sensibilidad. Tiene el inconveniente <strong>de</strong> ser poco específica, por lo que<br />
ofrecerá falsos positivos. Pruebas típicas basadas en este método son: las<br />
pruebas reumáticas (Proteína C reactiva, Factores reumatoi<strong>de</strong>s, Waale- Rose,<br />
Singer-plotz, Antiestreptolisina), la RPR, la VDRL y la TPHA, que se usan en el<br />
diagnóstico <strong>de</strong> la sífilis, la <strong>de</strong>l látex Criptococo etc.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
C) INHIBICION DE LA AGLUTINACION:<br />
Los Acs. reconocen y reaccionan con sus Ags. específicos. Pue<strong>de</strong> suce<strong>de</strong>r que<br />
en la muestra problema el Ag. esté en forma soluble (no unido a una partícula)<br />
por lo que se producirá la reacción Ag.-Ac. pero no se observará la aglutinación.<br />
Esta prueba es una adaptación <strong>de</strong> las reacciones <strong>de</strong> aglutinación que nos<br />
permite la <strong>de</strong>tección y cuantificación <strong>de</strong> los Ags. solubles.<br />
La prueba se realiza en varias etapas:<br />
1. Se aña<strong>de</strong> a la muestra problema (Ag. soluble buscado) el Ac. específico <strong>de</strong>l<br />
Ag. buscado. Si no se produce aglutinación pue<strong>de</strong> <strong>de</strong>berse a 2 causas:<br />
a) Que no exista el Ag. buscado:<br />
b) Que exista el Ag. buscado, pero que esté en forma soluble:<br />
Para saber si existe el Ag. en forma soluble o no existe el Ag. buscado, se hace<br />
la 2ª etapa:<br />
2. Se aña<strong>de</strong> a la mezcla anterior partículas recubiertas con el Ag. buscado en la<br />
muestra problema. Pue<strong>de</strong> ocurrir:<br />
a) Que se produzca una aglutinación:<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L.<br />
Esto significa que no existe el Ag. buscado, ya que los lugares <strong>de</strong> unión <strong>de</strong>l Ac.<br />
añadido en la 1ª etapa (específico <strong>de</strong>l Ag. buscado) estaban libres y han<br />
reaccionado en la 2ª etapa con las partículas añadidas que tenían el Ag.<br />
recubriéndolas.<br />
b) Que no se produzca la aglutinación:<br />
Esto significa que existe el Ag. soluble que estamos buscando, ya que los<br />
lugares <strong>de</strong> unión <strong>de</strong>l Ac. añadido en la 1ª etapa (específico <strong>de</strong>l Ag. buscado)<br />
estaban ocupados por el Ag <strong>de</strong> la muestra problema y por tanto no ha podido<br />
reaccionar, el Ac añadido, con el Ag. particulado añadido en la 2ª etapa.<br />
Esta prueba, <strong>de</strong> inhibición <strong>de</strong> la aglutinación también se pue<strong>de</strong> realizar<br />
cuantitativamente. Para ello utilizaremos diferentes diluciones <strong>de</strong> la muestra<br />
problema.<br />
Una aplicación <strong>de</strong> esta prueba es el diagnóstico <strong>de</strong>l embarazo, en el que se<br />
<strong>de</strong>tecta la hormona GCh, antígeno soluble.<br />
D) TEST DE COOMBS O ANTICUERPOS NO AGLUTINANTES:<br />
Algunos tipos <strong>de</strong> IgG pue<strong>de</strong>n unirse a los Ags. fijados a las partículas, pero no<br />
aglutinarlos. Son los llamados Acs. incompletos.<br />
Esta prueba <strong>de</strong>tecta estos Acs. no aglutinantes mediante la adición <strong>de</strong><br />
antiglobulinas-IgG (antiinmunoglobulinas), que ayudarán a formar puentes <strong>de</strong><br />
unión entre las partículas.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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Hay 2 tipos <strong>de</strong> pruebas:<br />
a) Prueba <strong>de</strong> coombs directa:<br />
TEMARIO DE T.E.L<br />
Ayuda a <strong>de</strong>tectar Acs. unidos a partículas. Ej. los hematíes en el recién nacido<br />
con enfermedad hemolítica por incompatibilidad Rh están sensibilizados por Acs.<br />
no aglutinantes (IgG materna). La adición <strong>de</strong> antiglobulinas humanas permite el<br />
establecimiento <strong>de</strong> puentes entre los hematíes a través <strong>de</strong>l Ac. anti-IgG y hace<br />
posible la aglutinación.<br />
b)- Prueba <strong>de</strong> coombs indirecta:<br />
Detecta Acs. no aglutinantes libres en el suero. Se realiza e 2 fases:<br />
a) Se aña<strong>de</strong> a la muestra problema (Ac. no aglutinante buscado) Ags.<br />
específicos particulados. No se producirá la aglutinación<br />
b) Se aña<strong>de</strong> antiglobulinas (anti-IgG) a la mezcla anterior. Las antiglobulinas se<br />
unirán a los Acs.no aglutinantes fijados y provocarán la aglutinación <strong>de</strong> las<br />
partículas.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
Se usa esta prueba para el diagnóstico serológico <strong>de</strong> la brucelosis crónica.<br />
También para <strong>de</strong>tectar los Acs. no aglutinantes maternos en el caso <strong>de</strong><br />
incompatibilidad Rh.<br />
REACCIONES CON INTERVENCION DEL COMPLEMENTO<br />
Son procedimientos muy sensibles, pero actualmente han sido superados por el<br />
RIA, el IF. y el ELISA. Todavía hay técnicas, que usan la fijación <strong>de</strong>l<br />
complemento para el diagnóstico <strong>de</strong> enfermeda<strong>de</strong>s fúngicas, víricas y<br />
parasitarias.<br />
El término COMPLEMENTO se usa para <strong>de</strong>signar una serie <strong>de</strong> proteínas<br />
plasmáticas, cerca <strong>de</strong> 20, que son activadas en secuencia (en cascada) <strong>de</strong>spués<br />
<strong>de</strong> producirse la reacción Ag.-Ac. La primera proteína <strong>de</strong>l complemento que se<br />
activa se une a un sitio <strong>de</strong>l interior <strong>de</strong>l Ac. que seria inaccesible si el Ac. no ha<br />
reaccionado con el Ag. Después <strong>de</strong> esta reacción hay cambios conformacionales<br />
en la molécula <strong>de</strong>l Ac. <strong>de</strong> tal manera que hace que la región <strong>de</strong> articulación se<br />
abra quedando expuesta al sitio <strong>de</strong> fijación <strong>de</strong>l complemento.<br />
Las proteínas <strong>de</strong>l complemento tienen la capacidad <strong>de</strong> lisar las células cuando la<br />
reacción Ag-Ac. se produce con Ags. situados en las superficies celulares.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
PRUEBAS DE FIJACION DEL COMPLEMENTO:<br />
Se pue<strong>de</strong>n utilizar, como todas las pruebas serológicas, para <strong>de</strong>tectar Ags. o<br />
Acs. Se basan en que los complejos Ag.-Ac. formados al fijar el complemento<br />
impi<strong>de</strong>n la hemólisis que ese mismo complemento produciría sobre un sistema<br />
hemolítico incompleto ( hematíes (Ag.)- Acs. hemolíticos.).<br />
La prueba se realiza en 2 etapas:<br />
1º.- Se pone en contacto el Ag. y el Ac., <strong>de</strong> los cuales uno es conocido y el otro<br />
no, en presencia <strong>de</strong> complemento.<br />
2º.- Se investiga la presencia <strong>de</strong> complemento libre por la adición <strong>de</strong> un sistema<br />
hemolítico incompleto (hematíes + hemolisinas) Podremos observar 2<br />
resultados:<br />
a) Que exista el Ag. o el Ac. buscado:<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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) Que no exista el Ag. o el Ac. buscado:<br />
TEMARIO DE T.E.L<br />
INMUNOTURBIDIMETRIA Y INMUNONEFELOMETRIA<br />
Cuando un haz <strong>de</strong> luz choca con una partícula en suspensión, sufre una serie <strong>de</strong><br />
fenómenos, parte <strong>de</strong> la luz es transmitida, parte absorbida, parte reflejada, y por<br />
último parte es dispersada.<br />
INMUNOTURBIDIMETRIA<br />
Esta técnica se basa en la medición <strong>de</strong> la luz que no se ha transmitido a través<br />
<strong>de</strong> una suspensión cuando sobre ésta inci<strong>de</strong> un rayo <strong>de</strong> luz colimado. Es por<br />
tanto la medida <strong>de</strong> la disminución <strong>de</strong> la intensidad <strong>de</strong> la luz inci<strong>de</strong>nte (causada<br />
por dispersión, reflexión y absorción <strong>de</strong> la luz). Se pue<strong>de</strong> medir como %T o como<br />
absorbancia.<br />
Cuando un antígeno y un anticuerpo se unen en un medio líquido, se forman<br />
inmunocomplejos que quedan en suspensión, dando una turbi<strong>de</strong>z al líquido que<br />
es proporcional a la cantidad <strong>de</strong> antígeno o anticuerpo <strong>de</strong> la muestra.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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INMUNONEFELOMETRIA<br />
TEMARIO DE T.E.L<br />
Se basa en la medición <strong>de</strong> la luz dispersada por las partículas <strong>de</strong> una<br />
suspensión cuando sobre ésta inci<strong>de</strong> una luz colimada. Se mi<strong>de</strong> la luz <strong>de</strong>sviada<br />
en un <strong>de</strong>terminado ángulo (<strong>de</strong> 15º A 90º), con respecto a la dirección <strong>de</strong>l rayo<br />
inci<strong>de</strong>nte.<br />
La formación <strong>de</strong> inmunocomplejos antígeno-anticuerpo es capaz <strong>de</strong> dispersar la<br />
luz que atraviesa la solución don<strong>de</strong> se <strong>de</strong>sarrolla la reacción. Por tanto mediante<br />
esta técnica podremos <strong>de</strong>terminar la existencia <strong>de</strong> antígenos o anticuerpos en<br />
una muestra.<br />
REACCIONES DE TRANSFERENCIA O INMUNOBLOTTING<br />
Se basan en la transferencia <strong>de</strong> una sustancia <strong>de</strong>s<strong>de</strong> un gel, don<strong>de</strong> se hayan<br />
separado sus diversos componentes, a un soporte fácilmente manejable.<br />
Las sustancias a estudiar se separan en un gel <strong>de</strong> poliacrilamida mediante la<br />
electroforesis. Una vez separadas todas las sustancias se realiza la<br />
transferencia, por capilaridad o por electroforesis (electrobotting), a una<br />
membrana, generalmente <strong>de</strong> nitrocelulosa. Esta membrana tiene una gran<br />
capacidad para fijar las proteínas. También se pue<strong>de</strong>n bloquear fácilmente los<br />
sitios <strong>de</strong> unión libres.<br />
Las diferentes sustancias que se han transferido se podrán estudiar por<br />
diferentes métodos, fundamentalmente ELISA o RIA, añadiendo a la membrana<br />
los anticuerpos específicos <strong>de</strong> las sustancias a estudiar.<br />
Es una técnica cualitativa y los resultados se observaran en forma <strong>de</strong> unas<br />
bandas correspondientes a cada una <strong>de</strong> las sustancias estudiadas presentes en<br />
la muestra problema. La técnica se llama Western blot<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
Actualmente tiene una gran aplicación como técnica para confirmar la infección<br />
por VIH (SIDA), ya que a una buena sensibilidad, comparable al ELISA, une una<br />
gran especificidad, eliminándose <strong>de</strong> esta forma los falsos positivos. Se haría <strong>de</strong><br />
la siguiente forma:<br />
o Fraccionamiento, mediante electroforesis en un gel <strong>de</strong><br />
poiacrilamida, <strong>de</strong>l virus VIH <strong>de</strong>sorganizado y parcialmente<br />
purificado. Las diferentes proteínas víricas se separarán según su<br />
peso molecular.<br />
o Transferencia a una membrana <strong>de</strong> nitrocelulosa <strong>de</strong> las proteínas<br />
separadas, que actuarán como antígenos.<br />
o Se aña<strong>de</strong> la muestra problema (suero con sospecha <strong>de</strong> tener<br />
anticuerpos contra el VIH) a la membrana anterior. Si existen los<br />
anticuerpos se unirán a sus antígenos correspondientes.<br />
o Se aña<strong>de</strong> antiglobulina conjugada con un marcador que se unirá a<br />
los complejos Ag.-Ac. formados anteriormente.<br />
o Se visualiza según el método empleado (ELISA o RIA)<br />
o Se compara el resultado con un control.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
También se utiliza este método para la <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> ácidos nucleicos. Si<br />
<strong>de</strong>terminamos DNA la técnica se llamará Southern blot, y si es RNA se llamará<br />
Northern blot.<br />
METODOS TERCIARIOS<br />
Están basados en los efectos biológicos que siguen a la unión Ag-Ac. o a las<br />
consecuencias <strong>de</strong>rivadas <strong>de</strong> dicha unión.<br />
Algunos <strong>de</strong> estos efectos son:<br />
a.- Fagocitosis.<br />
b.- Opsonización: preparación <strong>de</strong>l Ag. para ser fagocitado.<br />
c.- Adherencia inmunitaria: facilita la fagocitosis.<br />
d.- Desgranulación celular.<br />
e.- Bacteriolisis.<br />
f.- Inmovilización <strong>de</strong> microorganismos. etc.<br />
Casi todos estos efectos biológicos están basados en la actividad <strong>de</strong>l<br />
complemento.<br />
PRUEBAS MÁS IMPORTANTES:<br />
A) PRUEBAS DE PROTECCIÓN:<br />
Estudian, mediante pruebas "in vivo", los Acs. protectores, que son los<br />
responsables <strong>de</strong> la inmunidad adquirida, y sus Ags. correspondientes. Pue<strong>de</strong>n<br />
ser activas o pasivas:<br />
a) Activas: Sirven para <strong>de</strong>terminar la capacidad vacunante <strong>de</strong> una preparación<br />
antigénica. Para ello se administra ésta a un lote <strong>de</strong> animales y tras un periodo<br />
<strong>de</strong> tiempo (para que pueda fabricar Acs.), se les inocula el germen virulento. La<br />
protección se medirá por la supervivencia <strong>de</strong> los animales.<br />
b) Pasivas: Se usan para medir el po<strong>de</strong>r protector <strong>de</strong> un suero inmune. Para ello<br />
se administra el suero a un lote <strong>de</strong> animales y, tras un periodo <strong>de</strong> tiempo se<br />
inocula el germen virulento. La protección se medirá, al igual que antes por la<br />
supervivencia <strong>de</strong> los animales.<br />
B) PRUEBAS DE NEUTRALIZACIÓN:<br />
Cuando un Ag. se une a su Ac. correspondiente pue<strong>de</strong> per<strong>de</strong>r su capacidad<br />
patógena, tóxica, hormonal, enzimática etc., <strong>de</strong> que está dotado el Ag. Esto se<br />
manifestará por la posterior inoculación <strong>de</strong> la unión Ag.-Ac. a un animal <strong>de</strong><br />
experimentación, a un cultivo, etc. Ejemplo: si unimos una toxina con su<br />
correspondiente antitoxina se neutralizará el efecto tóxico. Esto se <strong>de</strong>muestra<br />
inoculando a un animal <strong>de</strong> experimentación la mezcla.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
C) TEST DE NELSON: Prueba utilizada en el diagnóstico <strong>de</strong> la sífilis.<br />
Entre los métodos 3º también po<strong>de</strong>mos encontrar las pruebas que pue<strong>de</strong>n<br />
ayudarnos a <strong>de</strong>terminar la hipersensibilidad <strong>de</strong> un individuo a diferentes<br />
sustancias como medicamentos, pólenes, productos químicos, polvo <strong>de</strong> la casa,<br />
alimentos etc.<br />
Se entien<strong>de</strong> por hipersensibilidad a la respuesta inmunitaria que causa daño en<br />
el individuo que la produce.<br />
Las pruebas más comunes son:<br />
D) TEST CUTÁNEOS POR INTRADERMOREACCIÓN DEL ALERGENO:<br />
Consiste en inyectar bajo la piel las sustancias a estudiar, como alergenos, y<br />
observar la reacción que se produce al cabo <strong>de</strong> poco tiempo<br />
E) PARCHES CUTANEOS:<br />
Se escarifica la piel y posteriormente se coloca un parche impregnado con la<br />
sustancia a estudiar en la zona escarificada. Tras un periodo <strong>de</strong> tiempo se<br />
observa los resultados.<br />
F) PRUEBAS DE PROVOCACIÓN:<br />
Las sustancias o alergenos se administran por vía natural (inhalación, vía oral<br />
etc.) para provocar la reacción alérgica.<br />
G) TEST DE PRAUSNITZ-KUSTNER O DE ANAFILAXIA CUTÁNEA PASIVA:<br />
El suero <strong>de</strong> un paciente alérgico se inyecta en la piel <strong>de</strong> un individuo sano. A las<br />
24 horas se inocula en el mismo lugar el alergeno. Si existe el Ac., se origina una<br />
reacción alérgica (prurito, eritema, e<strong>de</strong>ma).<br />
H) PRUEBA DE MANTOUX O DE LA TUBERCULINA:<br />
Consiste en inyectar intradérmicamente en el brazo una preparación <strong>de</strong><br />
tuberculina. Tras un periodo <strong>de</strong> 48-72 horas se observará una inflamación en el<br />
lugar <strong>de</strong> la inyección. Se medirá el diámetro <strong>de</strong> la inflamación para dar como (+)<br />
o (-) la prueba.<br />
ESTUDIO DE LAS DIFERENTES POBLACIONES LINFOCITARIAS<br />
En los métodos inmunológicos no solo hay que estudiar la reacción antígenoanticuerpo<br />
y sus consecuencias correspondientes, a veces hay que estudiar las<br />
diferentes células pertenecientes a la inmunidad celular, en concreto los<br />
linfocitos T y B.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
Hay técnicas que permiten el aislamiento <strong>de</strong> los linfocitos <strong>de</strong>l resto <strong>de</strong> los<br />
componentes <strong>de</strong> la sangre. Se basan generalmente en la velocidad <strong>de</strong><br />
sedimentación o en la centrifugación en gradiente <strong>de</strong> <strong>de</strong>nsidad.<br />
También hay métodos que permite la i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> las diferente<br />
subpoblaciones linfocitarias como la prueba <strong>de</strong> la formación <strong>de</strong> rosetas E. Se<br />
basa en la capacidad que tienen los linfocitos T <strong>de</strong> formar rosetas <strong>de</strong> manera<br />
espontánea con los glóbulos rojos <strong>de</strong> carnero, sin la intervención <strong>de</strong><br />
inmunoglobulinas.<br />
En algunas ocasiones hay que <strong>de</strong>terminar la capacidad funcional <strong>de</strong> los<br />
linfocitos, parámetro más a<strong>de</strong>cuado para valorar el estado inmunológico <strong>de</strong>l<br />
individuo que su cantidad. Se valora la capacidad <strong>de</strong> producción <strong>de</strong> anticuerpos,<br />
la respuesta a los mitógenos etc. Entre las técnicas más importantes están: la<br />
transformación linfoblástica, el cultivo mixto <strong>de</strong> linfocitos, y la proliferación <strong>de</strong><br />
linfocitos frente a diversas sustancias, como por ejemplo las lecitinas vegetales.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
TEMA 12.- ESTUDIOS DE<br />
PATERNIDAD POR ADN.<br />
¿Cómo se hace un estudio <strong>de</strong> paternidad por<br />
ADN?<br />
La molécula <strong>de</strong> ADN (ácido <strong>de</strong>soxirribonucleico) es la portadora <strong>de</strong> toda la<br />
información genética que pasa <strong>de</strong> una generación a la siguiente y contiene<br />
todas las instrucciones necesarias para la formación <strong>de</strong> un organismo nuevo, así<br />
como para el control <strong>de</strong> todas las activida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> las células durante el tiempo <strong>de</strong><br />
vida <strong>de</strong>l organismo. Está presente en todos los organismos vivos <strong>de</strong>s<strong>de</strong> virus<br />
y bacterias hasta plantas y animales.<br />
En organismos superiores el ADN es único para cada individuo <strong>de</strong> cada<br />
especie e invariable durante el periodo <strong>de</strong> vida <strong>de</strong>l organismo. Esta característica<br />
es lo que se conoce como "huella genética" y es la base <strong>de</strong> los estudios <strong>de</strong><br />
i<strong>de</strong>ntificación genética <strong>de</strong> individuos.<br />
Salvo unas pocas excepciones (glóbulos rojos en mamíferos, etc.), todas las<br />
células <strong>de</strong> un organismo vivo tienen ADN. Gracias a ello es posible extraer el<br />
ADN a partir <strong>de</strong> cualquier muestra biológica (sangre, pelo, semen, huesos<br />
etc.) e incluso a partir <strong>de</strong> muestras <strong>de</strong>gradadas.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
Mediante la técnica <strong>de</strong>l PCR o "reacción en ca<strong>de</strong>na<br />
<strong>de</strong> la polimerasa", es posible amplificar la molécula<br />
<strong>de</strong> ADN <strong>de</strong> forma exponencial en el laboratorio. Para<br />
realizar un análisis genético se necesita muy poca<br />
cantidad <strong>de</strong> muestra ya que a partir <strong>de</strong> una simple<br />
molécula <strong>de</strong> ADN se pue<strong>de</strong>n obtener millones <strong>de</strong><br />
copias.<br />
Des<strong>de</strong> un punto <strong>de</strong> vista estructural, el ADN está<br />
formado por una sucesión <strong>de</strong> moléculas simples<br />
llamadas nucleótidos, compuestos por un azúcar<br />
(<strong>de</strong>soxirribosa), un grupo fosfato y una base<br />
nitrogenada, que pue<strong>de</strong> ser púrica (A<strong>de</strong>nina o<br />
Guanina) o pirimidímica (Citosina o Timina). Los<br />
nucleótidos aparecen unidos entre sí mediante<br />
enlaces químicos <strong>de</strong> forma específica (una a<strong>de</strong>nina<br />
siempre se aparea con una timina y una citosina con<br />
una guanina) creando una hebra <strong>de</strong> longitud variable.<br />
La naturaleza física <strong>de</strong> estas moléculas hace que dos<br />
hebras se asocien <strong>de</strong> forma complementaria<br />
formando una doble ca<strong>de</strong>na helicoidal. Mediante el<br />
proceso <strong>de</strong> secuenciación, y empleando unos<br />
aparatos muy sofisticados llamados secuenciadores<br />
automáticos, es posible conocer la secuencia exacta<br />
<strong>de</strong> nucleótidos que forman cada molécula <strong>de</strong> ADN.<br />
Dentro <strong>de</strong> las células el ADN sufre un proceso <strong>de</strong><br />
plegamiento y empaquetamiento dando lugar a los<br />
cromosomas. Los humanos poseen 46 cromosomas, 23<br />
proce<strong>de</strong>ntes <strong>de</strong> la madre y 23 proce<strong>de</strong>ntes <strong>de</strong>l padre.<br />
Esta es la base <strong>de</strong> los análisis <strong>de</strong> paternidad ya que<br />
estudiando una serie <strong>de</strong> marcadores genéticos situados<br />
en los diferentes cromosomas (los STRs o "secuencias<br />
cortas repetidas en tan<strong>de</strong>m") es posible <strong>de</strong>terminar <strong>de</strong><br />
forma inequívoca la paternidad <strong>de</strong> un individuo.<br />
La molécula <strong>de</strong> ADN tiene una gran estabilidad lo que<br />
facilita su transporte y almacenamiento. Así, es posible<br />
mantener congeladas muestras <strong>de</strong> ADN durante mucho<br />
tiempo para realizar con ellas estudios genéticos<br />
posteriores.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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UN POCO DE HISTORIA<br />
TEMARIO DE T.E.L<br />
La <strong>de</strong>mostración por parte <strong>de</strong> Avery y colaboradores en la década <strong>de</strong> los 40 <strong>de</strong><br />
la existencia <strong>de</strong>l DNA como la estructura sobre la que recae toda la información<br />
genética y el posterior <strong>de</strong>scubrimiento en los años 50 <strong>de</strong> la estructura <strong>de</strong> doble<br />
hélice <strong>de</strong>l DNA por Watson y Crick (pulse aquí para ver una copia <strong>de</strong>l trabajo<br />
original <strong>de</strong> Watson y Crick), dieron lugar a toda una serie <strong>de</strong> trabajos<br />
experimentales en las décadas <strong>de</strong> los años 60 y 70 encaminados a la<br />
elucidación <strong>de</strong> las claves <strong>de</strong> la codificación genética que nos han conducido a la<br />
revolución científica que se vive actualmente en el campo <strong>de</strong> la genética y la<br />
biología molecular.<br />
Posteriormente, el <strong>de</strong>scubrimiento <strong>de</strong> la "reacción en ca<strong>de</strong>na <strong>de</strong> la polimerasa"<br />
(PCR) por K. Mullis en 1987 permitió la amplificación in vitro <strong>de</strong> fragmentos <strong>de</strong><br />
DNA <strong>de</strong> interés, abriendo todo un nuevo abanico <strong>de</strong> posibilida<strong>de</strong>s en la<br />
manipulación <strong>de</strong>l DNA que se completó posteriormente en los años 90 con el<br />
<strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> la secuenciación automática <strong>de</strong> DNA por el método <strong>de</strong> Sanger<br />
con reactivos fluorescentes en lugar <strong>de</strong> radiactivos, permitiendo conocer<br />
exactamente el or<strong>de</strong>n <strong>de</strong> los nucleótidos en la secuencia <strong>de</strong>l fragmento <strong>de</strong> DNA<br />
en cuestión. En la actualidad, las técnicas <strong>de</strong> PCR y <strong>de</strong> secuenciación<br />
automática <strong>de</strong> DNA son totalmente rutinarias en la mayoría <strong>de</strong> los laboratorios <strong>de</strong><br />
Bioquímica y Biología Molecular.<br />
En fechas recientes, el inicio <strong>de</strong>l <strong>de</strong>nominado Proyecto Genoma Humano por<br />
parte <strong>de</strong> diferentes laboratorios <strong>de</strong> todo el mundo, está permitiendo la or<strong>de</strong>nación<br />
y asignamiento <strong>de</strong> diferentes segmentos <strong>de</strong> DNA a localizaciones conocidas<br />
<strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> los cromosomas, lo que está facilitando el <strong>de</strong>scubrimiento continuo <strong>de</strong><br />
los <strong>de</strong>nominados marcadores genéticos, localizaciones físicas y perfectamente<br />
i<strong>de</strong>ntificables en un cromosoma cuyo paso hereditario <strong>de</strong> generación en<br />
generación pue<strong>de</strong> ser monitorizado. Estos marcadores genéticos pue<strong>de</strong>n ser<br />
regiones <strong>de</strong> DNA que se expresan en forma <strong>de</strong> proteínas, o segmentos <strong>de</strong> DNA<br />
sin función codificante pero con un patrón hereditario que pue<strong>de</strong> ser<br />
<strong>de</strong>terminado.<br />
El PCR permite la amplificación específica <strong>de</strong> una secuencia requerida <strong>de</strong> DNA<br />
cientos <strong>de</strong> millones <strong>de</strong> veces en un tiempo <strong>de</strong> pocas horas, in<strong>de</strong>pendientemente<br />
<strong>de</strong> su origen (virus, bacterias, plantas, animales o humanos). Esta técnica es<br />
especialmente valiosa y prácticamente insustituible teniendo en cuenta su alta<br />
especificidad, fácil automatización y alta capacidad para amplificar insignificantes<br />
cantida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> muestra <strong>de</strong> DNA. El PCR también pue<strong>de</strong> ser utilizado para<br />
<strong>de</strong>tectar la existencia <strong>de</strong> una secuencia <strong>de</strong>finida en una muestra <strong>de</strong> DNA.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
Durante mucho tiempo la aplicación <strong>de</strong> estas técnicas <strong>de</strong> Bioquímica y Biología<br />
Molecular han estado prácticamente restringidas al ámbito académico e<br />
investigador. Sin embargo, en los últimos años estas técnicas se están<br />
convirtiendo en una herramienta fundamental e imprescindible en muchas áreas<br />
como la biomedicina, biología forense, agricultura, gana<strong>de</strong>ría, tecnología <strong>de</strong><br />
alimentos, etc. Como ejemplo, en biología forense, la utilización <strong>de</strong> PCR es<br />
prácticamente insustituible <strong>de</strong>bido a que las características ambientales, <strong>de</strong><br />
almacenamiento, etc. <strong>de</strong> las muestras, pue<strong>de</strong>n llevar a la <strong>de</strong>gradación <strong>de</strong>l DNA y<br />
llegar a impedir la utilización <strong>de</strong> otras técnicas alternativas. En países como<br />
Estados Unidos o el Reino Unido, la aplicación <strong>de</strong> este tipo <strong>de</strong> técnicas se lleva a<br />
cabo <strong>de</strong> forma continua y rutinaria en diversos campos <strong>de</strong> la ciencia. Sin<br />
embargo, en España es un campo nuevo y <strong>de</strong> reciente implantación.<br />
Extracción <strong>de</strong>l ADN:<br />
La muestra biológica (sangre, uñas, hisopados o cualquier otro tejido que<br />
contenga células humanas con núcleo) se somete a la acción <strong>de</strong> <strong>de</strong>tergentes,<br />
que disuelven los lípidos; y enzimas proteolíticas, que cortan las proteínas.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 166 <strong>de</strong> 287<br />
Luego <strong>de</strong> incubar la mezcla una<br />
noche a 60 grados centígrados, se<br />
produce la ruptura <strong>de</strong> la estructura<br />
celular liberando todo su<br />
contenido a la solución.<br />
La mezcla se limpia mediante<br />
sucesivos lavados con solventes<br />
orgánicos (fenol, cloroformo), que<br />
coagulan proteínas y extraen los<br />
lípidos, y finalmente el ADN se<br />
separa por precipitación con<br />
alcohol en medio salino.<br />
Eventualmente, en los casos <strong>de</strong> manchas antiguas o huesos, se realizan<br />
purificaciones posteriores por diálisis o adsorción a soportes sólidos.<br />
Existen métodos alternativos en los cuales la muestra sanguínea se <strong>de</strong>posita<br />
sobre un papel especial, que la mantiene inalterada por años a temperatura<br />
ambiente. Previo al análisis, se cortan con un sacabocados pequeño<br />
fragmentos <strong>de</strong>l papel (alre<strong>de</strong>dor <strong>de</strong> 1 mm) y se extraen las impurezas mediante<br />
lavados. El papel así procesado, con el ADN adherido, se analiza directamente<br />
colocándolo en la mezcla <strong>de</strong> amplificación.
Análisis <strong>de</strong>l ADN:<br />
Existen dos metodologías diferentes:<br />
TEMARIO DE T.E.L<br />
a) Corte con enzimas <strong>de</strong> restricción, corrimiento electroforético en geles <strong>de</strong><br />
agarosa, transferencia a una membrana <strong>de</strong> nylon o celulosa y tratamiento<br />
con sondas <strong>de</strong> locus múltiple o <strong>de</strong> locus específico. Estas técnicas han<br />
caído en <strong>de</strong>suso, por lo cual no serán tratadas aquí.<br />
b) Amplificación mediante PCR o reacción en ca<strong>de</strong>na <strong>de</strong> la polimerasa: es<br />
un proceso que consiste en imitar una actividad normal <strong>de</strong> la célula: la<br />
copia <strong>de</strong> ADN, aunque en este caso limitado a pequeños fragmentos, en<br />
los cuales están ubicadas las regiones variables.<br />
Para ello, se coloca en cada tubo una porción <strong>de</strong>l ADN extraído <strong>de</strong> cada<br />
persona y una mezcla que contiene nucleótidos, sales, una enzima que "copia"<br />
ADN (<strong>de</strong>nominada polimerasa) y los "primers" que reconocen la zona variable.<br />
La mezcla se somete a variaciones <strong>de</strong> temperatura en un ciclador térmico, que<br />
produce sucesivamente tres temperaturas diferentes: una que <strong>de</strong>snaturaliza o<br />
separa las ca<strong>de</strong>nas <strong>de</strong>l ADN, otra que facilita que los "primers" reconozcan y se<br />
adhieran a la región a copiar, y la tercera que permite la extensión <strong>de</strong> la ca<strong>de</strong>na<br />
copiada, mediante la unión <strong>de</strong> los nucleótidos que se encuentran en la solución,<br />
con la ayuda <strong>de</strong> la polimerasa.<br />
Luego, los amplificados se someten a un campo eléctrico en el interior <strong>de</strong> un<br />
soporte semisólido o gel (electroforesis). Como el ADN está cargado<br />
negativamente, se dirige hacia el polo positivo, los fragmentos pequeños más<br />
rápido que los gran<strong>de</strong>s, produciendo su separación.<br />
Finalmente, los fragmentos separados se visualizan mediante diferentes<br />
métodos:<br />
• Radiactivos: si uno <strong>de</strong> los nucleótidos estaba marcado radiactivamente,<br />
basta poner el gel en contacto con una película radiográfica, que se revela<br />
para observar las variantes.<br />
• Tinción con plata: se trata el gel con sales <strong>de</strong> plata, que por su carga<br />
positiva son atraídas por la carga negativa <strong>de</strong> los fragmentos <strong>de</strong> ADN, y<br />
se revela <strong>de</strong> modo similar a una fotografía.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
Tanto los métodos radiactivos como los <strong>de</strong> tinción con plata están cayendo en<br />
<strong>de</strong>suso, y en la actualidad son empleados solamente por laboratorios que<br />
poseen un escaso volumen <strong>de</strong> trabajo.<br />
• Sistemas automatizados: son los <strong>de</strong> última generación, en los cuales al<br />
proceso <strong>de</strong> electroforesis lo efectúa un secuenciador automático, que lee<br />
mediante un rayo laser los "primers", marcados con un fluorocromo,<br />
adheridos a las zonas variables. Una computadora permite <strong>de</strong>terminar<br />
qué variantes son las que se encuentran en cada muestra.<br />
Interpretación <strong>de</strong> los resultados:<br />
Según las metodologías empleadas, los resultados se visualizan como "bandas"<br />
(en los formatos radiactivos o <strong>de</strong> tinción) o como "picos" en un gráfico (sistemas<br />
automatizados). Dado que la interpretación es idéntica, en los ejemplos<br />
utilizaremos los gráficos obtenidos <strong>de</strong> un secuenciador automático.<br />
Madre:<br />
Hijo:<br />
Padre<br />
alegado:<br />
Consi<strong>de</strong>rando que cada individuo hereda una variante<br />
<strong>de</strong> su madre y la otra <strong>de</strong> su padre biológico,<br />
supongamos los siguientes resultados para un<br />
hipotético "sistema A":<br />
Es evi<strong>de</strong>nte que el hijo comparte una variante con su<br />
madre y la otra con su padre alegado, por lo cual podría<br />
ser hijo <strong>de</strong> ambos. Sin embargo, esa situación pue<strong>de</strong><br />
darse por azar, ya que hay<br />
muchos individuos <strong>de</strong> la<br />
población general que<br />
presentan esa variante Madre:<br />
compartida.<br />
Entonces, repetimos el<br />
estudio con otro sistema,<br />
que analizará una zona<br />
variable diferente. El resultado para ese "sistema B"<br />
podría ser:<br />
Y se confirmaría la inclusión. Para que el estudio<br />
resulte suficientemente creíble, se acepta a nivel<br />
mundial que <strong>de</strong>ben analizarse un mínimo <strong>de</strong> 12<br />
sistemas <strong>de</strong> microsatélites, por supuesto, con<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 168 <strong>de</strong> 287<br />
Hijo:<br />
Padre<br />
alegado:
TEMARIO DE T.E.L<br />
inclusión en todos los casos. Para las técnicas actuales automatizadas, ello no<br />
presenta ningún inconveniente, ya que existen métodos <strong>de</strong> amplificación <strong>de</strong> 15<br />
regiones variables en una sola reacción.<br />
El estudio completo, con sistemas <strong>de</strong> última generación, se vería así:<br />
Madre:<br />
Hijo:<br />
Padre<br />
alegado:<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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Madre:<br />
Hijo:<br />
Padre<br />
alegado:<br />
Madre:<br />
Hijo:<br />
Padre<br />
alegado:<br />
TEMARIO DE T.E.L<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 170 <strong>de</strong> 287
TEMARIO DE T.E.L<br />
En el ejemplo anterior, se observan 15 sistemas variables y a<strong>de</strong>más el<br />
<strong>de</strong>nominado "amelogenina", que sirve para <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> sexo: en lo varones<br />
se aprecian dos picos ("XY") y en las mujeres, sólo uno ("XX"). Los números<br />
<strong>de</strong>bajo <strong>de</strong> cada variante indica el número <strong>de</strong> repeticiones que posee la<br />
secuencia "core" que <strong>de</strong>fine al sistema cuyo nombre se coloca en la parte<br />
superior <strong>de</strong>l registro gráfico (ej.: D5S818, D13S317, etc).<br />
Otra posibilidad para el sistema B sería:<br />
Madre:<br />
Hijo:<br />
Padre<br />
alegado:<br />
como:<br />
Madre: 8-12.<br />
Hijo: 8-13.<br />
Padre alegado: 12-13.<br />
Que indicaría la exclusión <strong>de</strong>l padre alegado como<br />
padre biológico (obsérvese que la variante 11 está<br />
en el hijo pero no en la madre ni en el padre alegado).<br />
Para asegurarse que no se <strong>de</strong>ba a una falsa exclusión<br />
<strong>de</strong>bida a una mutación, se sugiere continuar el estudio<br />
hasta observar al menos tres situaciones como ésta,<br />
<strong>de</strong> no compartición <strong>de</strong> variantes entre padre e hijo<br />
alegado.<br />
Las variantes mencionadas se codifican por<br />
convención mediante un número (ubicado en el<br />
esquema en la parte inferior <strong>de</strong> cada pico), que<br />
expresa el número <strong>de</strong> veces que está repetida la<br />
secuencia que caracteriza al sistema. Así, en nuestro<br />
hipotético "sistema A", los resultados se expresarían<br />
Cualquier otro estudio, realizado en cualquier lugar <strong>de</strong>l mundo, <strong>de</strong>l mismo<br />
"sistema A", <strong>de</strong>be necesariamente arrojar los mismos resultados numéricos. Si<br />
eso no ocurre, alguno cometió un error.<br />
Finalmente, se realiza un cálculo estadístico <strong>de</strong> la probabilidad <strong>de</strong> paternidad e<br />
índice <strong>de</strong> paternidad, basándose en análisis efectuados previamente <strong>de</strong> las<br />
variantes observadas en individuos no relacionados <strong>de</strong> la población general.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
Cuanto menos frecuentes en la población sean las variantes obtenidas, mayores<br />
serán la probabilidad y el índice <strong>de</strong> paternidad.<br />
Habitualmente, para individuos vivos, la "probabilidad <strong>de</strong> paternidad" es superior<br />
al 99,99%. Por ejemplo, un "índice <strong>de</strong> paternidad" <strong>de</strong> 1,2 x 10 6 indica que 1 <strong>de</strong><br />
cada 1200000 individuos <strong>de</strong> la población general podrían ser asignados como<br />
padres biológicos <strong>de</strong>l hijo en cuestión, sin serlo, es <strong>de</strong>cir, por azar.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
TEMA 13.- MÉTODOS ÓPTICOS<br />
PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS<br />
ENFERMEDADES INFECCIOSAS<br />
INTRODUCCIÓN<br />
Cuando se establece el diagnóstico clínico <strong>de</strong> una enfermedad infecciosa, con<br />
frecuencia es crucial el po<strong>de</strong>r i<strong>de</strong>ntificar rápida y provisionalmente el agente<br />
etiológico con el fin <strong>de</strong> po<strong>de</strong>r instaurar las a<strong>de</strong>cuadas medidas terapéuticas y en<br />
ocasiones epi<strong>de</strong>miológicas; en todo caso siempre es conveniente llegar a la<br />
confirmación bacteriológica.<br />
En realidad las técnicas utilizadas actualmente han variado muy poco <strong>de</strong>s<strong>de</strong> el<br />
inicio <strong>de</strong> la era bacteriológica; más o menos sofisticadamente, se continúa con la<br />
i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> los gérmenes por visualización directa, por técnicas <strong>de</strong> cultivo y<br />
en ocasiones por inoculación animal.<br />
VISUALIZACION DIRECTA O EXAMEN MICROSCÓPICO<br />
El estudio microscópico directo <strong>de</strong> una muestra no permite por sí solo, más que<br />
en raras ocasiones, la i<strong>de</strong>ntificación precisa <strong>de</strong>l microorganismo observado. No<br />
obstante, nunca se <strong>de</strong>be prescindir <strong>de</strong> él como orientativo, salvo en algunos<br />
casos, en relación con la naturaleza <strong>de</strong> la muestra examinada, cuando no existe<br />
probabilidad <strong>de</strong> obtener ninguna información.<br />
El examen microscópico sirve <strong>de</strong> pauta para el uso <strong>de</strong> técnicas complementarias<br />
<strong>de</strong> cultivo o <strong>de</strong> estudio bioquímico y evita, muchas veces, incurrir en errores<br />
graves. Este examen permite obtener información respecto a la presencia <strong>de</strong><br />
bacterias y su abundancia, observar su morfología y disposición (por ejemplo los<br />
Streptococcus se disponen en ca<strong>de</strong>na y los Staphylococcus en forma <strong>de</strong><br />
racimos), <strong>de</strong>terminar sus características <strong>de</strong> tinción, la reacción celular, e incluso<br />
conocer la citología <strong>de</strong>l material examinado. Si se parte <strong>de</strong> un cultivo, la<br />
información pue<strong>de</strong> ampliarse aún más y apreciarse mejor la forma, tamaño,<br />
disposición y las peculiarida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> tinción.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
El examen microscópico comporta habitualmente dos modalida<strong>de</strong>s diferentes:<br />
examen en fresco y mediante tinción.<br />
EXAMEN EN FRESCO<br />
También conocido como montaje húmedo, consiste en colocar el material a<br />
examinar entre un porta y un cubreobjetos; si se trata <strong>de</strong> un producto sólido, se<br />
realizará previamente una suspensión <strong>de</strong>l mismo en agua <strong>de</strong>stilada o s.s.f<br />
estériles. Para la observación se coloca el con<strong>de</strong>nsador bajo y el objetivo seco<br />
fuerte (40X).La microscopía <strong>de</strong> contraste <strong>de</strong> fases y la <strong>de</strong> campo oscuro facilitan<br />
la observación <strong>de</strong> estructuras con bajo índice <strong>de</strong> refracción que pasarían<br />
inadvertidas con el microscopio <strong>de</strong> campo claro; sus indicaciones son muy<br />
precisas (por ejemplo, la i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> espiroquetas).<br />
El examen en fresco se dirige principalmente a la <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> microorganismos<br />
directamente en las muestras, a cuantificar su concentración, a obtener alguna<br />
información sobre su morfología y, con frecuencia, a <strong>de</strong>terminar la movilidad <strong>de</strong><br />
una especie aislada. A<strong>de</strong>más, tambien permite observar otro tipo <strong>de</strong> células<br />
(hematíes, leucocitos, células epi<strong>tel</strong>iales), cristales y algunas estructuras que<br />
ayudan para la valoración clínica <strong>de</strong> <strong>de</strong>terminadas muestras.<br />
El examen en fresco pue<strong>de</strong> ayudarse <strong>de</strong> recursos que facilitan la visualización <strong>de</strong><br />
ciertos microorganismos:<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
• La simple adición <strong>de</strong> azul <strong>de</strong> metileno u otro colorante favorece la<br />
diferenciación <strong>de</strong> elementos celulares.<br />
• La preparación con tinta china (método <strong>de</strong> Burri) o nigrosina permite la<br />
evi<strong>de</strong>nciación <strong>de</strong> la cápsula microbiana. Se utiliza para el diagnóstico <strong>de</strong><br />
infección por Cryptococcus.<br />
• El montaje con potasa al 10% en caliente o con azul <strong>de</strong> lactofenol es <strong>de</strong><br />
gran utilidad para el estudio <strong>de</strong> estructuras fúngicas, sobre todo <strong>de</strong><br />
hongos <strong>de</strong>rmatofitos.<br />
• La preparación con solución yodada(lugol) es <strong>de</strong> elección para la<br />
i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> algunas parasitosis intestinales.<br />
EXAMEN POR TINCIÓN<br />
El examen <strong>de</strong>l material teñido, ya sea directamente a partir <strong>de</strong> muestras clínicas<br />
o <strong>de</strong>l <strong>de</strong>sarrollo en los cultivos, es el método más útil para la i<strong>de</strong>ntificación<br />
presuntiva <strong>de</strong> las bacterias y <strong>de</strong> ciertos virus y para la i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong>finitiva <strong>de</strong><br />
la mayoría <strong>de</strong> los parásitos y <strong>de</strong> muchos hongos.<br />
Las preparaciones teñidas se visualizan al microscopio con el con<strong>de</strong>nsador alto y<br />
el objetivo <strong>de</strong> inmersión <strong>de</strong> gran aumento (100X).<br />
De forma resumida po<strong>de</strong>mos <strong>de</strong>cir que la coloración o tinción es un proceso<br />
mediante el cual un elemento toma color bajo la acción <strong>de</strong> una sustancia<br />
colorante.<br />
Un colorante es una sustancia capaz <strong>de</strong> comunicar su color a otros cuerpos.<br />
Pue<strong>de</strong>n ser: ácidos (tiñen a estructuras básicas; ejemplos: Eosina, ácido<br />
Pícrico,Aurantina.), básicos (tiñen estructuras ácidas). Son colorantes nucleares.<br />
Ejemplos: Azul <strong>de</strong> metileno, Ver<strong>de</strong> malaquita, Fuchina, Violeta <strong>de</strong> genciana,<br />
Safranina,...) y neutros (son capaces <strong>de</strong> teñir tanto las estructuras ácidas como<br />
básicas. Ejemplos: Eosinato <strong>de</strong> Azul <strong>de</strong> metileno.<br />
En Microbiología se utilizan sobre todo colorantes básicos o nucleares <strong>de</strong>bido a<br />
la gran basofilia <strong>de</strong>l citoplasma bacteriano, rico en ARN. Estos colorantes se<br />
presentan generalmente asociados a un mordiente (ácido fénico) para reforzar<br />
su acción, aunque algunas técnicas <strong>de</strong> tinción aplican, a<strong>de</strong>más, otro mordiente<br />
suplementario (lugol en la tinción <strong>de</strong> Gram).<br />
Preparación <strong>de</strong> un frotis.<br />
Todas las técnicas <strong>de</strong> tinción exigen una preparación previa <strong>de</strong>l frotis antes <strong>de</strong><br />
proce<strong>de</strong>r a la tinción en sí. Los pasos a seguir son :<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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Extensión<br />
TEMARIO DE T.E.L<br />
• Cuando el producto a teñir es líquido se <strong>de</strong>positará con asa <strong>de</strong> Pt,<br />
previamente flameada, una gota <strong>de</strong>l mismo sobre el portaobjetos y se<br />
exten<strong>de</strong>rá formando una capa fina y uniforme <strong>de</strong> aproximadamente 1,5<br />
cm. <strong>de</strong> lado.<br />
• Cuando se parte <strong>de</strong> un medio sólido o semisólido se <strong>de</strong>positará una gota<br />
<strong>de</strong> agua <strong>de</strong>stilada o s.s.f. en el porta y, utilizando asa <strong>de</strong> Pt previamente<br />
flameada, se suspen<strong>de</strong>rá en ella una pequeña cantidad <strong>de</strong> cultivo. Se<br />
extien<strong>de</strong> <strong>de</strong> la misma forma que en el caso anterior. Hay que cuidar no<br />
poner <strong>de</strong>masiada masa <strong>de</strong> microorganismo, pues se formaría una capa<br />
gruesa que dificultaría la observación.<br />
• Cuando se trata <strong>de</strong> una muestra tomada con escobillón se pue<strong>de</strong>n<br />
exten<strong>de</strong>r directamente o se suspen<strong>de</strong>n en 2 c.c. <strong>de</strong> suero fisiológico<br />
estéril contenidos en un tubo. Se <strong>de</strong>posita una gota <strong>de</strong> la suspensión en el<br />
centro <strong>de</strong>l portaobjetos y se extien<strong>de</strong>.<br />
Desecación.<br />
Se <strong>de</strong>ja secar al aire o manteniendo el portaobjetos alto por encima <strong>de</strong> la llama.<br />
Fijación.<br />
Cuando la extensión está bien seca hay que proce<strong>de</strong>r a fijarla. Tiene por objeto<br />
adherir los gérmenes al portaobjetos para que al lavar no se arrastre. Se<br />
consigue mediante la coagulación <strong>de</strong> las proteínas <strong>de</strong> los gérmenes.<br />
En Microbiología, el agente fijador que se suele emplear es el calor: una vez<br />
seca la extensión, se pasa el portaobjetos dos o tres veces por la llama <strong>de</strong>l<br />
mechero con la extensión hacia arriba. El portaobjetos <strong>de</strong>be notarse caliente<br />
pero no quemar cuando se coloca en el dorso <strong>de</strong> la mano.<br />
Una vez fijada la preparación se <strong>de</strong>jará enfriar antes <strong>de</strong> proce<strong>de</strong>r a la coloración<br />
ya que <strong>de</strong> lo contrario precipitaría el colorante.<br />
También se pue<strong>de</strong> realizar la fijación mediante el empleo <strong>de</strong> fijadores químicos<br />
tales como el alcohol metílico o etílico, <strong>de</strong>jándolos en contacto dos o tres<br />
minutos, eliminando <strong>de</strong>spués el exceso.<br />
Una vez preparada y fijada la extensión, el siguiente paso sería la tinción.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TIPOS DE TINCIONES<br />
TINCIÓN SENCILLA.<br />
TEMARIO DE T.E.L<br />
Se realiza utilizando un sólo colorante. Se pue<strong>de</strong> emplear cualquier colorante<br />
básico, preferiblemente azul <strong>de</strong> metileno o fucsina.<br />
Técnica:<br />
1. Extensión.<br />
2. Desecación.<br />
3. Fijación. Dejar enfriar.<br />
4. Tinción: Se cubre la preparación con el colorante (azul <strong>de</strong> metileno)<br />
durante 1-2 minutos.<br />
5. Lavado: Se lava con abundante agua para eliminar el exceso <strong>de</strong><br />
colorante. Lo idóneo es usar agua <strong>de</strong>stilada, pero tambien se pue<strong>de</strong> usar<br />
agua corriente (esto pue<strong>de</strong> causar errores, como por ejemplo <strong>de</strong>pósitos<br />
<strong>de</strong> cal).<br />
6. Secado: Se secará primeramente entre papel <strong>de</strong> filtro, evitando presionar<br />
directamente sobre la extensión. Se limpiarán los restos <strong>de</strong> colorante que<br />
que<strong>de</strong>n en el portaobjetos fuera <strong>de</strong> la extensión y se <strong>de</strong>jará que acabe <strong>de</strong><br />
secarse al aire.<br />
7. Observación al microscopio. Se observarán las bacterias con su forma y<br />
agrupación característica, teñidas <strong>de</strong> azul.<br />
TINCIONES DIFERENCIALES<br />
TINCIÓN DE GRAM<br />
Se estudia con esta coloración la morfología <strong>de</strong> las bacterias y su forma <strong>de</strong><br />
agrupación y a la vez tiene interés taxonómico ya que se emplea para diferenciar<br />
los dos tipos clásicos <strong>de</strong> microorganismos: Gram (+) y Gram (-).<br />
Las bacterias que son capaces <strong>de</strong> retener el primer colorante usado (Cristal<br />
violeta o Violeta <strong>de</strong> genciana) aun <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> la <strong>de</strong>coloración son las<br />
<strong>de</strong>nominadas Gram (+). Las bacterias Gram (-) pier<strong>de</strong>n el colorante al ser<br />
tratadas con el <strong>de</strong>colorante.<br />
Como se ha indicado la diferencia entre los dos tipos resi<strong>de</strong> en la pared celular:<br />
Las Gram (+) tienen una pared muy gruesa, con una malla bien engarzada,<br />
reteniendo bien el colorante durante la coloración. La pared <strong>de</strong> las Gram (-) es<br />
mas <strong>de</strong>lgada y su malla es más floja, por lo que el <strong>de</strong>colorante <strong>de</strong>stiñe a este tipo<br />
<strong>de</strong> bacterias.<br />
A<strong>de</strong>más las Gram (+) tienen en su pared celular un contenido <strong>de</strong> lípidos (1-4 % )<br />
menor que en las Gram (-) ( 11-20 % ). Estos lípidos van a ser disueltos por el<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
<strong>de</strong>colorante orgánico empleado, aumentando la permeabilidad <strong>de</strong> la membrana y<br />
eliminando el colorante, <strong>de</strong>colorándose con facilidad las Gram (-).<br />
El valor diagnóstico <strong>de</strong> esta tinción es variable; normalmente permite una buena<br />
orientación al microbiólogo para seleccionar las técnicas <strong>de</strong> cultivo más<br />
a<strong>de</strong>cuadas y también tiene valor en orientar hacia un diagnóstico etiológico, en<br />
especial para instaurar un tratamiento inicial; en otras ocasiones el diagnóstico<br />
pue<strong>de</strong> consi<strong>de</strong>rarse prácticamente cierto, como ocurre en el caso <strong>de</strong> la uretritis<br />
gonocócica aguda masculina, la meningitis purulenta por meningococo o<br />
neumococo, etc.<br />
Técnica:<br />
1. Extensión.<br />
2. Desecación.<br />
3. Fijación. Dejar enfriar.<br />
4. Coloración: Se cubre la preparación con Violeta <strong>de</strong> Genciana o Cristal<br />
violeta y se <strong>de</strong>ja actuar durante 1,5 o 2 minutos.<br />
5. Lavar ligeramente con agua para eliminar el exceso <strong>de</strong> colorante o<br />
simplemente volcar el portaobjetos y escurrir el colorante. A continuación<br />
se cubre la preparación con Lugol (mordiente) durante 2 minutos. El<br />
mordiente produce una unión mas intima entre el colorante y la estructura<br />
a colorear. La función <strong>de</strong> mordiente la tiene el Iodo; el Ioduro potásico se<br />
utiliza para favorecer la disolución <strong>de</strong>l Iodo metálico en el agua.<br />
6. Decoloración: Escurrir la solución <strong>de</strong> Lugol, lavar con agua y sosteniendo<br />
el portaobjetos entre el pulgar y el índice <strong>de</strong>colorar con Alcohol-acetona<br />
hasta apenas arrastrar colorante violeta. Al añadir cristal violeta se tiñen<br />
todas las bacterias, pero al <strong>de</strong>colorar solo las G (-) pier<strong>de</strong>n el colorante.<br />
7. Lavar con agua abundante a fin <strong>de</strong> <strong>de</strong>tener la <strong>de</strong>coloración.<br />
8. Coloración <strong>de</strong> contraste: Se cubre la preparación con Fucsina fenicada<br />
diluida o con Safranina (preferentemente) y se <strong>de</strong>ja actuar durante 1-2<br />
minutos.<br />
9. Lavar con agua.<br />
10. Secado.<br />
11. Observación al microscopio. Las bacterias gram positivas se observan <strong>de</strong><br />
color azul violeta y las gram negativas <strong>de</strong> color rosa.<br />
Existe una variante <strong>de</strong> la tinción <strong>de</strong> Gram i<strong>de</strong>ada para daltónicos en la que en<br />
lugar <strong>de</strong> usar Safranina o Fucsina fenicada como colorante <strong>de</strong> contraste, se<br />
emplea el marrón <strong>de</strong> Bismarck durante 30-60 segundos. Las bacterias G (-) se<br />
observarán, en este caso, <strong>de</strong> color pardo-amarillento.<br />
Hay ciertos grupos <strong>de</strong> bacterias que pier<strong>de</strong>n sus características tintoriales<br />
cuando envejecen, pasando <strong>de</strong> G (+) a G (-); a estas bacterias se les <strong>de</strong>nomina<br />
Gram lábiles o Gram variables. Se recomienda realizar la tinción <strong>de</strong> Gram a<br />
cultivos <strong>de</strong> 24 horas.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
TINCIONES PARA ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTES<br />
Existen una serie <strong>de</strong> microorganismos que poseen en su pared celular ciertos<br />
lípidos complejos, que dificultan la penetración <strong>de</strong> los colorantes en la célula.<br />
Solamente utilizando colorantes enérgicos como la fucsina fenicada, y forzando<br />
su acción mediante la aplicación <strong>de</strong> calor o prolongando el tiempo <strong>de</strong> contacto,<br />
estos microorganismos logran retener el colorante. Y lo hacen <strong>de</strong> tal manera,<br />
que incluso <strong>de</strong>colorantes muy enérgicos como el alcohol-ácido no consiguen<br />
<strong>de</strong>colorarlos. Por esto se <strong>de</strong>nominan ácido- alcohol resistentes.<br />
Los géneros Mycobacterium, Nocardia, y los parásitos coccí<strong>de</strong>os como<br />
Cryptosporidium, se caracterizan por sus propieda<strong>de</strong>s <strong>de</strong> ácido-alcohol<br />
resistencia.<br />
Estas tinciones constituyen una importante ayuda para la búsqueda <strong>de</strong>l bacilo <strong>de</strong><br />
Koch (Mycobacterium tuberculosis).Entre ellas po<strong>de</strong>mos citar: la tinción <strong>de</strong><br />
Zhiehl-Neelsen y la <strong>de</strong> Kinyoun.<br />
TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN<br />
Los colorantes y reactivos usados en esta tinción son:<br />
Técnica:<br />
o Fucsina fenicada.<br />
o Alcohol-ácido (<strong>de</strong>colorante). Alcohol <strong>de</strong> 961: 97 ml.; ClH : 3 ml. Hay<br />
que añadir lentamente el ácido al alcohol ya que pue<strong>de</strong> haber<br />
<strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> calor.<br />
o Azul <strong>de</strong> metileno o Ver<strong>de</strong> <strong>de</strong> malaquita.<br />
1. Extensión.<br />
2. Desecación.<br />
3. Fijación. Dejar enfriar.<br />
4. Coloración: Cubrir la preparación con fucsina fenicada y calentar el<br />
portaobjetos o bien directamente sobre el mechero o bien utilizando un<br />
algodón impregnado en alcohol, hasta la emisión <strong>de</strong> vapores por parte <strong>de</strong><br />
la preparación. Cuando se observa la emisión <strong>de</strong> vapores se retirará el<br />
foco calorífico, volviéndolo a aplicar 2 0 3 veces <strong>de</strong> modo que se<br />
mantenga dicha emisión durante 5 minutos. Hay que evitar la ebullición<br />
<strong>de</strong>l colorante y que en ningún momento la preparación que<strong>de</strong> sin<br />
colorante. También se pue<strong>de</strong> realizar la coloración cubriendo la<br />
preparación con un rectángulo <strong>de</strong> papel <strong>de</strong> filtro y añadiendo el colorante<br />
<strong>de</strong> modo que que<strong>de</strong> perfectamente impregnado el papel <strong>de</strong> filtro. A<br />
continuación se irá calentando manteniéndose la emisión <strong>de</strong> vapores<br />
durante 5 minutos sin <strong>de</strong>jar que se seque el papel <strong>de</strong> filtro.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
5. Se <strong>de</strong>jará enfriar y se lavará con agua. En el caso <strong>de</strong> utilizar papel <strong>de</strong> filtro<br />
se retirará este mediante unas pinzas y a continuación se lavará con<br />
agua.<br />
6. Decoloración: enérgicamente con alcohol-clorhídrico hasta que la<br />
preparación que<strong>de</strong> con un ligero tinte rosa. A continuación se lavará con<br />
agua.<br />
7. Coloración <strong>de</strong> contraste: Cubrir la preparación con azul <strong>de</strong> metileno<br />
durante 2-3 minutos.<br />
8. Lavar con agua.<br />
9. Secar y observar el microscopio.<br />
Los microorganismos ácido-alcohol resistentes se observarán <strong>de</strong> color<br />
rojo y los restantes <strong>de</strong> color azul. Si como colorante <strong>de</strong> contraste en vez <strong>de</strong> azul<br />
<strong>de</strong> metileno se hubiera empleado ver<strong>de</strong> malaquita, los microorganismos no<br />
ácido-alcohol resistentes se observan <strong>de</strong> color ver<strong>de</strong>.<br />
TINCIÓN DE KINYOUN<br />
Es una tinción ácido-alcohol resistente, modificación <strong>de</strong> la <strong>de</strong> Ziehl-Neelsen,<br />
llamada tambien como método frío <strong>de</strong>bido a que en lugar <strong>de</strong> emplear calor para<br />
facilitar la penetración <strong>de</strong>l colorante se aumenta la proporción ed fenol y fucsina<br />
en la fórmula <strong>de</strong>l colorante con respecto a la fucsina <strong>de</strong> Ziehl.<br />
Técnica:<br />
1. Extensión.<br />
2. Desecación.<br />
3. Fijación. Dejar enfriar.<br />
4. Coloración: Cubrir la preparación con la fucsina <strong>de</strong> Kinyoun y <strong>de</strong>jar actuar<br />
durante 5-7 minutos-min., sin calentar.<br />
5. Lavar con agua o simplemente escurrir el colorante.<br />
6. Decolorar con alcohol-HCl.<br />
7. Lavar con agua.<br />
8. Coloración <strong>de</strong> contraste: azul <strong>de</strong> metileno durante 2-3 min.<br />
9. Lavar, secar y observar al microscopio.<br />
La observación será similar a la expuesta en la tinción <strong>de</strong> Ziehl-Neelsen.<br />
Cuando se observa una tinción AAR se recomienda hacer una valoración<br />
cuantitativa <strong>de</strong> los bacilos presentes en la muestra. El objetivo se ha <strong>de</strong> colocar<br />
en el extremo <strong>de</strong> la preparación y se recorre toda una línea (100 campos en<br />
objetivo <strong>de</strong> inmersión) contando los bacilos AAR encontrados. Una forma <strong>de</strong><br />
informar número <strong>de</strong> BAAR observados en frotis teñidos es la siguiente:<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
N1 <strong>de</strong> BAR observados Informe <strong>de</strong>l método CDC<br />
0<br />
1 - 2/300 F<br />
1 - 9/100 F<br />
9 - 9/10 F<br />
1 - 9/F<br />
> 9/F<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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Negativo para BAR (-)<br />
N1 visto ( )<br />
N1 promedio/100 F (1+)<br />
N1 promedio/10 F (2+)<br />
N1 promedio/F (3+)<br />
> 9/F (4+)<br />
Estos datos se refieren a observación en microscopio con objetivo <strong>de</strong> inmersión.<br />
Existen factores para establecer una equivalencia entre estos datos y los<br />
correspondientes a la observación con objetivo 25X o 40X.<br />
TINCIONES ESTRUCTURALES<br />
Utilizan más <strong>de</strong> un colorante y sirven para poner <strong>de</strong> manifiesto distintas<br />
estructuras bacterianas.<br />
TINCIÓN DE ESPORAS. MÉTODO DE WIRTZ-CONKLIN<br />
Algunos microorganismos tienen la propiedad <strong>de</strong> formar esporas, que son<br />
formas <strong>de</strong> resistencia. Su formación se <strong>de</strong>be a una concentración <strong>de</strong><br />
protoplasma bacteriano. Pue<strong>de</strong>n ser <strong>de</strong> forma esférica u oval y <strong>de</strong> diverso<br />
tamaño. Pue<strong>de</strong>n ser <strong>de</strong> localización central, subterminal, o terminal. También<br />
pue<strong>de</strong>n salir al exterior.<br />
La pared <strong>de</strong> las esporas es bastante impermeable, por lo que cuesta trabajo<br />
teñirlas, <strong>de</strong> modo que en las preparaciones teñidas por los métodos corrientes,<br />
las esporas aparecen como cuerpos incoloros y refringentes. Pero si se fuerza la<br />
coloración mediante el calor, el colorante llegará a teñir las esporas.<br />
Debido a la citada impermeabilidad <strong>de</strong> la pared <strong>de</strong> las esporas, durante el<br />
periodo <strong>de</strong> <strong>de</strong>coloración, se <strong>de</strong>colorará toda la célula bacteriana excepto las<br />
esporas.<br />
Se necesitan cultivos <strong>de</strong> al menos 48 horas, para que el microorganismo haya<br />
tenido tiempo suficiente <strong>de</strong> formarlas.<br />
Técnica:<br />
1. Extensión.<br />
2. Desecación.<br />
3. Fijación. Dejar enfriar.<br />
4. Coloración: Cubrir la preparación con ver<strong>de</strong> malaquita al 5% en solución<br />
acuosa, manteniéndola a emisión <strong>de</strong> vapores durante 5 min, teniendo las
TEMARIO DE T.E.L<br />
mismas precauciones que las especificadas en la tinción <strong>de</strong> Ziehl-<br />
Neelsen.<br />
5. Dejar enfriar.<br />
6. Lavar con abundante agua. La espora sigue teñida <strong>de</strong> ver<strong>de</strong> y la célula<br />
vegetativa pier<strong>de</strong> el colorante.<br />
7. Colorante <strong>de</strong> contraste: Safranina y <strong>de</strong>jar actuar durante 1 min.<br />
8. Lavar con agua.<br />
9. Secar y observar al microscopio. Las esporas se verán <strong>de</strong> color ver<strong>de</strong> y<br />
las células vegetativas se observarán <strong>de</strong> color rosa. La disposición y<br />
tamaño <strong>de</strong> las esporas tiene gran interés en taxonomía.<br />
Existe otra tinción <strong>de</strong> esporas, el método <strong>de</strong> Moeller, que utiliza como reactivos:<br />
solución acuosa <strong>de</strong> ácido crómico, fucsina fenicada <strong>de</strong> Ziehl-Neelsen, solución<br />
acuosa <strong>de</strong> clorhidrato <strong>de</strong> anilina, azul <strong>de</strong> metileno y alcohol absoluto.<br />
TINCIÓN DE FLAGELOS<br />
Para su observación, se <strong>de</strong>be partir <strong>de</strong> cultivos jóvenes, <strong>de</strong> entre seis y doce<br />
horas.<br />
Se prepara una suspensión <strong>de</strong>l germen en agua <strong>de</strong>stilada, mezclando<br />
suavemente hasta obtener una suspensión lechosa. Si se sospecha que el<br />
germen es patógeno, se <strong>de</strong>be utilizar agua formolada al 5-10%.<br />
Se <strong>de</strong>posita unas gotas <strong>de</strong> la suspensión en un extremo <strong>de</strong>l portaobjetos<br />
inclinado, <strong>de</strong> forma que las gotas se extiendan a lo largo <strong>de</strong>l cristal. Se <strong>de</strong>jará<br />
secar al aire sin aplicar calor.<br />
A) MÉTODO DE RHODES<br />
o Se cubre la extensión con el mordiente <strong>de</strong> Rho<strong>de</strong>s durante 3-5 min.<br />
Lavar cuidadosamente con agua <strong>de</strong>stilada, mejor por inmersión.<br />
o Cubrir con la solución <strong>de</strong> nitrato <strong>de</strong> plata amoniacal, calentándolo<br />
hasta casi ebullición y <strong>de</strong>jándolo actuar <strong>de</strong> 3-5 min.<br />
o Lavar con agua <strong>de</strong>stilada y secar.<br />
Se observa con objetivo <strong>de</strong> inmersión, directamente o bajo un cubreobjetos.<br />
Los flagelos podrán observarse gracias al precipitado <strong>de</strong> nitrato <strong>de</strong> plata que se<br />
<strong>de</strong>posita en torno suyo.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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B) MÉTODO DE TRIBONDEAU<br />
TEMARIO DE T.E.L<br />
o Se fija el frotis con alcohol y se cubre con la mezcla formada por 5<br />
ml <strong>de</strong>l mordiente <strong>de</strong> Tribon<strong>de</strong>au y 0,5 ml <strong>de</strong> cristal violeta<br />
previamente sometida a ebullición. Se <strong>de</strong>ja actuar durante 20<br />
segundos.<br />
o Se lava rápidamente con agua, sin volcar previamente el colorante,<br />
se seca y se observa al microscopio con objetivo <strong>de</strong> inmersión.<br />
Los flagelos se verán <strong>de</strong> color castaño.<br />
C) MÉTODO DE LEIFSON<br />
o Se cubre la preparación con el colorante <strong>de</strong> Leifson y se <strong>de</strong>ja<br />
actuar durante unos 10 minutos.<br />
o Se lava con agua, sin volcar el colorante, se seca y se observa al<br />
microscopio con objetivo <strong>de</strong> inmersión.<br />
Los flagelos se observan <strong>de</strong> color rojo oscuro a azul negruzco.<br />
TINCIÓN DE CÁPSULAS<br />
La cápsula es una capa mucosa, más o menos gruesa, que envuelve la pared<br />
celular <strong>de</strong> algunas bacterias.<br />
A) MÉTODO DE HISS<br />
o Realizar un frotis espeso <strong>de</strong> una mezcla <strong>de</strong> suspensión bacteriana<br />
con solución fisiológica y suero sanguíneo. Secar a temperatura<br />
ambiente y fijar al calor.<br />
o Cubrir la preparación con solución <strong>de</strong> cristal violeta al 1% y<br />
calentar con vapor fluyente durante un minuto.<br />
o Lavar con solución <strong>de</strong> sulfato <strong>de</strong> cobre al 2%, secar y observar al<br />
microscopio con objetivo <strong>de</strong> inmersión.<br />
Las cápsulas se colorean <strong>de</strong> azul pálido y las bacterias <strong>de</strong> color púrpura.<br />
B) MÉTODO DE LA TINTA CHINA<br />
o Sin fijar el frotis, se cubre con fucsina diluida durante dos minutos.<br />
Lavar con agua <strong>de</strong>stilada y secar al aire.<br />
o Se colocan en un extremo <strong>de</strong>l porta dos gotas <strong>de</strong> nigrosina o <strong>de</strong><br />
tinta china y se hace una extensión por el método <strong>de</strong> los dos<br />
portaobjetos. Se <strong>de</strong>ja secar y se observa al microscopio con<br />
objetivo <strong>de</strong> inmersión.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
El fondo aparecerá negro, las bacterias teñidas <strong>de</strong> rojo y la cápsula como un<br />
halo blanco que las envuelve.<br />
TINCIÓN DE CORPÚSCULOS METACROMÁTICOS<br />
El género Corynebacterium presenta unos gránulos <strong>de</strong> reserva <strong>de</strong> fosfato,<br />
llamados gránulos o corpúsculos metacromáticos.<br />
A) MÉTODO DE ALBERT<br />
o Se fija el frotis al calor, se cubre con el colorante <strong>de</strong> Albert, se <strong>de</strong>ja<br />
actuar durante 15 minutos y se lava con agua <strong>de</strong>stilada.<br />
o Se cubre la preparación con lugol durante un minuto, lavar con<br />
agua, secar a temperatura ambiente y observar con objetivo <strong>de</strong><br />
inmersión.<br />
Los corpúsculos metacromáticos se tiñen <strong>de</strong> color azul oscuro.<br />
B) MÉTODO DE LOEFFLER<br />
o Fijar el frotis con calor, cubrir con el colorante <strong>de</strong> Loeffler y <strong>de</strong>jar<br />
actuar durante tres minutos.<br />
o Lavar con agua <strong>de</strong>stilada, <strong>de</strong>jar secar y observar con objetivo <strong>de</strong><br />
inmersión.<br />
Los gránulos se verán <strong>de</strong> color azul intenso.<br />
C) MÉTODO DE ERNST-NEISSER<br />
o Fijar el frotis al calor, cubrir con azul acético y <strong>de</strong>jar actuar durante<br />
10 min, calentando hasta emisión <strong>de</strong> vapores los primeros minutos.<br />
o Lavar con agua <strong>de</strong>stilada y cubrir con una solución <strong>de</strong> vesuvina<br />
durante un minuto.<br />
o Lavar, secar y observar con objetivo <strong>de</strong> inmersión.<br />
TINCIONES DIFERENCIALES PARA PARÁSITOS<br />
Diversas coloraciones diferenciales son empleadas para mejorar la visualización<br />
y <strong>de</strong>stacar la estructura interna <strong>de</strong> quistes, trofozoitos u otras formas <strong>de</strong><br />
parásitos, especialmente <strong>de</strong> los que se encuentran en heces. Entre éstas<br />
po<strong>de</strong>mos <strong>de</strong>stacar la <strong>de</strong> Wheatley-tricromo y la <strong>de</strong> hierro hematoxilina.<br />
La coloración con toluidina O, se emplea para el examen rápido <strong>de</strong> material <strong>de</strong>l<br />
tracto respiratorio con el fin <strong>de</strong> <strong>de</strong>terminar la presencia <strong>de</strong> Pneumocystis carinii.<br />
Una modificación rápida <strong>de</strong> la coloración <strong>de</strong> Gomori con metenamina-plata ha<br />
<strong>de</strong>mostrado ser muy valiosa para el diagnóstico <strong>de</strong> P. carinii en lavados<br />
bronquiales y otras muestras.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
TINCIONES DIFERENCIALES PARA FROTIS DE SANGRE Y CORTES DE<br />
TEJIDOS<br />
Los parásitos que circulan en la sangre con frecuencia se encuentran <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong><br />
los eritrocitos o libres en el plasma. Se han <strong>de</strong>sarrollado diversas coloraciones<br />
que permiten diferenciar estos parásitos <strong>de</strong> los componentes celulares normales.<br />
Las dos coloraciones que se emplean más comúnmente son la <strong>de</strong> Wright y la <strong>de</strong><br />
Giemsa.<br />
La tinción <strong>de</strong> Giemsa también se emplea para visualizar inclusiones virales o <strong>de</strong><br />
otro origen en las células infectadas que se obtienen directamente <strong>de</strong> materiales<br />
clínicos, como la base <strong>de</strong> vesículas que se supone son herpéticas o raspados <strong>de</strong><br />
córnea en casos sospechosos <strong>de</strong> conjuntivitis por Chlamydia trachomatis.<br />
También pue<strong>de</strong> <strong>de</strong>tectarse mediante la coloración <strong>de</strong> Giemsa la presencia <strong>de</strong><br />
otros parásitos como toxoplasma en tejido cerebral. Ni la tinción <strong>de</strong> Wright ni la<br />
<strong>de</strong> Giemsa teñirán en forma regular los elementos fúngicos o bacterianos, <strong>de</strong><br />
modo que <strong>de</strong>ben usarse junto con otras coloraciones si se <strong>de</strong>sconoce totalmente<br />
la etiología <strong>de</strong> la supuesta infección.<br />
Se conocen otras tinciones que son empleadas para propósitos especiales,<br />
como la coloración con yodo para <strong>de</strong>tectar la presencia <strong>de</strong> inclusiones en<br />
monocapas celulares infectadas con clamidias, la <strong>de</strong> Sellers para cuerpos <strong>de</strong><br />
inclusión en tejidos infectados con el virus <strong>de</strong> la rabia y la <strong>de</strong> Giménez para<br />
Chlamydia y Legionella.<br />
TINCIONES PARA HONGOS<br />
Los elementos <strong>de</strong> los hongos pue<strong>de</strong>n visualizarse en materiales fijados por<br />
diversas coloraciones. La coloración con ácido preyódico-Schiff (PAS) es<br />
probablemente una <strong>de</strong> las mejores tinciones generales ya que la mayoría <strong>de</strong> los<br />
hongos presentes en materiales clínicos (esputo, tejidos, etc.) tomarán la<br />
coloración. La metenamina-plata, a<strong>de</strong>más <strong>de</strong> teñir a ciertos parásitos, también<br />
colorea las pare<strong>de</strong>s <strong>de</strong> las células micóticas <strong>de</strong> marrón oscuro-negro. El<br />
polisacárido capsular <strong>de</strong> ciertos hongos, especialmente Cryptococcus<br />
neoformans, toma un color rosa brillante con la coloración <strong>de</strong> mucicarmín, que<br />
ha <strong>de</strong>mostrado ser muy útil para diferenciar este hongo en los tejidos.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TINCIONES FLUORESCENTES<br />
TEMARIO DE T.E.L<br />
Algunos colorantes <strong>de</strong>nominados<br />
fluorocromos tienen la propiedad <strong>de</strong><br />
ser excitados cuando absorben luz<br />
ultravioleta (luz <strong>de</strong> longitud <strong>de</strong> onda<br />
corta). A medida que las moléculas<br />
excitadas regresan a su estado<br />
normal, liberan el exceso <strong>de</strong> energía<br />
en forma <strong>de</strong> luz visible <strong>de</strong> mayor<br />
longitud <strong>de</strong> onda que la radiación<br />
excitante. Esta propiedad se<br />
<strong>de</strong>nomina fluorescencia. Los objetos<br />
fluorescentes aparecen<br />
brillantemente iluminados contra un<br />
fondo oscuro, según el color <strong>de</strong>l colorante usado. En la figura anterior se<br />
representa un diagrama <strong>de</strong> un microscopio <strong>de</strong> fluorescencia.<br />
TINCIÓN FLUORESCENTE CON AURAMINA-RODAMINA<br />
Es una tinción muy usada para micobacterias, cuando el volumen <strong>de</strong> muestras a<br />
examinar es elevado. Se fundamenta en la afinidad que poseen los ácidos<br />
micólicos <strong>de</strong> la pared celular <strong>de</strong> las micobacterias por los colorantes<br />
fluorescentes o fluorocromos Auramina y Rodamina. Estos colorantes se fijan a<br />
las bacterias que aparecen <strong>de</strong> color amarillo o naranja brillante contra un fondo<br />
oscuro.<br />
Un aspecto importante <strong>de</strong> la coloración rodamina-auramina es que luego los<br />
frotis pue<strong>de</strong>n ser reteñidos con la coloración <strong>de</strong> Ziehl-Neelsen o Kinyoun<br />
directamente sobre la tinción con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite <strong>de</strong><br />
inmersión.<br />
Técnica:<br />
1. Extensión.<br />
2. Desecación.<br />
3. Fijación. Dejar enfriar.<br />
4. Coloración: Cubrir la preparación con el colorante auramina-rodamina<br />
previamente filtrado. Mantenerlo así durante 15 min. No hay que calentar.<br />
5. Lavar con agua <strong>de</strong>stilada.<br />
6. Decoloración con alcohol -HCl. Cubrir la preparación con el <strong>de</strong>colorante y<br />
<strong>de</strong>jar actuar <strong>de</strong> 3 a 4 minutos.<br />
7. Lavar con agua <strong>de</strong>stilada.<br />
8. Añadir permanganato potásico al 0,5% en agua <strong>de</strong>stilada y <strong>de</strong>jar actuar<br />
<strong>de</strong> 2 a 4 minutos. El permanganato se utiliza para eliminar la<br />
fluorescencia residual <strong>de</strong> los <strong>de</strong>sechos <strong>de</strong> fondo. Pero <strong>de</strong>be evitarse el<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
tratamiento excesivo con el contracolorante porque pue<strong>de</strong> rebajar la<br />
intensidad fluorescente <strong>de</strong> los bacilos coloreados.<br />
9. Lavar con agua <strong>de</strong>stilada.<br />
10. Secar al aire y observar con el microscopio <strong>de</strong> fluorescencia.<br />
El agudo contraste entre las micobacterias coloreadas brillantemente y el fondo<br />
oscuro ofrece las gran<strong>de</strong>s ventajas <strong>de</strong> una fácil, rápida y completa observación.<br />
Pue<strong>de</strong> usarse un objetivo <strong>de</strong> 25X (100X en la tinción <strong>de</strong> Ziehl-Neelsen y<br />
similares), para observar el frotis, lo que permite la inspección <strong>de</strong> un área<br />
extensa en poco tiempo. Otras ventajas son el mejor contraste, el mínimo<br />
esfuerzo visual y la relativa falta <strong>de</strong> importancia <strong>de</strong> la agu<strong>de</strong>za para el color <strong>de</strong>l<br />
observador.<br />
TINCIÓN FLUORESCENTE CON NARANJA DE ACRIDINA<br />
Se basa en la tinción <strong>de</strong> los ácidos nucleicos <strong>de</strong> los microorganismos por el<br />
fluorocromo naranja <strong>de</strong> acridina.<br />
Esta tinción se utiliza principalmente para el estudio <strong>de</strong> microorganismos en<br />
hemocultivos y líquido cefalorraquí<strong>de</strong>o.<br />
La técnica es muy simple:<br />
o Cubrir la preparación ya fijada con solución <strong>de</strong> naranja <strong>de</strong> acridina<br />
durante 2 min.<br />
o Lavar con agua <strong>de</strong>stilada.<br />
o Dejar secar.<br />
o Observar al microscopio <strong>de</strong> fluorescencia. Las bacterias se<br />
observan <strong>de</strong> color naranja fluorescente.<br />
TINCIÓN FLUORESCENTE CON BLANCO DE CALCOFLÚOR<br />
Las pare<strong>de</strong>s celulares <strong>de</strong> los hongos fijan el colorante blanco <strong>de</strong> calcoflúor<br />
aumentando consi<strong>de</strong>rablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras.<br />
En algunos laboratorios ha suplantado al azul <strong>de</strong> lactofenol en muchas<br />
aplicaciones. Los organismos fluorescen con luz blanco-azulada o ver<strong>de</strong><br />
manzana, según la fuente luminosa.<br />
TINCIONES DE INMUNOFLUORESCENCIA<br />
Estas tinciones se basan en el uso <strong>de</strong> colorantes conjugados con anticuerpos.<br />
Se emplean con profusión en el laboratorio los anticuerpos monoclonales, que<br />
son muy específicos, conjugados con isotiocianato <strong>de</strong> fluoresceína. Sus<br />
indicaciones son <strong>de</strong> dos tipos:<br />
o La tinción <strong>de</strong> inmunofluorescencia directa (IFD) es útil para el<br />
diagnóstico <strong>de</strong> Legionella, Neisseria gonorrhoeae y<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
microorganismos difíciles <strong>de</strong> cultivar como Treponema,<br />
Pneumocystis, Chlamydia, y virus Herpes.<br />
o La tinción <strong>de</strong> inmunofluorescencia indirecta (IFI) se utiliza<br />
preferentemente para el diagnóstico <strong>de</strong> algunas viriasis,<br />
investigando los anticuerpos en el suero (virus Epstein-Bar).<br />
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA<br />
El microscopio electrónico emplea electrones en vez <strong>de</strong> luz para visualizar<br />
objetos pequeños. Mediante el empleo <strong>de</strong>l microscopio electrónico se han<br />
<strong>de</strong>scubierto muchas características morfológicas <strong>de</strong> las bacterias, componentes<br />
bacterianos, hongos y parásitos.<br />
La microscopía electrónica permite efectuar el diagnóstico directo presuntivo <strong>de</strong><br />
diversas infecciones víricas, en particular las gastroenteritis e infecciones por<br />
herpes simple.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
TEMA 14.- TÉCNICAS DE CULTIVO Y<br />
AISLAMIENTO DE PATÓGENOS<br />
INTRODUCCIÓN.<br />
Para estudiar las reacciones metabólicas <strong>de</strong> las bacterias es necesario<br />
cultivarlas en medios <strong>de</strong> cultivo, que son mezclas <strong>de</strong> sustancias que<br />
proporcionan en forma asimilable todos los elementos necesarios para su<br />
crecimiento y multiplicación.<br />
Los medios <strong>de</strong> cultivo <strong>de</strong>ben incluir los elementos indispensables para la vida<br />
bacteriana, tales como carbono, nitrógeno, hidrógeno y oxígeno, elementos<br />
minerales (fósforo, azufre, calcio, magnesio e hierro), micronutrientes o<br />
elementos traza (Zn, Co, Cu, Mn,...) y factores <strong>de</strong> crecimiento (vitaminas, bases<br />
púricas y pirimidínicas, aminoácidos,...)<br />
COMPONENTES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.<br />
COMPONENTES BÁSICOS:<br />
• Agua: Para asimilar los alimentos, las bacterias necesitan agua. También<br />
da condiciones <strong>de</strong> humedad necesaria para la vida. El agua será <strong>de</strong>stilada<br />
ya que la <strong>de</strong>l grifo contiene calcio y magnesio que pue<strong>de</strong>n formar<br />
precipitados con otros compuestos <strong>de</strong>l medio <strong>de</strong> cultivo.<br />
• Peptonas: proteínas parcialmente hidrolizadas. Principalmente son fuente<br />
<strong>de</strong> nitrógeno, y también <strong>de</strong> carbono, azufre...<br />
• Extracto <strong>de</strong> carne: Constituye una fuente <strong>de</strong> carbono, nitrógeno, sales<br />
inorgánicas y factores <strong>de</strong> crecimiento.<br />
• Cloruro sódico: Tiene como fin proporcionar un a<strong>de</strong>cuado equilibrio<br />
osmótico. Incrementa la presión osmótica <strong>de</strong>l medio para evitar la lisis <strong>de</strong><br />
las bacterias.<br />
• Agentes solidificantes: Los contienen los medios sólidos y semisólidos.<br />
El agar es el más usado; la gelatina y la albúmina se usan escasamente.<br />
OTROS COMPONENTES:<br />
• Sustancias inhibidoras <strong>de</strong> crecimiento: Son sustancias que impi<strong>de</strong>n el<br />
crecimiento <strong>de</strong> los microorganismos que no nos interesan que se<br />
<strong>de</strong>sarrollen. Entre éstas po<strong>de</strong>mos citar colorantes como el cristal violeta,<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
el ver<strong>de</strong> brillante que inhiben a gram positivos; sales biliares que también<br />
inhiben a gram positivos; antibióticos, etc.<br />
• Indicadores: Se utilizan para <strong>de</strong>tectar variaciones en la aci<strong>de</strong>z o<br />
alcalinidad <strong>de</strong>l medio causadas por el metabolismo bacteriano. Estas<br />
variaciones se aprecian por el cambio <strong>de</strong> color <strong>de</strong>l indicador.<br />
• Sustancias enriquecedoras: Son sustancias que se aña<strong>de</strong>n para<br />
favorecer el crecimiento <strong>de</strong> ciertos microorganismos que son más<br />
exigentes. Ej.: suero, leche, sangre, huevo.<br />
• Agentes reductores: Se aña<strong>de</strong> a los medios para promover la<br />
anaerobiosis. Entre los más empleados están: tioglicolato sódico, cisteína,<br />
ác. ascórbico.<br />
• Hidratos <strong>de</strong> carbono: sobre todo mono y disacáridos. Se pue<strong>de</strong>n<br />
adicionar con fines <strong>de</strong> nutrición o para realizar pruebas <strong>de</strong> i<strong>de</strong>ntificación<br />
bioquímica.<br />
• Sales minerales: sulfatos y fosfatos <strong>de</strong> calcio, potasio, magnesio, hierro,..<br />
• Tampones estabilizadores <strong>de</strong>l pH: ya que éste pue<strong>de</strong> variar durante el<br />
proceso <strong>de</strong> preparación <strong>de</strong>l medio o como consecuencia <strong>de</strong> la<br />
acumulación <strong>de</strong> los productos <strong>de</strong>l metabolismo bacteriano.<br />
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO.<br />
NORMAS GENERALES.<br />
Los medios <strong>de</strong> cultivo se comercializan <strong>de</strong>secados, en forma <strong>de</strong> polvo, para su<br />
disolución y esterilización. Actualmente se pue<strong>de</strong>n adquirir también medios<br />
sólidos ya preparados, dispuestos en frascos, que se licuan mediante ebullición y<br />
se dispensan en placas; medios en tubos y medios sólidos en placa, listos para<br />
su inoculación.<br />
Aunque esta última práctica se ha extendido enormemente facilitando el trabajo<br />
rutinario, conviene conocer las operaciones necesarias para preparar un medio<br />
<strong>de</strong> cultivo en buenas condiciones. Para ello seguiremos los siguientes pasos:<br />
A) PESADA DE LOS COMPONENTES:<br />
Debe ser lo más precisa posible. Como hemos dicho anteriormente, actualmente<br />
los medios vienen <strong>de</strong>shidratados y no habría que pesar uno por uno cada<br />
componente.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
B) DISOLUCIÓN DE LOS COMPONENTES:<br />
Siempre se hace en agua <strong>de</strong>stilada, salvo indicación contraria. El agua<br />
<strong>de</strong>sionizada no se aconseja. Los recipientes <strong>de</strong>ben ser <strong>de</strong> vidrio y estar limpios.<br />
El calor favorece o es imprescindible para la disolución <strong>de</strong> algunos productos,<br />
pero <strong>de</strong>be limitarse al estrictamente necesario, sin llegar a la ebullición<br />
prolongada. Para evitar el <strong>de</strong>sbor<strong>de</strong> por ebullición, los envases con soluciones<br />
que <strong>de</strong>ben ser esterilizadas en el autoclave, sólo <strong>de</strong>ben contener dos tercios <strong>de</strong><br />
su volumen total <strong>de</strong> líquido.<br />
C) AJUSTE DEL pH:<br />
Es muy importante para la calidad <strong>de</strong>l medio. Se realiza con tiras indicadoras y<br />
soluciones <strong>de</strong> ácidos y bases. Normalmente se ajustan a pH neutro.<br />
D) REPARTO EN RECIPIENTES:<br />
Si el medio preparado se va a utilizar en tubos o frascos, se repartirá en éstos<br />
con ayuda <strong>de</strong> un dosificador, se les pondrá un tapón y una vez rotulados se<br />
dispondrán en gradillas o cestillos <strong>de</strong> autoclave y se proce<strong>de</strong>rá a su<br />
esterilización. Si el medio se fuera a repartir en placas <strong>de</strong> Petri, se esterilizará en<br />
el matraz don<strong>de</strong> se hubiese preparado y posteriormente se repartirá ante<br />
mechero en placas estériles.<br />
E) ESTERILIZACIÓN:<br />
Se suele realizar en el autoclave a 1 atm. <strong>de</strong> sobrepresión (121º C), durante 15-<br />
20 min..En caso <strong>de</strong> medios <strong>de</strong> cultivo que no se puedan esterilizar a estas<br />
temperaturas, se recurrirá a la filtración esterilizante o bien a la tindalización.<br />
Una vez que el ciclo <strong>de</strong> esterilización ha finalizado, <strong>de</strong>be reducirse lentamente la<br />
presión <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong>l autoclave. El medio no <strong>de</strong>be permanecer <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> éste una<br />
vez que se ha equilibrado la presión, ya que el calentamiento prolongado pue<strong>de</strong><br />
alterar alguno <strong>de</strong> los componentes.<br />
F) CONSERVACIÓN DE LOS MEDIOS:<br />
Deben conservarse en el refrigerador (las placas, invertidas e introducidas en<br />
bolsas <strong>de</strong> plástico; los tubos, convenientemente tapados). Transcurrido un mes,<br />
no se <strong>de</strong>be usar ningún medio.<br />
Si se quiere comprobar la esterilidad <strong>de</strong>l medio, se incuban las placas o tubos a<br />
37º C durante 48 h. y se comprueba si hay crecimiento.<br />
La calidad final <strong>de</strong>l medio <strong>de</strong> cultivo preparado <strong>de</strong>pen<strong>de</strong> <strong>de</strong> la forma en que se<br />
prepara, por lo que es <strong>de</strong> real importancia que se sigan las normas expuestas<br />
anteriormente.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.<br />
Se pue<strong>de</strong>n clasificar atendiendo a distintos criterios:<br />
ATENDIENDO A SU ESTADO FÍSICO:<br />
• Líquidos: favorecen mucho el <strong>de</strong>sarrollo y multiplicación <strong>de</strong> las bacterias<br />
porque al difundirse estas por todo el medio encuentran fácilmente las<br />
sustancias que necesitan para nutrirse. No contienen agar.<br />
• Sólidos: contienen <strong>de</strong> 15 a 17 g <strong>de</strong> agar por litro. Las bacterias crecen<br />
con mayor dificultad; no obstante, son <strong>de</strong> gran utilidad para el estudio <strong>de</strong><br />
las características <strong>de</strong> crecimiento, <strong>de</strong> la producción <strong>de</strong> hemólisis y otras<br />
peculiarida<strong>de</strong>s.<br />
• Semisólidos: se utilizan mucho para observar la movilidad <strong>de</strong> los<br />
microorganismos. Contienen agar en una proporción <strong>de</strong> 3 a 5 g. por litro.<br />
ATENDIENDO A SU <strong>UTIL</strong>IDAD:<br />
GENERALES O COMUNES:<br />
Son apropiados para el cultivo <strong>de</strong> la mayoría <strong>de</strong> los microorganismos por la<br />
facilidad con que se <strong>de</strong>sarrollan en ellos. Se usan para cultivar bacterias poco<br />
exigentes.<br />
Entre ellos po<strong>de</strong>mos citar el caldo nutritivo, el TSB, el agar nutritivo y el TSA.<br />
MEDIOS ESPECIALES:<br />
Conocidos también como específicos, van dirigidos al cultivo <strong>de</strong> <strong>de</strong>terminadas<br />
especies bacterianas o son utilizados con fines <strong>de</strong> diferenciación.<br />
Entre éstos tenemos:<br />
A) MEDIOS ENRIQUECIDOS: son medios generales a los que se les aña<strong>de</strong><br />
ciertos productos (sangre, suero, glucosa,...), favoreciendo así el crecimiento <strong>de</strong><br />
ciertos microorganismos muy exigentes. Ejemplos: agar-glucosa (agar nutritivo<br />
añadido <strong>de</strong> glucosa), agar sangre (agar nutritivo añadido <strong>de</strong> sangre), agar<br />
chocolate, etc.<br />
B) MEDIOS SELECTIVOS: estos medios contienen componentes que inhiben el<br />
<strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> ciertos microorganismos, lo cual permite aislar el microorganismo<br />
que se busca. Entre estos medios po<strong>de</strong>mos citar: agar Salmonella-Shigella (agar<br />
SS, selectivo para Salmonellas y Shigellas), agar MacConkey (se utiliza para el<br />
aislamiento <strong>de</strong> Enterobacterias), agar <strong>de</strong> Thayer-Martin (selectivo para<br />
Neisseria), agar Manitol salado (Chapman, selectivo <strong>de</strong> Estafilococos coagulasa<br />
positivos), agar <strong>de</strong> Lowenstein-Jensen (selectivo para el cultivo <strong>de</strong><br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
micobacterias, especialmente Mycobacterium tuberculosis, agar <strong>de</strong> Sabouraud<br />
(para el cultivo <strong>de</strong> la mayoría <strong>de</strong> las levaduras y hongos patógenos).<br />
C) MEDIOS DIFERENCIALES: son aquéllos en los que a<strong>de</strong>más <strong>de</strong> crecer las<br />
bacterias, al actuar éstas sobre alguno <strong>de</strong> los componentes específicos <strong>de</strong>l<br />
medio, <strong>de</strong>muestran alguna <strong>de</strong> sus propieda<strong>de</strong>s bioquímicas. Contienen<br />
azúcares e indicadores, concebidos para provocar una respuesta bioquímica<br />
conocida (si la bacteria es capaz <strong>de</strong> fermentar el azúcar que lleva el medio, se<br />
producirá una acidificación <strong>de</strong>l medio con el consiguiente viraje <strong>de</strong> color <strong>de</strong>l<br />
medio por el cambio <strong>de</strong> pH).<br />
Ejemplos:Agar hierro <strong>de</strong> Kligler, Agar <strong>de</strong> MacConkey (diferencia los bacilos<br />
entéricos fermentadores y no fermentadores <strong>de</strong> la lactosa.<br />
Fermentadores <strong>de</strong> lactosa---> colonias rosas;<br />
No fermentadores <strong>de</strong> lactosa (lactosa negativos) ---> colonias incoloras).<br />
D) MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO: son medios líquidos que favorecen o<br />
permiten la multiplicación <strong>de</strong> unas bacterias, inhibiendo parcial o totalmente la <strong>de</strong><br />
otras. Ejemplos: agua <strong>de</strong> peptona alcalina (favorece la multiplicación <strong>de</strong> Vibrio<br />
cholerae), caldo selenito (favorece el crecimiento <strong>de</strong> Salmonellas y Shigellas,<br />
fundamentalmente Salmonellas).<br />
E) MEDIOS DE TRANSPORTE: se utilizan para asegurar la viabilidad <strong>de</strong> las<br />
bacterias <strong>de</strong>s<strong>de</strong> el momento <strong>de</strong> la toma <strong>de</strong> las muestras hasta su posterior<br />
siembra en el laboratorio o para su envío <strong>de</strong> unos laboratorios a otros.<br />
Actualmente los medios <strong>de</strong> transporte más utilizados son los <strong>de</strong> Stuart, Amies, y<br />
el medio <strong>de</strong> Cary-Blair.<br />
F) MEDIOS DE CONSERVACIÓN: son una variación <strong>de</strong> los medios <strong>de</strong><br />
transporte. Aseguran las características morfológicas y fisiológicas <strong>de</strong> las<br />
bacterias por un periodo largo <strong>de</strong> tiempo. Ejemplo: agar <strong>de</strong> tripticasa y soja.<br />
Un gran número <strong>de</strong> medios <strong>de</strong> cultivo utilizados en el laboratorio <strong>de</strong><br />
microbiología se podrían englobar en varios <strong>de</strong> los grupos anteriormente<br />
expuestos. Ej.: agar sangre, es un medio enriquecido y diferencial.<br />
CONDICIONES NECESARIAS PARA EL DESARROLLO DE LOS<br />
PATÓGENOS.<br />
Para que las bacterias y hongos puedan <strong>de</strong>sarrollarse en un medio artificial,<br />
a<strong>de</strong>más <strong>de</strong> tener los nutrientes necesarios, se <strong>de</strong>ben cumplir una serie <strong>de</strong><br />
condiciones:<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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CONDICIONES ATMOSFÉRICAS:<br />
TEMARIO DE T.E.L<br />
Los microorganismos patógenos pue<strong>de</strong>n ser aerobios, anaerobios,<br />
microaerófilos, anaerobios facultativos y capnófilos.<br />
Aerobios; es <strong>de</strong>cir, utilizan el oxígeno como aceptor terminal <strong>de</strong> electrones y<br />
presentan un <strong>de</strong>sarrollo abundante en una atmósfera con la concentración<br />
normal <strong>de</strong>l aire.<br />
Anaerobios: relativamente intolerantes a la presencia <strong>de</strong> oxígeno.<br />
Microaerófilos: crecen bien en atmósferas con menor presión <strong>de</strong> oxígeno.<br />
Anaerobios facultativos: pue<strong>de</strong>n crecer en condiciones aerobias o anaerobias.<br />
Capnófilos: crecen mejor en una atmósfera con mayor concentración <strong>de</strong> CO2<br />
que la ambiental.<br />
Los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos pue<strong>de</strong>n ser incubados<br />
en una concentración <strong>de</strong> aire ambiental sin mayor dificultad.<br />
Los microorganismos capnófilos pue<strong>de</strong>n ser cultivados en una estufa <strong>de</strong><br />
incubación con puertas selladas, en una atmósfera <strong>de</strong> 5-10% <strong>de</strong> CO2.Una<br />
mezcla a<strong>de</strong>cuada <strong>de</strong> gas, contenido en cilindros cercanos, penetra<br />
automáticamente en la estufa. Como rutina <strong>de</strong>be controlarse la concentración <strong>de</strong><br />
CO2.<br />
El sistema más comúnmente usado para crear una atmósfera específica<br />
anaerobia o capnófila es la jarra anaerobia. Las que se encuentran en el<br />
comercio son la GasPak y las <strong>de</strong> Scott Laboratories y Oxoid U.S.A. Ambos<br />
sistemas utilizan una jarra <strong>de</strong> plástico transparente, pesada, con una abraza<strong>de</strong>ra<br />
para evitar pérdidas.<br />
Existen mo<strong>de</strong>los que presentan en la tapa<strong>de</strong>ra un manómetro y válvulas para<br />
hacer el vacío y para introducir la mezcla gaseosa que proporciona la<br />
anaerobiosis. En la cara interior <strong>de</strong> la tapa<strong>de</strong>ra hay una especie <strong>de</strong> "clip" para<br />
sujetar la bolsa que lleva el catalizador.<br />
Las jarras para anaerobiosis se emplean principalmente para cultivos en placas.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
La atmósfera anaerobia en el interior <strong>de</strong> estas jarras se pue<strong>de</strong> conseguir según<br />
varios procedimientos:<br />
A) TÉCNICA DE EVACUACION/REEMPLAZO:<br />
En este procedimiento se precisa primero crear el vacío mediante una bomba <strong>de</strong><br />
vacío y una vez hecho ésto se introducirá la mezcla gaseosa que suele estar<br />
constituida por un 10% <strong>de</strong> H2 , 5% <strong>de</strong> CO2 y 85% <strong>de</strong> N2 . Se usa un indicador<br />
redox que nos permite controlar si se ha producido o no la atmósfera anaerobia.<br />
B) TÉCNICA QUE EMPLEA UN SISTEMA GENERADOR DE H2 Y CO2:<br />
En este sistema utilizaremos:<br />
* Generador <strong>de</strong>scartable <strong>de</strong> H2-CO2, que consiste en una envoltura sellada <strong>de</strong><br />
papel <strong>de</strong> aluminio que contiene dos tabletas, una <strong>de</strong> las cuales contiene a su vez<br />
ácido cítrico y bicarbonato sódico y la otra borohidruro <strong>de</strong> sodio. Cuando se<br />
introduce agua en este sobre, la primera tableta libera CO2 y la segunda libera<br />
H2. El H2 producido, en presencia <strong>de</strong>l catalizador, reaccionará con el oxígeno<br />
presente, produciendo agua.<br />
2H2 + O2 ------> 2H2O<br />
Existen sobres generadores <strong>de</strong> atmósferas especiales requeridas por<br />
<strong>de</strong>terminados microorganismos.<br />
* Indicador <strong>de</strong> anaerobiosis: los hay <strong>de</strong> tipo bacteriológico y químico.<br />
Los bacteriológicos consisten en introducir en la jarra un cultivo <strong>de</strong> un aerobio<br />
estricto; si éste crece, indica un fallo en el establecimiento <strong>de</strong> la atmósfera <strong>de</strong><br />
anaerobiosis. El inconveniente <strong>de</strong> estos indicadores es que los resultados no son<br />
conocidos hasta el final <strong>de</strong>l período <strong>de</strong> incubación.<br />
Por ello, son más usados los indicadores químicos, los cuales se <strong>de</strong>coloran<br />
cuando están reducidos. En el mercado existen indicadores químicos como son<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
las tiras <strong>de</strong> azul <strong>de</strong> metileno y tiras <strong>de</strong> resazurina. El azul <strong>de</strong> metileno es azul<br />
cuando está oxidado y la resazurina es rosa.<br />
* Catalizador en "frío": consta <strong>de</strong> unas bolitas <strong>de</strong> alúmina recubiertas <strong>de</strong><br />
paladio. Este catalizador se inactiva por el SH2 y otros productos metabólicos<br />
volátiles producidos por las bacterias, así como por el exceso <strong>de</strong> humedad. Se<br />
asegura una actividad óptima <strong>de</strong>l catalizador reemplazándolo por uno nuevo<br />
cada vez o bien "reactivándolo" <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> cada utilización, lo cual se consigue<br />
calentándolo en el horno a 160-170ºC durante 2 horas, y manteniéndolo en<br />
recipiente seco y limpio <strong>de</strong>spués <strong>de</strong>l calentamiento.<br />
El proceso a seguir en esta técnica es el siguiente:<br />
1. Reemplazar el catalizador por uno nuevo o "reactivado."<br />
2. Colocar los materiales a incubar en la jarra; si son placas se colocaran en<br />
el portaplacas <strong>de</strong> forma invertida<br />
3. Abrir el sobre <strong>de</strong>l indicador y exponer unos 10 mm <strong>de</strong> la tira.<br />
4. Añadir 10 ml <strong>de</strong> agua al sobre generador.<br />
5. Cerrar la jarra herméticamente y meterla en estufa para incubación.<br />
6. Se pue<strong>de</strong> comprobar el buen <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong>l proceso por los siguientes<br />
datos:<br />
a. La tapa<strong>de</strong>ra, con el catalizador en su superficie interna, <strong>de</strong>be estar<br />
caliente al tacto.<br />
b. Debe aparecer en el interior <strong>de</strong> la jarra agua <strong>de</strong> con<strong>de</strong>nsación a los<br />
15-30 minutos <strong>de</strong> haber añadido el agua al generador.<br />
c. El indicador cambiará <strong>de</strong> color a las dos o tres horas.<br />
d. Si la jarra lleva manómetro, se pue<strong>de</strong> observar el buen <strong>de</strong>sarrollo<br />
<strong>de</strong>l proceso mediante la evolución <strong>de</strong> los cambios <strong>de</strong> presión: la<br />
producción <strong>de</strong> gas origina una presión positiva <strong>de</strong><br />
aproximadamente 0,3 bar. La presión bajará en un período <strong>de</strong><br />
30-40 minutos a 0,1 bares aproximadamente.<br />
C) TÉCNICA QUE EMPLEA UN SISTEMA GENERADOR DE CO2:<br />
En este sistema se utiliza el generador <strong>de</strong>scartable <strong>de</strong> CO2 y un indicador <strong>de</strong><br />
anaerobiosis (igual al <strong>de</strong>scrito anteriormente.)<br />
El generador <strong>de</strong>scartable <strong>de</strong> CO2 consiste en un sobre que contiene como<br />
principio activo el ácido ascórbico. Cuando este sobre se coloca en una jarra<br />
cerrada, el oxígeno atmosférico <strong>de</strong> la jarra es rápidamente absorbido con la<br />
generación simultánea <strong>de</strong> dióxido <strong>de</strong> carbono. Este método difiere <strong>de</strong>l anterior en<br />
que la reacción continúa sin producción <strong>de</strong> hidrógeno, y por tanto no requiere un<br />
catalizador. Tampoco es necesaria la adición <strong>de</strong> agua para activar la reacción.<br />
Precauciones: tan pronto como la bolsita es expuesta al aire se inicia la<br />
reacción. Es por tanto esencial colocar ésta en la jarra y cerrar ésta última en<br />
menos <strong>de</strong> un minuto.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
Las condiciones anaerobias estrictas que exigen algunos microorganismos<br />
pue<strong>de</strong>n obtenerse en sistemas cerrados como una caja con guantes anaerobios<br />
o cámara anaerobia, que consiste en una cámara <strong>de</strong> gas sellada con puertas en<br />
forma <strong>de</strong> guantes y una cerradura para la transferencia <strong>de</strong> materiales <strong>de</strong>ntro y<br />
fuera <strong>de</strong> la cámara. El operador coloca sus manos y brazos <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> los<br />
guantes para manejar los materiales <strong>de</strong> cultivo que se han colocado <strong>de</strong>ntro. Para<br />
crear la atmósfera <strong>de</strong> anaerobiosis se usa un sistema similar al <strong>de</strong>scrito en la<br />
técnica <strong>de</strong> evacuación/reemplazo en la jarra <strong>de</strong> anaerobiosis. Con objeto <strong>de</strong><br />
eliminar el oxígeno residual que haya podido quedar se hace circular H2 a través<br />
<strong>de</strong> un catalizador <strong>de</strong> paladio.<br />
Los medios se incuban <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> una incubadora colocada <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> la cámara<br />
o bien manteniendo toda la cámara a 35º C.<br />
TEMPERATURA:<br />
La temperatura óptima <strong>de</strong> incubación para la mayoría <strong>de</strong> los patógenos humanos<br />
está próxima a la corporal (35-37º C), pero existen variaciones. Algunos no<br />
pue<strong>de</strong>n soportar esta Tª, y otros tienen un margen más amplio. Determinados<br />
hongos y levaduras <strong>de</strong>rmatofitos, crecen mejor a temperatura ambiente, próxima<br />
a los 30ºC.<br />
Es muy importante que la Tª <strong>de</strong> incubación se mantenga en los límites<br />
establecidos durante todo el proceso .La humedad pue<strong>de</strong> ser controlada <strong>de</strong><br />
forma automática si se hace llegar agua <strong>de</strong>s<strong>de</strong> una fuente externa a medida que<br />
el sistema lo necesita o manualmente si se coloca un recipiente con agua en el<br />
estante inferior <strong>de</strong> la estufa.<br />
TIEMPO DE INCUBACIÓN:<br />
Será <strong>de</strong> 18-24 h, en términos generales. Algunas bacterias necesitan una<br />
incubación adicional para <strong>de</strong>sarrollarse bien y han <strong>de</strong> mantenerse hasta 48-72 h.<br />
A veces será necesario más tiempo, como por ejemplo las que crecen a Tª < 17º<br />
(psicrófilas) se mantienen 5 días a 17º C.; 15 días para los hongos <strong>de</strong>rmatofitos.<br />
pH DEL MEDIO :<br />
Las bacterias se <strong>de</strong>sarrollan habitualmente a pH próximo a la neutralidad,<br />
aunque algunas exigen un pH específico distinto.<br />
PRESIÓN OSMÓTICA:<br />
Debido a la composición <strong>de</strong> la pared celular bacteriana, las bacterias se adaptan<br />
bien a las variaciones <strong>de</strong> la presión osmótica; sin embargo, "in vitro", los medios<br />
<strong>de</strong> cultivo se preparan en condiciones <strong>de</strong> isotonía.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
CARACTERISTICAS DE ALGUNOS MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS<br />
CON MAYOR FRECUENCIA.<br />
Existen en el mercado una extensísima variedad <strong>de</strong> medios <strong>de</strong> cultivo, útiles<br />
para su empleo en el laboratorio <strong>de</strong> Microbiología clínica, con lo que se van a<br />
consi<strong>de</strong>rar solamente aquellos <strong>de</strong> mayor interés para el diagnóstico general.<br />
AGAR NUTRITIVO<br />
Composición: extracto <strong>de</strong> carne, peptona, cloruro sódico, agar y agua <strong>de</strong>stilada.<br />
Es un medio <strong>de</strong> cultivo general.Sirve como base para la preparación <strong>de</strong> otros<br />
medios enriquecidos y selectivos.<br />
CALDO DE TRIPTICASA Y SOJA ( TSB )<br />
Composición: tripticasa, soja y agua <strong>de</strong>stilada.<br />
Es un medio <strong>de</strong> uso general. Se pue<strong>de</strong> adicionar <strong>de</strong> agar para obtener un medio<br />
sólido que, dispuesto en tubos inclinados, es <strong>de</strong> utilidad para el mantenimiento<br />
<strong>de</strong> microorganismos. Si se le aña<strong>de</strong> cistina se obtiene un medio más reducido y<br />
capaz <strong>de</strong> conservar microorganismos que requieren bajas concentraciones <strong>de</strong><br />
oxígeno.<br />
INFUSION DE CEREBRO Y CORAZON( BHI )<br />
Composición: infusión <strong>de</strong> cerebro y corazón, peptona, glucosa, cloruro sódico,<br />
fosfato disódico y agua <strong>de</strong>stilada.<br />
Es un medio enriquecido. Es un excelente caldo para hemocultivo.<br />
CALDO DE TIOGLICOLATO<br />
Composición: caseína, extracto <strong>de</strong> levadura, cloruro sódico, glucosa, tioglicolato<br />
sódico, L-cistina, resazurina, agar y agua <strong>de</strong>stilada.<br />
Es el caldo <strong>de</strong> enriquecimiento más comúnmente usado en microbiología clínica.<br />
Este medio lleva agentes reductores (tioglicolato y L-cistina) que disminuyen el<br />
cociente <strong>de</strong> óxido-reducción y favorece el <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> anaerobios. La<br />
resazurina actúa como indicador (presenta color rosa en estado oxidado).La<br />
pequeña proporción <strong>de</strong> agar (0,75 g/l) que contiene el medio tiene como finalidad<br />
evitar que las corrientes <strong>de</strong> convección transporten el oxígeno atmosférico a toda<br />
la masa <strong>de</strong> caldo.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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AGAR DE STUART<br />
TEMARIO DE T.E.L<br />
Composición: ácido tioglicólico, glicerofosfato sódico, cloruro cálcico, agar y agua<br />
<strong>de</strong>stilada.<br />
Es un medio especialmente creado para el transporte <strong>de</strong> muestras. Va dispuesto<br />
en tubos, en estado semisólido y con una profundidad a<strong>de</strong>cuada, para conseguir<br />
el fin que preten<strong>de</strong>.<br />
AGAR DE MUELLER-HINTON<br />
Composición: infusión <strong>de</strong> carne, aminoácidos, almidón, agar y agua <strong>de</strong>stilada.<br />
Es un medio enriquecido, utilizado como medio <strong>de</strong> elección para realizar pruebas<br />
<strong>de</strong> sensibilidad a los antimicrobianos (antibiograma).<br />
AGAR SANGRE<br />
Composición: extracto <strong>de</strong> carne, peptona, cloruro sódico, sangre, agar y agua<br />
<strong>de</strong>stilada.<br />
Es un medio enriquecido utilizado para el cultivo <strong>de</strong> microorganismos exigentes,<br />
así como para estudiar la actividad hemolítica.<br />
El medio base utilizado con mayor frecuencia para la fabricación <strong>de</strong> agar sangre<br />
es el TSA (agar tripticasa soja), al que se adiciona sangre <strong>de</strong>sfibrinada <strong>de</strong><br />
carnero, conejo o caballo en una proporción <strong>de</strong>l 5-10%.La sangre se aña<strong>de</strong> al<br />
agar esterilizado y enfriado a 45-50º C, evitando la formación <strong>de</strong> burbujas. La<br />
sangre humana proce<strong>de</strong>nte <strong>de</strong> banco tiene el inconveniente <strong>de</strong> contener citrato,<br />
que pue<strong>de</strong> inhibir el crecimiento <strong>de</strong> algunos microorganismos.<br />
AGAR SANGRE PARA ANAEROBIOS<br />
Se trata <strong>de</strong>l mismo medio <strong>de</strong> agar sangre, al que se adicionan antibióticos para<br />
el aislamiento selectivo <strong>de</strong> anaerobios. Los aminoglucósidos y la vancomicina<br />
son los más empleados. El medio toma el nombre <strong>de</strong>l antibiótico que lleva<br />
incorporado: ejemplo agar kanamicina-vancomicina.<br />
Medios enriquecidos muy utilizados son los <strong>de</strong> Schaedler y Wilkins-Chalgren.<br />
AGAR CHOCOLATE<br />
Composición: extracto <strong>de</strong> carne, peptona, cloruro sódico, sangre, agar y agua<br />
<strong>de</strong>stilada.<br />
Lleva como base agar nutritivo, al que se agrega sangre <strong>de</strong>sfibrinada cuando el<br />
medio está a una temperatura <strong>de</strong> aproximadamente 80º C. El calentamiento<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
tiene como fin la liberación <strong>de</strong> los factores X ( hemina) y V (difosfo-piridín-a<strong>de</strong>nínnucleótido),<br />
necesarios para el <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> algunos microorganismos. Está<br />
especialmente indicado para Neisseria y Haemophilus.<br />
AGAR CLED<br />
Composición: extracto <strong>de</strong> carne, peptona, triptona, L-cistina, lactosa, azul <strong>de</strong><br />
bromotimol, agar y agua <strong>de</strong>stilada.<br />
Utilizado para el aislamiento y recuento <strong>de</strong> microorganismos en la orina. La<br />
<strong>de</strong>ficiencia en electrolitos logra inhibir la invasión o swarming <strong>de</strong>l género Proteus.<br />
La lactosa permite diferenciar los microorganismos fermentadores por el viraje<br />
<strong>de</strong>l indicador a amarillo.<br />
AGAR MAC CONKEY<br />
Composición: peptona, lactosa, cloruro sódico, sales biliares, cristal violeta, rojo<br />
neutro, agar y agua <strong>de</strong>stilada.<br />
Es el medio primario selectivo y diferencial que se emplea más a menudo para el<br />
aislamiento y diferenciación <strong>de</strong> bacilos entéricos gram negativos fermentadores y<br />
no fermentadores <strong>de</strong> lactosa. Las sales biliares y el cristal violeta actúan como<br />
inhibidores <strong>de</strong> gram positivos. Las bacterias que fermentan la lactosa producen<br />
colonias <strong>de</strong> color rojo que pue<strong>de</strong>n estar ro<strong>de</strong>adas <strong>de</strong> una zona opaca <strong>de</strong>bida a la<br />
precipitación <strong>de</strong> las sales biliares; las no fermentadoras dan colonias incoloras<br />
más o menos transparentes.<br />
AGAR DE LEVINE O EOSINA AZUL DE METILENO (EMB)<br />
Composición: peptona, fosfato dipotásico, lactosa, eosina, azul <strong>de</strong> metileno, agar<br />
y agua <strong>de</strong>stilada.<br />
Es un medio selectivo y diferencial que se usa para el aislamiento, el cultivo y<br />
diferenciación <strong>de</strong> bacilos entéricos gram negativos. Las colonias fermentadoras<br />
<strong>de</strong> la lactosa presentan un tono violeta más o menos intenso.<br />
AGAR XLD (Xilosa-Lisina-Desoxicolato sódico)<br />
Composición: extracto <strong>de</strong> levadura, xilosa, lactosa, sacarosa, lisina, <strong>de</strong>soxicolato<br />
sódico, cloruro sódico, tiosulfato sódico, citrato férrico-amónico, rojo fenol, agar y<br />
agua <strong>de</strong>stilada.<br />
Se consi<strong>de</strong>ra un medio <strong>de</strong> selectividad mo<strong>de</strong>rada recomendado para el<br />
aislamiento <strong>de</strong> Shigella (colonias transparentes no fermentadoras) y Salmonella<br />
(colonias transparentes y negras no fermentadoras). El citrato y tiosulfato<br />
permiten la visualización <strong>de</strong> microorganismos productores <strong>de</strong> sulfhídrico como<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
colonias con centros negros. El <strong>de</strong>soxicolato sódico actúa como agente<br />
selectivo.<br />
AGAR DE HEKTOEN<br />
Composición: extracto <strong>de</strong> levadura, peptona, lactosa, sacarosa, salicina, sales<br />
biliares, fucsina ácida, cloruro sódico, hiposulfito sódico, citrato férrico-amónico,<br />
azul <strong>de</strong> bromotimol, agar y agua <strong>de</strong>stilada.<br />
Es un medio diferencial y altamente selectivo para Salmonellas y Shigellas. Al<br />
igual que el agar XLD, no necesita ser esterilizado en el autoclave antes <strong>de</strong><br />
verterlo en las placas, <strong>de</strong>bido a que son tan pocos los microorganismos que<br />
pue<strong>de</strong>n <strong>de</strong>sarrollar en él.<br />
AGAR S-S (SALMONELLA-SHIGELLA)<br />
Composición: extracto <strong>de</strong> carne, peptona, lactosa, sales biliares, citrato sódico,<br />
citrato férrico, tiosulfato sódico, ver<strong>de</strong> brillante, rojo neutro, agar y agua <strong>de</strong>stilada.<br />
Es un medio diferencial selectivo utilizado para el aislamiento <strong>de</strong> Salmonellas y<br />
Shigella. El <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> otros bacilos gram negativos y <strong>de</strong> cocos gram positivos<br />
está inhibido por el ver<strong>de</strong> brillante, las sales biliares y las elevadas<br />
concentraciones <strong>de</strong> tiosulfato y citrato.<br />
CALDO DE SELENITO<br />
Composición: triptona, fosfato disódico, lactosa, selenito sódico y agua <strong>de</strong>stilada.<br />
Se utiliza para el enriquecimiento <strong>de</strong> Salmonella. El selenito presente en el<br />
medio inhibe a otras bacterias entéricas en las primeras horas <strong>de</strong> incubación.<br />
CALDO GN<br />
Composición: triptona, glucosa, manitol, citrato sódico, <strong>de</strong>soxicolato sódico,<br />
cloruro sódico, fosfato dipotásico, fosfato monopotásico y agua <strong>de</strong>stilada.<br />
Se emplea como caldo <strong>de</strong> enriquecimiento selectivo para el cultivo <strong>de</strong><br />
Salmonellas y Shigellas.<br />
CALDO DE TETRATIONATO<br />
Composición: peptona <strong>de</strong> soja, hidrolizado trípsico <strong>de</strong> caseína, cloruro sódico,<br />
carbonato cálcico, bilis, tiosulfato sódico y agua <strong>de</strong>stilada.<br />
Es un medio selectivo utilizado para el enriquecimiento <strong>de</strong> Salmonella.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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AGAR CIN<br />
TEMARIO DE T.E.L<br />
Composición: extracto <strong>de</strong> levadura, peptona, manitol, sales biliares, cefsulodina,<br />
irgasán, novobiocina, rojo neutro, cristal violeta, agar y agua <strong>de</strong>stilada.<br />
Es un medio selectivo para Yersinia.<br />
AGAR MANITOL SALADO (CHAPMAN)<br />
Composición: extracto <strong>de</strong> carne, peptona, cloruro sódico, manitol, rojo fenol, agar<br />
y agua <strong>de</strong>stilada.<br />
Es un medio selectivo utilizado para el aislamiento <strong>de</strong> Staphylococcus, basado<br />
en la tolerancia que poseen a una alta concentración <strong>de</strong> cloruro sódico (7,5%).<br />
Sirve también como medio diferencial <strong>de</strong> cepas fermentadoras <strong>de</strong>l manitol.<br />
Staphylococcus aureus en condiciones anaerobias es la única especie <strong>de</strong>l<br />
género que produce esta fermentación.<br />
AGAR DE THAYER MARTIN<br />
Tiene como base el agar chocolate, suplementado por la adición <strong>de</strong> extracto <strong>de</strong><br />
levadura y otros factores <strong>de</strong> enriquecimiento. También lleva añadidos antibióticos<br />
tales como vancomicina, colimicina y nistatina, lo que le confiere un carácter<br />
altamente selectivo.<br />
El medio <strong>de</strong> Thayer Martin permite el crecimiento <strong>de</strong> cepas exigentes <strong>de</strong><br />
Neisseria, tales como Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis.<br />
AGAR NEW YORK CITY(NYC)<br />
Es un medio muy similar al anterior, usado con los mismos fines. A<strong>de</strong>más <strong>de</strong> los<br />
tres antimicrobianos <strong>de</strong>l agar <strong>de</strong> Thayer-Martin, lleva añadido trimetoprim para<br />
hacerlo más selectivo.<br />
AGAR GARDNERELLA<br />
Composición: extracto <strong>de</strong> carne, peptona, cloruro sódico, sangre humana, tween<br />
80, ácido nalidíxico, colimicina, anfotericina B, agar y agua <strong>de</strong>stilada.<br />
Permite el crecimiento rápido <strong>de</strong> Gardnerella vaginalis.<br />
AGAR GRANADA<br />
Composición: proteosa peptona, almidón, glucosa, piruvato sódico, fosfato<br />
disódico, MOPS hemisódico, metotrexato, colimicina, metronidazol, cristal<br />
violeta, suero <strong>de</strong> caballo, agar y agua <strong>de</strong>stilada.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
Es un medio especial y selectivo para el aislamiento, <strong>de</strong>tección e i<strong>de</strong>ntificación<br />
<strong>de</strong> Streptococcus agalactiae (grupo B).Para que el medio ofrezca un rendimiento<br />
<strong>de</strong>l 100% <strong>de</strong>be incubarse en anaerobiosis.<br />
AGAR DE BORDET-GENGOU<br />
Composición: infusión <strong>de</strong> patata, proteosa peptona, cloruro sódico, glicerol<br />
sangre, agar.<br />
Es un medio enriquecido que se utiliza para el aislamiento <strong>de</strong> las especies <strong>de</strong>l<br />
género Bor<strong>de</strong><strong>tel</strong>la.<br />
MEDIO DE LOEFFLER<br />
Composición: suero <strong>de</strong> buey, caldo glucosado, polvo <strong>de</strong> huevo.<br />
Se utiliza para el cultivo <strong>de</strong> Corynebacterium y otros microorganismos exigentes.<br />
Asimismo en él se pone en evi<strong>de</strong>ncia la cromogénesis y po<strong>de</strong>r proteolítico <strong>de</strong><br />
ciertas bacterias.<br />
AGAR SABOURAUD<br />
Composición: peptona, glucosa, agar y agua <strong>de</strong>stilada.<br />
Este medio se adapta particularmente al cultivo <strong>de</strong> la mayoría <strong>de</strong> levaduras y<br />
hongos patógenos. El medio contiene una cantidad mínima <strong>de</strong> nutrientes y un<br />
pH ácido (5,6) que lo hace selectivo. Suele adicionarse <strong>de</strong> antibióticos<br />
(gentamicina, cloranfenicol) para potenciar su selectividad.<br />
AGAR DE LOWENSTEIN-JENSEN<br />
Composición: fosfato monopotásico, sulfato magnésico, citrato magnésico,<br />
asparagina, fécula <strong>de</strong> patata, glicerina, ver<strong>de</strong> malaquita, huevo y agua <strong>de</strong>stilada.<br />
Es un medio utilizado para el cultivo <strong>de</strong> Mycobacterium. En este medio también<br />
pue<strong>de</strong>n crecer y diferenciarse las especies <strong>de</strong>l género Nocardia. Se <strong>de</strong>be<br />
esterilizar por tindalización.<br />
AGAR CAMPYLOBACTER (PRESTON)<br />
Composición: caldo nutritivo, carbón activado, hidrolizado <strong>de</strong> caseína,<br />
<strong>de</strong>soxicolato sódico, sulfato ferroso, piruvato sódico, cefoperazona, agar y agua<br />
<strong>de</strong>stilada.<br />
Ha sido especialmente preparado para el cultivo y diferenciación <strong>de</strong> especies <strong>de</strong>l<br />
género Campylobacter a partir <strong>de</strong> muestras fecales. La incubación a temperatura<br />
elevada (42ºC) limita mucho el crecimiento <strong>de</strong> la flora acompañante.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
Otro medio también utilizado para el aislamiento <strong>de</strong> Campylobacter es el agar<br />
Skirrow.<br />
AGAR COLUMBIA<br />
Composición: mezcla <strong>de</strong> peptonas, almidón, cloruro sódico, agar y agua<br />
<strong>de</strong>stilada.<br />
Es un medio enriquecido que se utiliza para el cultivo <strong>de</strong> microorganismos<br />
exigentes y como base para la preparación <strong>de</strong> agar sangre y agar chocolate.<br />
AGAR TCBS<br />
Composición: peptona <strong>de</strong> caseína, peptona <strong>de</strong> carne, extracto <strong>de</strong> levadura,<br />
citrato sódico, tiosulfato sódico, agar y agua <strong>de</strong>stilada.<br />
El agar TCBS es un medio selectivo utilizado para el aislamiento <strong>de</strong> Vibrio.<br />
TECNICAS DE AISLAMIENTO EN PLACA O INOCULACION POR ESTRIAS Y<br />
RECUENTO DE PATOGENOS<br />
Para el aislamiento, por lo general el inóculo se extien<strong>de</strong> sobre la superficie <strong>de</strong><br />
las placas según un mo<strong>de</strong>lo o patrón estandarizado, <strong>de</strong> modo que el <strong>de</strong>sarrollo<br />
bacteriano pueda ser <strong>de</strong>terminado en forma semicuantitativa o relativa. Un<br />
mo<strong>de</strong>lo útil <strong>de</strong> estrías se presenta en la figura.<br />
Hay otras técnicas <strong>de</strong> estriación, con ligeras modificaciones, que persiguen fines<br />
concretos: estriación <strong>de</strong> 3/4 <strong>de</strong> la placa para muestras con alto contenido<br />
microbiano, estriación <strong>de</strong> varias placas en ca<strong>de</strong>na para muestras con flora mixta<br />
difícil <strong>de</strong> separar (aislamiento por agotamiento), <strong>de</strong>scarga central con<br />
estriaciones laterales para muestras con escaso contenido microbiano, estriación<br />
libre, según las preferencias.<br />
Cuando se trabaja con muestras muy espesas, como esputo, y con algunos<br />
medios muy selectivos, como los agares para heces, se obtienen mejores<br />
aislamientos si se lleva el asa varias veces al área <strong>de</strong> inoculación original<br />
durante la etapa <strong>de</strong> siembra inicial. Consi<strong>de</strong>remos que para la mayoría <strong>de</strong> las<br />
muestras no es necesario quemar el asa entre dos áreas <strong>de</strong> siembra, pero<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
pue<strong>de</strong> ser beneficioso cuando el inóculo original proviene <strong>de</strong> una colonia<br />
bacteriana en crecimiento.<br />
Para facilitar el recuento <strong>de</strong> las colonias <strong>de</strong>be sembrarse la placa con una<br />
cantidad medida <strong>de</strong> inóculo con un asa calibrada y siguiendo la técnica <strong>de</strong><br />
siembra masiva, como se muestra en la figura.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
TEMA 15.- MÉTODOS DE<br />
IDENTIFICACIÓN BACTERIANA<br />
INTRODUCCIÓN<br />
En clínica la rápida y correcta i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong>l microorganismo o<br />
microorganismos causantes <strong>de</strong> una infección pue<strong>de</strong> ser trascen<strong>de</strong>ntal para la<br />
implantación <strong>de</strong>l tratamiento a<strong>de</strong>cuado. De ahí la importancia <strong>de</strong> las pruebas que<br />
se seleccionen para llegar a dicha i<strong>de</strong>ntificación.<br />
El método más extendido para llegar a la i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> microorganismos se<br />
basa en la realización <strong>de</strong> una batería <strong>de</strong> pruebas bioquímicas, a través <strong>de</strong> las<br />
cuales se va a <strong>de</strong>tectar el metabolismo <strong>de</strong>l microorganismo, enzimas que posee,<br />
características <strong>de</strong> resistencia a <strong>de</strong>terminadas sustancias, etc... La i<strong>de</strong>ntificación<br />
es tanto mejor cuanto mayor es el número <strong>de</strong> caracteres investigados.<br />
Para realizar correctamente las pruebas bioquímicas es fundamental tener<br />
colonias perfectamente aisladas, es <strong>de</strong>cir, partir <strong>de</strong> cultivos puros. Por otro<br />
lado, se <strong>de</strong>be realizar un control periódico <strong>de</strong> medios y reactivos mediante el<br />
empleo <strong>de</strong> microorganismos positivos y negativos.<br />
CLASIFICACIÓN DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS<br />
Las pruebas bioquímicas <strong>de</strong> i<strong>de</strong>ntificación bacteriana las po<strong>de</strong>mos clasificar<br />
atendiendo a varios criterios:<br />
PROCESOS RESPIRATORIOS QUE <strong>UTIL</strong>IZAN LAS BACTERIAS PARA LA<br />
OBTENCIÓN DE ENERGÍA<br />
A) PRUEBA DE LA CATALASA<br />
* Fundamento: se investiga la presencia en el microorganismo <strong>de</strong> la enzima<br />
catalasa, capaz <strong>de</strong> <strong>de</strong>scomponer el peróxido <strong>de</strong> hidrógeno o agua oxigenada<br />
(H2O2) en H2O y O2, que se <strong>de</strong>spren<strong>de</strong> en forma <strong>de</strong> burbujas en el medio. El<br />
H2O2 se forma como un producto terminal oxidativo <strong>de</strong> la <strong>de</strong>scomposición<br />
aeróbica <strong>de</strong> los azúcares; si se acumulara sería tóxica para la bacteria.<br />
* Reactivo: H2O2 <strong>de</strong> 10 volúmenes (3%).<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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* Técnica:<br />
TEMARIO DE T.E.L<br />
Con un asa o hilo <strong>de</strong> inoculación, recoger el centro <strong>de</strong> una colonia pura <strong>de</strong> 18-24<br />
h. y colocarla sobre un portaobjetos limpio. A continuación agregar una gota <strong>de</strong><br />
agua oxigenada <strong>de</strong> 10 volúmenes sobre el microorganismo <strong>de</strong>l portaobjetos.<br />
No invertir el or<strong>de</strong>n <strong>de</strong>l método pues pue<strong>de</strong>n registrarse falsos positivos<br />
especialmente si se utilizan hilos o asas que contengan hierro. Si se están<br />
utilizando asas o hilos <strong>de</strong> platino también se pue<strong>de</strong> caer en este error ya que el<br />
platino pue<strong>de</strong> producir un resultado falsamente positivo. El nicrom no ocasiona<br />
estos problemas. No es necesaria la mezcla <strong>de</strong>l cultivo y el agua oxigenada con<br />
la aguja o el asa <strong>de</strong> inoculación.<br />
Si el microorganismo es catalasa [+] se observará <strong>de</strong> inmediato la aparición <strong>de</strong><br />
burbujas (liberación <strong>de</strong> gas).<br />
También se pue<strong>de</strong> realizar esta prueba agregando directamente el agua<br />
oxigenada a un cultivo puro <strong>de</strong> agar en pico <strong>de</strong> flauta o en placa (sobre colonias<br />
aisladas en este caso).<br />
* Precauciones:<br />
• Se <strong>de</strong>be evitar la utilización <strong>de</strong> agar-sangre como medio <strong>de</strong> cultivo ya que<br />
los eritrocitos contienen la enzima catalasa y po<strong>de</strong>mos obtener falsos<br />
positivos.<br />
• El H2O2 al 30% (100 volúmenes ) es una solución bastante cáustica.<br />
• No se <strong>de</strong>ben usar cultivos excesivamente viejos, ya que con el tiempo<br />
pue<strong>de</strong>n per<strong>de</strong>r la actividad catalásica, pudiéndose obtener falsos<br />
resultados negativos.<br />
• No utilizar asas o hilos <strong>de</strong> platino, ni que contengan vestigios <strong>de</strong> hierro.<br />
* Interés: diferenciación <strong>de</strong> los géneros:<br />
- Streptococcus [-], Micrococcus [+] y Staphylococcus [+]<br />
- Clostridium [-] y Bacillus [+].<br />
B) PRUEBA DE LA OXIDASA<br />
* Fundamento: se investiga la presencia <strong>de</strong> la enzima citocromooxidasa en el<br />
microorganismo, la cual oxida al dimetil-parafenilen-diamina (reactivo incoloro)<br />
dando un producto <strong>de</strong> color.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
El sistema citocromooxidasa se encuentra, por lo general, en microorganismos<br />
aerobios.<br />
* Reactivos: Dimetil-p-fenilendiamina o tetrametil-p-fenilendiamina impregnado<br />
sobre tiras o discos <strong>de</strong> papel <strong>de</strong> filtro.<br />
* Técnica. Lectura e interpretación <strong>de</strong> resultados:<br />
1. Colocar una tira o disco impregnado <strong>de</strong> reactivo en un porta.<br />
2. Tomar una colonia con el asa y <strong>de</strong>positarla sobre la tira o disco.<br />
3. La aparición <strong>de</strong> un color azul oscuro indica la existencia <strong>de</strong>l enzima<br />
citocromooxidasa (prueba positiva).<br />
* Precauciones:<br />
o Proteger el reactivo <strong>de</strong> la luz ya que se altera con ella.<br />
o Guardar en frío.<br />
o Los medios que contienen colorantes pue<strong>de</strong>n interferir la reacción.<br />
o Algunas asas <strong>de</strong> cultivo metálicas pue<strong>de</strong>n interferir la reacción. Se<br />
ha comprobado que la presencia <strong>de</strong> un simple vestigio <strong>de</strong> hierro<br />
pue<strong>de</strong> por sí solo catalizar la oxidación <strong>de</strong>l reactivo, dando una<br />
falsa reacción positiva. Por ello <strong>de</strong>ben utilizarse asas <strong>de</strong>sechables<br />
o bastoncillos.<br />
* Interés: ayuda a la i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> los géneros Pseudomonas (por lo general<br />
positivo) <strong>de</strong> las Enterobacterias [-], entre otros.<br />
C) PRUEBA DE ÓXIDO-FERMENTACIÓN<br />
* Fundamento: mediante esta prueba se va a <strong>de</strong>terminar si la utilización <strong>de</strong> los<br />
hidratos <strong>de</strong> carbono por parte <strong>de</strong> un microorganismo se realiza por vía oxidativa<br />
(proceso aeróbico, presencia <strong>de</strong> oxígeno) o por vía fermentativa (proceso<br />
anaeróbico, ausencia <strong>de</strong> oxígeno).<br />
* Medio <strong>de</strong> cultivo: Medio <strong>de</strong> Huhg y Leifson: es un medio semisólido en tubo<br />
que lleva incorporado el azúcar y azul <strong>de</strong> bromotimol como indicador. Se<br />
esteriliza a 112º 30 minutos.<br />
La concentración <strong>de</strong> agar empleado (3 g/l) permite también la observación <strong>de</strong> la<br />
movilidad, a<strong>de</strong>más <strong>de</strong> la capacidad oxidativa o fermentativa <strong>de</strong> un<br />
microorganismo.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
La glucosa es el hidrato <strong>de</strong> carbono más comúnmente empleado en el medio<br />
base <strong>de</strong> O/F. Sin embargo, un microorganismo pue<strong>de</strong> no metabolizar la glucosa<br />
y sí otros hidratos <strong>de</strong> carbono. Convendría emplear una batería en la que se<br />
incluyeran otros hidratos <strong>de</strong> carbono como lactosa, sacarosa,...<br />
El azul <strong>de</strong> bromotimol es un indicador <strong>de</strong> pH, que a pH ácido presenta color<br />
amarillo; a pH básico, color azul y a pH neutro color ver<strong>de</strong>.<br />
* Técnica: se inocula por picadura y por duplicado, cubriendo uno <strong>de</strong> los tubos<br />
con parafina líquida para crear condiciones <strong>de</strong> anaerobiosis. La positividad se<br />
traduce por el viraje amarillo <strong>de</strong>l indicador.<br />
Se incuban los tubos durante 3 o 4 días a 37º C, ya que algunos<br />
microorganismos producen reacciones lentas o débiles. La observación <strong>de</strong> los<br />
resultados será diaria.<br />
* Lectura e interpretación <strong>de</strong> resultados: mediante la utilización <strong>de</strong> este medio<br />
se pue<strong>de</strong>n apreciar tres caracteres:<br />
o Movilidad: +, cuando el microorganismo no limita su crecimiento a<br />
la línea <strong>de</strong> la siembra.<br />
o Producción <strong>de</strong> gases: se <strong>de</strong>tecta por la aparición <strong>de</strong> burbujas en el<br />
medio.<br />
o Vía oxidativa o fermentativa para la utilización <strong>de</strong>l hidrato <strong>de</strong><br />
carbono:<br />
tubo abierto tubo cerrado vía utilizada<br />
amarillo ver<strong>de</strong> oxidativa<br />
amarillo amarillo fermentativa<br />
ver<strong>de</strong> ver<strong>de</strong> no utilizan el hidrato <strong>de</strong> carbono<br />
* Interés: generalmente para diferenciar<br />
géneros intestinales no Enterobacterias Gram<br />
(-) <strong>de</strong> las Enterobacterias. Ej.: Enterobacterias<br />
fermentan la glucosa; Pseudomonas oxida la<br />
glucosa.<br />
Esta prueba ayuda también a la diferenciación<br />
<strong>de</strong> los géneros <strong>de</strong> la familia Micrococcaceae<br />
(Micrococcus, por lo general oxida la glucosa;<br />
Staphylococcus la fermenta).<br />
Otras pruebas incluidas en este apartado son:<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
D) PRUEBA DE LA REDUCCIÓN DE NITRATOS (para diferenciar especies <strong>de</strong><br />
Haemophilus, así como para i<strong>de</strong>ntificar Enterobacterias, generalmente positivas.<br />
E) TEST DE BRAUM O PRUEBA DEL CIANURO POTÁSICO (para<br />
diferenciación <strong>de</strong> Enterobacterias).<br />
F) PRUEBA DE LOS CALDOS FECALES ( FK Y SF ), para diferenciar<br />
Streptococcus.<br />
PRUEBAS BASADAS EN EL METABOLISMO GLUCÍDICO<br />
La mayoría <strong>de</strong> las bacterias son capaces <strong>de</strong> metabolizar la mayoría <strong>de</strong> los<br />
hidratos <strong>de</strong> carbono, ya sea por vía oxidativa o fermentativa. Incluiremos las<br />
siguientes pruebas:<br />
A) PRUEBA DE LA â-GALACTOSIDASA (ONPG)<br />
* Fundamento: <strong>de</strong>mostrar la presencia en el microorganismo <strong>de</strong> la enzima âgalactosidasa,<br />
utilizando el orto-nitro-fenil-â-D-galacto-piranósido (ONPG).<br />
Si el microorganismo posee esta enzima, el ONPG que es incoloro, es<br />
hidrolizado, produciéndose orto-nitrofenol que presenta una coloración amarilla<br />
cuando se encuentra en solución neutra o alcalina; en condiciones ácidas es<br />
incoloro.<br />
Los microorganismos fermentadores <strong>de</strong> la lactosa poseen dos enzimas: la<br />
enzima permeasa (que regula la entrada <strong>de</strong> la lactosa en la bacteria) y una<br />
enzima â-galactosidasa (que <strong>de</strong>sdobla la lactosa en glucosa más galactosa).<br />
Los microorganismos que fermentan la lactosa poseen las dos enzimas; los no<br />
fermentadores carecen <strong>de</strong> ambas enzimas. Hay microorganismos <strong>de</strong>nominados<br />
"fermentadores tardíos <strong>de</strong> la lactosa" que poseen la â-galactosidasa pero no la<br />
permeasa. Cuando se utiliza una <strong>de</strong>terminada concentración <strong>de</strong> lactosa, estos<br />
microorganismos producen <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> cierto período <strong>de</strong> tiempo (48 horas a<br />
varios días o semanas) algunas células mutantes que poseen permeasa,<br />
observándose la fermentación tardía <strong>de</strong> la lactosa, lo que indica que poseen la<br />
enzima â-galactosidasa.<br />
* Medio <strong>de</strong> cultivo: caldo ONPG:<br />
Este caldo se distribuye asépticamente en tubos estériles.<br />
El ONPG se pue<strong>de</strong> encontrar comercialmente impregnado en discos.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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* Técnica:<br />
TEMARIO DE T.E.L<br />
Mediante la utilización <strong>de</strong> discos <strong>de</strong> ONPG:<br />
o Realizar una suspensión bacteriana <strong>de</strong>nsa <strong>de</strong>l microorganismo<br />
objeto <strong>de</strong> estudio en un tubo que contenga unos 0,5 ml <strong>de</strong> S.S.F.<br />
estéril.<br />
o Colocar en el tubo un disco <strong>de</strong> ONPG.<br />
o Incubar a 37º C <strong>de</strong>s<strong>de</strong> 1-24 horas, <strong>de</strong>pendiendo <strong>de</strong>l inóculo.<br />
* Lectura e interpretación <strong>de</strong> resultados:<br />
o prueba [+]: aparición <strong>de</strong> un color amarillo estable por liberación <strong>de</strong>l<br />
o-nitrofenol.<br />
o prueba [-]: incoloro <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> 24 horas.<br />
A la hora <strong>de</strong> hacer la lectura hay que tener en cuenta el pH dada la influencia<br />
que tiene en la aparición <strong>de</strong>l color amarillo. En caso <strong>de</strong> un aparente resultado<br />
negativo se pue<strong>de</strong> alcalinizar ligeramente el medio para comprobar que no se<br />
trata <strong>de</strong> un falso resultado negativo.<br />
* Interés: diferenciar los microorganismos fermentadores lentos <strong>de</strong> la lactosa <strong>de</strong><br />
los lactosa -. Ej. E.coli +, Citrobacter +, Salmonella -, Proteus -, Shigella -.<br />
Algunas especies <strong>de</strong> Pseudomonas son ONPG [+] y otras [-].<br />
B) PRUEBA DEL ROJO DE METILO<br />
* Fundamento: mediante esta prueba se va a comprobar la capacidad <strong>de</strong> un<br />
microorganismo <strong>de</strong> producir y mantener estables los productos terminales ácidos<br />
<strong>de</strong> la fermentación <strong>de</strong> la glucosa y vencer la capacidad amortiguadora <strong>de</strong>l<br />
sistema. Es una prueba cualitativa para la producción <strong>de</strong> ácidos y requiere<br />
microorganismos que produzcan ácidos fuertes (láctico, acético, fórmico), a partir<br />
<strong>de</strong> la glucosa, por la vía <strong>de</strong> fermentación ácido mixta.<br />
Todos los miembros <strong>de</strong> las Enterobacteriaceas son, por <strong>de</strong>finición,<br />
fermentadores <strong>de</strong> la glucosa. En el caldo RM/VP, <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> 18-24 horas <strong>de</strong><br />
incubación, la fermentación resultante da productos secundarios metabólicos<br />
ácidos; por lo tanto inicialmente todas las enterobacterias darán una reacción<br />
RM[+]. Sin embargo, <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> más tiempo <strong>de</strong> incubación, como lo exige la<br />
realización <strong>de</strong> la prueba (2-5 días), aquellos microorganismos que son realmente<br />
RM[+] continúan produciendo más ácidos y dan como resultado un bajo pH<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
terminal, venciendo al sistema amortiguador <strong>de</strong> fosfato y manteniendo un medio<br />
ácido (pH 4,2 o menos).<br />
Aquellos microorganismos que presenten la prueba RM [-] continúan<br />
metabolizando los productos iniciales <strong>de</strong> la fermentación, produciendo<br />
compuestos neutros, elevando el pH hacia la neutralidad (pH=6 o más).<br />
* Medio <strong>de</strong> cultivo: Medio <strong>de</strong> Clark y Lubs (caldo RM/VP).Se reparte en tubos.<br />
* Reactivo: se utiliza solución alcohólica al 0,2% <strong>de</strong> rojo <strong>de</strong> metilo.<br />
* Técnica: sembrar con asa el medio líquido con el microorganismo objeto <strong>de</strong><br />
estudio e incubar a 37º C <strong>de</strong> 2-5 días.<br />
* Lectura e interpretación <strong>de</strong> resultados: <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> dos días <strong>de</strong> incubación<br />
se aña<strong>de</strong>n unas 5 gotas <strong>de</strong> reactivo al medio, observándose un viraje a rojo si es<br />
positivo y una coloración amarilla si es negativa. Si aparece un color anaranjado<br />
indica una reacción retardada. Tanto si la prueba es negativa como si aparece el<br />
color anaranjado se continuará la incubación hasta 5 días y se repetirá la prueba.<br />
Si continúa color amarillo o anaranjado será prueba negativa.<br />
Se ha <strong>de</strong>sarrollado una microtécnica rápida (método <strong>de</strong> Barry) que ha permitido<br />
disminuir el período <strong>de</strong> incubación con relación al método común (2-5 días). Se<br />
ha <strong>de</strong>mostrado que utilizando menores volúmenes <strong>de</strong> caldo para la prueba, los<br />
microorganismos en estudio sufrían una mejor exposición al oxígeno<br />
atmosférico, que hacía que los microorganismos RM [-] revirtieran al pH neutro<br />
inicial con mayor rapi<strong>de</strong>z.<br />
* Interés: diferenciación <strong>de</strong> Enterobacterias.<br />
C) PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER<br />
* Fundamento: observar si el microorganismo fermenta la glucosa por la vía<br />
butanodiólica. Si es así, se forma un producto intermedio (acetoína) que forma<br />
un complejo <strong>de</strong> color rojizo con el á-naftol.<br />
* Medio <strong>de</strong> cultivo: Medio <strong>de</strong> Clark y Lubs o lo que es lo mismo caldo RM/VP.<br />
* Reactivos:<br />
o á-naftol al 5% en alcohol absoluto.<br />
o KOH al 40%.<br />
* Técnica: sembrar el medio (en tubos) e incubar <strong>de</strong> 24 a 48 horas a 37º C.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
* Lectura e interpretación <strong>de</strong> resultados: según el volumen <strong>de</strong> medio se aña<strong>de</strong><br />
un volumen <strong>de</strong>terminado <strong>de</strong> la solución <strong>de</strong> á-naftol y <strong>de</strong> la <strong>de</strong> potasa (0,6 ml y 0,2<br />
ml respectivamente cuando el tubo contiene unos 2 ml <strong>de</strong> medio). Se agita para<br />
exponer el medio al oxígeno atmosférico para que se <strong>de</strong> la reacción:<br />
o Coloración rosa-rojiza en menos <strong>de</strong> una hora: VP [+]<br />
o Color amarillo en la superficie <strong>de</strong>l medio: VP [-]<br />
* Interés: diferenciación <strong>de</strong> Enterobacterias.<br />
D) PRUEBA CON AGAR HIERRO DE KLIGLER<br />
* Fundamento: mediante esta prueba vamos a po<strong>de</strong>r <strong>de</strong>terminar:<br />
a. La capacidad <strong>de</strong> un microorganismo <strong>de</strong> atacar un hidrato <strong>de</strong><br />
carbono específico (en este caso glucosa, lactosa o ambas)<br />
incorporado en un medio <strong>de</strong> crecimiento básico.<br />
b. Producción o no <strong>de</strong> gases: CO2 e H2 como productos finales <strong>de</strong>l<br />
metabolismo <strong>de</strong> los hidratos <strong>de</strong> carbono.<br />
c. Producción <strong>de</strong> ácido sulfhídrico (SH2).<br />
El medio <strong>de</strong> Kligler contiene como hidratos <strong>de</strong> carbono la glucosa y la lactosa.<br />
Existe otro medio, el TSI, que posee un tercer hidrato <strong>de</strong> carbono, la sacarosa;<br />
los fundamentos bioquímicos <strong>de</strong> ambos son los mismos, por lo que nos vamos a<br />
referir solamente al medio <strong>de</strong> Kligler.<br />
* Medio <strong>de</strong> cultivo: Agar hierro <strong>de</strong> Kligler. Se esteriliza a 112º durante 30 min.<br />
y se <strong>de</strong>ja enfriar en planos inclinados y profundos.<br />
La lactosa (incluida en el medio) está presente en una concentración 10 veces<br />
superior a la glucosa.<br />
El sulfato <strong>de</strong> hierro se adiciona al medio para <strong>de</strong>tectar la formación <strong>de</strong> SH2 por la<br />
bacteria, originándose sulfuro ferroso que es <strong>de</strong> color negro.<br />
El indicador <strong>de</strong> pH rojo fenol (que lleva el medio) es amarillo a un pH ácido, rojo<br />
a pH alcalino y anaranjado-rojizo a pH inicial <strong>de</strong>l medio 7,4.<br />
* Técnica: la inoculación <strong>de</strong>l medio se realiza en picadura hasta unos 0,6 cm.<br />
<strong>de</strong>l fondo.<br />
Esta distancia se <strong>de</strong>be respetar a fin <strong>de</strong> evitar la entrada <strong>de</strong> aire en la parte<br />
profunda y una alteración en el medio anaerobio. Se retira el hilo por el mismo<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
camino <strong>de</strong> entrada y, sin volver a cargar el hilo, se siembra en estrías la<br />
superficie <strong>de</strong>l pico <strong>de</strong> flauta.<br />
Se incuban los tubos inoculados a 35-37º C durante 18-24 h. Es importante<br />
respetar estos tiempos <strong>de</strong> incubación, ya que lecturas <strong>de</strong> menor o mayor<br />
incubación pue<strong>de</strong>n dar resultados falsamente positivos o negativos.<br />
* Lectura e interpretación <strong>de</strong> los resultados:<br />
a) Utilización <strong>de</strong> los hidratos <strong>de</strong> carbono:<br />
• Fermentación <strong>de</strong> la glucosa y no <strong>de</strong> la lactosa: pico alcalino (rojo) y<br />
fondo ácido (amarillo), K/A. Ejemplo <strong>de</strong> no fermentadores <strong>de</strong><br />
lactosa y sí <strong>de</strong> glucosa: Shigella, Proteus, Salmonella.<br />
• Fermentación tanto <strong>de</strong> la glucosa como <strong>de</strong> la lactosa: Pico ácido<br />
(amarillo), fondo ácido (amarillo). A/A. Ejemplos <strong>de</strong><br />
microorganismos fermentadores <strong>de</strong> lactosa y glucosa son<br />
Escherichia coli, Klebsiella y Enterobacter.<br />
• No hay fermentación ni <strong>de</strong> glucosa ni <strong>de</strong> lactosa: Pico alcalino<br />
(rojo) y fondo alcalino (rojo). K/K. En ausencia <strong>de</strong> fermentación <strong>de</strong><br />
hidratos <strong>de</strong> carbono no se forman ácidos, y la utilización <strong>de</strong> las<br />
peptonas con la consiguiente producción <strong>de</strong> grupos básicos hace<br />
que todo el medio aparezca <strong>de</strong> color rojo. Las bacterias que<br />
producen este tipo <strong>de</strong> fermentación son conocidas como "no<br />
fermentadoras" y es una importante indicación <strong>de</strong> que el<br />
microorganismo no pertenece a las Enterobacterias. Ej.:<br />
Pseudomonas aeruginosa (bacilo no Enterobacteriaceae Gram (-)).<br />
b) Producción <strong>de</strong> gas:<br />
Los gases producidos son el CO2 y el H2 , productos finales <strong>de</strong>l metabolismo <strong>de</strong><br />
la glucosa. Se pue<strong>de</strong>n apreciar por la aparición <strong>de</strong> burbujas en la parte inferior<br />
<strong>de</strong>l medio, por la producción <strong>de</strong> grietas en su interior o incluso por la elevación<br />
<strong>de</strong>l medio, que se separa <strong>de</strong>l fondo.<br />
c) Producción <strong>de</strong> ácido sulfhídrico (SH2):<br />
El sulfhídrico es incoloro y su presencia se <strong>de</strong>tecta a través <strong>de</strong> la formación <strong>de</strong><br />
sulfuro ferroso, que es negro. Debido a que se requiere un medio ácido para que<br />
un microorganismo produzca sulfhídrico, un fondo negro <strong>de</strong>be leerse como<br />
ácido aún cuando el color amarillo esté oscurecido por el precipitado negro.<br />
Cuando se interpreta un resultado en el medio <strong>de</strong> Kligler pue<strong>de</strong> observarse la<br />
combinación <strong>de</strong> cualquiera <strong>de</strong> las reacciones características, <strong>de</strong>biendo anotarse<br />
<strong>de</strong> la siguiente manera:<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
a) Fermentación <strong>de</strong> hidratos <strong>de</strong> carbono: como ya se ha indicado.<br />
b) Producción <strong>de</strong> gases: se registra con un círculo alre<strong>de</strong>dor <strong>de</strong>l símbolo que<br />
indica la aci<strong>de</strong>z o basicidad en la parte inferior <strong>de</strong>l tubo.<br />
c) Producción <strong>de</strong> SH2: se indica con una "S" junto al símbolo que indica la aci<strong>de</strong>z<br />
o alcalinidad <strong>de</strong> la parte inferior <strong>de</strong>l tubo.<br />
* Interés: Se utiliza primariamente para i<strong>de</strong>ntificar géneros <strong>de</strong> Enterobacterias.<br />
Reacciones <strong>de</strong> las Enterobacterias más frecuentes aisladas en clínica en agar<br />
hierro Kligler<br />
Alc/A<br />
gas<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
-<br />
-<br />
-<br />
-<br />
Alc/A<br />
no gas<br />
+<br />
+<br />
-<br />
-<br />
+<br />
+<br />
+<br />
-<br />
-<br />
alc= alcalino o rojo.<br />
a= ácido o amarillo.<br />
A/A<br />
gas<br />
+<br />
-<br />
+<br />
Alc/A<br />
SH2<br />
Otras pruebas incluidas en este apartado son:<br />
+<br />
-<br />
-<br />
+<br />
+<br />
-<br />
-<br />
-<br />
-<br />
+<br />
+<br />
-<br />
-<br />
-<br />
+<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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A/A<br />
SH2<br />
-<br />
-<br />
-<br />
+<br />
-<br />
-<br />
-<br />
-<br />
+<br />
E. Coli<br />
Especies<br />
Morganella sp.<br />
Provi<strong>de</strong>ncia sp.<br />
Serratia sp.<br />
Enterobacter sp.<br />
Citrobacter sp.<br />
Salmonella sp.<br />
Shigella sp.<br />
Yersinia sp.<br />
Klebsiella sp.<br />
Proteus sp.<br />
E) PRUEBA DE LA FERMENTACIÓN DE AZÚCARES (para diferenciación <strong>de</strong><br />
Enterobacterias; todas las Enterobacterias fermentan la glucosa. Algunas<br />
a<strong>de</strong>más fermenta la lactosa.)
TEMARIO DE T.E.L<br />
F) PRUEBA DE LA HIDRÓLISIS DE LA ESCULINA (para diferenciar los<br />
Estreptococos <strong>de</strong>l grupo D, que tienen esta propiedad, <strong>de</strong> otros Estreptococos,<br />
que no pertenecen a dicho grupo.<br />
PRUEBAS BASADAS EN EL METABOLISMO PROTÉICO<br />
Se investiga la presencia en los microorganismos <strong>de</strong> enzimas con actividad<br />
proteolítica. Incluiremos las siguientes pruebas:<br />
A) PRUEBA DE LA COAGULASA<br />
* Fundamento: se preten<strong>de</strong> comprobar la facultad <strong>de</strong> un microorganismo <strong>de</strong><br />
coagular el plasma por acción <strong>de</strong> la enzima coagulasa. La coagulasa se pue<strong>de</strong><br />
encontrar en dos formas: libre y fija o ligada (unida a la pared bacteriana).<br />
La coagulasa es una enzima con actividad semejante a la protrombina, capaz <strong>de</strong><br />
transformar el fibrinógeno en fibrina, provocando la formación <strong>de</strong> un coágulo<br />
visible.<br />
* Medios y reactivos:<br />
No se <strong>de</strong>be emplear sangre citratada pues los microorganismos que utilizan<br />
citrato, como por ej. Streptococcus faecalis, pue<strong>de</strong>n dar una falsa reacción<br />
positiva.<br />
* Técnica:<br />
Se pue<strong>de</strong>n seguir dos tipos <strong>de</strong> técnicas:<br />
1.- Prueba <strong>de</strong>l portaobjetos: pone <strong>de</strong> manifiesto la coagulasa ligada:<br />
o Colocar una gota <strong>de</strong> agua <strong>de</strong>stilada o solución salina fisiológica<br />
estéril sobre un portaobjetos.<br />
o Emulsionar suavemente una gota <strong>de</strong> suspensión <strong>de</strong>l<br />
microorganismo en estudio <strong>de</strong> 24 horas en un caldo enriquecido<br />
(Ej.: BHI) en la gota <strong>de</strong> agua, utilizando un asa o una varilla. La<br />
prueba pue<strong>de</strong> hacerse también partiendo directamente <strong>de</strong> una<br />
colonia obtenida en una placa <strong>de</strong> aislamiento.<br />
o Añadir una gota <strong>de</strong>l plasma y mezclar bien.<br />
o Inclinar el portaobjetos hacia uno y otro lado.<br />
2.- Prueba en tubo <strong>de</strong> hemólisis: pone <strong>de</strong> manifiesto la coagulasa ligada y la<br />
libre:<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
o Añadir asépticamente 0,5 ml <strong>de</strong> plasma a 0,5 ml <strong>de</strong> un cultivo puro<br />
<strong>de</strong> 18 a 24 h. en un caldo enriquecido.<br />
o Mezclar por rotación suave <strong>de</strong>l tubo, evitando agitar el contenido.<br />
o Incubar a 37º C, preferiblemente en un baño <strong>de</strong> agua, observando<br />
periódicamente el tubo.<br />
* Lectura e interpretación <strong>de</strong> resultados:<br />
1.- Prueba en portaobjetos: una reacción positiva se <strong>de</strong>tecta en 15 a 20<br />
segundos por la formación <strong>de</strong> grumos blancos. La prueba se consi<strong>de</strong>ra negativa<br />
si no se observa aglutinación en 2 a 3 minutos. Todos los resultados negativos<br />
<strong>de</strong>ben verificarse mediante la prueba en tubos <strong>de</strong>bido a que algunas cepas <strong>de</strong><br />
Staphylococcus aureus producen coagulasa libre que no reacciona en la prueba<br />
en portaobjetos.<br />
2.- Prueba en tubo:<br />
o La reacción se consi<strong>de</strong>ra positiva ante cualquier grado <strong>de</strong><br />
coagulación visible <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong>l tubo. La reacción se observa mejor<br />
inclinando el tubo. Si es positiva, el coágulo permanece en el fondo<br />
<strong>de</strong>l tubo.<br />
o Reacción negativa: ausencia <strong>de</strong> coágulo tras 24-48 horas <strong>de</strong><br />
incubación.<br />
* Interés: se utiliza <strong>de</strong> manera específica para diferenciar Staphylococcus<br />
aureus (coagulasa positivo) <strong>de</strong> otras especies <strong>de</strong> Staphylococcus.<br />
B) PRODUCCIÓN DE HEMÓLISIS<br />
* Fundamento: los microorganismos, cuando se cultivan "in vitro" sobre medios<br />
que contienen sangre, pue<strong>de</strong>n producir alre<strong>de</strong>dor <strong>de</strong> las colonias unas zonas <strong>de</strong><br />
hemólisis variables, según se origine una <strong>de</strong>strucción parcial o total <strong>de</strong> los<br />
eritrocitos. Las sustancias responsables <strong>de</strong> estos fenómenos son exotoxinas,<br />
liberadas por las bacterias al medio, llamadas hemolisinas.<br />
* Medio <strong>de</strong> cultivo: Agar-sangre, constituido por un medio básico (Ej.: agar<br />
nutritivo o TSA) adicionado <strong>de</strong> un 5% <strong>de</strong> sangre <strong>de</strong>sfibrinada <strong>de</strong> carnero o <strong>de</strong><br />
caballo, preferentemente la <strong>de</strong>l primero, ya que las hemólisis se visualizan mejor.<br />
* Técnica: inocular siguiendo la técnica <strong>de</strong> aislamiento. Incubar durante 24-48<br />
horas a 37º C.<br />
* Lectura e interpretación <strong>de</strong> resultados: po<strong>de</strong>mos hablar <strong>de</strong> á, â, o ã<br />
hemólisis.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
La á-hemólisis es una hemólisis parcial, en la que los hematíes son<br />
parcialmente dañados.<br />
Se observa por una estrecha zona ver<strong>de</strong> alre<strong>de</strong>dor <strong>de</strong> la colonia.<br />
La â-hemólisis se caracteriza por una zona clara e incolora que ro<strong>de</strong>a a la<br />
colonia, <strong>de</strong>bido a la <strong>de</strong>strucción total <strong>de</strong> los glóbulos rojos. Es una hemólisis total.<br />
En la ã-hemólisis no se observa ninguna variación alre<strong>de</strong>dor <strong>de</strong> las colonias ni<br />
actuación sobre los glóbulos rojos.<br />
* Interés: esta prueba se emplea fundamentalmente para <strong>de</strong>terminar las<br />
diferentes especies <strong>de</strong> Streptococcus: por ej. S. pyogenes es â-hemolítico; S.<br />
pneumoniae es á-hemolítico.<br />
C. PRUEBA DEL INDOL<br />
* Fundamento: se investiga la presencia en el microorganismo <strong>de</strong> la enzima<br />
triptofanasa o triptofano<strong>de</strong>saminasa, capaz <strong>de</strong> <strong>de</strong>sdoblar el triptófano<br />
(aminoácido) en indol más alanina. Se <strong>de</strong>tecta la presencia <strong>de</strong> esta enzima<br />
mediante la reacción <strong>de</strong>l indol producido con el reactivo<br />
p-dimetilaminobenzal<strong>de</strong>hido.<br />
* Medio <strong>de</strong> cultivo: Agua <strong>de</strong> peptona:<br />
* Reactivo: Reactivo <strong>de</strong> Kovacs:<br />
- Alcohol amílico o isoamílico o butílico... 75 ml<br />
- p-dimetilaminobenzal<strong>de</strong>hido............... 5 mg<br />
- HCl concentrado............................. 25 ml<br />
* Técnica: sembrar con asa <strong>de</strong><br />
platino el medio con el<br />
microorganismo objeto <strong>de</strong> estudio<br />
(tubos <strong>de</strong> hemólisis). Incubar a 37º<br />
C durante 24-48 horas.<br />
* Lectura e interpretación <strong>de</strong><br />
resultados: se agregan unas<br />
gotas <strong>de</strong>l reactivo <strong>de</strong> Kovacs<br />
directamente sobre el tubo<br />
incubado y se agita. En caso <strong>de</strong><br />
que la prueba sea positiva, es<br />
<strong>de</strong>cir, en caso <strong>de</strong> que se haya<br />
producido indol, éste reaccionará con el p-dimetilaminobenzal<strong>de</strong>hido,<br />
apareciendo un anillo <strong>de</strong> color rojo en la superficie <strong>de</strong>l tubo. El HCl tiene como<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
función bajar algo el pH, favoreciéndose así la reacción, y el alcohol amílico<br />
concentra el color en la superficie.<br />
Pue<strong>de</strong> también utilizarse el reactivo <strong>de</strong> Erlich para realizar la lectura.<br />
C) PRUEBA DE LA FENILALANINA-DESAMINASA<br />
* Fundamento: comprobar si el microorganismo posee esta enzima. Si la<br />
poseen, estos gérmenes transforman la fenilalanina en ácido fenilpirúvico, el cual<br />
forma un complejo <strong>de</strong> color ver<strong>de</strong> al reaccionar con el tricloruro <strong>de</strong> hierro.<br />
* Medio <strong>de</strong> cultivo: medio <strong>de</strong> fenilalanina.<br />
El medio se reparte en tubos, se esteriliza y se <strong>de</strong>ja solidificar en pico <strong>de</strong> flauta.<br />
* Reactivo: Tricloruro <strong>de</strong> hierro (CL3Fe) al 10% en agua <strong>de</strong>stilada.<br />
* Técnica: sembrar en tubos inclinados e incubar a 37ºC durante 24-48 h.<br />
* Lectura e interpretación <strong>de</strong> resultados: añadir 4 o 5 gotas <strong>de</strong>l reactivo sobre<br />
la superficie <strong>de</strong>l medio una vez incubado. Hacer rotar suavemente el tubo. En el<br />
término <strong>de</strong> 1 a 5 minutos, si la reacción es positiva aparece un color ver<strong>de</strong> en el<br />
pico <strong>de</strong> flauta así como en el líquido en contacto con él.<br />
* Precauciones: la interpretación <strong>de</strong> positiva o negativa <strong>de</strong>be hacerse <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong><br />
los primeros 5 minutos <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> haber añadido el reactivo porque el color<br />
ver<strong>de</strong> se <strong>de</strong>svanece con bastante rapi<strong>de</strong>z.<br />
* Interés: para diferenciar los géneros Proteus y Provi<strong>de</strong>ncia [+] <strong>de</strong>l resto <strong>de</strong> los<br />
géneros <strong>de</strong> las Enterobacterias [-].<br />
E) PRUEBA DE LA UREASA<br />
* Fundamento: mediante esta prueba <strong>de</strong>terminamos la capacidad <strong>de</strong>l<br />
microorganismo <strong>de</strong> <strong>de</strong>sdoblar la urea en CO2 y amoníaco por acción <strong>de</strong> la<br />
enzima ureasa. Se visualiza el proceso <strong>de</strong>bido a que la alcalinidad que se<br />
produce origina un cambio <strong>de</strong> color en el indicador que lleva incorporado el<br />
medio.<br />
Esta prueba se pue<strong>de</strong> realizar en tubo con medio sólido o sobre discos <strong>de</strong> papel<br />
<strong>de</strong> filtro.<br />
1.- Prueba en tubo<br />
* Medio <strong>de</strong> cultivo: Medio <strong>de</strong> Christensen:<br />
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El medio se esteriliza en el autoclave. Se <strong>de</strong>ja enfriar hasta 50-55ºC y a esta<br />
temperatura se le aña<strong>de</strong>n 100 ml <strong>de</strong> solución <strong>de</strong> urea al 20% en agua <strong>de</strong>stilada,<br />
esterilizada por filtración. Se distribuye el medio asépticamente en tubos estériles<br />
y se <strong>de</strong>ja enfriar en posición inclinada.<br />
* Técnica: sembrar el pico <strong>de</strong> flauta con un inóculo <strong>de</strong>nso e incubar a 35-37ºC<br />
durante 1-6 días, observando las primeras 6 horas y luego cada 24 horas.<br />
* Lectura e interpretación <strong>de</strong> resultados:<br />
Se consi<strong>de</strong>ra la prueba [+], es <strong>de</strong>cir, el microorganismo será ureasa [+] si <strong>de</strong>bido<br />
a la alcalinización <strong>de</strong>l medio, éste toma una coloración roja-rosácea.<br />
* Interés: todas las especies <strong>de</strong>l género Proteus dan positiva esta reacción<br />
<strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> las 6 primeras horas, virando la superficie <strong>de</strong>l medio a color<br />
rojo-rosáceo. Se pue<strong>de</strong> así diferenciar el género Proteus <strong>de</strong> otros<br />
microorganismos ureasa [+] retardados como especies <strong>de</strong> Klebsiella o<br />
Enterobacter, así como <strong>de</strong> microorganismos ureasa [-] como E.coli.<br />
2.- Prueba en discos <strong>de</strong> papel <strong>de</strong> filtro<br />
* Técnica: con una solución <strong>de</strong> urea se impregna un disco <strong>de</strong> papel <strong>de</strong> filtro<br />
colocado en una placa <strong>de</strong> Petri; se toma una colonia <strong>de</strong>l microorganismo a<br />
estudiar y se frota sobre el disco húmedo.<br />
* Lectura e interpretación <strong>de</strong> resultados:<br />
Si el disco vira a rosado o rojo en los dos minutos siguientes indica positividad <strong>de</strong><br />
la prueba.<br />
* Interés: todas las especies <strong>de</strong>l género Proteus dan positiva esta prueba.<br />
F) PRUEBA DE LA DNasa<br />
* Fundamento: se basa en la capacidad que poseen ciertas bacterias para<br />
hidrolizar enzimáticamente el ADN produciendo una mezcla <strong>de</strong> mono y<br />
polinucleótidos.<br />
* Medio <strong>de</strong> cultivo: se utiliza el agar-DNA:<br />
Preparar el medio, esterilizar en autoclave y distribuir en placas.<br />
* Reactivo: ácido clorhídrico 1N.<br />
* Técnica: sembrar una colonia <strong>de</strong>l microorganismo a investigar sobre una placa<br />
<strong>de</strong> agar DNA <strong>de</strong> forma que <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> la investigación que<strong>de</strong> una estría<br />
superficial o un botón <strong>de</strong> crecimiento <strong>de</strong>nso. Incubar 24 horas a 37º C.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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* Lectura e interpretación <strong>de</strong> resultados: cubrir la placa con ClH 1N. En caso<br />
<strong>de</strong> que el microorganismo sea productor <strong>de</strong> DNasa, se observa una zona clara<br />
alre<strong>de</strong>dor <strong>de</strong>l crecimiento; en caso negativo, el medio permanece opaco.<br />
* Interés: diferenciar S. aureus (DNasa +) <strong>de</strong> otras especies <strong>de</strong> Staphylococcus.<br />
Otras pruebas incluidas en este apartado:<br />
G) PRUEBA DE LA HIDRÓLISIS DE LA GELATINA (diferencia especies <strong>de</strong><br />
Staphylococcus, dando positivo S. aureus.<br />
H) INVESTIGACIÓN DE DESCARBOXILASAS (para <strong>de</strong>terminar grupos<br />
bacterianos entre las Enterobacterias.)<br />
PRUEBAS BASADAS EN EL METABOLISMO LIPÍDICO<br />
A) PRUEBA DE LA LIPASA<br />
Se lleva a cabo por cultivo sobre agar enriquecido con tween 80.La existencia <strong>de</strong><br />
lipasa se traduce por la aparición <strong>de</strong> un halo opaco alre<strong>de</strong>dor <strong>de</strong> las colonias.<br />
Esta prueba se utiliza para diferenciar ciertas Micobacterias.<br />
B) PRUEBA DE LA LECITINASA<br />
Se realiza por cultivo sobre un medio con yema <strong>de</strong> huevo (lecitina). Las colonias<br />
productoras <strong>de</strong> lecitinasa, forman una zona opaca a su alre<strong>de</strong>dor.<br />
PRUEBAS BASADAS EN CARACTERES DE RESISTENCIA A CIERTAS<br />
SUSTANCIAS<br />
A) TEST DE LA OPTOQUINA<br />
* Fundamento: se <strong>de</strong>termina la sensibilidad <strong>de</strong> un microorganismo a la<br />
optoquina.<br />
* Medio <strong>de</strong> cultivo: agar sangre<br />
* Reactivo: discos impregnados <strong>de</strong> optoquina.<br />
* Técnica: sembrar masivamente una colonia <strong>de</strong>l microorganismo a investigar<br />
sobre una placa <strong>de</strong> agar sangre y colocar en la superficie <strong>de</strong> la placa los discos<br />
<strong>de</strong> optoquina. Incubar a 37º durante 24 horas.<br />
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* Lectura e interpretación <strong>de</strong> los resultados: en caso <strong>de</strong> que el<br />
microorganismo sea sensible a la optoquina, se observa un halo <strong>de</strong> inhibición<br />
alre<strong>de</strong>dor <strong>de</strong>l disco.<br />
* Interés: diferenciar Streptococcus pneumoniae (sensible) <strong>de</strong> otras especies <strong>de</strong><br />
Streptococcus alfahemolíticos (resistentes).<br />
B) TEST DE LA BACITRACINA<br />
* Fundamento: se <strong>de</strong>termina la sensibilidad <strong>de</strong> un microorganismo a la<br />
bacitracina.<br />
* Medio <strong>de</strong> cultivo: placas con agar sangre.<br />
* Reactivo: discos impregnados con bacitracina.<br />
* Técnica: sembrar masivamente una colonia <strong>de</strong>l microorganismo a investigar<br />
en una placa <strong>de</strong> agar sangre y colocar sobre la placa los discos <strong>de</strong> bacitracina.<br />
Incubar a 37º durante 24 horas.<br />
* Lectura e interpretación <strong>de</strong> los resultados: una zona <strong>de</strong> inhibición <strong>de</strong>l<br />
crecimiento alre<strong>de</strong>dor <strong>de</strong>l disco, aunque sea pequeña, indicará la sensibilidad.<br />
* Interés: diferenciar Streptococcus pyogenes (grupo A <strong>de</strong> Lancefield), sensible<br />
a la bacitracina, <strong>de</strong> otras especies <strong>de</strong> Streptococcus betahemolíticos (grupos B,<br />
C, D, F, G) que son resistentes.<br />
También po<strong>de</strong>mos incluir en este apartado la prueba <strong>de</strong> SOLUBILIDAD EN<br />
BILIS (para diferenciar Streptococcus Pneumoniae, que tiene esta propiedad, <strong>de</strong><br />
otras especies <strong>de</strong> Streptococcus alfahemolíticos.<br />
INVESTIGACIÓN DE SUSTANCIAS ENERGÉTICAS NUTRITIVAS<br />
A) PRUEBA DE LA <strong>UTIL</strong>IZACIÓN DE CITRATOS<br />
* Fundamento: mediante esta prueba se <strong>de</strong>termina si el microorganismo es<br />
capaz <strong>de</strong> utilizar el citrato como única fuente <strong>de</strong> carbono.<br />
El medio incluye citrato <strong>de</strong> sodio como única fuente <strong>de</strong> carbono y fosfato <strong>de</strong><br />
amonio como única fuente <strong>de</strong> nitrógeno. Las bacterias que pue<strong>de</strong>n utilizar citrato<br />
como única fuente <strong>de</strong> carbono también pue<strong>de</strong>n extraer nitrógeno <strong>de</strong> la sal <strong>de</strong><br />
amonio, con producción <strong>de</strong> amoníaco, llevando a la alcalinización <strong>de</strong>l medio. El<br />
medio lleva un indicador, el azul <strong>de</strong> bromotimol, que es amarillo a pH ácido,<br />
ver<strong>de</strong> a pH neutro y azul a pH alcalino.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
* Medio <strong>de</strong> cultivo: Medio <strong>de</strong> citrato <strong>de</strong> Simmons.<br />
El medio se reparte en tubos <strong>de</strong> ensayo y una vez estériles se inclinan en pico<br />
<strong>de</strong> flauta.<br />
* Técnica: sembrar en pico <strong>de</strong> flauta el microorganismo obtenido en medio sólido<br />
(los caldos pue<strong>de</strong>n aportar elementos nutritivos que pue<strong>de</strong>n falsear los<br />
resultados), procurando no tocar con el asa el medio, porque sustancias<br />
nutritivas <strong>de</strong> éste podrían igualmente falsear los resultados. Incubar a 37º C <strong>de</strong><br />
24-48 horas.<br />
* Lectura e interpretación <strong>de</strong> resultados:<br />
o Prueba positiva: crecimiento con un color azul intenso en el pico<br />
<strong>de</strong> flauta tras 24-48 horas <strong>de</strong> incubación.<br />
o Prueba negativa: no se observa crecimiento ni cambio <strong>de</strong> color (el<br />
medio permanece <strong>de</strong> color ver<strong>de</strong>.)<br />
o Si se observa crecimiento sin cambio <strong>de</strong> color, se confirmará la<br />
positividad <strong>de</strong> la prueba incubando el tubo 24 horas más, durante<br />
las que suele aparecer el color azul.<br />
* Interés: esta prueba junto con las <strong>de</strong> Indol, Rojo <strong>de</strong> Metilo y Voges<br />
Proskauer constituyen el IMViC y sirven, junto con otras pruebas para la<br />
diferenciación <strong>de</strong> los géneros <strong>de</strong> las Enterobacteriaceas.<br />
La prueba <strong>de</strong>l TUBO DE GERMINACION o TEST DE FILAMENTACION,<br />
aunque estrictamente hablando no se trata <strong>de</strong> una prueba bioquímica, ha <strong>de</strong> ser<br />
nombrada dado el gran valor que posee para la i<strong>de</strong>ntificación rápida y presuntiva<br />
<strong>de</strong> Candida Albicans y Candida s<strong>tel</strong>latoi<strong>de</strong>a, que son las dos únicas especies <strong>de</strong>l<br />
género Candida capaces <strong>de</strong> producir tubos germinales.<br />
Para diferenciar anaerobios, si no se utiliza el método <strong>de</strong> cromatografía gaslíquido<br />
o IFI, se <strong>de</strong>be introducir una batería bioquímica que investigue: indol,<br />
urea, gelatina, catalasa, fermentación <strong>de</strong> hidratos <strong>de</strong> carbono, hidrólisis <strong>de</strong><br />
almidón y esculina, comportamiento en medio <strong>de</strong> infusión cerebro-corazón con<br />
hemina, menadiona y sangre <strong>de</strong> cor<strong>de</strong>ro adicionada <strong>de</strong> diversas sustancias<br />
(como sales biliares, ver<strong>de</strong> brillante o antibióticos), reducción <strong>de</strong> nitratos, lipasa y<br />
lecitinasa.<br />
SISTEMAS MULTIPRUEBAS<br />
En los últimos años han aparecido en el mercado numerosos sistemas o equipos<br />
multipruebas con el fin <strong>de</strong> facilitar la i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> algunas bacterias, sobre<br />
todo Enterobacterias, cocos G (+), microorganismos anaerobios y levaduras.<br />
Estos sistemas proporcionan mayor comodidad y rapi<strong>de</strong>z, pue<strong>de</strong>n ser más<br />
baratos, pero no carecen <strong>de</strong> problemas si se manejan <strong>de</strong> forma incorrecta.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
Todos exigen unas condiciones muy precisas <strong>de</strong> concentración <strong>de</strong>l inóculo, <strong>de</strong><br />
inoculación, <strong>de</strong> incubación y <strong>de</strong> lectura, que si no se observan pue<strong>de</strong>n dar lugar<br />
a importantes errores. Estos sistemas pue<strong>de</strong>n ser manuales y automatizados.<br />
SISTEMAS COMERCIALES MANUALES:<br />
A) SISTEMA API<br />
Se trata <strong>de</strong> una tarjeta <strong>de</strong> material plástico dividida en pequeños pocillos que<br />
contienen diferentes substratos <strong>de</strong>shidratados, en los cuales se inocula una<br />
suspensión <strong>de</strong>l microorganismo a estudiar.<br />
La lectura <strong>de</strong> los resultados se efectúa directamente, interpretando el color <strong>de</strong><br />
cada reacción, o tras la adición <strong>de</strong> reactivos reveladores. Con los resultados se<br />
establece un código numérico que correspon<strong>de</strong> a una <strong>de</strong>terminada especie<br />
reflejada en unas tablas.<br />
Existe disponible para la i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> Enterobacterias, Estafilococos,<br />
Estreptococos, anaerobios, levaduras y algunas bacterias exigentes.<br />
Los resultados presentan una correlación con las pruebas clásicas superior al<br />
90%.Su principal inconveniente radica en la incapacidad <strong>de</strong> <strong>de</strong>tectar reacciones<br />
débiles.<br />
B) SISTEMA ENTEROTUBE<br />
Consiste en un tubo <strong>de</strong> plástico dividido en compartimentos que contienen<br />
sustratos en forma <strong>de</strong> agar. La inoculación se realiza directamente a partir <strong>de</strong> la<br />
colonia, por picadura y arrastre a través <strong>de</strong> los diferentes sustratos. La lectura e<br />
interpretación no difieren <strong>de</strong>l sistema anterior.<br />
Existe comercializado para Enterobacterias y bacterias no fermentadoras. Los<br />
problemas <strong>de</strong> este sistema son más consi<strong>de</strong>rables en cuanto al inóculo, que no<br />
siempre es uniforme, y a la conservación <strong>de</strong> los sustratos.<br />
C) OTROS SISTEMAS<br />
a) MICRO-ID: consta <strong>de</strong> 15 cámaras <strong>de</strong> reacción en las que hay discos <strong>de</strong> papel<br />
impregnados <strong>de</strong> sustratos y reactivos correspondientes a cada prueba<br />
bioquímica a ensayar.<br />
b) MINITEK: es un sistema semejante al anterior. Actualmente hay más <strong>de</strong> 30<br />
discos <strong>de</strong> sustratos diferentes.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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SISTEMAS COMERCIALES AUTOMATIZADOS:<br />
Estos suponen un importante progreso técnico, pero no están libres <strong>de</strong><br />
problemas. A<strong>de</strong>más no es aconsejable que estos sistemas utilizados por alguien<br />
que no está preparado y que confía ciegamente en el sistema sin adoptar una<br />
actitud crítica respecto a los resultados ofrecidos por éste.<br />
Suelen consistir en paneles en los que a<strong>de</strong>más <strong>de</strong> encontrarse los sustratos para<br />
el <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> diversas pruebas bioquímicas, se encuentran diversos<br />
antimicrobianos a distintas concentraciones, con lo que se realiza<br />
simultáneamente la i<strong>de</strong>ntificación y antibiograma <strong>de</strong>l microorganismo objeto <strong>de</strong><br />
estudio. Existen distintos paneles para distintos grupos <strong>de</strong> microorganismos. La<br />
inoculación y la lectura <strong>de</strong> estos paneles se suele hacer <strong>de</strong> forma automática,<br />
incorporándose los datos obtenidos en un or<strong>de</strong>nador, el cual proporciona con un<br />
índice alto <strong>de</strong> fiabilidad la i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong>l microorganismo.<br />
Es obvio que ningún sistema automatizado pue<strong>de</strong> ser mejor que el método <strong>de</strong><br />
referencia, pues ante cualquier discrepancia este último se supone correcto.<br />
TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS<br />
Una reacción <strong>de</strong> hibridación es el proceso por el que dos monoca<strong>de</strong>nas <strong>de</strong> ADN,<br />
ARN o una <strong>de</strong> ADN y otra <strong>de</strong> ARN, <strong>de</strong> distinto origen y que muestran<br />
complementariedad <strong>de</strong> bases se unen formando una molécula estable, que<br />
recibe la <strong>de</strong>nominación <strong>de</strong> híbrido.<br />
La técnica <strong>de</strong> hibridación se basa en el apareamiento <strong>de</strong>l ácido nucleico a<br />
estudiar con una molécula <strong>de</strong> ADN o ARN conocida y llamada sonda. Esta<br />
reacción pue<strong>de</strong> ponerse <strong>de</strong> manifiesto gracias a la incorporación <strong>de</strong> un sistema<br />
indicador bien radioactivo o no radioactivo (colorimétrico o fluorimétrico). En la<br />
reacción <strong>de</strong> hibridación, la unión sonda-diana se produce gracias a la formación<br />
<strong>de</strong> puentes <strong>de</strong> hidrógeno entre bases complementarias (a<strong>de</strong>nina-timina,<br />
guanina-citosina.)<br />
Hoy día estas técnicas se están introduciendo poco a poco en la rutina <strong>de</strong> los<br />
gran<strong>de</strong>s Laboratorios <strong>de</strong> Microbiología, utilizándose con relativa frecuencia para<br />
la <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> patógenos humanos. En estos casos, las muestras se<br />
procesan para la inmovilización <strong>de</strong>l ácido nucleico sobre un soporte sólido y<br />
posteriormente se realiza la hibridación con sondas específicas para el<br />
microorganismo causal <strong>de</strong> la infección. A<strong>de</strong>más, la posibilidad <strong>de</strong> po<strong>de</strong>r construir<br />
sondas frente a cualquier región <strong>de</strong>l genoma <strong>de</strong> los microorganismos permite el<br />
diagnóstico diferencial <strong>de</strong> subtipos. Otra gran aplicación <strong>de</strong> la hibridación es<br />
que mediante ella se pue<strong>de</strong>n <strong>de</strong>tectar genes <strong>de</strong> resistencia a antibióticos<br />
directamente en el producto patológico, ofreciendo una alternativa al<br />
antibiograma.<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
Para incrementar aún más la sensibilidad ha aparecido en la actualidad un<br />
método que permite incrementar específicamente una secuencia <strong>de</strong>terminada<br />
<strong>de</strong> ácidos nucleicos hasta un número <strong>de</strong> copias que pueda ser <strong>de</strong>tectado<br />
mediante la hibridación; es el método <strong>de</strong> la reacción en ca<strong>de</strong>na <strong>de</strong> la polimerasa<br />
(PCR). Este método permite la <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> aquellos microorganismos que se<br />
encuentran en pequeño número en la muestra y, aunque por el momento está<br />
limitado a laboratorios <strong>de</strong> investigación <strong>de</strong>bido a su complejidad y alto coste<br />
económico, parece que en un futuro aparecerán equipos comerciales que<br />
contribuirán a su difusión.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
TEMA 16. ANTIBIOGRAMAS. TIPOS.<br />
INTRODUCCIÓN.<br />
Una vez aislado e i<strong>de</strong>ntificado un microorganismo como probable agente causal<br />
<strong>de</strong> un proceso infeccioso, se ha <strong>de</strong> estudiar que susceptibilidad presenta a los<br />
agentes antimicrobianos. Se entien<strong>de</strong> por antibiograma la "técnica que permite el<br />
estudio "in vitro" <strong>de</strong> la sensibilidad <strong>de</strong> los microorganismos a los agentes<br />
antimicrobianos (antibióticos y quimioterápicos). Tiene por objeto proporcionar<br />
datos útiles para el tratamiento <strong>de</strong> una enfermedad infecciosa, aportando una<br />
información valiosísima para el establecimiento <strong>de</strong> la terapéutica antiinfecciosa,<br />
aunque para el mayor rendimiento <strong>de</strong> ésta se <strong>de</strong>ben consi<strong>de</strong>rar también las<br />
características <strong>de</strong>l antimicrobiano, la clínica <strong>de</strong>l proceso y al propio paciente que<br />
lo pa<strong>de</strong>ce.<br />
In<strong>de</strong>pendientemente <strong>de</strong>l tipo <strong>de</strong> antibiograma que se realice, es fundamental<br />
partir <strong>de</strong> cultivos puros para obtener resultados fiables. En general, se <strong>de</strong>be<br />
realizar siempre un aislamiento y trabajar con colonias <strong>de</strong> un solo tipo <strong>de</strong><br />
microorganismo. Las técnicas realizadas a partir <strong>de</strong> cultivos mixtos casi nunca<br />
tienen valor y pue<strong>de</strong>n conducir a errores terapéuticos graves.<br />
TIPOS DE ANTIBIOGRAMA.<br />
Existen diversos métodos siendo los más importantes los <strong>de</strong>:<br />
• Difusión: se realizan en medio sólido; habitualmente son cualitativos,<br />
clasificando a los microorganismos en sensibles, intermedios o resistentes<br />
a un <strong>de</strong>terminado antimicrobiano.<br />
• Dilución: son los métodos <strong>de</strong> referencia. Se pue<strong>de</strong>n realizar en medio<br />
líquido o en medio sólido. Proporcionan resultados cuantitativos,<br />
<strong>de</strong>stacando la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), que es la<br />
concentración más baja <strong>de</strong> antimicrobiano que inhibe el crecimiento <strong>de</strong>l<br />
microorganismo.<br />
Existen algunas técnicas rápidas para acortar los estudios <strong>de</strong> eficacia <strong>de</strong><br />
antimicrobianos, pero si es posible <strong>de</strong>ben evitarse. En caso <strong>de</strong> infecciones muy<br />
peligrosas o si, por examen microscópico <strong>de</strong>l producto patológico, se sospecha<br />
una infección monomicrobiana, pue<strong>de</strong> ser conveniente intentar <strong>de</strong>terminar la<br />
susceptibilidad relativa <strong>de</strong>l microorganismo directamente en la muestra; pero,<br />
realmente, no hay ningún método a<strong>de</strong>cuado que pueda obviar el cultivo <strong>de</strong> la<br />
muestra, la i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong>l posible agente etiológico y la realización <strong>de</strong> pruebas<br />
convencionales <strong>de</strong> susceptibilidad, aunque se retrase el resultado más tiempo.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
Hay dos puntos clave a tener en cuenta a la hora <strong>de</strong> realizar las pruebas <strong>de</strong><br />
sensibilidad antimicrobiana. En primer lugar, es muy importante que se realicen<br />
<strong>de</strong> modo estandarizado ya que los resultados pue<strong>de</strong>n variar mucho en función<br />
<strong>de</strong> las condiciones <strong>de</strong> trabajo (inóculo, medio <strong>de</strong> cultivo, concentración, pH); por<br />
este motivo se <strong>de</strong>ben aplicar las normas publicadas en relación a este tipo <strong>de</strong><br />
pruebas. Sin embargo, hay que señalar que estas normas solo se aplican a las<br />
bacterias aerobias y anaerobias, no habiéndose estandarizado métodos <strong>de</strong><br />
prueba para hongos, parásitos y virus, y no pue<strong>de</strong> asegurarse la<br />
reproductibilidad <strong>de</strong> los resultados <strong>de</strong>l mismo laboratorio o la comparabilidad con<br />
los <strong>de</strong> laboratorios diferentes. En segundo lugar, los resultados <strong>de</strong> las pruebas<br />
para las bacterias se obtienen en el ambiente <strong>de</strong>l laboratorio, que es muy<br />
diferente al medio interno <strong>de</strong>l huésped.<br />
ANTIBIOGRAMA AEROBIO.<br />
MEDIO DE CULTIVO.<br />
Debe cumplir las siguientes condiciones:<br />
• Ser <strong>de</strong> amplio espectro nutritivo, para que permita el crecimiento <strong>de</strong> la<br />
mayoría <strong>de</strong> los microorganismos. En algunas ocasiones será necesario<br />
añadir sangre <strong>de</strong>sfibrinada o achocolatada para microorganismos muy<br />
exigentes, pero normalmente no es aconsejable, ya que las proteínas que<br />
llevan incorporadas ligan a los antimicrobianos, disminuyendo su acción.<br />
• Ser <strong>de</strong> pH estable (7,2-7,4): la aci<strong>de</strong>z y la alcalinidad modifican la<br />
actividad <strong>de</strong> <strong>de</strong>terminados antimicrobianos.<br />
• No <strong>de</strong>be contener inhibidores <strong>de</strong> antimicrobianos: Ej.:<br />
o Las sales <strong>de</strong> Ca y Mg que forman complejos con tetraciclinas y<br />
betalactámicos.<br />
o Los glúcidos, que en medios mal tamponados podrían dar lugar a<br />
disminución <strong>de</strong>l pH.<br />
o La sangre, ya comentada.<br />
o Las peptonas, que inactivan a <strong>de</strong>rivados sulfamídicos.<br />
El medio <strong>de</strong> cultivo que mejor reúne las anteriores condiciones y que es apto<br />
para cualquier tipo <strong>de</strong> antibiograma aerobio es el <strong>de</strong> Müeller-Hinton, que se<br />
utiliza tanto en caldo como en forma sólida.<br />
Previamente, antes <strong>de</strong> sembrar en el medio, hay que hacer la preparación <strong>de</strong><br />
inóculo.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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PREPARACIÓN DEL INÓCULO.<br />
TEMARIO DE T.E.L<br />
Se prepara sembrando 4-5 colonias iguales en 5 ml <strong>de</strong> solución salina fisiológica<br />
estéril o en caldo nutritivo o en TSB, e incubando <strong>de</strong> 2-6 horas a 35-37ºC, hasta<br />
que el crecimiento produzca una turbi<strong>de</strong>z semejante a la <strong>de</strong>l estandar número<br />
0,5 <strong>de</strong> la escala <strong>de</strong> MacFarland, el cual se prepara adicionando 0,05 ml <strong>de</strong> Cl2Ba<br />
0,048M (1% P/V; 1,175% P/V <strong>de</strong> Cl2Ba.2H2O) a 9,95 ml <strong>de</strong> H2SO4 0,36N (1%<br />
V/V).<br />
Si la turbi<strong>de</strong>z fuera mayor que la <strong>de</strong>l estándar, se diluye con solución salina<br />
fisiológica estéril o con el caldo y si fuera menor se <strong>de</strong>ja más tiempo incubando.<br />
Cuando se consigue esta turbi<strong>de</strong>z, equivale a una concentración <strong>de</strong><br />
microorganismos <strong>de</strong> aproximadamente 1,5 x 10 8 microorganismos/ml.<br />
Si las circunstancias lo precisan también se pue<strong>de</strong> obtener el inóculo <strong>de</strong>seado<br />
suspendiendo directamente en 5 ml <strong>de</strong> solución salina fisiológica estéril algunas<br />
colonias proce<strong>de</strong>ntes <strong>de</strong> un cultivo joven, homogeneizando bien y ajustando<br />
<strong>de</strong>spués la turbi<strong>de</strong>z.<br />
ANTIMICROBIANOS A ELEGIR.<br />
Se utilizan productos <strong>de</strong> calidad con una actividad perfectamente conocida (en<br />
microgramos o UI/ml). Los antimicrobianos utilizados en cada prueba <strong>de</strong><br />
sensibilidad se seleccionan según el tipo <strong>de</strong> microorganismo aislado o que se<br />
sospeche y el interés terapéutico; se recomienda elegir un solo representante <strong>de</strong><br />
los antibióticos con estructura química similar y resistencia cruzada. A<br />
continuación se expone una relación don<strong>de</strong> se indican los antimicrobianos a<br />
elegir según el tipo <strong>de</strong> microorganismo, incluyendo los indicados para<br />
microorganismos anaerobios. Cada laboratorio seleccionará <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> esos<br />
grupos los que consi<strong>de</strong>re más apropiados.<br />
• Antibiograma <strong>de</strong> Staphylococcus.<br />
Amicacina<br />
Ampicilina o Amoxicilina<br />
Ampicilina-sulbactam o Amoxicilina-clavulánico<br />
Cefalosporina <strong>de</strong> primera generación (Cefalotina)<br />
Cefalosporina <strong>de</strong> tercera generación (Cefotaxima)<br />
Clindamicina<br />
Cloxacilina (en Müeller-Hinton salino)<br />
Cotrimoxazol (Sulfametoxazol-trimetoprim)<br />
Eritromicina<br />
Fosfomicina<br />
Nitrofurantoína (en infecciones urinarias)<br />
Norfloxacina o Ciprofloxacina (en infecciones urinarias)<br />
Tetraciclina<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
Tobramicina<br />
Vancomicina o Teicoplanina<br />
• Antibiograma <strong>de</strong> Enterobacterias<br />
Amicacina<br />
Ampicilina o Amoxicilina<br />
Ampicilina-sulbactam o Amoxicilina-clavulánico<br />
Cefotaxima<br />
Cefoxitina<br />
Ceftazidima<br />
Cefuroxima<br />
Ciprofloxazina<br />
Cloranfenicol (para Salmonella)<br />
Colistina (con fines taxonómicos)<br />
Cotrimoxazol<br />
Fosfomicina<br />
Imipenem<br />
Nitrofurantoína (en infecciones urinarias)<br />
Norfloxacina (en infecciones urinarias)<br />
Piperacilina<br />
Tobramicina<br />
Ticarcilina<br />
• Antibiograma <strong>de</strong> Pseudomonas y afines.<br />
Amicacina<br />
Azlocilina<br />
Aztreonam<br />
Cefotaxima<br />
Ceftazidima<br />
Ceftriaxona<br />
Ciprofloxacina<br />
Colistina<br />
Fosfomicina<br />
Imipenem<br />
Gentamicina<br />
Ofloxacina<br />
Norfloxacina (en infecciones urinarias)<br />
Piperacidina<br />
Ticarcilina<br />
Tobramicina<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
• Antibiograma <strong>de</strong> Streptococcus y otros microorganismos <strong>de</strong>licados.<br />
Ampicilina<br />
Cefalotina<br />
Cefotaxima o Ceftriaxona<br />
Ciprofloxacina<br />
Cloranfenicol<br />
Cotrimoxazol<br />
Eritromicina<br />
Fosfomicina<br />
Imipenem<br />
Tetraciclina<br />
Vancomicina<br />
• Antibiograma <strong>de</strong> anaerobios<br />
Cefoxitina o Cefmetazol<br />
Clindamicina<br />
Cloranfenicol<br />
Eritromicina<br />
Imipenem<br />
Metronidazol<br />
Penicilina<br />
INCUBACIÓN: Para todos los antibiogramas aerobios, 35-37º C durante 18-24<br />
horas.<br />
La lectura e interpretación <strong>de</strong> resultados se verán en cada tipo <strong>de</strong><br />
antibiograma.<br />
CONTROL DE CALIDAD.<br />
Debido al gran número <strong>de</strong> variables que pue<strong>de</strong>n afectar los resultados, es muy<br />
importante realizar un riguroso control <strong>de</strong> calidad periódicamente con cepas<br />
patrón <strong>de</strong> sensibilidad conocida.<br />
ANTIBIOGRAMA POR DIFUSIÓN EN MEDIO SÓLIDO (MÉTODO DE BAUER-<br />
KIRBY).<br />
Se trata <strong>de</strong> un método <strong>de</strong> fácil ejecución, exacta reproducción, facilidad <strong>de</strong><br />
lectura y fiabilidad <strong>de</strong> resultados. Por todo ello es el que se realiza rutinariamente<br />
en la mayor parte <strong>de</strong> los pequeños laboratorios, recurriéndose también a él, en<br />
los gran<strong>de</strong>s laboratorios, cuando los resultados obtenidos por el método <strong>de</strong><br />
dilución en microplacas no son <strong>de</strong> total fiabilidad. Para ello se requiere que todos<br />
los <strong>de</strong>talles <strong>de</strong>l procedimiento estén cuidadosamente controlados y sean<br />
uniformes.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
Existen distintas técnicas que aplican el método <strong>de</strong> difusión en medio sólido,<br />
siendo una <strong>de</strong> las más utilizadas la <strong>de</strong> Bauer-Kirby.<br />
Este método consiste en inocular una placa <strong>de</strong> agar Müeller-Hinton con el<br />
microorganismo problema y colocar sobre la superficie <strong>de</strong>l medio unos discos<br />
que contengan concentraciones <strong>de</strong>terminadas <strong>de</strong> los antimicrobianos a ensayar.<br />
El antimicrobiano difun<strong>de</strong> por el medio, produciendo un gradiente <strong>de</strong><br />
concentración. Esta difusión se pue<strong>de</strong> pensar como una serie <strong>de</strong> anillos<br />
concéntricos, don<strong>de</strong> la concentración <strong>de</strong>l antimicrobiano disminuye a medida que<br />
aumenta la distancia al centro <strong>de</strong>l disco.<br />
Después <strong>de</strong> la incubación, el microorganismo se <strong>de</strong>sarrolla en toda la placa<br />
excepto alre<strong>de</strong>dor <strong>de</strong> los discos cuyas concentraciones son inhibitorias. La<br />
distancia en la que se inhibe el crecimiento <strong>de</strong>l microorganismo inoculado en el<br />
medio se <strong>de</strong>nomina halo <strong>de</strong> inhibición, se mi<strong>de</strong> en milímetros y es inversamente<br />
proporcional a la CMI.<br />
MEDIO DE CULTIVO.<br />
Se emplea el agar Müeller-Hinton, repartido en placas <strong>de</strong> modo que el medio<br />
alcance en la placa un espesor uniforme <strong>de</strong> 4 mm; si es más fino, los<br />
antimicrobianos tien<strong>de</strong>n a difundir más en dirección lateral, aumentando el<br />
tamaño <strong>de</strong> las zonas <strong>de</strong> inhibición; si el agar es <strong>de</strong> más <strong>de</strong> 4 mm. <strong>de</strong> espesor, se<br />
produce una mayor difusión hacia abajo, con ten<strong>de</strong>ncia a estrechar<br />
artificialmente las zonas <strong>de</strong> inhibición.<br />
Antes <strong>de</strong> utilizar las placas se <strong>de</strong>be comprobar que no posean agua <strong>de</strong><br />
con<strong>de</strong>nsación y se <strong>de</strong>ben <strong>de</strong>jar a temperatura ambiente hasta que alcancen la<br />
<strong>de</strong>l laboratorio.<br />
INÓCULO.<br />
La <strong>de</strong>nsidad <strong>de</strong>l inóculo es uno <strong>de</strong> los factores que más influye en el diámetro <strong>de</strong>l<br />
halo <strong>de</strong> inhibición, existiendo una relación inversa entre la concentración <strong>de</strong>l<br />
inóculo bacteriano y dicho halo. Por esto se <strong>de</strong>be estandarizar su preparación, lo<br />
cual se consigue ajustando la turbi<strong>de</strong>z al 0,5 <strong>de</strong> la escala <strong>de</strong> MacFarland, tal y<br />
como ya se ha <strong>de</strong>scrito.<br />
SIEMBRA.<br />
La inoculación se <strong>de</strong>be hacer <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> los primeros 15 minutos <strong>de</strong>spués <strong>de</strong><br />
preparado el inóculo. Existen varios métodos <strong>de</strong> inoculación; el <strong>de</strong> Bauer-Kirby<br />
consiste en introducir un escobillón en el inóculo ajustado, eliminar el exceso<br />
presionando suavemente sobre las pare<strong>de</strong>s <strong>de</strong>l tubo y sembrar la placa por<br />
estriación masiva en superficie, lo más homogénea posible. Antes <strong>de</strong> colocar los<br />
discos se <strong>de</strong>ja secar la superficie. No <strong>de</strong>be transcurrir más <strong>de</strong> 10 minutos entre<br />
la siembra y la colocación <strong>de</strong> los discos.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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COLOCACIÓN DE LOS DISCOS.<br />
TEMARIO DE T.E.L<br />
Los discos utilizados son <strong>de</strong> papel <strong>de</strong> filtro estériles <strong>de</strong> 6 mm <strong>de</strong> diámetro y<br />
contienen diferentes antimicrobianos <strong>de</strong>secados a la concentración<br />
convenientemente expresada (expresada en ìg/ml o en UI, atendiendo a las<br />
normas <strong>de</strong> la OMS). Se suelen comercializar en tubos <strong>de</strong> 50 unida<strong>de</strong>s, algunos<br />
<strong>de</strong> los cuales llevan un dispositivo que ayuda a la dispensación <strong>de</strong> los discos. De<br />
todas formas, suele ser más cómodo y seguro colocar los discos sobre la placa<br />
con pinzas estériles y frías (se mantienen en alcohol y se flamean y enfrían antes<br />
<strong>de</strong> su uso), presionando un poco sin tocar con las pinzas el medio <strong>de</strong> cultivo.<br />
Antes <strong>de</strong> su uso se sacan <strong>de</strong>l frigorífico y se <strong>de</strong>jan a temperatura ambiente unos<br />
30 minutos.<br />
Una vez colocados en la placa, los discos <strong>de</strong>ben quedar a unos 15 mm <strong>de</strong><br />
distancia entre si y <strong>de</strong>l bor<strong>de</strong> <strong>de</strong> la placa para que no se interfieran los halos <strong>de</strong><br />
inhibición. En las placas <strong>de</strong> 9 centímetros <strong>de</strong> diámetro se colocaran 6-8 discos y<br />
en las placas <strong>de</strong> 14 cm 12 discos; para microorganismos que suelan dar halos<br />
<strong>de</strong> inhibición muy gran<strong>de</strong>s, como Haemophilus sp., se <strong>de</strong>ben colocar menos<br />
discos por placa.<br />
Se <strong>de</strong>be evitar que los discos rue<strong>de</strong>n por el medio al colocarlos, ya que el<br />
antimicrobiano difundiría incontroladamente.<br />
Existen dispensadores automáticos <strong>de</strong> discos, que llevan acoplado un tipo<br />
especial <strong>de</strong> cartucho y que permiten la dispensación <strong>de</strong> tantos discos a la vez<br />
como cartuchos sea capaz <strong>de</strong> albergar.<br />
Antes <strong>de</strong> incubar las placas se <strong>de</strong>ben <strong>de</strong>jar reposar a temperatura ambiente<br />
unos 10 minutos para que los antimicrobianos hagan una predifusión. A<br />
continuación se incuban a 35-37ºC durante 18-24 horas.<br />
LECTURA E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS.<br />
Después <strong>de</strong>l período <strong>de</strong> incubación aparecen los halos <strong>de</strong> inhibición alre<strong>de</strong>dor<br />
<strong>de</strong> los discos que contienen antimicrobianos a los cuales es sensible el<br />
microorganismo en estudio. Utilizando una regla, se medirá el diámetro <strong>de</strong>l halo<br />
<strong>de</strong> inhibición en mm. Con la medida obtenida nos vamos a unas tablas que nos<br />
van a indicar si el microorganismo es "sensible", "mo<strong>de</strong>radamente sensible" o<br />
"resistente". Para la interpretación <strong>de</strong> los resultados ha <strong>de</strong> tenerse en cuenta la<br />
concentración <strong>de</strong>l disco, el microorganismo en cuestión y el medio <strong>de</strong> cultivo<br />
empleado, entre otros factores.<br />
La categoría "sensible" indica que la cepa estudiada es afectada por<br />
concentraciones normales <strong>de</strong> antimicrobianos, alcanzadas en el organismo<br />
administrando dosis habituales.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
La categoría <strong>de</strong> "sensibilidad intermedia" indica que para actuar sobre el<br />
microorganismo se <strong>de</strong>be forzar la dosis, lo cual no siempre es posible, <strong>de</strong>bido a<br />
los efectos tóxicos.<br />
La categoría <strong>de</strong> "resistente" indica que la concentración máxima <strong>de</strong><br />
antimicrobiano que se pue<strong>de</strong> conseguir en el lugar <strong>de</strong> la infección no es<br />
suficiente para afectarle.<br />
La ten<strong>de</strong>ncia actual es a hacer una interpretación binaria, clasificando los<br />
microorganismos en sensibles o resistentes, según el diámetro <strong>de</strong> la zona <strong>de</strong><br />
inhibición sea mayor o menor que el establecido. Las respuestas intermedias<br />
quedan incluidas <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> las resistentes para no inducir a errores terapéuticos.<br />
A la hora <strong>de</strong> realizar la lectura hay que tener una serie <strong>de</strong> precauciones en<br />
casos concretos:<br />
• Con algunos antibióticos, como las sulfamidas, aparecen bor<strong>de</strong>s borrosos<br />
<strong>de</strong>l halo <strong>de</strong> inhibición y se <strong>de</strong>be medir el diámetro teniendo en cuenta la<br />
parte exterior <strong>de</strong> dicho bor<strong>de</strong>.<br />
• En los Proteus se pue<strong>de</strong> presentar invasión <strong>de</strong> la zona interior <strong>de</strong>l halo <strong>de</strong><br />
inhibición, observándose sin embargo un bor<strong>de</strong> neto. Esta invasión no hay<br />
que tenerla en cuenta en las lecturas y el diámetro se mi<strong>de</strong> consi<strong>de</strong>rando<br />
dicho bor<strong>de</strong> neto.<br />
• Staphylococcus aureus presenta resistencia cruzada a todos los<br />
betalactámicos; esta resistencia se estudia mediante discos <strong>de</strong> oxacilina<br />
<strong>de</strong> 1 ìg o <strong>de</strong> meticilina <strong>de</strong> 5 ìg, con incubación a 30ºC, o sobre Müeller-<br />
Hinton salino; las cepas resistentes a estos antibióticos <strong>de</strong>ben<br />
consi<strong>de</strong>rarse resistentes al grupo.<br />
LIMITACIONES DEL MÉTODO y CAUSAS DE ERROR.<br />
Pue<strong>de</strong>n clasificarse en <strong>de</strong>pendientes <strong>de</strong>:<br />
* Medio: mal estado, sin ajuste <strong>de</strong> pH, volumen ina<strong>de</strong>cuado <strong>de</strong> la placa.<br />
* Antimicrobianos:<br />
• Para los antimicrobianos que difun<strong>de</strong>n lentamente en el agar los<br />
resultados pue<strong>de</strong>n no ser fi<strong>de</strong>dignos y se <strong>de</strong>ben usar controles, aún<br />
cuando se utilicen discos <strong>de</strong> elevado contenido para contrarrestar en<br />
cierta medida la difusibilidad lenta.<br />
• Causas <strong>de</strong> error: mala conservación <strong>de</strong> los discos (<strong>de</strong>ben conservarse en<br />
frigorífico, en recipientes herméticamente cerrados y con <strong>de</strong>secador),<br />
caducidad <strong>de</strong> los mismos y tiempo <strong>de</strong> <strong>de</strong>mora al inocularlos.<br />
* Microorganismos:<br />
• Las técnicas <strong>de</strong> difusión no son aplicables a microorganismos <strong>de</strong><br />
<strong>de</strong>sarrollo lento; si se requiere una incubación prolongada para lograr<br />
suficiente <strong>de</strong>sarrollo y obtener una zona <strong>de</strong> inhibición <strong>de</strong>tectable, el<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
antibiótico pue<strong>de</strong> llegar a <strong>de</strong>teriorarse hasta el punto <strong>de</strong> producir lecturas<br />
imprecisas.<br />
• Estas técnicas tampoco dan buenos resultados con microorganismos muy<br />
exigentes.<br />
• Los métodos <strong>de</strong> difusión no son aplicables a la <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong><br />
susceptibilidad <strong>de</strong> anaerobios. El largo período <strong>de</strong> incubación necesario<br />
para la recuperación <strong>de</strong> muchos anaerobios ha hecho difícil establecer<br />
esquemas interpretativos fiables.<br />
• Causas <strong>de</strong> error: lo más habitual es el exceso <strong>de</strong> inóculo. También pue<strong>de</strong><br />
conducir a errores la utilización <strong>de</strong> cultivos viejos, la inoculación <strong>de</strong> más<br />
<strong>de</strong> un microorganismo (colonias distintas o cultivos contaminados), la<br />
excesiva <strong>de</strong>mora en la siembra y las condiciones <strong>de</strong> incubación.<br />
* Observador: errores <strong>de</strong> lectura o excesiva <strong>de</strong>mora en la misma y errores <strong>de</strong><br />
trascripción o interpretación <strong>de</strong> resultados.<br />
ANTIBIOGRAMA POR DILUCIÓN.<br />
Como ya hemos dicho, se pue<strong>de</strong>n realizar en medio líquido o en medio sólido.<br />
Mediante este tipo <strong>de</strong> antibiograma se <strong>de</strong>termina la "CMI": menor<br />
concentración <strong>de</strong> antimicrobiano capaz <strong>de</strong> inhibir totalmente el crecimiento<br />
bacteriano "in vitro".<br />
EN MEDIO LÍQUIDO.<br />
Consiste en preparar una batería <strong>de</strong> tubos con distintas diluciones<br />
(concentraciones crecientes) <strong>de</strong>l antimicrobiano, <strong>de</strong>positar en cada tubo un<br />
inóculo <strong>de</strong> <strong>de</strong>nsidad celular conocida y, tras incubación, ver en que tubos hay<br />
crecimiento y en cuales no. El tubo cuya concentración <strong>de</strong> antimicrobiano sea<br />
menor y en el que no haya crecimiento correspon<strong>de</strong> a la CMI.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
A) MEDIO DE CULTIVO: se utiliza el caldo <strong>de</strong> Müeller-Hinton o el <strong>de</strong> tripticasa soja<br />
para aquellos microorganismos que no pue<strong>de</strong>n crecer en Müeller-Hinton.<br />
B) TÉCNICA:<br />
• Preparar el inóculo correspondiente al 0,5 <strong>de</strong> la escala <strong>de</strong> Mac Farland.<br />
Realizar una dilución 1/100 <strong>de</strong>l inóculo, lo que equivale a 10 5<br />
microorganismos/ml aproximadamente.<br />
• Añadir 1 ml <strong>de</strong> este inóculo a una batería <strong>de</strong> tubos que contengan 1 ml <strong>de</strong><br />
caldo <strong>de</strong> Müeller- Hinton que lleva incorporado el antimicrobiano a<br />
concentraciones crecientes.<br />
• Incubar a 37º C durante 18-24 horas.<br />
• El tubo cuya concentración <strong>de</strong> antimicrobiano sea menor y no presente<br />
crecimiento, correspon<strong>de</strong> a la CMI.<br />
Se <strong>de</strong>be inocular un tubo <strong>de</strong> Müeller-Hinton que se guardará en frigorífico a 4º C<br />
como control <strong>de</strong> siembra.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
C) LECTURA E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: se consi<strong>de</strong>ra concentración<br />
mínima inhibitoria (CMI) la <strong>de</strong>l tubo con menor concentración (mayor dilución) <strong>de</strong><br />
antimicrobiano que no presente aumento <strong>de</strong> turbi<strong>de</strong>z respecto al tubo testigo<br />
guardado en el frigorífico.<br />
MICROTÉCNICA DE DILUCIÓN EN CALDO.<br />
Hoy día, en los laboratorios con un alto volumen <strong>de</strong> trabajo, se suele utilizar la<br />
microtécnica <strong>de</strong> dilución en caldo, cuyo fundamento es el mismo que el <strong>de</strong>l<br />
método que acabamos <strong>de</strong> <strong>de</strong>scribir, diferenciándose en que la sensibilidad <strong>de</strong><br />
los microorganismos a distintos antimicrobianos se prueba en una serie <strong>de</strong><br />
"pocillos" mol<strong>de</strong>ados en una placa <strong>de</strong> plástico.<br />
Cada placa pue<strong>de</strong> contener 80 o más pocillos según el número <strong>de</strong> hileras<br />
horizontales y verticales.<br />
Ej.: una microplaca que contenga 80 concavida<strong>de</strong>s dispuestas en 10 hileras<br />
verticales y 8 horizontales, permite el estudio <strong>de</strong> 10 antimicrobianos diferentes,<br />
cada uno a 8 diluciones seriadas. La microplaca se prepara colocando el<br />
volumen a<strong>de</strong>cuado <strong>de</strong> las distintas diluciones <strong>de</strong> antimicrobianos en los pocillos,<br />
si bien existen ya en el mercado microplacas con los antimicrobianos liofilizados,<br />
preparadas para su uso inmediato<br />
A B C D E F G H<br />
I J<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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128 ìg/ml<br />
64 ìg/ml<br />
32 ìg/ml<br />
16 ìg/ml<br />
8 ìg/ml<br />
4 ìg/ml<br />
2 ìg/ml<br />
1 ìg/ml<br />
TEMARIO DE T.E.L<br />
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Una vez preparadas dichas microplacas e incubadas se observará el crecimiento<br />
bacteriano como un botón en el fondo <strong>de</strong>l pocillo.<br />
Estudiaremos a continuación el ejemplo <strong>de</strong> la página anterior: Cada hilera<br />
vertical correspon<strong>de</strong> a un antimicrobiano distinto. Las hileras horizontales<br />
correspon<strong>de</strong>n a diferentes diluciones <strong>de</strong>l antimicrobiano.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
• Observamos que en la hilera "A" con un antimicrobiano <strong>de</strong>terminado [A]<br />
hay crecimiento bacteriano en todas las concavida<strong>de</strong>s. Esto significa que<br />
el microorganismo en estudio es resistente al antimicrobiano [A] en todas<br />
las concentraciones ensayadas, o bien, que la CMI es superior a 128<br />
ìg/ml.<br />
• Observamos que en la hilera "B" hay crecimiento bacteriano en las seis<br />
últimas concavida<strong>de</strong>s. Esto significa que la CMI <strong>de</strong>l antimicrobiano [B]<br />
para el microorganismo en estudio es 64 ìg/ml.<br />
EN MEDIO SÓLIDO.<br />
Este método permite también la investigación <strong>de</strong> la CMI. Tiene la ventaja <strong>de</strong> ser<br />
<strong>de</strong> más fácil y mejor manipulación que la técnica en medio líquido. A<strong>de</strong>más<br />
permite realizar el estudio <strong>de</strong> varias cepas distintas por placa y <strong>de</strong>scubre mejor<br />
una contaminación.<br />
Este método implica el uso <strong>de</strong> una serie <strong>de</strong> placas <strong>de</strong> agar Müeller-Hinton, cada<br />
una con una diferente concentración <strong>de</strong>l antimicrobiano a probar. Las diluciones<br />
<strong>de</strong> antimicrobiano suelen oscilar entre unos límites establecidos, que van <strong>de</strong>s<strong>de</strong><br />
0,25 ìg/ml hasta 128 ìg/ml, para la mayoría <strong>de</strong> los antimicrobianos, sin<br />
excepciones. El antimicrobiano se añadirá al medio <strong>de</strong> cultivo <strong>de</strong>spués <strong>de</strong><br />
esterilizarlo y una vez que se haya enfriado hasta aproximadamente 50º C, en<br />
proporción 1/10 (V/V).Se procurará una distribución lo más homogénea posible,<br />
evitando la formación <strong>de</strong> burbujas.<br />
Paralelamente se preparan placas control sin antimicrobiano. Las placas<br />
solidificadas se guardan refrigeradas y <strong>de</strong>ben utilizarse antes <strong>de</strong> una semana.<br />
A) MEDIO DE CULTIVO: agar Müeller-Hinton suplementado con un 5% <strong>de</strong> sangre<br />
en caso necesario.<br />
B) TÉCNICA:<br />
• Preparar las placas <strong>de</strong> agar Müeller-Hinton con las distintas diluciones <strong>de</strong><br />
antimicrobiano.<br />
• Preparar el inóculo ajustándolo al 0,5 <strong>de</strong> la escala <strong>de</strong> MacFarland y<br />
diluyéndolo al 1/10.<br />
• Inocular: la inoculación se realiza en "gota" (sin exten<strong>de</strong>r) mediante un<br />
asa calibrada que dispense 1 o 2 microlitros o con un dispositivo<br />
multidispensador que <strong>de</strong>posite este volumen <strong>de</strong> muestra, <strong>de</strong>l tipo <strong>de</strong>l<br />
replicador <strong>de</strong> Steers. En ambos casos, una gota <strong>de</strong> 5-8 mm <strong>de</strong> diámetro<br />
contiene la misma concentración microbiana. Se comienza inoculando las<br />
placas <strong>de</strong> menor concentración, <strong>de</strong>jando las placas control las últimas con<br />
el fin <strong>de</strong> comprobar que hubo microorganismos viables en todo el<br />
procedimiento y ausencia <strong>de</strong> contaminación. La posible invasión <strong>de</strong><br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
Proteus se evita presionando un cilindro <strong>de</strong> vidrio en el agar que ro<strong>de</strong>a la<br />
gota.<br />
• Las placas inoculadas se <strong>de</strong>jan reposar hasta que las gotas <strong>de</strong>l inóculo se<br />
absorben completamente, y luego se incuban a 35-37ºC durante 18-24<br />
horas.<br />
C) LECTURA E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: la CMI viene dada por la<br />
placa con menor concentración <strong>de</strong> antimicrobiano que evite el crecimiento <strong>de</strong> la<br />
cepa investigada.<br />
La interpretación clínica <strong>de</strong> estos resultados se traduce en que se <strong>de</strong>be lograr<br />
alcanzar en el lugar <strong>de</strong> la infección una concentración <strong>de</strong> antimicrobiano al<br />
menos igual a la C.M.I..<br />
SISTEMAS AUTOMATIZADOS PARA PRUEBAS DE<br />
SUSCEPTIBILIDAD.<br />
Estos sistemas aportan un resultado que se pue<strong>de</strong> clasificar en susceptible,<br />
intermedio o resistente o en una concentración mínima inhibitoria. Algunos<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
sistemas se limitan a hacer automáticos métodos tradicionales, mientras que<br />
otros pue<strong>de</strong>n dar lecturas tras pocas horas <strong>de</strong> incubación. La mayoría utilizan un<br />
procedimiento mecanizado <strong>de</strong> inoculación <strong>de</strong> caldo sobre las diferentes<br />
concentraciones <strong>de</strong> atimicrobiano, congelado o liofilizado, y una fase <strong>de</strong> lectura y<br />
procesamiento <strong>de</strong> resultados; otros sistemas inoculan placas <strong>de</strong> agar con<br />
diferentes diluciones <strong>de</strong> antimicrobiano, <strong>de</strong> forma similar a la que se utiliza con el<br />
replicador <strong>de</strong> Steers.<br />
La mayoría <strong>de</strong> los sistemas se basan en la comparación <strong>de</strong>l crecimiento<br />
microbiano <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> un <strong>de</strong>terminado tiempo <strong>de</strong> incubación en presencia <strong>de</strong>l<br />
antimicrobiano y el obtenido durante el mismo tiempo en su ausencia. La<br />
cantidad <strong>de</strong> crecimiento pue<strong>de</strong> <strong>de</strong>terminarse utilizando transmisión o dispersión<br />
<strong>de</strong> la luz, efectuándose los cálculos por or<strong>de</strong>nador. Para la <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> la<br />
CMI se emplean diferentes concentraciones <strong>de</strong>l antimicrobiano.<br />
ANTIBIOGRAMA ANAEROBIO.<br />
Los estudios <strong>de</strong> sensibilidad frente a los gérmenes anaerobios no tienen una<br />
eficacia y reproductibilidad igual que los <strong>de</strong>stinados a los gérmenes aerobios (los<br />
vistos hasta ahora). Por este motivo hay investigadores que recomiendan la no<br />
utilización sistemática <strong>de</strong> estos métodos y que el tratamiento se establezca<br />
según criterios terapéuticos previamente establecidos, basados en el<br />
conocimiento <strong>de</strong> los patrones <strong>de</strong> sensibilidad <strong>de</strong> los distintos grupos <strong>de</strong><br />
anaerobios, y en la probable etiología según el tipo y lugar <strong>de</strong> la infección. Hay<br />
ocasiones, sin embargo en las que la gravedad <strong>de</strong>l proceso o su larga duración<br />
aconsejan su realización.<br />
Se sigue una metodología similar a la <strong>de</strong>scrita para los microorganismos<br />
aerobios, siendo <strong>de</strong> elección el método <strong>de</strong> dilución, tanto en medio líquido como<br />
en sólido, utilizando un medio <strong>de</strong> cultivo enriquecido en incubando en<br />
condiciones anaerobias durante 24-72 horas.<br />
Como ya se ha comentado anteriormente, el método <strong>de</strong> Bauer-Kirby no presenta<br />
la utilidad que tiene en ambiente aerobio ya que las condiciones <strong>de</strong> este método<br />
no son totalmente reproducibles en ausencia <strong>de</strong> oxígeno; así, el medio <strong>de</strong><br />
Müeller-Hinton no sirve para el crecimiento <strong>de</strong> muchos anaerobios, y tiene que<br />
utilizarse suplementado con sangre <strong>de</strong> cor<strong>de</strong>ro o <strong>de</strong> caballo, falseando esta<br />
inclusión el diámetro <strong>de</strong>l halo <strong>de</strong> inhibición producido por algunos antibióticos.<br />
A<strong>de</strong>más, no existe una estricta correlación entre los citados halos y las CMIs.<br />
Otra dificultad que presenta el método es que sólo es válido para<br />
microorganismos <strong>de</strong> crecimiento rápido y la mayoría <strong>de</strong> los anaerobios no lo son.<br />
Señalaremos, a continuación, una serie <strong>de</strong> factores a tener en cuenta antes <strong>de</strong><br />
efectuar estudios <strong>de</strong> sensibilidad para microorganismos anaerobios:<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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MEDIO DE CULTIVO.<br />
TEMARIO DE T.E.L<br />
Para los antibiogramas anaerobios en caldo se pue<strong>de</strong> utilizar el caldo infusión<br />
cerebro corazón, el caldo Schaedler, el caldo Brucella o el tioglicolato, siendo<br />
probablemente este último el que mejores resultados da. Estos medios <strong>de</strong>ben ir<br />
suplementados con hemina y vitamina K1 (factores <strong>de</strong> crecimiento para<br />
Bacteroi<strong>de</strong>s fragilis). También se les pue<strong>de</strong> adicionar extracto <strong>de</strong> levadura, que<br />
aportará vitaminas, purinas y pirimidinas.<br />
Para las técnicas en medios sólidos se suelen utilizar, a<strong>de</strong>más <strong>de</strong> los ya citados<br />
previa adición <strong>de</strong> agar, el Eugón agar, el Müeller-Hinton agar suplementado con<br />
un 5% <strong>de</strong> sangre <strong>de</strong> cor<strong>de</strong>ro o <strong>de</strong> caballo o el medio <strong>de</strong> Wilkins y Chalgren,<br />
específicamente recomendado para la prueba <strong>de</strong> dilución en agar.<br />
ATMÓSFERA DE INCUBACIÓN: La más recomendable es la que está<br />
compuesta por un 5% <strong>de</strong> CO2, 10% <strong>de</strong> H2 y 85% <strong>de</strong> N2. La cantidad <strong>de</strong> CO2 no<br />
<strong>de</strong>be exce<strong>de</strong>r <strong>de</strong>l 10%, pues pue<strong>de</strong> disminuir la acción <strong>de</strong> algunos antibióticos<br />
como lincomicina, macrólidos y aminoglicósidos. A<strong>de</strong>más, en los medios sólidos<br />
influye rebajando el pH superficial, con la consecuente alteración <strong>de</strong>l efecto <strong>de</strong><br />
beta-lactámicos y aminósidos.<br />
INÓCULO.<br />
Es prácticamente imposible precisar la cifra i<strong>de</strong>al <strong>de</strong> microorganismos para el<br />
inóculo <strong>de</strong>l antibiograma anaerobio. Sin embargo, con el fin <strong>de</strong> estandarizar, se<br />
consi<strong>de</strong>ra el inóculo más apropiado el que presenta una turbi<strong>de</strong>z igual a la mitad<br />
<strong>de</strong>l 1 <strong>de</strong> la escala <strong>de</strong> MacFarland.<br />
En la práctica se llega a la citada turbi<strong>de</strong>z suspendiendo directamente un cultivo<br />
joven, con menos <strong>de</strong> 72 horas, en caldo recientemente regenerado. A<br />
continuación se diluye al 1/200, con el fin <strong>de</strong> obtener una concentración<br />
bacteriana situada entre 10 5 y 10 6 UFC/ml (unida<strong>de</strong>s formadoras <strong>de</strong> colonias<br />
/ml). La manipulación pue<strong>de</strong> hacerse en condiciones aerobias <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> la<br />
primera media hora, sin que el germen anaerobio pierda viabilidad.<br />
PRUEBAS ESPECIALES.<br />
Ocasionalmente una <strong>de</strong>terminada situación clínica pue<strong>de</strong> justificar la solicitud al<br />
laboratorio <strong>de</strong> una prueba no habitual respecto a fármacos antimicrobianos. A<br />
continuación se <strong>de</strong>scriben las pruebas no habituales que se solicitan con más<br />
frecuencia.<br />
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA BACTERICIDA.<br />
A partir <strong>de</strong> la técnica <strong>de</strong> antibiograma por dilución en medio líquido (macro y<br />
microtécnica) se pue<strong>de</strong> calcular la "CMB" (Concentración Mínima Bactericida)<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
que se <strong>de</strong>fine como la "menor concentración <strong>de</strong> antimicrobiano que mata por lo<br />
menos el 99,9% <strong>de</strong>l inóculo original". Se pone <strong>de</strong> manifiesto sembrando con asa<br />
masivamente en una placa <strong>de</strong> agar Müeller-Hinton los tubos que no hayan<br />
presentado turbi<strong>de</strong>z e incubando a 37ºC durante 18-24 horas. En la práctica la<br />
CMB vendrá dada por la concentración <strong>de</strong>l tubo con menor concentración <strong>de</strong><br />
antimicrobiano que impida el crecimiento sobre el medio sólido.<br />
La <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> la CMB está especialmente indicada en casos en que las<br />
<strong>de</strong>fensas <strong>de</strong>l enfermo están seriamente comprometidas, prefiriéndose<br />
administrar drogas bactericidas o fungicidas. La endocarditis ha sido y sigue<br />
siendo una <strong>de</strong> las principales indicaciones para estas pruebas. La <strong>de</strong>terminación<br />
<strong>de</strong> la CMB es también una prueba frecuentemente solicitada para pacientes <strong>de</strong><br />
trasplante y quimioterapia <strong>de</strong>l cáncer.<br />
PRUEBA DE LA BETALACTAMASA.<br />
El grupo <strong>de</strong> fármacos betalactámicos engloba las penicilinas y cefalosporinas. El<br />
mecanismo <strong>de</strong> resistencia más frecuente frente a este tipo <strong>de</strong> fármacos es la<br />
producción <strong>de</strong> una enzima bacteriana (betalactamasa) que inactiva el fármaco al<br />
romper el anillo betalactámico.<br />
La prueba <strong>de</strong> la betalactamasa constituye un método rápido <strong>de</strong> establecer si un<br />
germen que se ha aislado produce betalactamasa. En la práctica diaria se realiza<br />
<strong>de</strong> forma rutinaria in vitro para investigar, <strong>de</strong> forma más rápida que con el<br />
antibiograma, la producción <strong>de</strong> betalactamasa por Staphylococcus aureus,<br />
Haemophilus influenza y Neisseria gonorrhoeae. Sin embargo, hay que recordar<br />
que a veces las bacterias son resistentes a los fármacos betalactámicos por<br />
mecanismos que no tienen nada que ver con la producción <strong>de</strong> betalactamasa.<br />
Por lo tanto, un resultado positivo indica una resistencia, mientras que un<br />
resultado negativo no garantiza la sensibilidad.<br />
La prueba se realiza exponiendo un substrato <strong>de</strong> prueba batalactámico al<br />
germen durante un período que oscila, <strong>de</strong>pendiendo <strong>de</strong>l microorganismo y el<br />
método <strong>de</strong> prueba, entre los 10 segundos y los 60 minutos. Existen tres métodos<br />
<strong>de</strong> uso general: el método acidométrico, el método yodométrico y el método <strong>de</strong> la<br />
cefalosporina cromógena, pudiendo realizarse tanto con un substrato líquido<br />
como con papeles <strong>de</strong> filtro impregnados.<br />
Quizás <strong>de</strong> estos tres métodos el más utilizado sea el <strong>de</strong> la cefalosporina<br />
cromógena; la prueba se lleva a cabo añadiendo una suspensión concentrada<br />
<strong>de</strong>l germen en estudio a un substrato cromógeno amortiguado (en esta prueba,<br />
una cefalosporina cromogénica como la nitrocefina), incubándolo durante diez<br />
minutos a temperatura ambiente y observando si se produce cambio <strong>de</strong> color,<br />
que se originaría por la ruptura <strong>de</strong> los anillos betalactámicos <strong>de</strong> la cefalosporina<br />
cromogénica.<br />
ESTUDIO DE SECUENCIAS DE ADN PORTADORAS DE LA RESISTENCIA<br />
ANTIMICROBIANA: Mediante el estudio <strong>de</strong>l ADN, por sondas y actualmente<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
mediante tratamiento previo con la reacción en ca<strong>de</strong>na <strong>de</strong> la polimerasa (PCR),<br />
pue<strong>de</strong> i<strong>de</strong>ntificarse la presencia <strong>de</strong> secuencias responsables <strong>de</strong> resistencia a<br />
distintos antimicrobianos; por ejemplo, la secuencia TEM-1 es responsable <strong>de</strong> la<br />
resistencia frente a penicilinas y cefalosporinas.<br />
PRUEBAS DE SINERGIA ANTIMICROBIANA.<br />
Cuando se administran dos o más fármacos antimicrobianos a un paciente, el<br />
efecto <strong>de</strong> la combinación pue<strong>de</strong> ser:<br />
• Aditivo: cuando la actividad antimicrobiana <strong>de</strong> la combinación es la que<br />
cabría prever sumando las activida<strong>de</strong>s que presentan los fármacos por<br />
separado.<br />
• Antagónico: cuando la actividad <strong>de</strong> la combinación es notablemente<br />
inferior a la suma <strong>de</strong> las activida<strong>de</strong>s individuales.<br />
• Sinérgico: cuando la actividad <strong>de</strong> la combinación es consi<strong>de</strong>rablemente<br />
superior a la suma <strong>de</strong> las activida<strong>de</strong>s individuales.<br />
En la mayor parte <strong>de</strong> los casos la administración <strong>de</strong> fármacos <strong>de</strong> forma<br />
combinada se realiza sobre la base <strong>de</strong> la experiencia <strong>de</strong>scrita anteriormente.<br />
Solo en casos muy concretos, cuando un resultado sea esencial para el<br />
tratamiento <strong>de</strong> un paciente, es aconsejable estudiar el efecto <strong>de</strong> una<br />
combinación frente al germen aislado en el propio paciente.<br />
ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL SUERO.<br />
En la actualidad el estudio <strong>de</strong> la actividad antibacteriana <strong>de</strong>l suero es una prueba<br />
que se realiza en pacientes con septicemia, endocarditis, osteomielitis y<br />
meningitis para conocer la vali<strong>de</strong>z <strong>de</strong> la terapia establecida y modificarla en el<br />
caso <strong>de</strong> que los niveles sanguíneos (séricos) sean bajos.<br />
El propósito <strong>de</strong> esta técnica es <strong>de</strong>terminar el título <strong>de</strong> actividad antimicrobiana <strong>de</strong><br />
la combinación suero-antibiótico contra el microorganismo aislado <strong>de</strong>l proceso<br />
infeccioso en el paciente estudiado.<br />
La prueba bactericida <strong>de</strong>l suero se realiza con muestras <strong>de</strong> suero obtenidas<br />
inmediatamente antes <strong>de</strong> la administración <strong>de</strong>l antimicrobiano (muestra en el<br />
mínimo) y 30-90 minutos <strong>de</strong> <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> la misma (según la vía <strong>de</strong><br />
administración y el fármaco <strong>de</strong> que se trate) (muestra en el máximo). Se diluyen<br />
los sueros utilizando como diluyente medio <strong>de</strong> cultivo líquido (BHI, caldo <strong>de</strong><br />
Müeller-Hinton suplementado con Ca ++ y Mg ++ ) o preferiblemente suero humano<br />
acumulado carente <strong>de</strong> antimicrobianos ya que permite mantener una<br />
concentración constante <strong>de</strong> las proteínas séricas en cada tubo. A continuación<br />
se aña<strong>de</strong> una suspensión <strong>de</strong> turbi<strong>de</strong>z estandarizada <strong>de</strong>l germen aislado en el<br />
paciente a cada tubo <strong>de</strong> dilución <strong>de</strong> suero y a un tubo control que no contiene<br />
actividad antimicrobiana.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 245 <strong>de</strong> 287
TEMARIO DE T.E.L<br />
La <strong>de</strong>nsidad <strong>de</strong> microorganismos en cada tubo <strong>de</strong>be ser <strong>de</strong> aproximadamente<br />
5x10 5 UFC/ml. Los tubos se incuban a 35ºC durante 20 horas en una atmósfera<br />
apropiada para el germen, se agitan para exponer a los microorganismos a la<br />
actividad antimicrobiana que pueda haber escapado a la exposición previa al<br />
adherirse a las pare<strong>de</strong>s <strong>de</strong>l tubo, y se vuelven a incubar otras cuatro horas.<br />
En este punto se <strong>de</strong>termina el título inhibitorio <strong>de</strong>l suero, i<strong>de</strong>ntificando la dilución<br />
máxima <strong>de</strong>l suero que inhibe el crecimiento visible <strong>de</strong>l microorganismo. Los<br />
tubos que no presentan crecimiento visible se subcultivan en agar sangre o agar<br />
chocolate y se incuban durante 24 horas. Se cuenta el número <strong>de</strong> colonias <strong>de</strong><br />
cada subcultivo y se <strong>de</strong>termina el título bactericida <strong>de</strong>l suero, i<strong>de</strong>ntificando la<br />
máxima dilución <strong>de</strong>l suero que provoca la muerte <strong>de</strong> al menos el 99,9% <strong>de</strong>l<br />
inóculo original.<br />
Actualmente, <strong>de</strong> forma general, se consi<strong>de</strong>ra a<strong>de</strong>cuada una dosificación <strong>de</strong><br />
antibiótico que <strong>de</strong> un título bactericida máximo ≥32 y mínimo ≥8.<br />
DETERMINACIÓN DE LAS CONCENTRACIONES DE ANTIMICROBIANOS<br />
EN LOS LÍQUIDOS DEL ORGANISMO.<br />
La <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong>l nivel <strong>de</strong> antimicrobiano en el suero u otro líquido corporal<br />
está indicada en los siguientes casos:<br />
• Fármacos antimicrobianos (ej.: aminoglucósidos, cloranfenicol) que tienen<br />
unos márgenes <strong>de</strong> concentraciones terapéuticas-tóxicas estrechos o se<br />
acumulan rápidamente hasta alcanzar concentraciones tóxicas en los<br />
pacientes con disfunciones renales o hepáticas.<br />
• Pacientes don<strong>de</strong> no se ha <strong>de</strong>mostrado el efecto clínico previsto; el fracaso<br />
<strong>de</strong>l tratamiento podría <strong>de</strong>berse a comportamiento particular <strong>de</strong>l<br />
antimicrobiano en ese paciente o a efectos <strong>de</strong>l paciente, microorganismo<br />
o antimicrobiano que pue<strong>de</strong>n <strong>de</strong>sviar o anular la acción <strong>de</strong>l<br />
antimicrobiano.<br />
• Tratamiento <strong>de</strong> infecciones locales severas.<br />
• Situaciones don<strong>de</strong> la enfermedad subyacente <strong>de</strong>l paciente es tal que<br />
pue<strong>de</strong> suponerse que el antibiótico <strong>de</strong>be hacer algo más que eliminar<br />
rutinariamente el microorganismo.<br />
La mayoría <strong>de</strong> las <strong>de</strong>terminaciones <strong>de</strong> los niveles <strong>de</strong> antimicrobianos se realizan<br />
con inmunoensayos instrumentados rápidos. Los inmunoensayos <strong>de</strong>sarrollados<br />
para el control <strong>de</strong> las drogas son mucho más específicos que los bioensayos y<br />
a<strong>de</strong>más tienen la ventaja <strong>de</strong> proporcionar los resultados en unas pocas horas,<br />
sin requerir una incubación hasta el día siguiente.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 246 <strong>de</strong> 287
TEMARIO DE T.E.L<br />
DIÁMETRO ESTANDAR Y CORRELACIÓN APROXIMADA CON LA CMI<br />
ANTIMICROBIANO<br />
A. nadilíxico y pipemídico<br />
Amicacina<br />
Ampicilina (Enterobacterias)<br />
Ampicilina para enterococos<br />
Ampicilina para estafilococos<br />
Ampicilina para estreptococos<br />
Ampicilina para haemophilus<br />
Azlocilina<br />
Aztreonan<br />
Cafaclor para haemophilus<br />
Cefalosporinas<br />
Ciprofloxacina<br />
Clindamicina<br />
Cloranfenicol<br />
Cloranfenicol (haemophilus)<br />
Colistina<br />
Cotrimoxazol<br />
Eritromicina<br />
Fostomicina<br />
Gentamicina<br />
Imipenem<br />
Meticilina<br />
Netilmicina<br />
Nitrofurantoína<br />
Norfloxacina<br />
Ofloxacina<br />
Oxacilina<br />
Oxacilina para neumococos<br />
Penicilina para estafilococos<br />
Penicilina para estreptococos<br />
Piperacilina (Enterobacterias)<br />
Piperacilina para pseudomonas<br />
Rifampicina<br />
Tetraciclina<br />
Ticarcilina para enterobacterias<br />
Ticarcilina para pseudomonas<br />
Tobramicina<br />
Vancomicina<br />
Carga<br />
30 mcg<br />
30 mcg<br />
10 mcg<br />
10 mcg<br />
10 mcg<br />
10 mcg<br />
10 mcg<br />
75 mcg<br />
30 mcg<br />
30 mcg<br />
30 mcg<br />
5 mcg<br />
2 mcg<br />
30 mcg<br />
30 mcg<br />
10 mcg<br />
25 mcg<br />
15 mcg<br />
50 mcg<br />
10 mcg<br />
10 mcg<br />
5 mcg<br />
30 mcg<br />
300mcg<br />
10 mcg<br />
5 mcg<br />
1 mcg<br />
1 mcg<br />
10 UI<br />
10 UI<br />
100mcg<br />
100mcg<br />
5 mcg<br />
30 mcg<br />
75 mcg<br />
75 mcg<br />
10 mcg<br />
30 mcg<br />
Diámetro en milímetros<br />
R<br />
≤ 13<br />
≤ 14<br />
≤ 11<br />
≤ 16<br />
≤ 28<br />
≤ 21<br />
≤ 19<br />
≤ 14<br />
≤ 17<br />
≤ 18<br />
≤ 14<br />
≤ 16<br />
≤ 14<br />
≤ 12<br />
≤ 25<br />
≤ 8<br />
≤ 10<br />
≤ 13<br />
≤ 11<br />
≤ 12<br />
≤ 14<br />
≤ 9<br />
≤ 12<br />
≤ 14<br />
≤ 14<br />
≤ 14<br />
≤ 10<br />
≤ 19<br />
≤ 28<br />
≤ 19<br />
≤ 14<br />
≤ 17<br />
≤ 16<br />
≤ 14<br />
≤ 14<br />
≤ 14<br />
≤ 12<br />
≤ 9<br />
MS<br />
14-18<br />
15-16<br />
12-13<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 247 <strong>de</strong> 287<br />
-<br />
-<br />
22-29<br />
-<br />
15-17<br />
-<br />
19-23<br />
15-17<br />
17-20<br />
15-16<br />
13-17<br />
26-28<br />
9-10<br />
11-15<br />
14-17<br />
12-14<br />
13-14<br />
-<br />
10-13<br />
13-14<br />
15-16<br />
-<br />
-<br />
11-12<br />
-<br />
-<br />
20-27<br />
15-17<br />
-<br />
17-19<br />
15-18<br />
15-19<br />
-<br />
13-14<br />
10-11<br />
S<br />
≥ 19<br />
≥ 17<br />
≥ 14<br />
≥ 17<br />
≥ 29<br />
≥ 30<br />
≥ 20<br />
≥ 18<br />
≥ 26<br />
≥ 24<br />
≥ 18<br />
≥ 21<br />
≥ 17<br />
≥ 18<br />
≥ 29<br />
≥ 11<br />
≥ 200<br />
≥ 18<br />
≥ 15<br />
≥ 15<br />
≥ 16<br />
≥ 14<br />
≥ 15<br />
≥ 17<br />
≥ 17<br />
≥ 16<br />
≥ 13<br />
≥ 20<br />
≥ 29<br />
≥ 28<br />
≥ 18<br />
≥ 18<br />
≥ 20<br />
≥ 19<br />
≥ 20<br />
≥ 15<br />
≥ 15<br />
≥ 12<br />
Correlación con CMI<br />
en mcg/ml<br />
R<br />
≥ 32<br />
≥ 32<br />
≥ 32<br />
≥ 16<br />
âlactamasa<br />
≥ 4<br />
≥ 4<br />
≥ 256<br />
≥ 32<br />
≥ 32<br />
≥ 32<br />
≥ 4<br />
≥ 2<br />
≥ 25<br />
≥ 8<br />
≥ 4<br />
≥35<br />
≥ 8<br />
-<br />
≥ 8<br />
≥ 16<br />
-<br />
≥ 32<br />
≥ 100<br />
≥ 16<br />
≥ 8<br />
-<br />
-<br />
âlactamasa<br />
≥ 4<br />
≥ 256<br />
≥ 128<br />
≥ 4<br />
≥ 16<br />
≥ 128<br />
≥ 128<br />
≥ 8<br />
-<br />
S<br />
≤ 12<br />
≤ 12<br />
≤ 8<br />
≤ 4<br />
≤ 0,2<br />
≤ 0,1<br />
≤ 2<br />
≤ 64<br />
≤ 8<br />
≤ 8<br />
≤ 8<br />
≤ 1<br />
≤ 1<br />
≤ 12<br />
≤ 4<br />
-<br />
≤ 2<br />
-<br />
≤ 6<br />
≤ 4<br />
≤ 3<br />
≤ 8<br />
≤ 25<br />
≤ 4<br />
≤ 2<br />
≤ 1<br />
≤ 0,06<br />
≤ 0,1<br />
≤ 0,1<br />
≤ 64<br />
≤ 64<br />
≤ 1<br />
≤ 4<br />
≤ 16<br />
≤ 64<br />
≤ 6<br />
≤ 5
TEMARIO DE T.E.L<br />
TEMA 17.- CONTROLES DE CALIDAD<br />
INTERNOS Y EVALUACIÓN<br />
EXTERNA DE LA CALIDAD.<br />
INTRODUCCIÓN<br />
En un sentido amplio, el control <strong>de</strong> calidad en los laboratorios <strong>de</strong>be hacerse<br />
siempre extensivo a cualquiera <strong>de</strong> sus aspectos clínico y <strong>de</strong> laboratorio, ya que<br />
en la práctica resulta difícil consi<strong>de</strong>rarlos <strong>de</strong> forma aislada o in<strong>de</strong>pendiente.<br />
Debe procurarse ante todo una correcta recogida <strong>de</strong> los especímenes <strong>de</strong><br />
sangre, su a<strong>de</strong>cuada manipulación y el empleo <strong>de</strong> los métodos más fiables. Ello<br />
obliga, por tanto, al mantenimiento periódico <strong>de</strong> los instrumentos analíticos y a<br />
una verificación sistemática <strong>de</strong> la calidad <strong>de</strong> las técnicas y sus correspondientes<br />
reactivos mediante la ayuda <strong>de</strong> especímenes y muestras control a<strong>de</strong>cuados y<br />
<strong>de</strong> proce<strong>de</strong>ncia garantizada. Finalmente, el laboratorio <strong>de</strong>be también velar por la<br />
claridad y corrección en la forma <strong>de</strong> expresar los resultados al objeto <strong>de</strong> facilitar<br />
en todo momento su interpretación clínica.<br />
En los laboratorios, el empleo cada vez más extendido <strong>de</strong> autoanalizadores ha<br />
contribuido <strong>de</strong> manera <strong>de</strong>cisiva no sólo a incrementar la rapi<strong>de</strong>z en la obtención<br />
<strong>de</strong> los análisis, sino fundamentalmente a mejorar la exactitud y precisión <strong>de</strong> los<br />
resultados. Asimismo, la posibilidad <strong>de</strong> obtener <strong>de</strong> forma sistemática parámetros<br />
que, por el carácter engorroso <strong>de</strong> su <strong>de</strong>terminación manual, sólo se<br />
suministraban esporádicamente ha significado una gran mejora en el diagnóstico<br />
diferencial <strong>de</strong> numerosas situaciones patológicas.<br />
Como contrapartida, tales instrumentos precisan una atención técnica<br />
permanente, por cuanto un fallo en su calibración o pequeñas variaciones<br />
intrínsecas <strong>de</strong>l sistema pue<strong>de</strong>n repercutir <strong>de</strong> manera <strong>de</strong>cisiva sobre un número<br />
muy elevado <strong>de</strong> resultados.<br />
El control <strong>de</strong> calidad en los laboratorios tiene especial importancia para todas<br />
aquellas técnicas fundamentales en el diagnóstico clínico en general. Aunque<br />
estos parámetros, hoy día, son <strong>de</strong>terminados <strong>de</strong> forma sistemática por diversos<br />
autoanalizadores, alguno <strong>de</strong> ellos a partir <strong>de</strong> una misma muestra <strong>de</strong> sangre, los<br />
laboratorios con reducido volumen asistencial continúan empleando los métodos<br />
convencionales o manuales don<strong>de</strong> el colorímetro, la centrífuga y el microscopio<br />
ocupan aún un lugar <strong>de</strong>stacado.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
Este instrumental, aunque simple y reducido, precisa, al igual que los<br />
autoanalizadores, un control <strong>de</strong> calidad periódico, por lo que en modo alguno<br />
<strong>de</strong>be confundirse control <strong>de</strong> calidad con automatización.<br />
CONCEPTOS BÁSICOS<br />
La realización <strong>de</strong> controles <strong>de</strong> calidad en el laboratorio clínico presupone el<br />
conocimiento <strong>de</strong> una terminología básica sin la cual resulta difícil interpretar el<br />
significado <strong>de</strong> los resultados obtenidos.<br />
Exactitud. Es la aproximación <strong>de</strong> una medida a su valor real. Un método exacto<br />
es, por tanto, aquel que suministra una medida correcta o real <strong>de</strong>l parámetro<br />
analizado. Lo contrario es la inexactitud. El valor real <strong>de</strong> una medida se obtiene<br />
cuando se emplean métodos <strong>de</strong> referencia seleccionados por su calidad en<br />
comparación con otros, <strong>de</strong> acuerdo con unos criterios emitidos por organismos<br />
internacionales y reactivos <strong>de</strong> calidad garantizada.<br />
Precisión. Se <strong>de</strong>fine como la aproximación <strong>de</strong>l valor <strong>de</strong> una medida a sí mismo,<br />
cuando se realizan varias <strong>de</strong>terminaciones <strong>de</strong> la misma empleando el mismo<br />
método. Para conocer la precisión <strong>de</strong> una medida no es necesario conocer su<br />
valor real, ya que lo único que interesa es el grado <strong>de</strong> variación obtenido<br />
<strong>de</strong>spués <strong>de</strong> realizar varias <strong>de</strong>terminaciones <strong>de</strong> la misma (reproductibilidad <strong>de</strong> la<br />
medida).<br />
Error. Es la <strong>de</strong>sviación <strong>de</strong> una medida con respecto a los criterios <strong>de</strong> exactitud y<br />
precisión. La inexactitud no <strong>de</strong>be acompañarse forzosamente <strong>de</strong> imprecisión y<br />
viceversa. Así, un método pue<strong>de</strong> ser exacto pero impreciso, o preciso pero<br />
inexacto o ambas cosas a la vez (Figura 1).<br />
El error pue<strong>de</strong> ser <strong>de</strong> dos tipos: aleatorio o sistemático. El error aleatorio<br />
obe<strong>de</strong>ce a causas difíciles <strong>de</strong> <strong>de</strong>terminar, que casi siempre surgen <strong>de</strong> forma<br />
esporádica (fallo técnico al tomar una medida). Por el contrario, el error<br />
sistemático suele obe<strong>de</strong>cer a causas fáciles <strong>de</strong> i<strong>de</strong>ntificar, por cuanto se repite<br />
siempre <strong>de</strong> la misma manera (<strong>de</strong>ficiente calibración <strong>de</strong> los instrumentos<br />
analíticos, errores sistemáticos en la preparación <strong>de</strong> reactivos y otros).<br />
Dispersión. Correspon<strong>de</strong> a la variabilidad <strong>de</strong> una medida alre<strong>de</strong>dor <strong>de</strong> su valor<br />
medio. La dispersión <strong>de</strong> una medida se <strong>de</strong>termina mediante dos parámetros:<br />
media aritmética ( X ) y <strong>de</strong>sviación estándar (DE). La media aritmética es el<br />
cociente entre la suma <strong>de</strong> todos los valores individuales (X) y el número total <strong>de</strong><br />
los mismos (N). Ejemplo: Si para una medida se obtienen 10 valores diferentes,<br />
5, 8, 6, 6, 7, 8, 7, 7, 9 y 7, la media aritmética <strong>de</strong> la misma será:<br />
5 + 8 + 6 + 6 + 7 + 8 + 7 + 7 + 9 + 7<br />
X<br />
=<br />
10<br />
= 7<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
Exactitud y<br />
precisión<br />
Situación i<strong>de</strong>al<br />
Exactitud e<br />
imprecisión<br />
Error aleatorio<br />
El valor <strong>de</strong> X se conoce simplemente como media o valor medio <strong>de</strong> un conjunto<br />
<strong>de</strong> valores y <strong>de</strong>be diferenciarse <strong>de</strong> la moda y la mediana.<br />
La moda correspon<strong>de</strong> al valor <strong>de</strong> conjunto que se repite con mayor frecuencia.<br />
En el ejemplo anterior la moda es 7.<br />
La mediana es el valor situado en medio <strong>de</strong> una serie <strong>de</strong> valores or<strong>de</strong>nados<br />
numéricamente. En el ejemplo anterior, las cifras or<strong>de</strong>nadas numéricamente son<br />
5, 6, 7, 8 y 9, por lo tanto la mediana es 7.<br />
Cuando, como en el ejemplo citado, la media aritmética, la moda y la mediana<br />
tienen el mismo valor, se dice que la población estudiada presenta una<br />
distribución normal o gaussiana.<br />
La <strong>de</strong>sviación estándar (DE) es la raíz cuadrada <strong>de</strong> la varianza (V), siendo ésta<br />
el cociente entre la suma <strong>de</strong> los cuadrados <strong>de</strong> las diferencias entre cada valor<br />
individual (Xi) y la media aritmética y los grados <strong>de</strong> libertad (número <strong>de</strong><br />
observaciones menos uno).<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 250 <strong>de</strong> 287<br />
Inexactitud y<br />
precisión<br />
Error sistemático<br />
Inexactitud e<br />
imprecisión<br />
Error aleatorio
TEMARIO DE T.E.L<br />
Así, en el ejemplo anterior, el valor <strong>de</strong> la DE sería <strong>de</strong> 1,15, y el <strong>de</strong> la varianza (V)<br />
<strong>de</strong> 1,33:<br />
Prueba Xi Xi-X (Xi-X) 2<br />
1 5 -2 4<br />
2 8 +1 1<br />
3 6 -1 1<br />
4 6 -1 1<br />
5 7 0 0<br />
6 8 +1 1<br />
7 7 0 0<br />
8 7 0 0<br />
9 9 +2 4<br />
10 7 0 0<br />
N = 10 Xi = 70 (Xi-X) 2 = 12<br />
70<br />
X = = 7<br />
10<br />
(Xi-X) 2 12<br />
V= = = 1,33<br />
N – 1 9<br />
DE = V = 1 , 33 = 1,15<br />
Coeficiente <strong>de</strong> variación. Correspon<strong>de</strong> al valor <strong>de</strong> la <strong>de</strong>sviación estándar (DE)<br />
expresada en tanto por ciento <strong>de</strong> la media.<br />
CV (%) =<br />
DE x 100<br />
X<br />
En el ejemplo anterior, el valor <strong>de</strong> CV sería:<br />
1,15 x 100<br />
CV = = 16,4 %<br />
7<br />
Histograma. Es la representación gráfica <strong>de</strong>l número <strong>de</strong> valores obtenidos para<br />
un <strong>de</strong>terminado parámetro y proporciona una imagen <strong>de</strong> la distribución <strong>de</strong><br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 251 <strong>de</strong> 287
TEMARIO DE T.E.L<br />
frecuencias (Figura 2). Cuando el número <strong>de</strong> valores es muy elevado, el<br />
histograma se transforma en una curva continua (curva <strong>de</strong> distribución).<br />
Frecuencia (%)<br />
80<br />
70<br />
60<br />
50<br />
40<br />
30<br />
20<br />
10<br />
0<br />
10 30 50 70 90<br />
Actividad Enzimática<br />
Figura 2. Histograma.<br />
Intervalo <strong>de</strong> confianza. El intervalo <strong>de</strong> confianza se <strong>de</strong>fine como un conjunto <strong>de</strong><br />
valores <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> los cuales está situada la media verda<strong>de</strong>ra. En general, el<br />
intervalo <strong>de</strong> confianza mínimo correspon<strong>de</strong> al 95 %, es <strong>de</strong>cir, la probabilidad <strong>de</strong><br />
que el valor medio sea el verda<strong>de</strong>ro es <strong>de</strong>l 95 % o uno <strong>de</strong> cada veinte valores<br />
obtenidos pue<strong>de</strong> hallarse fuera <strong>de</strong> los límites <strong>de</strong> confianza. En una distribución<br />
normal el límite <strong>de</strong> confianza mínimo correspon<strong>de</strong> a todos los valores incluidos<br />
<strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> las dos <strong>de</strong>sviaciones estándar <strong>de</strong> la media (2 DE).<br />
Patrones, muestra <strong>de</strong> referencia y controles. Un patrón es una sustancia<br />
cuyas características han sido analizadas mediante procedimientos físicos o<br />
químicos y a la cual se le ha asignado un <strong>de</strong>terminado valor. Los patrones<br />
pue<strong>de</strong>n ser <strong>de</strong> dos tipos: a) nacionales y b) internacionales.<br />
Los patrones internacionales son elaborados únicamente por la Organización<br />
Mundial <strong>de</strong> la Salud (OMS) o el Comité Internacional <strong>de</strong> Estandarización en<br />
Hematología (ICSH). La finalidad <strong>de</strong> los patrones internacionales es suministrar<br />
un valor <strong>de</strong> referencia, con el cual se contrasta el valor <strong>de</strong> los patrones<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 252 <strong>de</strong> 287
TEMARIO DE T.E.L<br />
elaborados por las diferentes organizaciones nacionales <strong>de</strong> control <strong>de</strong> calidad<br />
(patrones nacionales).<br />
Una muestra <strong>de</strong> referencia es una sustancia estable elaborada <strong>de</strong> acuerdo con<br />
las características <strong>de</strong> un patrón nacional o internacional y que normalmente es<br />
utilizada para controlar la exactitud <strong>de</strong> una <strong>de</strong>terminada técnica. Cuando la<br />
muestra <strong>de</strong> referencia se emplea para calibrar un instrumento analítico o para<br />
ajustar una medida a su valor verda<strong>de</strong>ro, recibe el nombre <strong>de</strong> calibrador.<br />
Un control es una muestra con características similares a los especímenes<br />
problemas que se emplean para verificar la precisión o reproductibilidad <strong>de</strong> un<br />
método o técnica y ocasionalmente pue<strong>de</strong>n servir para calibrar instrumentos, si<br />
se conoce el valor verda<strong>de</strong>ro <strong>de</strong> la medida que se quiere controlar.<br />
En hematología es muy común el empleo <strong>de</strong> controles constituidos por<br />
suspensiones <strong>de</strong> células sanguíneas (humanas o <strong>de</strong> animales) para la<br />
calibración <strong>de</strong> los analizadores <strong>de</strong>stinados a la <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> los parámetros<br />
básicos (recuentos, hemoglobina, hematocrito e índices eritrocitarios<br />
secundarios). En general, dichas suspensiones celulares tienen propieda<strong>de</strong>s<br />
físicas similares a los especímenes <strong>de</strong> sangre total humana y son preparadas<br />
por diferentes firmas comerciales, que las recomiendan para la calibración <strong>de</strong><br />
sus propios instrumentos. Dado que estas muestras control comerciales vienen<br />
convenientemente valoradas, es <strong>de</strong>cir, se conoce el valor <strong>de</strong> los parámetros que<br />
hay que controlar, son normalmente utilizadas para verificar no sólo la precisión,<br />
sino también la exactitud <strong>de</strong> los autoanalizadores (calibración). Esta función hace<br />
que normalmente se las conozca también como “calibradores”, aunque en<br />
realidad tal <strong>de</strong>nominación sea incorrecta <strong>de</strong>bido a la inexistencia <strong>de</strong> un patrón <strong>de</strong><br />
referencia internacional <strong>de</strong> sangre total estabilizada.<br />
SISTEMÁTICA DE CONTROL DE CALIDAD EN LOS LABORATORIOS<br />
El control <strong>de</strong> calidad en un laboratorio clínico <strong>de</strong>be consi<strong>de</strong>rar siempre la doble<br />
vertiente: interna y externa.<br />
El control <strong>de</strong> calidad interno ser realiza diariamente en cada laboratorio mediante<br />
empleo <strong>de</strong> especímenes control propios o comerciales y tiene como finalidad<br />
asegurar la fiabilidad <strong>de</strong> los métodos e instrumentos. El control <strong>de</strong> calidad<br />
externo se realiza periódicamente (en general cada mes) y en él participan otros<br />
muchos laboratorios, que al analizar un mismo espécimen controlan así la<br />
exactitud <strong>de</strong> los métodos que emplean en la realización <strong>de</strong> las técnicas.<br />
CONTROL DE CALIDAD INTERNO<br />
El control <strong>de</strong> calidad interno tiene como finalidad verificar la exactitud y precisión<br />
<strong>de</strong> los diferentes métodos o técnicas diagnósticas empleadas. Para ello es<br />
necesario el uso <strong>de</strong> controles y patrones.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 253 <strong>de</strong> 287
TEMARIO DE T.E.L<br />
Debe hacerse extensivo no sólo a la metodología empleada en la realización <strong>de</strong><br />
las diferentes técnicas, sino también a todo el proceso que se extien<strong>de</strong> <strong>de</strong>s<strong>de</strong> la<br />
preparación <strong>de</strong>l material que hay que utilizar y la extracción y manipulación <strong>de</strong><br />
las muestras <strong>de</strong> sangre hasta su procesamiento y entrega <strong>de</strong> resultados.<br />
Asimismo, <strong>de</strong>be incluir el control periódico <strong>de</strong> los reactivos, recipientes e<br />
instrumentos que se emplean tanto para las técnicas manuales como para las<br />
automatizadas.<br />
Para controlar la fiabilidad <strong>de</strong> las técnicas utilizadas para <strong>de</strong>terminar los<br />
parámetros básicos, se suelen emplear muestras control comerciales. Este tipo<br />
<strong>de</strong> controles son en la actualidad ampliamente utilizados para la calibración <strong>de</strong><br />
autoanalizadores, por lo que se <strong>de</strong>nominan también calibradores. Con todo, los<br />
controles comerciales, pese a su indudable utilidad, presentan diversos<br />
inconvenientes:<br />
• No controlan la metódica utilizada en la extracción y preparación <strong>de</strong> los<br />
especímenes <strong>de</strong> sangre que hay que utilizar.<br />
• Son fácilmente reconocidos por el personal técnico <strong>de</strong>l laboratorio, por lo<br />
que suelen recibir un tratamiento especial y, por tanto, distinto al <strong>de</strong> los<br />
restantes especímenes <strong>de</strong>l día.<br />
• Son relativamente caros, lo que hace difícil su adquisición para<br />
<strong>de</strong>terminados laboratorios.<br />
Por todo lo mencionado, los controles comerciales pue<strong>de</strong>n ser sustituidos por<br />
muestras control elaboradas en el mismo laboratorio. En este caso, el valor<br />
verda<strong>de</strong>ro <strong>de</strong> los parámetros que hay que controlar <strong>de</strong>be <strong>de</strong>terminarse<br />
previamente mediante los llamados métodos <strong>de</strong> referencia.<br />
En general, el control <strong>de</strong> calidad interno <strong>de</strong> parámetros básicos se consigue<br />
mediante el empleo combinado <strong>de</strong> muestras control comerciales y especímenes<br />
propios que se utilizan como controles. Los primeros son utilizados para verificar<br />
la calibración <strong>de</strong> los autoanalizadores y la exactitud <strong>de</strong> los valores suministrados<br />
por los mismos métodos u otros a lo largo <strong>de</strong>l día. Los especímenes control<br />
propios <strong>de</strong>ben ser elegidos al azar y se utilizan para verificar la reproductibilidad<br />
<strong>de</strong> los resultados correspondientes. Si tales especímenes no han <strong>de</strong> ser<br />
utilizados para verificar la exactitud <strong>de</strong> los métodos, no es indispensable la<br />
<strong>de</strong>terminación <strong>de</strong>l valor real <strong>de</strong> los parámetros que hay que controlar.<br />
CONTROL DE CALIDAD EXTERNO<br />
Gracias a la labor <strong>de</strong> diferentes organismos internacionales, la práctica <strong>de</strong><br />
controles <strong>de</strong> calidad interlaboratorios o externos mejoran la exactitud <strong>de</strong> los<br />
resultado suministrados por los diferentes laboratorios.<br />
En Europa existen varios programas <strong>de</strong> control <strong>de</strong> calidad externo que se aplican<br />
a nivel local, regional y nacional, permitiendo apreciar <strong>de</strong> una manera mucho<br />
más precisa las posibilida<strong>de</strong>s o limitaciones <strong>de</strong> cada laboratorio participante en<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 254 <strong>de</strong> 287
TEMARIO DE T.E.L<br />
relación a los restantes que intervienen en el mismo programa y comprobar su<br />
propio nivel metodológico <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong>l conjunto.<br />
La complejidad <strong>de</strong> estos programas <strong>de</strong> control <strong>de</strong> calidad viene dada por la<br />
multiplicidad <strong>de</strong> técnicas e instrumentos que pue<strong>de</strong>n emplearse en la<br />
<strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> un mismo parámetro y por el número <strong>de</strong> parámetros<br />
evaluados.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 255 <strong>de</strong> 287
TEMARIO DE T.E.L<br />
TEMA 18.- RECOGIDA DE LA<br />
MUESTRA. MÉTODOS DE<br />
IDENTIFICACIÓN.<br />
Como requisitos mínimos la muestra que llega al laboratorio <strong>de</strong>berá contener la<br />
siguiente información:<br />
* Nombre y apellidos<br />
* Fecha <strong>de</strong> nacimiento<br />
* Número <strong>de</strong> i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> la muestra, o <strong>de</strong>l paciente o <strong>de</strong> la hoja <strong>de</strong> petición<br />
* Número <strong>de</strong> la sala (remitente, nombre <strong>de</strong>l médico peticionario)<br />
* Fecha y hora <strong>de</strong> la toma <strong>de</strong> la muestra (día, hora, min.)<br />
Todas las personas involucradas en los procedimientos diagnósticos son<br />
conscientes <strong>de</strong>l problema <strong>de</strong> la i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> las muestras. La confusión en<br />
los nombres, peticiones, muestras o resultados <strong>de</strong> las pruebas <strong>de</strong> los pacientes<br />
pue<strong>de</strong> tener serios efectos sobre el tratamiento <strong>de</strong>l paciente y podría, por lo<br />
tanto, consi<strong>de</strong>rarse como una «mala praxis». Este capítulo resume brevemente<br />
la situación actual en la i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> muestras y pacientes durante la fase<br />
preanalítica.<br />
¿Nombre o número?<br />
Cuando un paciente es admitido en un hospital, tiene que ser i<strong>de</strong>ntificado por<br />
mucha gente, incluyendo enfermeras, facultativos, técnicos y otras personas. Lo<br />
mismo ha <strong>de</strong> ser válido para cualquier muestra tomada <strong>de</strong>l paciente y trasladada<br />
al laboratorio <strong>de</strong>l propio hospital u otro laboratorio externo.<br />
La comunicación entre todas las partes <strong>de</strong>l proceso diagnóstico requiere la<br />
transferencia <strong>de</strong> esta i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong>l paciente. El uso <strong>de</strong>l nombre y apellidos<br />
para i<strong>de</strong>ntificar un individuo ha <strong>de</strong>mostrado ser insuficiente para asegurar la<br />
transferencia correcta <strong>de</strong> la i<strong>de</strong>ntidad. El nombre, apellidos y la fecha <strong>de</strong><br />
nacimiento es la combinación <strong>de</strong> información usada más frecuentemente para la<br />
i<strong>de</strong>ntificación. A fin <strong>de</strong> reducir la cantidad <strong>de</strong> información manejada, en muchos<br />
hospitales se <strong>de</strong>stina al paciente un número.<br />
Este número no pue<strong>de</strong> ser utilizado para ningún otro individuo. I<strong>de</strong>almente, este<br />
número se imprime junto con el nombre sobre cualquier pedido, muestra e<br />
informe. Los números <strong>de</strong> la sala, habitación y cama pue<strong>de</strong>n ser una ayuda<br />
adicional. Esto es especialmente útil si la extracción <strong>de</strong> muestras no se hace por<br />
la misma persona que pi<strong>de</strong> los exámenes <strong>de</strong> laboratorio clínico.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 256 <strong>de</strong> 287
TEMARIO DE T.E.L<br />
Alternativamente, un paquete <strong>de</strong> etiquetas autoadhesivas preimpresas con la<br />
i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong>l paciente pue<strong>de</strong>n facilitarse en el momento <strong>de</strong> la admisión al<br />
hospital.<br />
Los métodos <strong>de</strong> i<strong>de</strong>ntificación<br />
A la llegada al laboratorio, el paciente ha <strong>de</strong> ser i<strong>de</strong>ntificado a partir <strong>de</strong> la<br />
información facilitada. Esto pue<strong>de</strong> hacerse visualmente leyendo el nombre y sala<br />
<strong>de</strong> la etiqueta y <strong>de</strong> la hoja <strong>de</strong> petición, transfiriendo esta información a las<br />
planillas <strong>de</strong> laboratorio y a todas las alícuotas <strong>de</strong> la muestra. La fase siguiente<br />
requiere la generación <strong>de</strong> un sistema <strong>de</strong> subnumeración que vincule al individuo<br />
y el día <strong>de</strong> la obtención <strong>de</strong> las muestras (comúnmente no más largo <strong>de</strong> tres <strong>de</strong><br />
dígitos).<br />
Muchas instituciones, sin embargo, usan medios electrónicos para transferir<br />
datos <strong>de</strong> i<strong>de</strong>ntificación: esto pue<strong>de</strong> hacerse en línea usando el sistema<br />
informático <strong>de</strong>l hospital, que transfiere los datos básicos <strong>de</strong>l paciente junto con la<br />
petición directamente al sistema informático <strong>de</strong>l laboratorio. En este caso, las<br />
muestras que llegan al laboratorio tienen que estar vinculadas a una hoja <strong>de</strong><br />
petición <strong>de</strong>terminada por el código <strong>de</strong> barras o un sistema <strong>de</strong> código alternativo<br />
fijado a las muestras.<br />
Recientemente, se han sugerido sistemas más sofisticados que se utilizarán<br />
ampliamente en el futuro: un código <strong>de</strong> barras bidimensional, código <strong>de</strong> puntos o<br />
chips fijados a la muestra que pue<strong>de</strong>n contener toda la información necesaria<br />
incluyendo la petición y la información sobre el paciente.<br />
I<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong> la muestra en el laboratorio, forma directa<br />
respecto a la indirecta<br />
La i<strong>de</strong>ntidad <strong>de</strong>l paciente se vincula inequívocamente al recipiente <strong>de</strong> la muestra<br />
en el punto <strong>de</strong> extracción o recolección <strong>de</strong> la misma, siempre que la muestra<br />
primaria se mantenga a lo largo <strong>de</strong> todo el proceso analítico. Esto necesita<br />
separadores suero/plasma para mantener la muestra <strong>de</strong> trabajo (plasma o<br />
suero) en el tubo <strong>de</strong> muestra primario (sangre) y <strong>de</strong> esta forma ser i<strong>de</strong>ntificado<br />
directamente por el lector <strong>de</strong>l analizador.<br />
Si el lector no está disponible o se hacen alícuotas la muestra original, pue<strong>de</strong><br />
usarse un dispositivo que automáticamente <strong>de</strong>fina las posiciones <strong>de</strong> cada<br />
muestreo en cada uno <strong>de</strong> los analizadores utilizados. Este tipo <strong>de</strong> i<strong>de</strong>ntificación<br />
se llama i<strong>de</strong>ntificación indirecta (por localización). Mientras que los mecanismos<br />
directos <strong>de</strong> i<strong>de</strong>ntificación permiten i<strong>de</strong>ntificar la muestra en cualquier momento y<br />
posición, la i<strong>de</strong>ntificación indirecta por la posición pue<strong>de</strong> hacerse únicamente con<br />
la ayuda <strong>de</strong> una lista numerada <strong>de</strong> posiciones o un sistema informático <strong>de</strong><br />
laboratorio.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 257 <strong>de</strong> 287
TEMARIO DE T.E.L<br />
A<strong>de</strong>más, cualquier porción alícuota tiene el peligro inherente <strong>de</strong> una confusión<br />
adicional entre muestras.<br />
Recomendación:<br />
• Cualquier muestra <strong>de</strong>berá i<strong>de</strong>ntificarse inequívocamente antes <strong>de</strong> ser<br />
procesada.<br />
• Los procedimientos <strong>de</strong> i<strong>de</strong>ntificación directa <strong>de</strong> muestras primarias<br />
<strong>de</strong>berían usarse preferentemente a la i<strong>de</strong>ntificación indirecta y subdivisión<br />
<strong>de</strong> la muestra en alícuotas, para reducir los errores en la i<strong>de</strong>ntificación.<br />
• Cualquier muestra cuya i<strong>de</strong>ntidad y origen no esté suficientemente<br />
documentada <strong>de</strong>berá separarse a una forma estable (suero, plasma),<br />
guardarla en el refrigerador y completar la información omitida antes <strong>de</strong><br />
procesarla.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 258 <strong>de</strong> 287
TEMARIO DE T.E.L<br />
TEMA 19.- TRANSPORTE DE<br />
MUESTRAS. EFECTOS DEL TIEMPO<br />
Y TEMPERATURA DURANTE EL<br />
TRANSPORTE.<br />
Los efectos <strong>de</strong>l tiempo y temperatura durante el transporte<br />
El traslado <strong>de</strong> muestras al laboratorio clínico pue<strong>de</strong> realizarse <strong>de</strong> diferentes<br />
maneras. Normalmente, los tiempos <strong>de</strong> traslado son cortos cuando el laboratorio<br />
se ubica cerca, o en las mismas instalaciones clínicas y no representa ningún<br />
problema.<br />
Figura 1<br />
Efecto <strong>de</strong>l tiempo y la temperatura <strong>de</strong> almacenamiento sobre la concentración <strong>de</strong> diversos<br />
componentes <strong>de</strong>l suero <strong>de</strong> sangre coagulada sin anticoagulante.<br />
(•) 4° C, (•) 23 ° C, (•) 30 ° C<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 259 <strong>de</strong> 287
TEMARIO DE T.E.L<br />
Sin embargo, el tiempo transcurrido <strong>de</strong>s<strong>de</strong> la extracción <strong>de</strong> la sangre a la<br />
centrifugación, no <strong>de</strong>bería exce<strong>de</strong>r <strong>de</strong> una hora. Algunos procedimientos <strong>de</strong><br />
medida requieren aditivos especiales tales como fluoruro <strong>de</strong> sodio/oxalato para<br />
medir la concentración <strong>de</strong> lactato o borato <strong>de</strong> sodio serina EDTA para medir la<br />
concentración <strong>de</strong> amonio. La medición <strong>de</strong> la concentración <strong>de</strong> hemoglobina en el<br />
plasma requiere la manipulación cuidadosa <strong>de</strong> la muestra <strong>de</strong> con EDTA.<br />
El traslado al laboratorio pue<strong>de</strong> realizarse bien mediante un mensajero, o bien<br />
mediante un sistema <strong>de</strong> reparto por tubo neumático.<br />
Los a<strong>de</strong>lantos actuales en los sistemas <strong>de</strong> este último tipo aseguran un traslado<br />
cuidadoso con el fin <strong>de</strong> evitar la hemólisis. Tales muestras pue<strong>de</strong>n usarse para<br />
medir magnitu<strong>de</strong>s bioquímicas, hematológicas o para la realización <strong>de</strong><br />
gasometrías.<br />
Si por alguna razón técnica se requiere un traslado <strong>de</strong> la muestra a larga<br />
distancia (p. ej. por correo o mensajeros <strong>de</strong> laboratorio), <strong>de</strong>bería evitarse hacerlo<br />
con las muestras <strong>de</strong> sangre. La Figura 1 muestra la influencia <strong>de</strong> la temperatura<br />
y duración <strong>de</strong>l almacenamiento <strong>de</strong> muestras <strong>de</strong> sangre coagulada sobre algunas<br />
magnitu<strong>de</strong>s<br />
La liberación <strong>de</strong> ión potasio <strong>de</strong>s<strong>de</strong> los eritrocitos es mínima a temperatura<br />
ambiente <strong>de</strong>bido a la actividad <strong>de</strong> la ATPasa intercambiadora <strong>de</strong> Na+/K+<br />
<strong>de</strong>pendiente <strong>de</strong> la temperatura. Este efecto aumenta tanto a 4° C como por<br />
encima <strong>de</strong> 30º C.<br />
Las concentraciones <strong>de</strong> glucosa disminuyen con el aumento <strong>de</strong> temperatura,<br />
mientras que con el fosfato se observa el fenómeno opuesto, ya que las<br />
fosfatasas <strong>de</strong>l plasma y los eritrocitos aumentan la concentración <strong>de</strong> este<br />
compuesto. Como se ha <strong>de</strong>mostrado en la Figura 1, la duración <strong>de</strong>l<br />
almacenamiento a una temperatura <strong>de</strong>terminada es un factor importante. Si una<br />
muestra <strong>de</strong> sangre se almacena durante 2 h a 23° C, las concentraciones <strong>de</strong><br />
glucosa disminuyen aproximadamente un 10 por ciento.<br />
En las muestras patológicas los efectos <strong>de</strong> tiempo y temperatura comúnmente<br />
observados pue<strong>de</strong>n presentar <strong>de</strong>sviaciones. La disminución <strong>de</strong>pendiente <strong>de</strong>l<br />
tiempo <strong>de</strong> la concentración <strong>de</strong> glucosa en las muestras <strong>de</strong> sangre es mayor en<br />
las leucocitosis.<br />
Del mismo modo, el aumento <strong>de</strong> la concentración <strong>de</strong> amonio <strong>de</strong>pendiente <strong>de</strong>l<br />
tiempo está más acentuado en muestras con la concentración catalítica <strong>de</strong> ã–<br />
glutamiltransferasa elevada. Los anticuerpos pue<strong>de</strong>n alterar las concentraciones<br />
<strong>de</strong> las células sanguíneas en función <strong>de</strong> la <strong>de</strong>pen<strong>de</strong>ncia <strong>de</strong> la temperatura que<br />
tengan dichos anticuerpos.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 260 <strong>de</strong> 287
TEMARIO DE T.E.L<br />
Las concentraciones <strong>de</strong> muchos componentes bioquímicos tales como<br />
electrólitos, sustratos o enzimas no resultan afectados por un tiempo <strong>de</strong><br />
transporte <strong>de</strong> envío <strong>de</strong> hasta cuatro días.<br />
Las concentraciones <strong>de</strong> hemoglobina y <strong>de</strong> eritrocitos son también estables. Se<br />
observan diferencias importantes en la fracción <strong>de</strong> volumen <strong>de</strong> los eritrocitos en<br />
la sangre («hematocrito»), el volumen entítico <strong>de</strong> los eritrocitos (VCM) y la<br />
concentración <strong>de</strong> bilirrubina en el plasma. Un examen fiable <strong>de</strong> los distintos<br />
leucocitos requiere que la preparación <strong>de</strong> la extensión <strong>de</strong> sangre se realice<br />
<strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> las 3 horas siguientes a la toma <strong>de</strong> la muestra.<br />
Transporte <strong>de</strong> muestras<br />
Cuando es necesario enviar sangre u otros fluidos corporales humanos a un<br />
laboratorio distante, se han <strong>de</strong> cumplir ciertas normas <strong>de</strong> seguridad. A<strong>de</strong>más,<br />
tiene que conservarse la integridad <strong>de</strong> la muestra para asegurar su correcto<br />
examen. Las muestras <strong>de</strong>ben enviarse en recipientes que «sean resistentes a la<br />
filtración, golpes y cambios <strong>de</strong><br />
presión, y otras condiciones que<br />
puedan incidir en la<br />
manipulación ordinaria que se<br />
realiza en el transporte».<br />
La Asociación Internacional <strong>de</strong><br />
Transporte Aéreo (IATA)<br />
requiere que en el exterior <strong>de</strong><br />
paquete se escriba «Muestras<br />
diagnósticas». En los Estados<br />
Unidos, las regulaciones <strong>de</strong> la<br />
Occupational Safety and Health<br />
Administration (OSHA)<br />
(Administración <strong>de</strong> Salud y<br />
Seguridad Laboral) requieren<br />
que se adhiera al paquete una<br />
etiqueta <strong>de</strong> biorriesgo.<br />
Las muestras <strong>de</strong>berán empaquetarse <strong>de</strong> una manera tal que puedan resistir las<br />
condiciones ambientales (temperatura y presión) a que puedan ser sometidas<br />
durante el transporte.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 261 <strong>de</strong> 287
TEMARIO DE T.E.L<br />
Figura 2. Empaquetado <strong>de</strong> muestras para el transporte<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 262 <strong>de</strong> 287<br />
Debe evitarse la exposición <strong>de</strong><br />
muestras a la luz directa con el fin<br />
<strong>de</strong> proteger a los componentes<br />
sensibles a la luz, tal como la<br />
bilirrubina. I<strong>de</strong>almente, <strong>de</strong>berían<br />
llevar varias capas <strong>de</strong> embalaje, con<br />
un recipiente primario con cierre que<br />
<strong>de</strong>bería introducirse en un recipiente<br />
secundario que a su vez <strong>de</strong>bería<br />
ponerse <strong>de</strong>ntro un recipiente<br />
exterior, como se representa en la<br />
Figura 2. Debe ponerse siempre un<br />
material absorbente entre los<br />
recipientes primario y secundario<br />
para asegurar que se absorba<br />
cualquier <strong>de</strong>rrame durante el<br />
transporte.<br />
Se <strong>de</strong>be utilizar una bolsa<br />
impermeable para asegurar que los<br />
documentos que acompañen esa<br />
muestra no serán dañados por<br />
cualquier filtración o <strong>de</strong>rrame <strong>de</strong> la<br />
misma.<br />
Las muestras <strong>de</strong> sangre seca sobre<br />
papel <strong>de</strong> filtro <strong>de</strong>berán enviarse en<br />
una envoltura <strong>de</strong> papel recio<br />
introducido en un sobre con precinto<br />
sellado para asegurar que los<br />
manipuladores <strong>de</strong>l envío estén<br />
protegidos <strong>de</strong> la exposición a la<br />
sangre seca, a<strong>de</strong>más <strong>de</strong> asegurar la<br />
integridad <strong>de</strong> la muestra durante el<br />
transporte.<br />
Para enviar muestras congeladas y refrigeradas, son a<strong>de</strong>cuados materiales<br />
aislantes tales como un recipiente <strong>de</strong> poliestireno. Para la congelación pue<strong>de</strong><br />
utilizarse hielo seco. LEAKAGE, NOTIFY<br />
Deben tomarse precauciones para asegurar que el recipiente empaquetado con<br />
hielo seco sea capaz <strong>de</strong> liberar el dióxido <strong>de</strong> carbono gaseoso para evitar una<br />
sobrepresión que podría ocasionar el estallido <strong>de</strong>l paquete.
TEMARIO DE T.E.L<br />
TEMA 20.- EL ALMACENAMIENTO<br />
DE MUESTRAS EN EL<br />
LABORATORIO. SISTEMAS DE<br />
CONSERVACIÓN.<br />
10 reglas y algunas recomendaciones<br />
1. El procedimiento está regido por la estabilidad <strong>de</strong> los componentes <strong>de</strong> la<br />
muestra. Las causas más importantes que pue<strong>de</strong>n ocasionar alteraciones<br />
en la calidad <strong>de</strong> la muestra son:<br />
• Metabolismo <strong>de</strong> las células sanguíneas<br />
• Evaporación o sublimación<br />
• Reacciones químicas<br />
• Descomposición microbiológica<br />
• Procesos osmóticos<br />
• Efecto <strong>de</strong> la luz<br />
• Difusión <strong>de</strong> gases<br />
2. Un transporte rápido y un corto tiempo <strong>de</strong> almacenamiento mejoran la<br />
fiabilidad <strong>de</strong> los resultados <strong>de</strong> laboratorio.<br />
3. Las muestras se conservan más tiempo almacenadas en frigorífico (¡pero<br />
hay notables excepciones!).<br />
4. Las muestras <strong>de</strong>berían almacenarse siempre en recipientes cerrados<br />
(¡evaporación!).<br />
5. El peligro <strong>de</strong> evaporación también existe en los refrigeradores<br />
(con<strong>de</strong>nsación <strong>de</strong> humedad sobre los elementos <strong>de</strong> enfriamiento).<br />
6. Los problemas <strong>de</strong> almacenamiento se reducen si se usan sistemas<br />
<strong>de</strong>sechables <strong>de</strong> tomar muestras.<br />
7. Los agentes <strong>de</strong> separación (p. ej. Geles separadores) mejoran los<br />
rendimientos <strong>de</strong> suero o plasma y permiten que estos puedan mantenerse<br />
en los tubos originales encima <strong>de</strong> la sangre (89).<br />
8. Evite sacudir los recipientes <strong>de</strong> muestra (¡sistemas <strong>de</strong> distribución <strong>de</strong> tubo<br />
neumático!): riesgo <strong>de</strong> hemólisis.<br />
9. Almacenar siempre verticalmente los recipientes <strong>de</strong> muestra que<br />
contienen sangre; el proceso <strong>de</strong> la coagulación se acelera.<br />
10. Etiquete el material infeccioso y manéjelo con especial cuidado.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
8 reglas especiales y algunas recomendaciones más<br />
útiles<br />
1. Evite el almacenamiento <strong>de</strong> la sangre. Las muestras <strong>de</strong> sangre <strong>de</strong>berían<br />
llegar al laboratorio <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> los 45 min siguientes a su recolección, a fin<br />
<strong>de</strong> asegurar que la centrifugación y separación <strong>de</strong> la muestra se efectúa<br />
<strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> la primera hora.<br />
2. Evite la glicólisis para mantener estables las concentraciones <strong>de</strong> glucosa<br />
y <strong>de</strong> lactato y el pH. La glicólisis pue<strong>de</strong> evitarse por la adición <strong>de</strong> un<br />
inhibidor junto con un anticoagulante.<br />
3. Evite el efecto <strong>de</strong> la luz <strong>de</strong> otra manera habrá una disminución en las<br />
concentraciones <strong>de</strong> bilirrubina, ascorbato, porfirinas, creatinacinasa y<br />
folatos.<br />
4. Reduzca el contacto con el aire tanto como sea posible. Si no se hace<br />
esto, la evaporación o la sublimación darán como resultado un aumento<br />
aparente en la concentración <strong>de</strong> todos los componentes no volátiles. Este<br />
es particularmente el caso cuando el volumen <strong>de</strong> la muestra es<br />
relativamente pequeño y el área <strong>de</strong> superficie es relativamente gran<strong>de</strong>.<br />
5. La sangre no <strong>de</strong>bería almacenarse en el refrigerador. Cuando la orina se<br />
enfría, las sales pue<strong>de</strong>n precipitar (fosfato <strong>de</strong> magnesio y calcio, urato).<br />
6. Para ciertos componentes, las muestras no <strong>de</strong>berían congelarse. Esta<br />
congelación pue<strong>de</strong> redundar en resultados erróneos para los siguientes<br />
componentes:<br />
Ejemplos <strong>de</strong> componentes <strong>de</strong> la sangre y la orina que no <strong>de</strong>ben<br />
almacenarse congelados<br />
Muestra Componentes<br />
Suero o plasma: Lipoproteínas<br />
(fracciones electroforéticas<br />
Lipoproteína X<br />
Apolipoproteína A-I y B<br />
Colesterol <strong>de</strong> LDL<br />
(prevenida por la adición <strong>de</strong> glicerol)<br />
Monómeros <strong>de</strong> fibrina en el plasma<br />
Sangre con EDTA Células sanguíneas<br />
Orina IgG<br />
Sedimento<br />
Urato (¡precipitaciones!)<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
7. Una <strong>de</strong>scongelación a<strong>de</strong>cuada. La homogeneización ina<strong>de</strong>cuada <strong>de</strong> las<br />
muestras congeladas <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> la <strong>de</strong>scongelación es una fuente muy<br />
común <strong>de</strong> error. Durante la <strong>de</strong>scongelación se producen gradientes <strong>de</strong><br />
concentración que van <strong>de</strong>splazándose <strong>de</strong>s<strong>de</strong> las soluciones concentradas<br />
que primero fun<strong>de</strong>n hacía las capas inferiores por las pare<strong>de</strong>s <strong>de</strong>l<br />
recipiente. Por tanto, <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> la <strong>de</strong>scongelación, la muestra <strong>de</strong>berá<br />
invertirse varias veces, evitando la formación <strong>de</strong> espuma. Con especial<br />
atención sobre los materiales no disueltos, disolviéndolos por<br />
calentamiento suave si fuera necesario.<br />
8. El almacenamiento <strong>de</strong> las muestras <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> su examen se <strong>de</strong>be<br />
realizar <strong>de</strong> tal manera que permita la confirmación <strong>de</strong> los resultados, la<br />
comprobación <strong>de</strong> la i<strong>de</strong>ntidad <strong>de</strong> las muestras o la realización <strong>de</strong><br />
exámenes adicionales por razones médicas o legales.<br />
Tiempo y condiciones <strong>de</strong> almacenamiento recomendadas para<br />
muestras tras ser examinadas<br />
Muestra para Tiempo<br />
almacenamiento<br />
Temperatura<br />
Bioquímica: 1 semana Refrigerador<br />
Inmunología: 1 semana Refrigerador<br />
Hematología: 2 días Temperatura ambiente<br />
Coagulación: 1 día Refrigerador<br />
Toxicología: 6 semanas Refrigerador<br />
Grupo sanguíneo: 1 semana Refrigerador<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
TEMA 21.- PREPARACIÓN DE LAS<br />
MUESTRAS. PROCESADO Y<br />
CENTRIFUGACIÓN.<br />
¿Qué ha <strong>de</strong> hacerse a la llegada <strong>de</strong> una muestra?<br />
Centrifugación<br />
La centrifugación <strong>de</strong> la sangre coagulada para obtener suero <strong>de</strong>bería realizarse<br />
<strong>de</strong>spués <strong>de</strong> haberse asegurado <strong>de</strong> que la sangre ha coagulado. Normalmente, el<br />
tiempo <strong>de</strong> espera para que la sangre coagule es aproximadamente <strong>de</strong> 30 min.<br />
Sin embargo, los pacientes que están con una terapia anticoagulante, o aquellos<br />
con <strong>de</strong>ficiencias en la coagulación tendrán una coagulación retrasada.<br />
La centrifugación <strong>de</strong> sangre coagulada para obtener suero o <strong>de</strong> sangre<br />
anticoagulada para obtener plasma se realiza típicamente entre 1000 y 1200 g<br />
durante 10 a 15 min. En las pruebas <strong>de</strong> coagulación, la sangre citratada <strong>de</strong>bería<br />
centrifugarse a 2000 g durante 15 min.<br />
La centrifugación se realiza comúnmente entre 20 y 22° C. Sin embargo, para<br />
algunos componentes que son lábiles durante la centrifugación a temperatura<br />
ambiente, especialmente si durante la centrifugación aumenta la temperatura, las<br />
muestras <strong>de</strong>berían centrifugarse a temperatura refrigerada (4° C). Sin embargo,<br />
la refrigeración pue<strong>de</strong> conducir<br />
a la filtración <strong>de</strong> ión potasio<br />
<strong>de</strong>s<strong>de</strong> la célula, aumentado el<br />
valor <strong>de</strong> su concentración en el<br />
plasma.<br />
Figura 1<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 266 <strong>de</strong> 287<br />
Las muestras no <strong>de</strong>berán<br />
volverse a centrifugar <strong>de</strong>spués<br />
<strong>de</strong> la obtención <strong>de</strong> suero o<br />
plasma. La alteración <strong>de</strong> la<br />
relación entre el agua<br />
plasmática y la celular pue<strong>de</strong><br />
afectar la concentración <strong>de</strong> los<br />
componentes, y así, introducir<br />
errores. Las muestras con una<br />
barrera <strong>de</strong> gel nunca <strong>de</strong>ben<br />
volverse a centrifugar.
TEMARIO DE T.E.L<br />
El tiempo y la fuerza centrífuga aplicada al sedimento <strong>de</strong> sangre heparinizada<br />
<strong>de</strong>bería ser tal que no <strong>de</strong>je plaquetas en la capa <strong>de</strong> plasma. Un fracaso al<br />
conseguir la sedimentación completa <strong>de</strong> plaquetas producirá aumentos<br />
ina<strong>de</strong>cuados en la concentración <strong>de</strong> ión potasio, lactato-<strong>de</strong>shidrogenasa,<br />
fosfatasa ácida y fosfato proce<strong>de</strong>ntes <strong>de</strong> las plaquetas remanentes en el plasma<br />
(Figura 1) <strong>de</strong> la muestra.<br />
La Figura 2 muestra el control visual <strong>de</strong>l plasma <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> la centrifugación a<br />
diversas velocida<strong>de</strong>s.<br />
Los tubos <strong>de</strong> micromuestra con o sin anticoagulantes pue<strong>de</strong>n centrifugarse para<br />
obtener suero o plasma en una microcentrífuga con un adaptador que acepte<br />
estos tubos. La centrifugación <strong>de</strong> tales tubos <strong>de</strong> recolección <strong>de</strong> micromuestras se<br />
realiza a velocida<strong>de</strong>s que van <strong>de</strong>s<strong>de</strong> las 6000 a las 15000 g durante un mínimo<br />
<strong>de</strong> 90 s.<br />
Figura 2<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 267 <strong>de</strong> 287
TEMARIO DE T.E.L<br />
TEMA 22.- ASPECTOS DE<br />
SEGURIDAD EN EL MANEJO DE<br />
MUESTRAS BIOLÓGICAS.<br />
Los pasos para garantizar la seguridad son primordiales para la protección <strong>de</strong> la<br />
salud pública <strong>de</strong> los trabajadores.<br />
En este capítulo, se discute específicamente la eliminación <strong>de</strong> muestras, agujas,<br />
tubos, y productos químicos.<br />
Eliminación <strong>de</strong> agujas y otros objetos cortantes<br />
La eliminación <strong>de</strong> todos los objetos cortantes y punzantes tales como agujas se<br />
realiza mediante su colocación en recipientes herméticos, resistentes a la<br />
punción, con las etiquetas y el código <strong>de</strong> color apropiados.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
Deberá evitarse reenfundar los objetos punzantes, así como doblar y romper las<br />
agujas. Sin embargo, si fuese necesario el reencapuchar, <strong>de</strong>berá usarse o bien<br />
una espátula <strong>de</strong> un solo uso, o preferentemente, un dispositivo para<br />
reencapuchar.<br />
Están disponibles dispositivos simples <strong>de</strong> reencapuchar, que permiten al<br />
flebotomista reenfundar la aguja con un riesgo mínimo <strong>de</strong> daño por punción.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 269 <strong>de</strong> 287
TEMARIO DE T.E.L<br />
Eliminación <strong>de</strong> tubos y muestras<br />
Los tubos <strong>de</strong> recolección <strong>de</strong> la muestra que contienen sangre y que son<br />
<strong>de</strong>stinados a su eliminación <strong>de</strong>berán colocarse en bolsas <strong>de</strong> biorriesgo que<br />
puedan resistir procesos <strong>de</strong> esterilización en autoclave. Estas bolsas <strong>de</strong>berían<br />
ponerse en recipientes a prueba <strong>de</strong> fugas que luego <strong>de</strong>ben cerrarse <strong>de</strong> forma<br />
hermética.<br />
Los fluidos corporales voluminosos tales como orina, vómitos, heces y otros<br />
fluidos corporales pue<strong>de</strong>n ser eliminados por vertido al inodoro. Los recipientes<br />
<strong>de</strong> fluidos, tales como bolsas <strong>de</strong> sangre, <strong>de</strong>berán incinerarse <strong>de</strong>spués <strong>de</strong><br />
colocarlos en recipientes <strong>de</strong> <strong>de</strong>sechos biopeligrosos.<br />
Productos Químicos<br />
Los residuos químicos pue<strong>de</strong>n ser inflamables, corrosivos, reactivos y tóxicos.<br />
Ejemplos <strong>de</strong> residuos químicos inflamables incluyen líquidos volátiles<br />
combustibles tales como solventes orgánicos (p. ej., etanoles, acetona, xileno,<br />
tolueno, etc.), oxidantes tales como peróxidos y sales <strong>de</strong> nitrato y gases<br />
combustibles tales como butano, silano e hidrógeno. Estos materiales <strong>de</strong>ben<br />
marcarse con las etiquetas apropiadas <strong>de</strong> tóxicos y peligrosos.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
No está recomendada la eliminación <strong>de</strong> disolventes combustibles a través <strong>de</strong> un<br />
frega<strong>de</strong>ro o el inodoro. Si tales solventes son fácilmente solubles en agua,<br />
podrían, ser eliminados en pequeñas cantida<strong>de</strong>s por vertido a un <strong>de</strong>sagüe,<br />
seguido por gran<strong>de</strong>s cantida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> agua. Lo mejor es recoger los disolventes<br />
inflamables en bidones <strong>de</strong> seguridad y almacenarlos en una cabina <strong>de</strong><br />
almacenamiento previo a la recolección por un gestor <strong>de</strong> residuos autorizado. El<br />
éter y los disolventes clorados se <strong>de</strong>berán recoger en latas separadas. Los otros<br />
disolventes pue<strong>de</strong>n combinarse en una sola.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
Ejemplos <strong>de</strong> disolventes corrosivos son los ácidos fuertes tales como ácido<br />
sulfúrico, clorhídrico, y fosfórico y bases tales como hidróxido <strong>de</strong> amonio.<br />
No <strong>de</strong>ben usarse productos químicos tóxicos, corrosivos e inflamables como<br />
conservantes en la fase preanalítica.<br />
Nunca se ha <strong>de</strong> agregar orina a ácidos concentrados. Dichos ácidos <strong>de</strong>berán ser<br />
diluidos añadiéndolos lentamente, <strong>de</strong>jándolos resbalar por las pare<strong>de</strong>s <strong>de</strong>l<br />
contenedor <strong>de</strong> orina. La eliminación <strong>de</strong> ácidos fuertes y materiales corrosivos<br />
<strong>de</strong>berá hacerse preferentemente por vertido al frega<strong>de</strong>ro, <strong>de</strong>jando correr el agua<br />
fría <strong>de</strong>l grifo, a continuación, en cantida<strong>de</strong>s abundantes contaminación para la<br />
capa <strong>de</strong> agua.<br />
Para estar bien informado sobre los productos químicos peligrosos, cada<br />
laboratorio <strong>de</strong>berá tener un archivo <strong>de</strong> hojas <strong>de</strong> datos <strong>de</strong> seguridad <strong>de</strong>l material<br />
que enumere las propieda<strong>de</strong>s peligrosas <strong>de</strong> cada producto químico, y que<br />
pue<strong>de</strong>n consultarse fácilmente en casos <strong>de</strong> emergencia o cuando haya duda con<br />
respecto a la naturaleza <strong>de</strong>l riesgo.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
TEMA 23. GESTIÓN DE RESIDUOS<br />
SANITARIOS.<br />
CLASIFICACIÓN, TRANSPORTE,<br />
ELIMINACIÓN Y TRATAMIENTO.<br />
Los avances tecnológicos en el campo <strong>de</strong> la atención al paciente, tiene como<br />
contrapunto un incremento notable <strong>de</strong>l volumen y diversidad <strong>de</strong> residuos<br />
sanitarios. La clasificación, transporte, eliminación y tratamiento y su gestión han<br />
planteado a nuestras organizaciones sanitarias numerosos problemas. Hoy, los<br />
centros sanitarios gestionan <strong>de</strong> forma diversa y con <strong>de</strong>sigual oportunidad los<br />
residuos clínicos y no cabe duda <strong>de</strong> que una parte consi<strong>de</strong>rable <strong>de</strong> forma poco<br />
justificada (normativas legales escasas, contradictorias y confusas).<br />
¿Qué situación tiene nuestro país respecto a los Residuos<br />
sanitarios?<br />
En España carecemos en el ámbito estatal <strong>de</strong> un marco legal actualizado que<br />
regule la eliminación <strong>de</strong> residuos sanitarios. Así la Ley 42/75 sobre <strong>de</strong>sechos y<br />
residuos sólidos indica que los residuos generados como consecuencia <strong>de</strong> las<br />
activida<strong>de</strong>s sanitarias en hospitales, clínicas y ambulatorios <strong>de</strong>ben ser<br />
consi<strong>de</strong>radas como residuos sólidos urbanos; por tanto, su recogida y su<br />
tratamiento son competencia <strong>de</strong> los Ayuntamientos, <strong>de</strong>jando a cada<br />
administración local la <strong>de</strong>cisión <strong>de</strong> los reglamentos, clasificación y el tratamiento<br />
<strong>de</strong> los residuos generados. En 1986, esta ley fue modificada por el Real Decreto<br />
legislativo 1163/1986 para adaptarse a la Directiva Comunitaria 75/442/CEE <strong>de</strong><br />
1975. Posteriormente el Real Decreto 833/88 por el que se aprueba el<br />
Reglamento para la ejecución <strong>de</strong> la Ley 20/86 <strong>de</strong> residuos tóxicos y peligrosos,<br />
completó la mencionada ley 42/75.<br />
En España, <strong>de</strong>s<strong>de</strong> los años 90, se ha realizado un gran esfuerzo, al menos<br />
legislativo, en la regulación <strong>de</strong> los residuos sanitarios. Hoy 12 <strong>de</strong> las 17<br />
Comunida<strong>de</strong>s Autónomas, han preparado <strong>de</strong>cretos específicos referentes a<br />
ellos. Debe también mencionarse, aunque son anteriores, los intentos llevados a<br />
cabo por diferentes Ayuntamientos como Madrid, Barcelona, Burgos, etc. con<br />
sus Or<strong>de</strong>nanzas Municipales, y los realizados por el SAS con sus Manual <strong>de</strong><br />
Gestión Interna <strong>de</strong> Residuos Sanitarios, así como proyectos llevados acabo por<br />
la iniciativa privada (Proyecto Clinhos, Instituto Cerdá), para organizar y tratar <strong>de</strong><br />
dar una coherencia a la gestión <strong>de</strong> estos residuos, por lo que po<strong>de</strong>mos afirmar<br />
que, aún faltando una legislación nacional, se ha tratado <strong>de</strong> regularizar este tipo<br />
<strong>de</strong> residuos.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
Riesgos <strong>de</strong> los Residuos Sanitarios<br />
La aproximación al hipotético riesgo infeccioso <strong>de</strong> los residuos sanitarios, exige,<br />
al menos, la consi<strong>de</strong>ración acerca <strong>de</strong> los <strong>de</strong> los factores necesarios para<br />
producir la enfermedad entre los que se encuentran: carga microbiana, la<br />
resistencia <strong>de</strong>l huésped, la puerta <strong>de</strong> entrada <strong>de</strong>l agente patógeno y la virulencia<br />
o la capacidad real <strong>de</strong>l patógeno <strong>de</strong> producir una enfermedad.<br />
Los riesgos <strong>de</strong> transmisión <strong>de</strong> enfermeda<strong>de</strong>s infecciosas a través <strong>de</strong> los residuos<br />
proce<strong>de</strong>nte <strong>de</strong> estos enfermos infecciosos, requieren buscar las evi<strong>de</strong>ncias<br />
epi<strong>de</strong>miológicas <strong>de</strong> tal riesgo. Los riesgos son remotos.<br />
Evi<strong>de</strong>ncias epi<strong>de</strong>miológicas<br />
El riesgo para el profesional sanitario que usa equipos o instrumental en el<br />
campo <strong>de</strong> la atención al paciente y el riesgo para el personal que manipula el<br />
residuo sanitario, es <strong>de</strong>cir ese material ya <strong>de</strong>sechado, es distinto.<br />
Existen datos en la literatura científica que confirman la existencia <strong>de</strong> casos <strong>de</strong><br />
transmisión ocupacional, principalmente Hepatitis B, C y VIH/ SIDA, adquiridos<br />
por TAS (Trabajador <strong>de</strong> Atención a la Salud - enfermería, médicos, técnicos <strong>de</strong><br />
laboratorio, etc.) como consecuencia <strong>de</strong> un acci<strong>de</strong>nte durante la atención medica<br />
a un paciente fuente positiva <strong>de</strong> tales enfermeda<strong>de</strong>s.<br />
Tabla. Casos <strong>de</strong>finidos <strong>de</strong> transmisión ocupacional <strong>de</strong> VIH/SIDA <strong>de</strong>clarados a nivel<br />
mundial.<br />
País<br />
Número<br />
E.E.U.U 49 58,34<br />
Francia 10 11,90<br />
España 5 5,95<br />
Italia 4 4,76<br />
Reino Unido 4 4,76<br />
Alemania 2 2,38<br />
Bélgica 2 2,38<br />
Confe<strong>de</strong>ración<br />
Helvética<br />
1 1,19<br />
Otros países 7 8,34<br />
TOTAL<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 274 <strong>de</strong> 287<br />
84<br />
%<br />
100,0<br />
Tomada y adaptada <strong>de</strong>: De Andrés R y Nájera R: Algunos aspectos <strong>de</strong> la<br />
exposición ocupacional a VIH en la atención <strong>de</strong> salud en el mundo. 1996
TEMARIO DE T.E.L<br />
De igual forma, se conocen, las diferentes categorías profesionales, el tipo <strong>de</strong><br />
exposición y los instrumentos que han intervenido en la transmisión ocupacional<br />
<strong>de</strong> esta enfermedad. Los pinchazos con agujas son los mas frecuentes (91,4%);<br />
cortes con escalpelo o bisturí representan el 4,3%, cortes con vidrio (material <strong>de</strong><br />
laboratorio) el 2,9%, siendo en un caso <strong>de</strong>sconocido.<br />
Tabla. Casos <strong>de</strong>finidos <strong>de</strong> infección por VIH-1 adquirida ocupacionalmente. Distribución<br />
por tipo <strong>de</strong> ocupación o categoría profesional.<br />
Categoría Profesional u Ocupación Nº (%)<br />
Personal <strong>de</strong> enfermería 40 46,62<br />
Médico clínico (no cirujano) 7 8,34<br />
Médico cirujano 1 1,19<br />
Técnico <strong>de</strong> laboratorio clínico 17 20,24<br />
Técnico <strong>de</strong> laboratorio no clínico 3 3,57<br />
Técnico <strong>de</strong> cirugía (instrumentista) 2 2,38<br />
Técnico <strong>de</strong> diálisis 1 1,19<br />
Terapeuta respiratorio 1 1,19<br />
Auxiliar <strong>de</strong> enfermería/auxiliar <strong>de</strong><br />
salud<br />
Gobernanta/personal <strong>de</strong><br />
1 1,19<br />
lavan<strong>de</strong>ría/mozo/personal <strong>de</strong><br />
mantenimiento<br />
3 3,57<br />
Otros, sin especificar 8 9,52<br />
TOTAL 84 100,00<br />
Fuente: De Andrés R y Nájera R: Algunos aspectos <strong>de</strong> la exposición ocupacional<br />
a VIH en la atención <strong>de</strong> salud en el mundo. 1996<br />
Tabla Instrumentos <strong>de</strong> Transmisión Ocupacional <strong>de</strong> VIH. EE.UU.(*) y EUROPA (Abril<br />
1996)**<br />
INSTRUMENTO EE.UU. EUROPA<br />
Agujas 39 25 (Pinchazo)<br />
Escalpelo 1<br />
1 (Corte con objeto<br />
agudo)<br />
Vidrio 2 -<br />
Desconocido? 1 -<br />
*Cardo, D. Comunicación Personal. Mayo 1996. (Centers for Disease Control and Prevention.<br />
Atlanta. Georgia)<br />
** De Andrés R y Nájera R: Algunos aspectos <strong>de</strong> la exposición ocupacional a VIH en la atención<br />
<strong>de</strong> salud en el mundo.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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Así, po<strong>de</strong>mos concluir que:<br />
TEMARIO DE T.E.L<br />
• La transmisión <strong>de</strong> la enfermedad no se ha producido por contacto con<br />
objetos no punzantes o cortantes (sábanas, guantes, etc.).<br />
• No existe ningún caso en la literatura científica <strong>de</strong> infección VIH/SIDA<br />
adquirida por manipulación <strong>de</strong> residuos sanitarios.<br />
• Es muy importante resaltarse el hecho <strong>de</strong> que más <strong>de</strong>l 95% <strong>de</strong> los<br />
portadores <strong>de</strong> VIH/SIDA no están hospitalizados y que el material<br />
potencialmente contaminado proce<strong>de</strong>nte <strong>de</strong> estos pacientes (jeringuillas,<br />
agujas, etc.), se elimina sin protección, incluidos en los residuos sólidos<br />
urbanos, comportando pues, mayor riesgo <strong>de</strong> transmitir VIH/SIDA y<br />
cualquier otra enfermedad ya que por lo general el número <strong>de</strong> portadores<br />
(personas sin la enfermedad clínica pero con la misma capacidad infectiva<br />
que un enfermo y por lo tanto más peligrosos <strong>de</strong>s<strong>de</strong> el punto <strong>de</strong> vista<br />
sanitario), es mayor que el <strong>de</strong> enfermos, llegando a veces a la relación<br />
10/1 (10 portadores por 1 enfermo) e incluso mayor.<br />
• No conocemos en la literatura científica ninguna evi<strong>de</strong>ncia o caso<br />
publicado <strong>de</strong> infección asociada a la manipulación <strong>de</strong> residuos entre los<br />
trabajadores <strong>de</strong> las empresas externas que se <strong>de</strong>dican a la gestión <strong>de</strong><br />
este tipo <strong>de</strong> residuos.<br />
Un segundo aspecto relacionado en la búsqueda <strong>de</strong> la evi<strong>de</strong>ncia <strong>de</strong> los riesgos<br />
<strong>de</strong> los residuos sanitarios lo aportan los distintos estudios microbiológicos <strong>de</strong><br />
carga microbiana en los residuos sanitarios versus residuos domésticos:<br />
Diferentes estudios científicos, en los que se han estudiado las cargas<br />
bacterianas o recuentos <strong>de</strong> bacterias totales, han puesto en evi<strong>de</strong>ncia que en los<br />
residuos sanitarios proce<strong>de</strong>ntes <strong>de</strong> hospitales gran<strong>de</strong>s y pequeños, recogidos en<br />
diferentes unida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> hospitalización, así como en clínicas privadas,<br />
comparados con los residuos domésticos, dan como resultado que la carga<br />
bacteriana, (concentración <strong>de</strong> bacterias), es mayor en los residuos domésticos<br />
que en los hospitalarios, con in<strong>de</strong>pen<strong>de</strong>ncia <strong>de</strong> su proce<strong>de</strong>ncia.<br />
Media aritmética <strong>de</strong> la concentración total por tipo <strong>de</strong> hospital y consulta privada<br />
en residuos sanitarios y residuos domésticos. (colonias / gramo <strong>de</strong> residuo)<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
FUENTE<br />
HOSPITAL GRANDE:<br />
C.I. Quirúrgicos<br />
1,5 x 10 6<br />
Hospitalización Quirúrgica 6,3 x 10 6<br />
Hospitalización Médica 8,5 x 10 6<br />
Pediatría 5,9 x 10 6<br />
Quirófano 6,3 x 10 5<br />
HOSPITAL PEQUEÑO:<br />
C.I.Quirúrgicos<br />
7,4 x 10 5<br />
Hospitalización Quirúrgica 1,8 x 10 7<br />
Hospitalización Médica 2,7 x 10 6<br />
Quirófano 2,9 x 10 4<br />
CONSULTAS PRIVADAS:<br />
Médico General<br />
1,3 x 10 6<br />
Dermatología 1,9 x 10 7<br />
Pediatría 1,0 x 10 7<br />
Dentista 1,5 x 10 4<br />
RESIDUO DOMÉSTICO O<br />
URBANO<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
Página 277 <strong>de</strong> 287<br />
Microorganismos<br />
Totales<br />
3,0 x 10 8<br />
Esta mayor concentración <strong>de</strong> bacterias en los residuos domésticos se mantenía<br />
incluso cuando se diferenciaban los diferentes grupos <strong>de</strong> bacterias que<br />
componían los residuos en: aerobios, coliformes, E. Coli, Gram positivos,<br />
estreptococos grupo D y anaerobios facultativos.
TEMARIO DE T.E.L<br />
Tabla. Media aritmética <strong>de</strong> la concentración total y por tipo <strong>de</strong> microorganismos en<br />
residuos sanitarios y residuos domésticos. (colonias / gramo <strong>de</strong> residuo)<br />
HOSPITAL<br />
GRANDE<br />
Gérmenes<br />
Totales<br />
Bacterias<br />
Gram<br />
Negativas<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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Estreptococos<br />
Grupo D<br />
Hongos<br />
Y<br />
Levaduras<br />
C.I.<br />
Quirúrgicos<br />
1,5 x 10 6 1,5 x 10 5 4,4 x 10 3 2,3 x 10 3<br />
Hospitalización<br />
Quirúrgica 6,3 x 10 6<br />
1,8 x 10 6<br />
2,9 x10 5<br />
2,8 x10 3<br />
Hospitalización<br />
Médica 8,5 x 10 6<br />
1,2 x 10 6<br />
8,3 x 10 4<br />
1,2 x 10 2<br />
Pediatría 5,9 x 10 6 6,9 x 10 6 1,3 x 10 6 1,8 x 10 3<br />
Quirófano 6,3 x 10 5 1,3 x 10 4 6,9 x 10 3 8,1 x 10 2<br />
HOSPITAL<br />
PEQUEÑO<br />
C.I.<br />
Quirúrgicos<br />
7,4 x 10 5 2,4 x 10 4 1,5 x 10 4 4,0 x 10 2<br />
Hospitalización<br />
Quirúrgica 1,8 x 10 7<br />
1,7 x 10 4<br />
6,1 x 10 5<br />
8,3 x 10 3<br />
Hospitalización<br />
Médica 2,7 x 10 6<br />
1,4 x 10 4<br />
5,5 x 10 4<br />
7,9 x 10 3<br />
Quirófano 2,9 x 10 4 8,5 x 10 4 2,8 x 10 2 2,5 x 10 3<br />
RESIDUO<br />
DOMESTICO<br />
O URBANO<br />
3,0 x 10 8<br />
Por lo tanto pue<strong>de</strong> concluirse que:<br />
6,3 x 10 7<br />
6,9 x 10 6<br />
6,5 x 10 5<br />
• Los casos documentados transmisión profesional se han producido <strong>de</strong>ntro<br />
<strong>de</strong> los centros sanitarios, como consecuencia <strong>de</strong> la atención sanitaria<br />
directa a pacientes.<br />
• No existe ningún caso documentado <strong>de</strong> VIH/SIDA se ha <strong>de</strong>bido a la<br />
manipulación <strong>de</strong> residuos sanitarios.<br />
• Los casos <strong>de</strong> infección recogidos en la literatura científica se han<br />
producido por material punzante.
TEMARIO DE T.E.L<br />
• El riesgo <strong>de</strong> infección por residuos sanitarios, sin objetos punzantes, es<br />
prácticamente inexistente.<br />
• La carga bacteriana, por tanto el potencial patógeno, <strong>de</strong> los residuos<br />
sanitarios es menor que el <strong>de</strong> los residuos domésticos.<br />
• No existe ninguna evi<strong>de</strong>ncia <strong>de</strong> que los residuos sanitarios sean una<br />
amenaza para la salud pública en general.<br />
• El mayor riesgo proviene <strong>de</strong> la utilización privada <strong>de</strong> jeringuillas (ADVP,<br />
diabéticos, asistencia domiciliaria, etc.).<br />
• En la literatura científica no hay evi<strong>de</strong>ncias <strong>de</strong> casos <strong>de</strong> infección por<br />
manipulación <strong>de</strong> residuos sanitarios entre los trabajadores <strong>de</strong> empresas<br />
externas que se <strong>de</strong>dican a la gestión <strong>de</strong> los mismos.<br />
Por lo tanto. La mejora <strong>de</strong> la gestión los residuos sanitarios, exige:<br />
1. Homogeneizar la <strong>de</strong>nominación, clasificación y <strong>de</strong>finición <strong>de</strong> los residuos<br />
sanitarios.<br />
2. Facilitar la segregación, envasado, almacenamiento y transporte interno.<br />
3. Unificar los criterios <strong>de</strong> gestión extracentro: (transporte y eliminación o<br />
tratamiento).<br />
4. Establecer un plan <strong>de</strong> gestión <strong>de</strong> los residuos en los centros sanitarios y<br />
no sanitarios.<br />
A cada una <strong>de</strong> estas propuestas que reflejan los aspectos prioritarios a tener en<br />
cuenta a la hora <strong>de</strong> gestionar este tipo <strong>de</strong> residuos.<br />
CLASIFICACIÓN Y DEFINICIÓN DE LOS RESIDUOS<br />
SANITARIOS.<br />
Residuo sanitario es el que se genera como resultado o a consecuencia <strong>de</strong> una<br />
actividad sanitaria bien médica, farmacéutica o veterinaria en cualquiera <strong>de</strong> sus<br />
ámbitos: asistenciales, docentes o investigadores.<br />
Se consi<strong>de</strong>ran incluidos, entre otros, hospitales, centros <strong>de</strong> especialida<strong>de</strong>s,<br />
centros <strong>de</strong> salud, clínicas públicas y/o privadas, consultorios, consultas, centros<br />
universitarios y / o <strong>de</strong> formación, farmacias, laboratorios clínicos (biológicos,<br />
anatomopatológicos, microbiológicos), laboratorios farmacéuticos, laboratorios<br />
industriales y cualquier centro en el que se realice actividad sanitaria médica,<br />
farmacéutica o veterinaria.<br />
CLASIFICACION<br />
Definición:<br />
Grupo I o Clase A) Residuos Generales o Urbanos.<br />
Sin ningún tipo <strong>de</strong> contaminación específica, están regulados por la Ley 42/75<br />
sobre <strong>de</strong>sechos y residuos sólidos urbanos y el RD 1163/86 que la adapta a la<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
directiva Comunitaria 75/422/CEE. Son pues aquellos generados en don<strong>de</strong> no se<br />
realiza actividad propiamente sanitaria, tales como oficinas, comedores, cocina,<br />
cafetería, salas <strong>de</strong> espera, almacenes etc. Incluyen papel, cartón, vidrio, restos<br />
<strong>de</strong> comida, restos <strong>de</strong> jardinería, mobiliario, metales etc.<br />
Grupo II o Clase B) Residuos Biosanitarios Asimilables a Urbanos (RBU)<br />
Son aquellos que no pue<strong>de</strong>n eliminarse mediante sistemas propios <strong>de</strong> los<br />
residuos sólidos urbanos, sino con tratamiento <strong>de</strong> incineración o <strong>de</strong>sinfección.<br />
Incluye a todos aquellos que no estén <strong>de</strong>finidos en el Grupo biosanitarios<br />
especiales o Específicos. Está constituido por residuos tales como material <strong>de</strong><br />
curas, yesos, filtros <strong>de</strong> hemodiálisis, vendajes, gasas, tabuladuras, guantes y<br />
otros <strong>de</strong>sechables quirúrgicos, bolsas <strong>de</strong> sangre vacías etc.<br />
Grupo III o Clase C) Residuos Biosanitarios especiales (RBE)<br />
Son los productos biológicos y todo material <strong>de</strong> contacto con estos productos,<br />
con excepción <strong>de</strong> las aguas residuales. En esta clase se incluyen aquellos<br />
residuos con capacidad potencial <strong>de</strong> producir contagio y/o toxicidad para los<br />
trabajadores sanitarios o por razones <strong>de</strong> ética y estética. Están constituidos por<br />
residuos <strong>de</strong> pacientes con infecciones altamente virulentas y erradicadas,<br />
Residuos <strong>de</strong> pacientes con infecciones <strong>de</strong> transmisión oral-fecal, Residuos <strong>de</strong><br />
pacientes con infecciones <strong>de</strong> transmisión por aerosoles, filtros <strong>de</strong> diálisis <strong>de</strong><br />
pacientes infecciosos, residuos punzantes o cortante, in<strong>de</strong>pendientemente <strong>de</strong> su<br />
origen, cultivos y reservas <strong>de</strong> agentes infeccioso, residuos <strong>de</strong> animales<br />
infecciosos <strong>de</strong> experimentación, cantida<strong>de</strong>s importantes <strong>de</strong> líquidos corporales,<br />
especialmente sangre humana, residuos anatómicos humanos reconocibles<br />
Grupo IV o Clase D) Residuos Químicos<br />
Residuos tipificados en normativas especiales: Residuos Químicos aquellos<br />
contemplados en la Ley 20/1.986 Básica <strong>de</strong> Residuos Tóxicos Peligrosos. Es el<br />
material <strong>de</strong> <strong>de</strong>secho contaminado con productos químicos que le confieren el<br />
carácter <strong>de</strong> residuo tóxico y peligroso. Se gestión queda regulada por el RD<br />
833/1988.<br />
Los más importantes están constituidos por los Citotóxicos o cistostáticos en los<br />
que importante recordar que <strong>de</strong>be ser diferenciada su eliminación final y por su<br />
importancia cuantitativa y su especificidad sanitaria. También se sitúan en este<br />
grupo el formal<strong>de</strong>hido, compuestos <strong>de</strong> revelado, disolventes, mercurio,<br />
medicamentos caducados, reactivos <strong>de</strong> laboratorio y un amplio grupo como son:<br />
compuesto oxidante, <strong>de</strong>sinfectante, pilas, gases <strong>de</strong> anestesia, aceites<br />
lubricantes, pinturas, lámparas fluorescentes, pesticidas, fibras <strong>de</strong> amianto,<br />
estabilizadores <strong>de</strong> material médico, etc.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
Grupo V o Clase E) Residuos Radiactivos<br />
Son residuos Radiactivos aquellos contaminados por sustancias radiactivas cuya<br />
eliminación es competencia exclusiva <strong>de</strong> la Empresa Nacional <strong>de</strong> Residuos<br />
Radiactivos (ENRESA), <strong>de</strong> acuerdo con el Real Decreto 1522/84.<br />
Grupo VI o Clase F) Restos anatómicos y humanos <strong>de</strong> entidad<br />
Los cadáveres y los restos humanos <strong>de</strong> entidad suficiente, proce<strong>de</strong>ntes <strong>de</strong><br />
abortos, mutilaciones y operaciones quirúrgicas. Su gestión queda regulada por<br />
el RD 2263/1974 sobre Policía Sanitaria Mortuoria<br />
Grupo VII o Clase G) Aguas Residuales<br />
Son líquidos que por su composición pue<strong>de</strong>n ser vertidos a la red <strong>de</strong><br />
saneamiento. Las or<strong>de</strong>nanzas municipales establecen las condiciones que<br />
<strong>de</strong>ben reunir las aguas que se vierten a la red <strong>de</strong> saneamiento.<br />
SEGREGACION, ENVASADO, ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE<br />
INTERNO<br />
El criterio que <strong>de</strong>be priorizarse es el <strong>de</strong> la correcta separación-segregación en<br />
los centros, que se realizará sobre la base <strong>de</strong> la clasificación <strong>de</strong> los grupos<br />
<strong>de</strong>finidos.<br />
Residuos Grupos Urbanos y Biosanitarios asimilables a urbanos: pue<strong>de</strong>n<br />
acumularse en un mismo envase ambos tipos <strong>de</strong> residuos. Deberán separarse<br />
<strong>de</strong> todas las <strong>de</strong>más clases <strong>de</strong> residuos.<br />
Los envases para estos residuos <strong>de</strong>ben cumplir las especificaciones oportunas<br />
(Normas Europeas): Bolsas con opacidad, impermeabilidad, resistencia etc. Si<br />
se utilizan bolsas <strong>de</strong> plástico serán <strong>de</strong> galga mínima 200, volumen no superior a<br />
70 litros. Color negro. (Iguales que las utilizadas para la recogida doméstica).<br />
Estos residuos se podrán compactar etc.<br />
Los residuos Biosanitarios Especiales: Acumulación separada <strong>de</strong> todas las<br />
<strong>de</strong>más Clases o Grupos y en envases o contenedores rígidos exclusivos <strong>de</strong> un<br />
solo uso <strong>de</strong> color amarillo y sin posibilidad <strong>de</strong> apertura una vez cerrados,<br />
etiquetados con el Pictograma BIORIESGO.<br />
Los Residuos Grupo Químicos Para Citostáticos utilizar envases similares <strong>de</strong><br />
color rojo y que contengan únicamente este tipo <strong>de</strong> residuos (Citostáticos), por<br />
tanto <strong>de</strong>ben separarse <strong>de</strong>l resto <strong>de</strong> los residuos <strong>de</strong> este tipo III, etiquetados con<br />
el Pictograma CITOTÓXICO), <strong>de</strong>ben prepararse en un local <strong>de</strong>stinado a tal<br />
efecto y con las medidas <strong>de</strong> seguridad a<strong>de</strong>cuadas. Otras características <strong>de</strong> los<br />
envases: Cumplir con las Normas Europeas, volumen máximo 60 litros <strong>de</strong><br />
capacidad, estanqueidad, opacidad, resistencia etc. Para contener agujas,<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
bisturís, objetos cortantes etc, podrán tener diferentes volúmenes <strong>de</strong> capacidad<br />
en función <strong>de</strong> las necesida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> cada área.<br />
Transporte Interno<br />
Cada centro productor establecerá <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> su programa <strong>de</strong> gestión los<br />
circuitos más acor<strong>de</strong>s con sus necesida<strong>de</strong>s, así como las características <strong>de</strong> los<br />
carros <strong>de</strong> transporte, su limpieza periódica, horarios <strong>de</strong> recogida etc.,<br />
minimizando el riesgo para la salud <strong>de</strong> los pacientes, personal y <strong>de</strong> los visitantes.<br />
Almacenamiento<br />
En un local a<strong>de</strong>cuado <strong>de</strong> fácil limpieza, ventilación a<strong>de</strong>cuada, estanco,<br />
señalizado, con capacidad suficiente <strong>de</strong> acuerdo al volumen <strong>de</strong> producción, la<br />
frecuencia, características y condiciones <strong>de</strong> la recogida.<br />
GESTIÓN EXTRACENTRO ( TRANSPORTE Y ELIMINACIÓN O<br />
TRATAMIENTO)<br />
Correspon<strong>de</strong> a la Consejería <strong>de</strong> Medio Ambiente <strong>de</strong> cada comunidad autónoma<br />
que <strong>de</strong>be regular, autorizar y supervisar el correcto cumplimiento <strong>de</strong> las normas<br />
establecidas para cada una <strong>de</strong> las operaciones que forman parte <strong>de</strong> la gestión<br />
en el exterior <strong>de</strong> los centros sanitarios.<br />
A.- Transporte Externo <strong>de</strong> los Residuos Biosanitarios Asimilables a<br />
Urbanos<br />
La recogida y el transporte externo <strong>de</strong> los Residuos Urbanos y Biosanitarios<br />
asimilables a urbanos, podrán acumularse juntos, <strong>de</strong>berá efectuarse, como<br />
mínimo, con las mismas precauciones que son <strong>de</strong> aplicación a los residuos<br />
sólidos urbanos.<br />
Los Ayuntamientos están obligados a su recogida, transporte y eliminación<br />
externa, en las condiciones que estipula la Ley 42 / 1.975 <strong>de</strong> Desechos y<br />
Residuos Sólidos Urbanos.<br />
B.- Transporte Externo <strong>de</strong> los Residuos Biosanitarios Especiales<br />
En vehículos autorizados que cumplan la normativa vigente sobre transporte <strong>de</strong><br />
mercancías por carretera. Los gestores <strong>de</strong> estos residuos <strong>de</strong>ben tener la/s<br />
autorizaciones correspondientes para su transporte según la normativa <strong>de</strong>l<br />
Ministerio <strong>de</strong> Medio Ambiente y las que cada Comunidad Autónoma establezca<br />
como propias.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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C.- Tratamiento y Eliminación<br />
TEMARIO DE T.E.L<br />
Grupo o Clases Residuos Generales y Residuos Biosanitarios Asimilables a<br />
Urbanos.<br />
Su tratamiento y eliminación <strong>de</strong>berá respetar, como mínimo, los mismos<br />
requisitos técnicos, operativos y <strong>de</strong> seguridad que la normativa vigente exija con<br />
carácter general para los Residuos urbanos.<br />
Grupo o Clase Residuos Biosanitarios Especiales<br />
Dada la particularidad <strong>de</strong> este tipo <strong>de</strong> residuos, sería oportuno que su<br />
tratamiento y eliminación cumpla con los siguientes criterios:<br />
• Que no se incluyan en ningún programa <strong>de</strong> reciclado, neutralización o<br />
valorización.<br />
• Deberán ser obligatoriamente incinerados, esterilizados o <strong>de</strong>sinfectados.<br />
Las mo<strong>de</strong>rnas tecnologías que aparezcan y que garanticen la correcta<br />
eliminación <strong>de</strong> estos residuos, <strong>de</strong>berán estar validadas y autorizadas por<br />
los organismos competentes.<br />
• La incineración <strong>de</strong> los Residuos Biosanitarios Especiales <strong>de</strong>berá cumplir<br />
la normativa vigente sobre la incineración <strong>de</strong> este tipo <strong>de</strong> residuos. En su<br />
<strong>de</strong>fecto <strong>de</strong>berá cumplir los siguientes requisitos mínimos:<br />
o La carga <strong>de</strong>l horno se realizará sin que exista ninguna<br />
manipulación directa <strong>de</strong> los residuos por parte <strong>de</strong> los operarios, y<br />
sin que se produzca la rotura <strong>de</strong> los envases que contienen los<br />
residuos, <strong>de</strong> forma que no exista contacto directo <strong>de</strong> los residuos<br />
con ningún elemento mecánico exterior al horno. Deben<br />
introducirse directamente en la tolva <strong>de</strong> la carga <strong>de</strong>l horno, sin<br />
pasar por la fosa <strong>de</strong> recepción.<br />
o Deberán cumplirse todas las especificaciones técnicas y operativas<br />
establecidas en la normativa vigente sobre incineración <strong>de</strong><br />
residuos sólidos urbanos en instalaciones <strong>de</strong> más <strong>de</strong> tres<br />
toneladas por hora <strong>de</strong> capacidad.<br />
o Ser <strong>de</strong> funcionamiento continuo.<br />
o Tener una capacidad superior a tres toneladas por hora.<br />
o El contenido <strong>de</strong> inquemados en las escorias propias <strong>de</strong> la<br />
incineración <strong>de</strong> residuos sólidos urbanos no <strong>de</strong>be ser superior al 3<br />
por 100.<br />
o La carga <strong>de</strong> los residuos biosanitarios especiales <strong>de</strong>be hacerse<br />
durante el funcionamiento normal <strong>de</strong>l horno. Deben excluirse, por<br />
tanto, las fases <strong>de</strong> encendido en enfriamiento <strong>de</strong>l horno.<br />
o Para los citotóxicos se alcanzarán temperaturas <strong>de</strong> 1.200º C.<br />
o El funcionamiento <strong>de</strong> estas plantas <strong>de</strong> incineración será autorizado<br />
por el órgano autonómico competente.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
Se entien<strong>de</strong> por <strong>de</strong>sinfección <strong>de</strong> residuos sanitarios especiales aquella<br />
tecnología que garantice: la eliminación <strong>de</strong> las formas vegetativas <strong>de</strong> bacterias,<br />
micobacterias, hongos y esporas <strong>de</strong> hongos que elimine los virus y que elimine<br />
las esporas <strong>de</strong>l Bacillus Antracis.<br />
La tecnología aplicada en todo proceso <strong>de</strong> <strong>de</strong>sinfección cumplirá los objetivos<br />
<strong>de</strong>finidos en este apartado. Será autorizado por el órgano autonómico<br />
competente.<br />
Al menos, trimestralmente <strong>de</strong>ben ser realizadas pruebas <strong>de</strong> control<br />
microbiológico para comprobar el grado o eficacia <strong>de</strong> la <strong>de</strong>sinfección y <strong>de</strong> la<br />
esterilización en toda la masa <strong>de</strong>l residuo según normas UNE.<br />
Los resultados <strong>de</strong> estos análisis <strong>de</strong>berán quedar reflejados en un documento <strong>de</strong><br />
control y seguimiento y siempre disponible a requerimiento <strong>de</strong> las autorida<strong>de</strong>s<br />
competentes.<br />
Grupo o Clase Residuos Químicos Citotóxicos<br />
Dado el problema que plantea la neutralización química y el riesgo que para los<br />
manipuladores externos y el medio ambiente, acompaña a este tipo <strong>de</strong> residuos,<br />
como ya he comentado, se propone la incineración como forma obligada <strong>de</strong><br />
eliminación en las condiciones <strong>de</strong>scritas en el apartado anterior sobre<br />
incineración <strong>de</strong> Residuos Sanitarios Específicos.<br />
Grupo o Clase Restos Anatómicos y Cadáveres<br />
Este tipo <strong>de</strong> restos serán gestionados según lo establecido en el Reglamento <strong>de</strong><br />
la Policía Sanitaria Mortuoria en el Decreto 2263/1974 y según las normativas<br />
autonómicas existentes al respecto <strong>de</strong> restos anatómicos y cadáveres.<br />
En perjuicio <strong>de</strong> lo establecido por la legislación especial vigente sobre obtención<br />
<strong>de</strong> piezas anatómicas por trasplante y utilización <strong>de</strong> cadáveres para fines<br />
científicos y <strong>de</strong> enseñanza, el <strong>de</strong>stino final <strong>de</strong> todo cadáver será uno <strong>de</strong> los tres<br />
siguientes:<br />
• Enterramiento en lugar autorizado.<br />
• Incineración.<br />
• Inmersión en alta mar.<br />
También tendrán uno <strong>de</strong> los <strong>de</strong>stinos expresados en el párrafo anterior, los<br />
restos humanos <strong>de</strong> entidad suficiente y proce<strong>de</strong>nte <strong>de</strong> abortos, mutilaciones y<br />
operaciones quirúrgicas, sin otro requisito en el or<strong>de</strong>n sanitario, que el certificado<br />
facultativo en que se acredite la causa y proce<strong>de</strong>ncia <strong>de</strong> tales restos.<br />
Cuando el médico que lo extienda <strong>de</strong>duzca la existencia <strong>de</strong> posibles riesgos <strong>de</strong><br />
contagio, lo pondrá inmediatamente en conocimiento <strong>de</strong> la Dirección Provincial<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
<strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> la Consejería <strong>de</strong> Salud correspondiente, que adoptará las<br />
medidas oportunas.<br />
PLAN DE GESTIÓN DE LOS RESIDUOS EN LOS CENTROS SANITARIOS (Y<br />
NO SANITARIOS):<br />
Todo Centro Sanitario <strong>de</strong>be disponer <strong>de</strong>:<br />
A.- Plan General <strong>de</strong> minimización en el que se <strong>de</strong>finan los tipos <strong>de</strong> residuos, su<br />
clasificación, separación, acondicionamiento, circuito <strong>de</strong> transporte interno,<br />
almacenamiento y tratamiento si lo realiza individualizado, así como acciones a<br />
tomar para implantar esta minimización.<br />
El término reducción en muchas ocasiones se utiliza como minimización y<br />
aunque la más simple y eficaz medida para reducir el volumen <strong>de</strong> residuos es<br />
introducir una clasificación o <strong>de</strong>finición <strong>de</strong> los mismos que sea clara y fácil <strong>de</strong><br />
enten<strong>de</strong>r así como establecer y aplicar criterios comunes referidos<br />
especialmente a aquellos residuos que por sus especiales características<br />
requieran un envasado, transporte y tratamiento diferenciado, en nuestra opinión<br />
la minimización <strong>de</strong> residuos es prioritaria e inaplazable ya que la política <strong>de</strong><br />
Residuos <strong>de</strong> la Unión Europea lo contempla en la Directiva 75/442, el 5º<br />
Programa <strong>de</strong> Medio Ambiente, la Directiva 91/C 190/ 01 relativa a los Envases y<br />
sus residuos, así como la Directiva 94/62, DOCE L, 365.<br />
La minimización <strong>de</strong>be enten<strong>de</strong>rse en el concepto más amplio <strong>de</strong> “prevenir la<br />
generación <strong>de</strong> residuos“ y este nuevo enfoque, para los residuos sanitarios,<br />
incluye actuaciones a llevar a efecto por el hospital, por los proveedores o<br />
fabricantes y por el Estado o Comunidad Autónoma.<br />
B.- Plan <strong>de</strong> Contingencia y medidas <strong>de</strong> prevención <strong>de</strong> riesgos para todo el<br />
personal (manipulador y no manipulador)<br />
Se <strong>de</strong>berá contemplar un Plan <strong>de</strong> Contingencia y Medidas <strong>de</strong> Prevención <strong>de</strong><br />
Riesgos, según los establecido mediante la Ley 31/95 <strong>de</strong>l 8 <strong>de</strong> Noviembre <strong>de</strong><br />
Prevención <strong>de</strong> Riesgos Laborales.<br />
La Ley <strong>de</strong> Prevención <strong>de</strong> Riesgos Laborales tiene por objeto promover la<br />
seguridad y la salud <strong>de</strong> los trabajadores mediante la aplicación <strong>de</strong> medidas y el<br />
<strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> las activida<strong>de</strong>s necesarias para la prevención <strong>de</strong> riesgos <strong>de</strong>rivados<br />
<strong>de</strong>l trabajo.<br />
Esta Ley establece los principios generales relativos a la prevención <strong>de</strong> los<br />
riesgos profesionales para la protección <strong>de</strong> la seguridad y <strong>de</strong> la salud, la<br />
eliminación o disminución <strong>de</strong> los riesgos <strong>de</strong>rivados <strong>de</strong>l trabajo, la información, la<br />
consulta, la participación equilibrada y la formación <strong>de</strong> los trabajadores en<br />
materia preventiva.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
La Ley <strong>de</strong> Prevención <strong>de</strong> Riesgos Laborales regula las actuaciones a <strong>de</strong>sarrollar<br />
por las Administraciones Públicas, así como por los empresarios, los<br />
trabajadores y sus respectivas organizaciones representativas.<br />
Por tanto <strong>de</strong>be existir una normativa acor<strong>de</strong> con lo establecido en la Ley <strong>de</strong><br />
prevención <strong>de</strong> Riesgos Laborales y con este Plan en don<strong>de</strong> estén recogidas y<br />
escritas las medidas que han <strong>de</strong> ponerse en práctica ante <strong>de</strong>terminadas<br />
circunstancias, (Roturas, salpicaduras, inoculaciones etc.), y otras tales como<br />
actuación inmediata en suelos y superficies, registros, protocolos <strong>de</strong> control y<br />
seguimiento, profilaxis etc. <strong>de</strong>l trabajador que sufra algún acci<strong>de</strong>nte o inci<strong>de</strong>nte<br />
con este tipo <strong>de</strong> residuos, así como la dotación y equipamiento para la<br />
protección individual y las vacunaciones obligatorias <strong>de</strong> este personal que, al<br />
menos <strong>de</strong>berían ser, frente a tétanos y hepatitis B.<br />
C.- Se <strong>de</strong>berá contemplar un Plan <strong>de</strong> Gestión <strong>de</strong> Envases y Residuos <strong>de</strong><br />
Envases Farmacéuticos, clínicos y hospitalarios.<br />
Atendiendo al objeto y ámbito <strong>de</strong> aplicación <strong>de</strong> la Ley <strong>de</strong> envases y residuos <strong>de</strong><br />
envases (BOE Nº 99 <strong>de</strong> 25/4/97), hay que tener en cuenta que hay que prevenir<br />
y reducir el impacto sobre el medio ambiente <strong>de</strong> los envases y la gestión <strong>de</strong> los<br />
residuos <strong>de</strong> envases a lo largo <strong>de</strong> todo su ciclo <strong>de</strong> vida.<br />
Para alcanzar los anteriores objetivos se establecen medidas <strong>de</strong>stinadas, como<br />
primera prioridad, a la prevención <strong>de</strong> la producción <strong>de</strong> residuos <strong>de</strong> envases, y en<br />
segundo lugar, a la reutilización <strong>de</strong> los envases, al reciclado y <strong>de</strong>más formas <strong>de</strong><br />
valorización <strong>de</strong> residuos <strong>de</strong> envases, con la finalidad <strong>de</strong> evitar o reducir su<br />
eliminación.<br />
Quedan <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong>l ámbito <strong>de</strong> aplicación <strong>de</strong> la Ley <strong>de</strong> envases y residuos <strong>de</strong><br />
envases a aquellos puestos en el mercado y generados, respectivamente, en el<br />
territorio <strong>de</strong>l Estado.<br />
Lo establecido en la Ley <strong>de</strong> envases y residuos <strong>de</strong> envases lo será sin perjuicio<br />
<strong>de</strong> las disposiciones <strong>de</strong> carácter especial referentes a seguridad, protección <strong>de</strong> la<br />
salud e higiene <strong>de</strong> los productos envasados, medicamentos, transportes y<br />
residuos peligrosos.<br />
D.- Participación <strong>de</strong>l personal en el Plan Propuesto<br />
Los profesionales sanitarios, y en general todos los empleados, son los<br />
miembros <strong>de</strong>l Hospital que están más en contacto con los residuos y emisiones<br />
que éste genera y su manera <strong>de</strong> trabajar pue<strong>de</strong> influir en su generación, por lo<br />
que ocupan una posición privilegiada para i<strong>de</strong>ntificar problemas y plantear<br />
posibles soluciones.<br />
Es importante que comprendan los motivos <strong>de</strong>l plan que se <strong>de</strong>sea implantar, que<br />
se familiaricen con los cambios que se propongan y se sientan parte importante<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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TEMARIO DE T.E.L<br />
<strong>de</strong>l programa en marcha, lo que pue<strong>de</strong> lograrse mediante la formación y el<br />
reconocimiento <strong>de</strong> sus aportaciones.<br />
La formación pue<strong>de</strong> proporcionarse organizando seminarios don<strong>de</strong> incluyan<br />
medios audiovisuales que pue<strong>de</strong>n servir para presentar ejemplos prácticos <strong>de</strong><br />
situaciones que aparezcan en las plantas: manipulaciones incorrectas,<br />
clasificaciones diferentes, etc.<br />
Mediante reuniones <strong>de</strong>l equipo responsable <strong>de</strong>l Plan <strong>de</strong> minimización<br />
hospitalaria con los operarios, es posible informarles <strong>de</strong> los objetivos <strong>de</strong>l Plan y<br />
<strong>de</strong> las mejoras que se espera alcanzar por la gestión <strong>de</strong>l hospital y la <strong>de</strong> los<br />
propios trabajadores. Estas reuniones permiten resolver las dudas que los<br />
operarios pue<strong>de</strong>n tener y conseguir que comenten los problemas que hayan<br />
i<strong>de</strong>ntificado. En estas reuniones se <strong>de</strong>be prestar especial atención al personal<br />
implicado en acciones con impacto directo en la generación <strong>de</strong> residuos y<br />
emisiones y que pue<strong>de</strong>n i<strong>de</strong>ntificar oportunida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> minimización: DUE/ATS,<br />
Facultativos médicos, auxiliares, personal interno, mantenimiento, etc.<br />
La formación <strong>de</strong> los operarios <strong>de</strong>be mantenerse mientras dure la elaboración e<br />
implantación <strong>de</strong>l Plan, pues siempre hay nuevos empleados que <strong>de</strong>sconocen las<br />
técnicas <strong>de</strong> minimización. A<strong>de</strong>más sirve para mantener el interés <strong>de</strong> todos los<br />
trabajadores y para informarles sobre los resultados <strong>de</strong>l programa en marcha. En<br />
los gran<strong>de</strong>s hospitales pue<strong>de</strong> hacerse con ayuda <strong>de</strong> un boletín interno o<br />
utilizando planes <strong>de</strong> anuncios instalados en las zonas <strong>de</strong> paso; en los pequeños<br />
hospitales o clínicas mediante reuniones periódicas.<br />
El procedimiento <strong>de</strong> las aportaciones <strong>de</strong> los operarios se logra por medio <strong>de</strong> una<br />
política diseñada al efecto, que pue<strong>de</strong> incluir regalos y primas por las i<strong>de</strong>as <strong>de</strong><br />
minimización que proporcionan buenos resultados, premios y nominaciones a las<br />
mejoras i<strong>de</strong>as.<br />
E.- Sistema <strong>de</strong> Evaluación y Registro.<br />
Es necesario estar en constante evaluación <strong>de</strong> los objetivos planteados en este<br />
plan para continuar con el mismo, si los objetivos se alcanzan, o para corregir las<br />
anomalías o <strong>de</strong>sviaciones que se <strong>de</strong>tecten.<br />
Para finalizar consi<strong>de</strong>ramos que la promulgación <strong>de</strong> una normativa estatal no<br />
<strong>de</strong>be obligar a la creación <strong>de</strong> normativas específicas por parte <strong>de</strong> las<br />
Comunida<strong>de</strong>s Autónomas que carezcan <strong>de</strong> ella. Sin embargo, la promulgación<br />
<strong>de</strong> una normativa estatal <strong>de</strong>bería establecer los requisitos mínimos que todas las<br />
Comunida<strong>de</strong>s Autónomas <strong>de</strong>berían consi<strong>de</strong>rar en la gestión <strong>de</strong> los residuos<br />
sanitarios, homogeneizando todos los aspectos aquí consi<strong>de</strong>rados.<br />
Fe<strong>de</strong>ración <strong>de</strong> Sanidad <strong>de</strong> Andalucía<br />
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