Práctica 1: TÉCNICA ASÉPTICA Y TÉCNICAS DE SIEMBRA ...

Práctica 1:
TÉCNICA ASÉPTICA Y TÉCNICAS DE SIEMBRA
INTRODUCCIÓN:
Cuando se trabaja con cultivos microbianos, la técnica aséptica se utiliza para
prevenir la introducción de organismos adicionales al cultivo.
Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfección y esterilización
para limitar o eliminar la presencia de microorganismos. La esterilización es un método de
eliminación total de cualquier forma viviente, mientras que la desinfección es un proceso
que elimina únicamente formas vegetativas de los microorganismos.
La esterilización con calor seco y húmedo son los procedimientos de mayor
utilización en microbiología. El calor seco desnaturaliza las enzimas y destruye a los
microorganismos por oxidación, por ejemplo al ponerlos directamente a la flama de un
mechero o en horno a 150-180° C durante 2 horas. Estos métodos se aplican principalmente
en la esterilización de asas de inoculación y todo tipo de material de vidrio y quirúrgico.
Los procesos con calor húmedo se aplican para esterilizar medios de cultivo,
soluciones y cultivos bacterianos que se desechan. El más recomendable es el autoclave en
el que se utiliza vapor de agua a presión para alcanzar temperaturas de 121 °C. El material
se deja a esta temperatura durante 15 minutos para asegurarse de la destrucción de
endosporas, que son las estructuras bacterianas más resistentes al calor.
Para el caso de materiales plásticos es recomendable el uso de gases como oxido de
etileno o con radiaciones gamma. Las superficies generalmente se desinfectan con
radiaciones U.V. o compuestos químicos en forma líquida como: los fenoles, compuestos
cuaternarios de amonio (alquildimetil bencilamonio), formaldehído, alcoholes, halógenos y
detergentes.
El tipo de microorganismo que será utilizado en este laboratorio serán bacterias. Las
bacterias se cultivan sobre materiales conocidos como medios de cultivo. La composición
química o nutricional de los medios es extremadamente variada (Práctica Medios de
Cultivo). Los medios más comunes son los caldos (medios líquidos), tubos con agar
inclinado, tubos con agar y cajas de Petri con agar o placas de agar. El agar es una sustancia
derivada de un alga marina que se solidifica como un semisólido tipo gelatina. Cuando se
añaden nutrientes y otros factores de crecimiento, muchos tipos de bacterias pueden
cultivarse en él.
A menudo es necesario tomar una muestra de bacterias de un tubo y colocarlas en
otro. El proceso requiere cuidado y precisión, y se lleva a cabo siguiendo la técnica aséptica
para evitar que la bacteria en el tubo contamine el área de trabajo o a la persona que lleva a
cabo la transferencia.
OBJETIVO: Conocer los principios generales de las técnicas de esterilización y
entender la importancia de las condiciones de asepsia para el control de contaminaciones
microbianas en el laboratorio.

MATERIAL POR EQUIPO:
- 1 caja de agar nutritivo (por alumno)
- Marcador indeleble
- 2 tubos con caldo nutritivo estéril (por alumno)
- 2 tubos con agar nutritivo inclinado estéril (por alumno)
- Gradilla
- Asa de siembra
- Encendedor
- 1 tubo con cultivo en caldo
- 1 tubo con cultivo en agar inclinado
(El material en letras cursivas será proporcionado por el profesor)
PROCEDIMIENTO:
a) Importancia de las condiciones de asepsia.
1. Marcar las cajas de la siguiente manera:
Caja 1: Puntas de los dedos.
Caja 2: Hablar frente a la placa.
Caja 3: Abiertas.
Caja 4: Caja control
2. Para la caja 1, toca suavemente la superficie del agar con las puntas de los dedos.
Destapa la caja 2 y sostenla a una distancia de 10 a 15 cm de tu boca. Repite tres veces
el trabalenguas de “Tres tristes tigres tragaban trigo en un trigal en tres tristes platos. En
tres tristes platos, en un trigal, tragaban trigo tres tristes tigres.” Tapa de nuevo las
cajas.
La caja 3 se dejará destapada durante toda la sesión de laboratorio.
La caja 4 se conservará sin abrir.
3. Una vez que las placas han sido expuestas, deben colocarse en la incubadora en
posición invertida. La siguiente sesión examina las placas y registra los resultados
en la tabla. Regresa las cajas a la profesora para que se desechen adecuadamente.
b) Transferencia tubo a tubo.
Cada alumno sembrará 4 tubos practicando los diferentes tipos de transferencia (Fig. 1):
• Caldo-Caldo
• Caldo-Agar inclinado
• Agar inclinado-Caldo
• Agar inclinado-Agar inclinado
Siempre mantener los tubos con caldo en una gradilla. Nunca acostados en la mesa de
trabajo, ni en la bata. Al acabar la práctica, coloca la gradilla con los tubos en la incubadora
a 37 °C hasta que te lo indique la profesora.

Rotular el tubo con el
nombre de la cepa, la fecha
y el nombre del alumno.
Retirar una tapa con el meñique y
la otra con el dedo anular,
mientras sostienes el asa. Nunca
poner las tapas sobre la mesa.
Sembrar en el tubo estéril un poco de
inóculo. En el caso de los caldos
únicamente inserta el asa en el medio. En
el caso del agar inclinado, dibuja con el asa
un “zig zag” en la superficie del agar.
Figura 1. Procedimiento de transferencia de inóculo de tubo a tubo.
Sostener los tubos con la mano no
dominante. Si los tubos tienen un tapón
en rosca, aflójalo de manera que solo se
necesite levantarlo para quitarlo. Si tiene
un tapón de algodón, sácalo un poco de
manera que no esté muy apretado.
Flamear la boca de ambos tubos para
matar cualquier microorganismo
presente en el aire y que pueda
contaminar la parte superior del tubo
durante las manipulaciones.
De nuevo flamea las bocas de los
tubos y tápalos de nuevo. Asegúrate de
mezclar muy bien el inóculo en los
tubos que contienen caldo sembrado.
Flamear el asa en el mechero Bunsen. El
asa se sostiene con la mano dominante,
como sosteniendo un lápiz o una pluma.
Dejar que el alambre se ponga al rojo
vivo. Dejar enfriar el asa unos breves
segundos.
Insertar el asa dentro del tubo que
contiene a la bacteria a ser sembrada.
Los tubos abiertos deben mantenerse en
posición inclinada para que el riesgo de
contaminación sea mínimo.
Flamea el asa hasta el rojo vivo
antes de que la coloques en la
mesa.
Si estas compartiendo el mechero con algún compañero, debes tener cuidado de no flamear dos asas al mismo
tiempo, ya que existe un alto riesgo de que alguien sufra quemaduras.

RESULTADOS
Realiza la descripción morfológica de las colonias (si es que hay) obtenidas en las cajas con
los distintos tratamiento en relación a la caja control.
Cuadro 1. Descripción morfológica de microorganismos en cajas de Petri con
diferentes tratamientos.
MEDIO DE Puntas de los Hablar frente Abierta al aire Control
CULTIVO dedos a la placa
RESULTADOS
Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco crecimiento,
(++) crecimiento regular y (+++) crecimiento abundante.
Registra la morfología macroscópica del microorganismo sembrado en los tubos con agar
inclinado y en los caldos de acuerdo a la guía de observación.
DISCUSIÓN
En esta sección se analizarán los resultados obtenidos, tratando de dar respuesta a las
siguiente preguntas (entre otras): ¿Debes tocar las cajas de agar con tus manos? ¿Puedes
encontrar organismos en el aire? ¿Qué resultados soportan tus conclusiones? ¿Cuando
trabajas con cultivos microbianos, puedes hablar? ¿Por qué sí o por qué no?
Contesta las siguientes preguntas relacionadas con la técnica de transferencia:
1. ¿Por qué razón no debes compartir el mechero de Bunsen?
2. ¿Cuál es la razón para flamear los tubos antes y después de cada transferencia?
3. ¿Por qué debes evitar el usar el pulgar para sostener las tapas durante una
transferencia?
4. Explica por qué debes evitar que el asa llena de inóculo toque la boca del tubo
fuente o del tubo a ser inoculado.
5. Cuando tomas un inóculo de un tubo con agar inclinado. ¿por qué es necesario tocar
una parte estéril del agar con el asa antes de tocar el crecimiento bacteriano?
6. ¿Por qué el asa debe ser flameada antes y después de todos los procedimientos de
siembra?
7. ¿Por qué las placas de agar deben mantenerse invertidas durante la incubación?

GUÍA DE OBSERVACIÓN
Tubos con agar inclinado.
Observa la figura 2, la cual muestra varias formas de crecimiento que se observan en tubos
con agar inclinado y compáralas con el tipo de crecimiento que ves en los tubos que
sembraste.
Figura 2. Tipos de crecimiento en tubos con agar inclinado.
Caldos
Ramificado Puntiforme Puntiaguda Uniforme Rizoide Extendido
A menos que tengas un cultivo fresco de 24 hrs directo de la incubadora, no verás muchos
tubos con turbidez. Esto es porque las bacterias tienden a depositarse o a precipitarse
cuando se refrigeran por varios días. Después de que te fijes si se formó un anillo o una
película en la superficie del tubo (fig. 3), toma los tubos y observa si se presenta el
fenómeno de precipitación. Una vez que se completó este paso, mezcla las bacterias
agitando, dando golpecitos, rodando el tubo en la palma de tu mano. No agites el tubo de
manera que la tapa se contamine con el caldo. Una vez mezclado, puedes observar turbidez,
floculación, o una apariencia de hilo dentro del caldo.
No inoculado
No inoculado Turbio Floculación Película Anillo Precipitación
Figura 3. Tipos de crecimiento en tubos con caldo.

CUESTIONARIO
a) Glosario. Define los siguientes términos.
1. Agar
2. Medio de cultivo
3. Caldo de cultivo
4. Incubación
5. Colonia
6. Inoculación
7. Contaminación
8. Técnica aséptica
9. Estéril
10. Desinfección
b) Haz un diagrama de flujo del procedimiento de transferencia microbiana de tubo a
tubo.
c) Completa el siguiente cuadro:
Cuadro 2. Equipo y material de laboratorio.
Equipo y Material Función Esquema (opcional)
Caja de Petri
Mechero de Bunsen
Asa bacteriológica
Pipetas
Micopipetas
Probeta
Matraz Erlenmeyer
Balanza analítica
Potenciómetro
Vortex
Triángulo Esparcir las bacterias en las placas de agar.
Perlas de vidrio
Incubadora
Refrigerador
Campana