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Instituto Politécnico Nacional<br />
Unidad Profesional Interdisciplinaria <strong>de</strong> Biotecnología<br />
Laboratorio <strong>de</strong> Cultivo <strong>de</strong> Tejidos<br />
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL<br />
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA<br />
DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS<br />
ACADEMIA DE BIOTECNOLOGÍA<br />
MANUAL DEL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS<br />
México D. F. Agosto 2009<br />
ELABORADO POR:<br />
Dr. Jesús Agustín Badillo Corona<br />
Dra. María <strong><strong>de</strong>l</strong> Carmen Oliver Salvador<br />
IBt. Karen Gisela Moreno Guerrero<br />
Biol. Verónica Pacheco González<br />
IBt. Hernán Cortes Arroyo<br />
Manual elaborado por Jesús Agustín Badillo Corona, María <strong><strong>de</strong>l</strong> Carmen Oliver Salvador, Karen Gisela Moreno Guerrero,<br />
Verónica Pacheco González y Hernán Cortés Arroyo<br />
1
Instituto Politécnico Nacional<br />
Unidad Profesional Interdisciplinaria <strong>de</strong> Biotecnología<br />
Laboratorio <strong>de</strong> Cultivo <strong>de</strong> Tejidos<br />
Relación <strong>de</strong> prácticas<br />
No. Titulo Numero <strong>de</strong><br />
sesiones*<br />
1 Germinación <strong>de</strong> semillas <strong>de</strong> diversas especies en condiciones <strong>de</strong> asepsia 4<br />
2 Preparación <strong>de</strong> medios <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong> para la generación <strong>de</strong> callos y<br />
micropropagación<br />
3 Establecimiento <strong>de</strong> un <strong>cultivo</strong> <strong>de</strong> callos <strong>de</strong> explantes <strong>de</strong> zanahoria<br />
(Daucus carota).<br />
4 Micropropagación <strong>de</strong> violeta africana Saintpaulia ionantha Wendi. 5<br />
5 Regeneración <strong>de</strong> plantas completas a partir <strong>de</strong> explantes <strong>de</strong> hojas <strong>de</strong><br />
Nicotiana tabacum<br />
*La sesiones necesarias para la realización <strong>de</strong> cada práctica no son necesariamente<br />
continuas.<br />
Manual elaborado por Jesús Agustín Badillo Corona, María <strong><strong>de</strong>l</strong> Carmen Oliver Salvador, Karen Gisela Moreno Guerrero,<br />
Verónica Pacheco González y Hernán Cortés Arroyo<br />
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Unidad Profesional Interdisciplinaria <strong>de</strong> Biotecnología<br />
Laboratorio <strong>de</strong> Cultivo <strong>de</strong> Tejidos<br />
Práctica 1. Germinación <strong>de</strong> semillas <strong>de</strong> diversas especies en condiciones <strong>de</strong> asepsia.<br />
INTRODUCCION<br />
Durante el <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> una planta los procesos <strong>de</strong> formación <strong>de</strong> semillas y <strong>de</strong><br />
germinación son procesos absolutamente indispensables para la dispersión y perpetuación<br />
<strong>de</strong> la especie. Por este motivo, averiguar los mecanismos que gobiernan la germinación<br />
<strong>de</strong> semillas ha sido esencial para compren<strong>de</strong>r tanto el papel reproductivo <strong>de</strong> éstas, como<br />
el papel que juegan en un contexto ecológico que tiene implicaciones <strong>de</strong> competitividad y<br />
dispersión.<br />
Hasta el día <strong>de</strong> hoy se han i<strong>de</strong>ntificado 4 requerimientos abióticos básicos necesarios para<br />
la germinación:<br />
1. Agua, mediado principalmente por el potencial hídrico <strong><strong>de</strong>l</strong> ambiente y <strong>de</strong> la<br />
semilla. Se consi<strong>de</strong>ra que es el factor <strong>de</strong>terminante para que se realice la<br />
germinación (si no hay agua no hay germinación).<br />
2. Oxígeno, el cual ingresa a la semilla en forma gaseosa o disuelto en agua.<br />
3. Temperatura, específica para cada especie.<br />
4. Luz, no es consi<strong>de</strong>rada un factor <strong>de</strong>terminante, pero si un promotor <strong>de</strong> la<br />
germinación.<br />
La semilla contiene al embrión generado por la fecundación en la planta madre y<br />
el éxito que tenga para su supervivencia <strong>de</strong>pen<strong>de</strong> mucho <strong>de</strong> su habilidad para germinar en<br />
el lugar y momento apropiado. Esto se asocia a mecanismos adaptativos que previenen la<br />
germinación en ausencia <strong>de</strong> un ambiente a<strong>de</strong>cuado, lo que se <strong>de</strong>nomina latencia <strong>de</strong><br />
semillas. En estos casos las estructuras <strong>de</strong> la semilla restringen cualquiera <strong>de</strong> los factores<br />
antes mencionados, en especial el agua y el oxígeno, con lo cual se limita la germinación.<br />
Dentro <strong>de</strong> los procesos y factores reconocidos para la liberación <strong>de</strong> las semillas <strong><strong>de</strong>l</strong> estado<br />
<strong>de</strong> latencia se encuentran los siguientes:<br />
• Post maduración (afterrippening): se obtiene cuando la semilla ha reducido el<br />
nivel <strong>de</strong> humedad por <strong>de</strong>secación.<br />
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• Escarificación natural. Se refiere a la permeabilización <strong>de</strong> la testa producto <strong>de</strong> la<br />
<strong>de</strong>gradación <strong>de</strong> ésta por diversos medios naturales (microorganismos, <strong>de</strong>sgaste<br />
mecánico, paso por el tracto digestivo etc.), permitiendo la penetración <strong>de</strong> agua y<br />
oxígeno hacia el embrión.<br />
• Congelamiento/enfriamiento: existen semillas que requieren períodos <strong>de</strong><br />
congelamiento para germinar.<br />
• Luz.<br />
OBJETIVOS GENERALES<br />
• Inducir la germinación <strong>de</strong> semillas <strong>de</strong> diferentes especies vegetales para la obtención<br />
<strong>de</strong> plántulas libres <strong>de</strong> hongos y bacterias.<br />
• Familiarizar al estudiante con las técnicas <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong> <strong>de</strong> vegetales in vitro<br />
OBJETIVOS ESPECÍFICOS<br />
• Propiciar el <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> habilida<strong>de</strong>s cognitivas y procedimentales <strong><strong>de</strong>l</strong> alumno en el<br />
empleo a<strong>de</strong>cuado <strong>de</strong> las técnicas <strong>de</strong> asepsia para el <strong>cultivo</strong> <strong>de</strong> semillas in vitro.<br />
• Preparar medios <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong> para la germinación <strong>de</strong> diferentes especies <strong>de</strong> semillas y<br />
analizar las diferencias entre ellos.<br />
• Analizar las diferencias que existen entre las condiciones que propician la<br />
germinación <strong>de</strong> cada especie vegetal empleada.<br />
• Obtener plántulas sanas a partir <strong>de</strong> semillas <strong>de</strong> diferentes especies vegetales.<br />
• Cultivar las plántulas sanas obtenidas en condiciones óptimas para su <strong>de</strong>sarrollo.<br />
MATERIALES POR EQUIPO:<br />
BIOLÓGICO<br />
Semillas <strong>de</strong> jitomate, tabaco, lechuga, zanahoria y <strong>de</strong> una Bromeliácea, Bromelia<br />
hemisphaerica.<br />
MATERIAL DE LABORATORIO • 2 matraz Erlenmeyer <strong>de</strong> 500 mL<br />
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• 2 vaso <strong>de</strong> precipitados <strong>de</strong> 100 o<br />
250 ml<br />
• 1 piceta <strong>de</strong> 250 mL<br />
• 1 agitador <strong>de</strong> vidrio<br />
• rollo <strong>de</strong> papel aluminio<br />
• 4cajas <strong>de</strong> Petri<br />
• rollo <strong>de</strong> algodón<br />
• 1esponja<br />
• 10 Frascos tipo “Gerber” con tapa<br />
<strong>de</strong> polietilino o Tubos <strong>de</strong> ensaye<br />
2.5 x 30 cm<br />
• Masking-tape<br />
• 2 Espátulas o cucharas <strong>de</strong> acero<br />
inoxidable<br />
DESARROLLO EXPERIMENTAL:<br />
Esterilizar previamente por equipo:<br />
• 2 vasos <strong>de</strong> precipitado <strong>de</strong> 250 mL<br />
• 1L <strong>de</strong> agua <strong>de</strong>stilada<br />
• 2 espátulas<br />
PROCEDIMIENTO:<br />
Preparación <strong><strong>de</strong>l</strong> medio <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong>:<br />
EQUIPOS<br />
• Campana <strong>de</strong> flujo laminar<br />
• Autoclave<br />
• Potenciómetro<br />
• Balanza analítica<br />
REACTIVOS<br />
• Etanol al 70%<br />
• HCl 1.0 N<br />
• NaOH 1.0 N<br />
• H2SO4 3.0 M<br />
• Sustancias orgánicas e inorgánicas<br />
(ver anexo).<br />
1. Conforme a las indicaciones dadas por el profesor según el número <strong>de</strong> equipos y las<br />
especies vegetales a utilizar, preparar medio <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong> semisólido <strong>de</strong> Knop o MS<br />
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según la formulación indicada en el Anexo 1. El pH <strong>de</strong>berá ajustarse con NaOH 1.0 N<br />
antes <strong>de</strong> adicionar el agar a los medios (Medio Knop a pH <strong>de</strong> 5.5 y Medio MS a<br />
pH.Preparar medio <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong> en cantidad suficiente para 10 frascos o 10 tubos.<br />
2. Fundir el agar en calor y verter 20 mL en cada frasco (tipo “Gerber”) o 15 mL en<br />
cada tubo, cubrir con tapa <strong>de</strong> plástico o doble tapa <strong>de</strong> papel aluminio y sujetar con<br />
ligas o Masking-tape, esterilizar en autoclave a 121°C y 15 psi <strong>de</strong> presión durante 15<br />
min.<br />
Desinfección <strong>de</strong> semillas:<br />
El siguiente protocolo pue<strong>de</strong> ser utilizado para semillas <strong>de</strong> zanahoria, jitomate y lechuga.<br />
a. Colocar las semillas en agua con extrán al 2% (o <strong>de</strong>tergente) durante 30-40 minutos,<br />
mantener en agitación (<strong>manual</strong> o con un agitador magnético).<br />
b. Enjuagar tres veces con agua estéril para eliminar el <strong>de</strong>tergente. A partir <strong>de</strong> este paso<br />
trabajar en la campana <strong>de</strong> flujo laminar. Utilizar la espátula estéril para retener las<br />
semillas.<br />
c. Sumergir las semillas en una solución <strong>de</strong> etanol al 70% por 30 segundos (exactos).<br />
d. Enjuagar tres veces con agua estéril para eliminar el etanol.<br />
e. Transferir las semillas a un vaso estéril y sumergirlas en una solución <strong>de</strong> hipoclorito<br />
<strong>de</strong> sodio al 1% <strong>de</strong> cloro libre durante 10 min.<br />
f. Lavar las semillas cinco veces con agua estéril para eliminar el hipoclorito <strong>de</strong> sodio y<br />
<strong>de</strong>cantar, ayudándose con la espátula estéril.<br />
Siembra e incubación <strong>de</strong> las semillas<br />
g. Del vaso <strong>de</strong> precipitados, tomar una a una las semillas y colocarlas en los tubos o<br />
frascos que contengan medio <strong>de</strong> Knop o MS con la ayuda <strong>de</strong> una espátula estéril.<br />
h. Colocar 3-5 semillas en cada tubo o frasco, procurando que que<strong>de</strong>n separadas y en<br />
contacto con el medio <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong>.<br />
i. Colocar los recipientes con las semillas en un cuarto <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong> en oscuridad a una<br />
temperatura <strong>de</strong> incubación <strong>de</strong> entre 24 a 26 ºC.<br />
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j. Observar cada semana las semillas. Separar los tubos o frascos contaminados y anotar<br />
si se trata <strong>de</strong> contaminación bacteriana o fúngica. Los frascos o tubos contaminados<br />
<strong>de</strong>berán esterilizarse a la brevedad.<br />
k. A la aparición <strong><strong>de</strong>l</strong> coleóptilo, exponer los tubos al fotoperíodo natural hasta que la<br />
plántula alcance una altura aproximada <strong>de</strong> 8-10 cm (<strong>de</strong>pendiendo <strong>de</strong> la especie).<br />
Protocolo para semillas <strong>de</strong> B. hemisphaerica:<br />
IMPORTANTE: Durante el seguimiento <strong>de</strong> este protocolo, <strong>de</strong>berán extremarse<br />
precauciones al manejar el acido sulfúrico ( H2SO4). Es altamente tóxico y corrosivo.<br />
a. Colocar las semillas en extrán al 2% (o <strong>de</strong>tergente) durante 40 minutos. Mantener<br />
en agitación <strong>de</strong> forma <strong>manual</strong> o con un agitador magnético.<br />
b. Enjuagar varias veces con agua para eliminar el <strong>de</strong>tergente. A partir <strong>de</strong> este paso<br />
trabajar en la campana <strong>de</strong> flujo laminar.<br />
c. Transferir las semillas a un vaso estéril y sumergir las semillas en una solución <strong>de</strong><br />
H2SO4 3.0 M durante 10 min.<br />
d. Enjuagar varias veces con agua estéril para eliminar el H2SO4. El enjuague <strong>de</strong>be<br />
realizarse con extremo cuidado a fin <strong>de</strong> no mermar la cantidad <strong>de</strong> semillas durante<br />
el proceso.<br />
e. Transferir las semillas enjuagadas a un vaso estéril y sumergirlas en una solución<br />
<strong>de</strong> etanol al 70% durante 30 segundos.<br />
f. Enjuagar varias veces con agua estéril para eliminar el etanol.<br />
g. Transferir las semillas a un vaso estéril y <strong>de</strong>jarlas en el mismo vaso, hidratando<br />
con agua estéril aproximadamente 24 horas, en condiciones <strong>de</strong> asepsia (el vaso<br />
<strong>de</strong>berá permanecer perfectamente tapado).<br />
h. Del vaso <strong>de</strong> precipitados, tomar una a una las semillas y transferirlas a los frascos<br />
con medio Knop con la ayuda <strong>de</strong> una espátula estéril.<br />
i. Colocar <strong>de</strong> 3 a 5 semillas por frasco, procurando que que<strong>de</strong>n separadas y en<br />
contacto con el medio <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong>.<br />
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j. Coloque los frascos, con las semillas en el cuarto <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong> en la oscuridad a una<br />
temperatura <strong>de</strong> incubación <strong>de</strong> entre 24 y 26 ºC.<br />
k. Observar cada semana las semillas. Separar los tubos o frascos contaminados y<br />
anotar si se trata <strong>de</strong> contaminación bacteriana o fúngica. Los frascos o tubos<br />
contaminados <strong>de</strong>berán esterilizarse a la brevedad<br />
l. A la aparición <strong><strong>de</strong>l</strong> coleóptilo, exponer los frascos al fotoperíodo natural hasta que<br />
la plántula alcance una altura aproximada <strong>de</strong> 2-3 cm.<br />
CUESTIONARIO<br />
1. ¿Qué pasa si las semillas se <strong>de</strong>jan más tiempo en etanol?<br />
2. ¿Por qué las semillas <strong>de</strong> B. hemisphaerica son tratadas con H2SO4?<br />
3. ¿Qué es el coleóptilo?<br />
4. Mencionar 3 puntos críticos para la germinación <strong>de</strong> semillas <strong>de</strong> B. hemisphaerica.<br />
5. ¿Por qué algunas semillas requieren <strong>de</strong> la obscuridad para germinar? ¿Qué tipo <strong>de</strong><br />
tratamiento luminoso requieren algunas semillas para po<strong>de</strong>r germinar?<br />
NOTA. A<strong>de</strong>más <strong>de</strong> los puntos mínimos que <strong>de</strong>be incluir el informe escrito <strong>de</strong> la práctica<br />
(Objetivos, introducción, <strong>de</strong>sarrollo, resultados, etc.) se <strong>de</strong>berán incluir y discutir los<br />
siguientes puntos:<br />
El tiempo <strong>de</strong> germinación <strong>de</strong> las semillas<br />
El % <strong>de</strong> germinación.<br />
Una comparación <strong>de</strong> estos resultados con los <strong>de</strong>más equipos.<br />
Discutir a <strong>de</strong>talle el papel que juega cada una <strong>de</strong> la soluciones en el proceso <strong>de</strong><br />
<strong>de</strong>sinfección.<br />
BIBLIOGRAFÍA<br />
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• Barrera Badillo G. y Oliver Salvador (2004). III Congreso Internacional y XIV<br />
Congreso Nacional <strong>de</strong> Ingeniería Bioquímica. Veracruz, Ver. <strong><strong>de</strong>l</strong> 31 <strong>de</strong> marzo al 2<br />
<strong>de</strong> abril.<br />
• Kieran, P.M., Mac Loughlin P.F., Malone D.M. (1997). Plant cell suspension<br />
cultures: some engineering consi<strong>de</strong>rations. Journal of Biotechnology. 59, 39-52.<br />
• Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and<br />
bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15(3): 473-497.<br />
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Práctica 2. Preparación <strong>de</strong> medios <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong> para la generación <strong>de</strong> callos y<br />
micropropagación<br />
INTRODUCCIÓN<br />
Entre los factores más importantes a tener en cuenta para lograr la respuesta morfológica<br />
<strong>de</strong>seada en un <strong>cultivo</strong> <strong>de</strong> tejido in vitro, es la composición <strong><strong>de</strong>l</strong> medio <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong>. El medio<br />
<strong>de</strong> <strong>cultivo</strong> está conformado por macro y micronutrientes esenciales para la supervivencia<br />
<strong>de</strong> la planta, nutrientes (hidratos <strong>de</strong> carbono, vitaminas), agentes reguladores <strong><strong>de</strong>l</strong><br />
crecimiento y hormonas vegetales, que ayudarán a obtener un callo, una planta completa,<br />
o un órgano vegetal en particular, a partir <strong><strong>de</strong>l</strong> explante elegido (en condiciones <strong>de</strong><br />
asepsia) y algún agente gelificante inerte (agar, gelrite, etc.). Los principales<br />
componentes <strong>de</strong> los diferentes medios <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong> se presentan en el cuadro 1:<br />
Cuadro 1. Principales componentes <strong><strong>de</strong>l</strong> medio para <strong>cultivo</strong>s vegetales in vitro.<br />
Componentes Características<br />
Fuente <strong>de</strong> carbono<br />
Sustancias<br />
inorgánicas<br />
Vitaminas<br />
Hormonas<br />
reguladores <strong><strong>de</strong>l</strong><br />
crecimiento<br />
Adaptado <strong>de</strong> Hall (2000).<br />
Generalmente, la mayoría <strong>de</strong> los <strong>cultivo</strong>s <strong>de</strong> células vegetales no<br />
son autótrofos y por lo tanto <strong>de</strong>pen<strong>de</strong>n completamente <strong>de</strong> una<br />
fuente externa <strong>de</strong> carbono. En muchos casos, se prefiere<br />
sacarosa, y ocasionalmente glucosa (Ej., <strong>cultivo</strong>s <strong>de</strong> algodón) o<br />
maltosa (Ej., <strong>cultivo</strong> <strong>de</strong> anteras).<br />
Macroelementos (N, P, K, Ca, Mg, S) y microelementos (Fe,<br />
Co, Zn, Ni, B, Al, Mn, Mo, Cu, I) en proporciones a<strong>de</strong>cuadas.<br />
Vitaminas B1, B2, B6, vitamina H, vitamina E, ácido fólico,<br />
ácido nicotínico, entre otras.<br />
Auxinas: promueven la elongación celular, la formación <strong>de</strong><br />
callos y raíces adventicias, inhiben la formación <strong>de</strong> brotes<br />
axilares adventicios y, en ocasiones, inhiben la embriogénesis.<br />
Citocininas: promueven la división celular, regulan el<br />
crecimiento y el <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> los <strong>tejidos</strong> vegetales.<br />
Otras: giberelinas, ácido absícico, etileno.<br />
Las exigencias minerales varían con la especie, la naturaleza <strong><strong>de</strong>l</strong> tejido y su estado<br />
fisiológico, pero, a<strong>de</strong>más, también varían con el método <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong> y el tipo <strong>de</strong><br />
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organogénesis estudiado. Por ejemplo, los meristemos y, en forma general, los <strong>tejidos</strong> con<br />
actividad metabólica elevada, pue<strong>de</strong>n presentar importantes necesida<strong>de</strong>s en potasio.<br />
En 1962, Murashige y Skoog propusieron un medio para la investigación <strong><strong>de</strong>l</strong> crecimiento<br />
óptimo <strong>de</strong> callos <strong>de</strong> la planta <strong><strong>de</strong>l</strong> tabaco (Nicotiana tabacum). Este medio es netamente<br />
superior a los medios anteriormente usados para iniciar la organogénesis y,<br />
particularmente, para la formación <strong>de</strong> yemas.<br />
A partir <strong>de</strong> estos resultados, el medio MS se ha empleado <strong>de</strong> una manera muy general<br />
para todos los tipos <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong> in vitro. A<strong>de</strong>más, pue<strong>de</strong> afirmarse que ha sido la<br />
utilización <strong><strong>de</strong>l</strong> medio MS junto con el empleo <strong>de</strong> fitohormonas apropiadas (citocininas y<br />
auxinas), lo que ha permitido el éxito <strong>de</strong> los trabajos sobre organogénesis en <strong>cultivo</strong> in<br />
vitro. El medio MS está caracterizado, principalmente, por un contenido elevado <strong>de</strong><br />
nitrógeno <strong><strong>de</strong>l</strong> cual 1/3 <strong><strong>de</strong>l</strong> total está aportado en forma reducida (NH4+) y por una<br />
concentración igualmente elevada en potasio.<br />
Los <strong>tejidos</strong> y células cultivadas in vitro son ampliamente heterótrofos con respecto al<br />
carbono <strong>de</strong>bido a la ausencia o insuficiente asimilación por clorofila. Por lo que resulta<br />
indispensable añadir azúcares a los medios <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong>, siendo los dos más utilizados la<br />
sacarosa y la glucosa. La concentración óptima <strong><strong>de</strong>l</strong> azúcar en los medios <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong> varía<br />
entre 20–80 g/L, en <strong>de</strong>pen<strong>de</strong>ncia <strong><strong>de</strong>l</strong> tipo <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong>, material vegetal, etc. Los azúcares<br />
presentan una acción metabólica y energética (Hall, 2000).<br />
OBETIVO GENERAL<br />
• Preparar medios <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong> para el <strong>cultivo</strong> in vitro <strong>de</strong> <strong>tejidos</strong> vegetales<br />
DESARROLLO EXPERIMENTAL<br />
1. Preparar medio <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong> MS semi-sólido (ver anexo). Complementarlo con los<br />
reguladores <strong><strong>de</strong>l</strong> crecimiento vegetal apropiados. Para <strong>cultivo</strong>s <strong>de</strong> zanahoria utilizar 1.0<br />
mg/L 2,4-D (2,4 ácido diclorofenoxiacético). Para generación <strong>de</strong> callos <strong>de</strong> la planta<br />
<strong><strong>de</strong>l</strong> tabaco, adicionar 1.0 mg/L <strong>de</strong> BAP (Bencil aminopurina) y 0.1 mg/L <strong>de</strong> ANA.<br />
Para la micropropagación <strong>de</strong> violeta utilizar 1.0 mg/L <strong>de</strong> AIA y 0.08 mg/L <strong>de</strong> BAP.<br />
2. Adicionar a todos los medios sacarosa 20 g/L y agar-agar 6.0 g/L, mioinositol 0.1<br />
g/L.<br />
3. Utilizar las vitaminas <strong>de</strong> Gamborg (1976), también conocidas como B5. Para violeta<br />
y zanahoria utilizar vitaminas MS.<br />
4. Ajustar el pH a 5.5 con NaOH 1.0 N, antes <strong>de</strong> agregar el agar.<br />
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5. Fundir el agar en calor y verter 25 mL por frasco (tipo “Gerber”). Cubrir con doble<br />
tapa <strong>de</strong> papel aluminio y sujetar con una liga o con tapa <strong>de</strong> plástico, esterilizar en<br />
autoclave a 121°C y 15 lb. <strong>de</strong> presión durante 15 min.<br />
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BIBLIOGRAFÍA<br />
Instituto Politécnico Nacional<br />
Unidad Profesional Interdisciplinaria <strong>de</strong> Biotecnología<br />
Laboratorio <strong>de</strong> Cultivo <strong>de</strong> Tejidos<br />
• Hall R.D (2000). Plant cell culture initiation. Molecular Biotechnology 16:<br />
161-173.<br />
• Gamborg OL, Miller RA and Ojima K. (1968). Nutrient requirements of<br />
suspension cultures of soybean root cells. Exp Cell Res. 50:151-8.<br />
• Murashige T and Skoog F (1962). A revised medium for rapid growth and<br />
bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15(3): 473-497.<br />
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Práctica 3. Establecimiento <strong>de</strong> un Cultivo <strong>de</strong> Callos <strong>de</strong> Explantes <strong>de</strong> Zanahoria<br />
(Daucus carota)<br />
Adaptada <strong>de</strong> Dodd and Roberts, 1985.<br />
INTRODUCCION<br />
Los callos <strong>de</strong> plantas son masas celulares diferenciadas, no organizadas y <strong>de</strong> rápido<br />
crecimiento que pue<strong>de</strong>n ser producidas en todas las especies <strong>de</strong> plantas en respuesta a un<br />
suplemento <strong>de</strong> hormonas endógenas o externas. Los <strong>cultivo</strong>s <strong>de</strong> callos <strong>de</strong> plantas (callos<br />
que crecen asépticamente en medios semisólidos con agar y hormonas vegetales) y<br />
<strong>cultivo</strong>s <strong>de</strong> suspensión <strong>de</strong> callos (callos que crecen asépticamente en medio líquidos en<br />
matraces o biorreactores) han incrementado su uso en Biotecnología como una<br />
herramienta para la manipulación genética <strong>de</strong> plantas, micropropagación, estudios <strong><strong>de</strong>l</strong><br />
metabolismo y <strong>de</strong> <strong>de</strong>sarrollo celular <strong>de</strong> plantas, así como para la producción comercial <strong>de</strong><br />
productos naturales (metabolitos primarios y secundarios). (Mc Donald, y col. 1995).<br />
OBJETIVO GENERAL<br />
• Familiarizar al estudiante con las técnicas <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong> <strong>de</strong> vegetales in vitro y establecer<br />
<strong>cultivo</strong>s <strong>de</strong> callos.<br />
MATERIALES:<br />
BIOLÓGICO<br />
Raíces <strong>de</strong> Zanahoria (Daucus carota)<br />
sanas y frescas.<br />
MATERIAL DE LABORATORIO (por<br />
cada equipo)<br />
3 vasos <strong>de</strong> precipitado <strong>de</strong> 250 ml<br />
2 pipetas <strong>de</strong> 1 ml<br />
1 piceta <strong>de</strong> 250 ml<br />
2 cajas <strong>de</strong> Petri<br />
Hojas <strong>de</strong> papel blanco o papel “kraft”<br />
(estéril)<br />
Algodón<br />
Bisturí, navajas <strong>de</strong> bisturí y pinzas <strong>de</strong><br />
disección<br />
EQUIPOS<br />
Campana <strong>de</strong> flujo laminar<br />
Autoclave<br />
Potenciómetro<br />
Balanza analítica<br />
REACTIVOS<br />
Etanol al 70%<br />
Solución <strong>de</strong> hipoclorito <strong>de</strong> sodio:<br />
blanqueador comercial (5.5 % <strong>de</strong> cloro<br />
libre) al 10 %.<br />
HCl 1.0 N<br />
NaOH 1.0 N<br />
Manual elaborado por Jesús Agustín Badillo Corona, María <strong><strong>de</strong>l</strong> Carmen Oliver Salvador, Karen Gisela Moreno Guerrero,<br />
Verónica Pacheco González y Hernán Cortés Arroyo<br />
14
1.0 litro <strong>de</strong> agua <strong>de</strong>stilada estéril.<br />
Instituto Politécnico Nacional<br />
Unidad Profesional Interdisciplinaria <strong>de</strong> Biotecnología<br />
Laboratorio <strong>de</strong> Cultivo <strong>de</strong> Tejidos<br />
Frascos “Gerber” con Medios <strong>de</strong> Murashige y Skoog (MS) preparados en la Práctica 2 o<br />
(Soluciones patrón <strong>de</strong> sustancias orgánicas e inorgánicas <strong><strong>de</strong>l</strong> Anexo <strong>de</strong> dicha práctica).<br />
PROCEDIMIENTO<br />
1. Preparar medio <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong> MS semi-sólido, complementarlo con 2,4-D 1.0 mg/L,<br />
sacarosa 20 g/L y agar-agar 6.0 g/L, mioinositol 0.1 g/L y vitaminas. Ajustar el pH a<br />
5.5 con NaOH 1.0 N, antes <strong>de</strong> agregar el agar.<br />
2. Preparar otro medio <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong>, MS sin mioinositol. Todo los <strong>de</strong>más componentes a la<br />
misma concentración y ajustar el pH <strong><strong>de</strong>l</strong> medio a 5.5.<br />
3. Fundir el agar en calor y verter 25 mL por frasco, tapar con doble tapa <strong>de</strong> papel<br />
aluminio y sujetar con una liga o con tapa <strong>de</strong> plástico, esterilizar en autoclave a 121°C<br />
y 15 lb. <strong>de</strong> presión durante 15 min.<br />
MATERIAL VEGETAL<br />
Utilizar zanahorias <strong>de</strong> aproximadamente 20 cm <strong>de</strong> longitud y 4 cm <strong>de</strong> diámetro.<br />
a. Lavar las zanahorias con agua corriente y jabón <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> un recipiente agitando<br />
<strong>manual</strong>mente.<br />
b. Pelar las zanahorias con un pelador <strong>de</strong> vegetales, eliminar 2 mm <strong><strong>de</strong>l</strong> tejido.<br />
c. Cortar a las zanahorias en rebanadas <strong>de</strong> un cm <strong>de</strong> grueso.<br />
d. Sumergir las rebanadas en una solución <strong>de</strong> etanol al 70% por 30 seg.<br />
e. Sumergir las rebanadas en una solución <strong>de</strong> hipoclorito <strong>de</strong> sodio al 10%, durante 10<br />
minutos, a partir <strong>de</strong> este paso trabajar en la campana <strong>de</strong> flujo laminar.<br />
f. Durante el tiempo <strong>de</strong> espera, numerar y pesar los frascos en los cuales se van a<br />
colocar los <strong>tejidos</strong>.<br />
g. Lavar el material vegetal cinco veces con agua <strong>de</strong>stilada y estéril, con agitación<br />
<strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> un vaso <strong>de</strong> precipitados, durante 30 seg.<br />
h. Del vaso <strong>de</strong> precipitados, tomar una a una las rebanadas y transferirlas a una caja <strong>de</strong><br />
Petri estéril y con la ayuda <strong>de</strong> unas pinzas <strong>de</strong> disección, cortar cubos <strong>de</strong> la zona <strong><strong>de</strong>l</strong><br />
cambium <strong>de</strong> un centímetro por lado <strong>de</strong> acuerdo con lo indicado en la figura 1.<br />
i. Colocar tres cortes (cubos) <strong>de</strong> cambium por frasco, procurando que la superficie <strong>de</strong><br />
uno <strong>de</strong> los lados <strong><strong>de</strong>l</strong> cubo que<strong>de</strong> en contacto con la superficie <strong><strong>de</strong>l</strong> medio <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong>.<br />
Manual elaborado por Jesús Agustín Badillo Corona, María <strong><strong>de</strong>l</strong> Carmen Oliver Salvador, Karen Gisela Moreno Guerrero,<br />
Verónica Pacheco González y Hernán Cortés Arroyo<br />
15
Instituto Politécnico Nacional<br />
Unidad Profesional Interdisciplinaria <strong>de</strong> Biotecnología<br />
Laboratorio <strong>de</strong> Cultivo <strong>de</strong> Tejidos<br />
j. Volver a pesar los frascos y calcular el peso <strong>de</strong> los explantes por diferencia.<br />
k. Coloque los frascos con los explantes en un cuarto <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong> con fotoperiodo <strong>de</strong> 16<br />
horas <strong>de</strong> luz por 8 <strong>de</strong> oscuridad a una temperatura <strong>de</strong> 24-26 ºC.<br />
l. Observar cada tres días el <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> los <strong>cultivo</strong>s, anotar las apariencias y cambios<br />
que van sufriendo los explantes. Separar los frascos con explantes necrosados y<br />
contaminados y <strong>de</strong>scribir si se trata <strong>de</strong> contaminación bacteriana o fúngica. Es <strong>de</strong><br />
particular importancia <strong>de</strong>terminar el tiempo <strong>de</strong> aparición <strong>de</strong> los callos.<br />
m. Pesar los frascos cada semana para calcular la tasa <strong>de</strong> crecimiento <strong><strong>de</strong>l</strong> callo.<br />
Requisitos para el informe escrito.<br />
1. Con los datos obtenidos <strong><strong>de</strong>l</strong> peso <strong>de</strong> los frascos, realizar la curva <strong>de</strong> crecimiento<br />
<strong><strong>de</strong>l</strong> <strong>cultivo</strong> <strong>de</strong> callos, en peso fresco vs tiempo.<br />
2. El informe <strong>de</strong> la práctica <strong>de</strong>be contener los resultados <strong>de</strong> todos los equipos <strong><strong>de</strong>l</strong><br />
grupo con los que se realizará la discusión y las conclusiones <strong>de</strong> los experimentos<br />
realizados en la misma.<br />
3. ¿Cual es el papel, en general, <strong><strong>de</strong>l</strong> mioinositol en la fisiología <strong>de</strong> las plantas?<br />
4. Incluir en su informe (<strong>de</strong>spués <strong>de</strong> haberlo leído) una copia <strong>de</strong>, por lo menos, un<br />
artículo reciente sobre el tópico o el <strong>cultivo</strong> <strong>de</strong> células y/o <strong>tejidos</strong> vegetales.<br />
BIBLIOGRAFÌA.<br />
1. Lebowitz, R. J. 1995. Micropropagation of African Violet. In Plant Biothecnology. A<br />
Laboratory Manual. WCB Wm. C. Brown Publishers. Dubuque, Iowa; Melbourne,<br />
Australia; Oxford, England.<br />
2. Mc Donald, K., Jackman, A., Thorup, J. And Dan<strong>de</strong>kar, A. (1995), Applied<br />
Biochemistry and Biotechnology. 54. 93-108.<br />
3. Dixon, R. A.(1985), Isolation and Maintenance of callus and cell suspension cultures<br />
in plant cell culture. A practical approach. Ed. Dixon R. A. IRL Press, Oxford.<br />
Washington.<br />
4. Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays<br />
with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15(3): 473-497.<br />
Manual elaborado por Jesús Agustín Badillo Corona, María <strong><strong>de</strong>l</strong> Carmen Oliver Salvador, Karen Gisela Moreno Guerrero,<br />
Verónica Pacheco González y Hernán Cortés Arroyo<br />
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Instituto Politécnico Nacional<br />
Unidad Profesional Interdisciplinaria <strong>de</strong> Biotecnología<br />
Laboratorio <strong>de</strong> Cultivo <strong>de</strong> Tejidos<br />
Práctica 4. Micropropagación <strong>de</strong> violeta africana Saintpaulia ionantha Wendi.<br />
Adaptada <strong>de</strong> Franco y García, 1995.<br />
INTRODUCCION<br />
La técnica <strong>de</strong> micropropagación <strong>de</strong> especies vegetales, utiliza diversas porciones <strong>de</strong><br />
órganos, <strong>tejidos</strong>, etc. y proporciona una herramienta capaz <strong>de</strong> producir un gran número <strong>de</strong><br />
plantas en cada <strong>cultivo</strong>; como consecuencia <strong>de</strong> la totipotencialidad <strong>de</strong> las células<br />
vegetales.<br />
Una planta ornamental <strong>de</strong> gran interés <strong>de</strong>ntro <strong><strong>de</strong>l</strong> comercio y la jardinería, es la violeta<br />
africana Saintpaulia ionantha Wendi, originaria <strong><strong>de</strong>l</strong> este <strong>de</strong> África. En la actualidad, se<br />
conocen más <strong>de</strong> 20 especies y cientos <strong>de</strong> varieda<strong>de</strong>s, las que se propagan por germinación<br />
<strong>de</strong> semillas o en forma vegetativa por esquejes. Las violetas son plantas muy apreciadas y<br />
por lo mismo, se encuentran ampliamente distribuidas por todo el mundo a través <strong>de</strong> las<br />
asociaciones <strong>de</strong> floricultores y aficionados. Las violetas africanas presentan gran<br />
diversidad morfológica y con una amplia gama <strong>de</strong> tonalida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> flores que van <strong>de</strong>s<strong>de</strong><br />
violeta púrpura a blancas.<br />
En la literatura encontramos varios autores que <strong>de</strong>sarrollaron diversas técnicas <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong><br />
“in vitro” para obtener violetas africanas a gran escala, a partir <strong>de</strong> pequeñas porciones <strong>de</strong><br />
peciolo y tejido foliar, entre ellos se pue<strong>de</strong> citar a Start y Cumming (1976), Bilkey y<br />
Mc.Cown (1978) y Cooke R. (1977).<br />
OBJETIVOS GENERALES<br />
• Demostrar los principios <strong>de</strong> la micropropagación y regeneración <strong>de</strong> plantas.<br />
• Propagar violeta africana Saintpaulia ionantha Wendi, por <strong>cultivo</strong> in vitro <strong>de</strong><br />
explantes foliares y <strong>de</strong> peciolo.<br />
MATERIALES<br />
BIOLOGICOS<br />
1 maceta con una planta <strong>de</strong> violeta africana (Saintpaulia ionantha Wendi.)<br />
EQUIPOS<br />
Campana <strong>de</strong> flujo laminar<br />
Autoclave<br />
Potenciómetro<br />
Manual elaborado por Jesús Agustín Badillo Corona, María <strong><strong>de</strong>l</strong> Carmen Oliver Salvador, Karen Gisela Moreno Guerrero,<br />
Verónica Pacheco González y Hernán Cortés Arroyo<br />
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Balanza analítica<br />
Instituto Politécnico Nacional<br />
Unidad Profesional Interdisciplinaria <strong>de</strong> Biotecnología<br />
Laboratorio <strong>de</strong> Cultivo <strong>de</strong> Tejidos<br />
MATERIAL DE LABORATORIO<br />
1 matraz Erlenmeyer <strong>de</strong> 2L<br />
1 matraz Erlenmeyer <strong>de</strong> 1L<br />
2 vasos <strong>de</strong> precipitados <strong>de</strong> 250 ml<br />
2 pipetas <strong>de</strong> 1 ml<br />
1 piceta <strong>de</strong> 250 ml<br />
1 agitador <strong>de</strong> vidrio<br />
5 cajas <strong>de</strong> Petri<br />
rollo <strong>de</strong> papel aluminio<br />
DESARROLLO EXPERIMENTAL<br />
rollo <strong>de</strong> algodón<br />
bisturí y pinzas <strong>de</strong> disección<br />
REACTIVOS<br />
Etanol al 70%<br />
Solución <strong>de</strong> hipoclorito <strong>de</strong> sodio:<br />
blanqueador comercial (5.5 % <strong>de</strong> cloro<br />
libre) al 10 %<br />
HCl 1.0 N<br />
NaOH 1.0 N<br />
2.0 litros <strong>de</strong> agua bi<strong>de</strong>stilada estéril.<br />
Soluciones patrón <strong>de</strong> sustancias<br />
orgánicas e inorgánicas (ver apéndice).<br />
1. Preparar un litro <strong>de</strong> medio <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong> semi-sólido <strong>de</strong> Murashige y Skoog (1962), MS,<br />
complementarlo con ácido nicotínico 0.5 mg, piridoxina 0.5 mg, ácido indolacético<br />
2.0 mg, 6-bencil aminopurina 0.08 mg, sacarosa 30 g y agar 6.0 g. Ajustar el pH a<br />
5.7.<br />
2. Preparar el medio MS disminuyendo a la cuarta parte la concentración <strong>de</strong> las<br />
sustancias inorgánicas y sacarosa 15 g/L. El resto <strong>de</strong> los componentes se utilizará en<br />
la misma concentración. Ajustar el pH a 5.7.<br />
3. Fundir el agar en calor y verter 20 mL por frasco, tapar con doble tapa <strong>de</strong> papel<br />
aluminio y sujete con una liga o con tapa <strong>de</strong> plástico. Esterilizar en autoclave a 15<br />
libras <strong>de</strong> presión y 121°C durante 15 min.<br />
PREPARACIÓN DEL MATERIAL VEGETAL.<br />
Utilizar hojas <strong>de</strong> violeta africana, <strong>de</strong> la planta patrón o una planta sana. Escoger varias<br />
hojas <strong>de</strong>sarrolladas, jóvenes (2-3 cm <strong>de</strong> diámetro) y sanas, <strong>de</strong>jar un centímetro <strong>de</strong> peciolo.<br />
Manual elaborado por Jesús Agustín Badillo Corona, María <strong><strong>de</strong>l</strong> Carmen Oliver Salvador, Karen Gisela Moreno Guerrero,<br />
Verónica Pacheco González y Hernán Cortés Arroyo<br />
18
Instituto Politécnico Nacional<br />
Unidad Profesional Interdisciplinaria <strong>de</strong> Biotecnología<br />
Laboratorio <strong>de</strong> Cultivo <strong>de</strong> Tejidos<br />
a. Colocar las hojas <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> un vaso <strong>de</strong> precipitados, lavar con agua corriente y jabón<br />
agitando <strong>manual</strong>mente.<br />
b. Sumergirlas en una solución <strong>de</strong> etanol al 70% por 30 seg.<br />
c. Sumergir las hojas en una solución <strong>de</strong> hipoclorito <strong>de</strong> sodio al 10%, durante 10<br />
minutos. A partir <strong>de</strong> este paso trabajar en la campana <strong>de</strong> flujo laminar.<br />
d. Lavar el material vegetal cinco veces con agua <strong>de</strong>stilada y estéril, con agitación<br />
<strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> un vaso <strong>de</strong> precipitados, durante 30 seg.<br />
e. Del vaso <strong>de</strong> precipitados, tomar una a una las hojas, trasnferir a una caja Petri estéril y<br />
con la ayuda <strong>de</strong> unas pinzas <strong>de</strong> disección, cortar en fracciones <strong>de</strong> un centímetro<br />
cuadrado como se muestra en la figura 1.<br />
f. Colocar dos o tres fracciones foliares por frasco, procurando que el envés foliar que<strong>de</strong><br />
en contacto con la superficie <strong><strong>de</strong>l</strong> medio <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong>.<br />
g. Colocar los frascos con los explantes en un cuarto <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong>, con fotoperiodo <strong>de</strong> 16<br />
horas luz, por 8 horas <strong>de</strong> oscuridad, a temperatura <strong>de</strong> 24ºC.<br />
h. Observar cada tercer día el <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> sus <strong>cultivo</strong>s. Anotar los cambios en la<br />
apariencia <strong>de</strong> los explantes. Separar los frascos con explantes necrosados y<br />
contaminados y registrar si se trata <strong>de</strong> contaminación bacteriana o fúngica<br />
Colocar en diferentes frascos los explantes <strong>de</strong>: a) peciolo, b) parte central <strong>de</strong> hoja y c)<br />
parte externa <strong>de</strong> la hoja (ver figura 1). Deben utilizarse los siguientes medios con los<br />
explantes: 1) MS y 2) MS a un cuarto <strong>de</strong> sales y 15 g/L <strong>de</strong> sacarosa.<br />
Discutir en el informe escrito sobre los siguientes puntos:<br />
1. ¿Cuál es el significado <strong><strong>de</strong>l</strong> término totipotencialidad celular?.<br />
2. ¿En la práctica, consi<strong>de</strong>ra factible el <strong>cultivo</strong> <strong>de</strong> una célula aislada y obtener una planta<br />
completa?<br />
3. Escriba el significado <strong><strong>de</strong>l</strong> término micropropagación.<br />
4. ¿Qué es una célula somática?<br />
Incluir en su informe, al menos un artículo, reciente, sobre el tema <strong>de</strong> la práctica o el<br />
<strong>cultivo</strong> <strong>de</strong> callos, células y/o <strong>tejidos</strong> vegetales al que previamente se le ha dado<br />
lectura.<br />
5. El informe <strong>de</strong> la práctica <strong>de</strong>be contener los resultados <strong>de</strong> los todos los equipos ,<br />
discusión y conclusiones sobre los experimentos realizados bien estructuradas y<br />
sustentadas en la literatura consultada.<br />
BIBLIOGRAFIA.<br />
1. Bilkey, P.C. and B.H. Mc Cown 1978. Micropropagation of African Violet from<br />
Petiolo Cross- Section. HortScience 13 (1):37-38.<br />
Manual elaborado por Jesús Agustín Badillo Corona, María <strong><strong>de</strong>l</strong> Carmen Oliver Salvador, Karen Gisela Moreno Guerrero,<br />
Verónica Pacheco González y Hernán Cortés Arroyo<br />
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Instituto Politécnico Nacional<br />
Unidad Profesional Interdisciplinaria <strong>de</strong> Biotecnología<br />
Laboratorio <strong>de</strong> Cultivo <strong>de</strong> Tejidos<br />
2. Cooke, R. 1997. Tissue Culture Propagation of African Violets. HortScience<br />
12(6):549<br />
3. Franco Rodríguez José y M. T. García, 1995. Ensayo <strong>de</strong>mostrativo sobre la<br />
propagación <strong>de</strong> violeta africana Saintpaulia ionantha Wendi por <strong>cultivo</strong> <strong>de</strong> <strong>tejidos</strong>.<br />
An.Esc.Nac.Cienc.Biol.México, 40:107-115.<br />
4. Martin, C. 1985. Cultivo <strong>de</strong> plantas en probeta. Mundo Científico. No.44:160-169.<br />
5. Murashige, T. And Skoog, 1962. A revised medium of rapid growth and bioassays<br />
with tobacco tissue. Physiol.Plantarum. 15:473-497.<br />
6. Pierik, R.L.M.1994. Biotecnología Vegetal como herramienta en la horticultura<br />
ornamental: Revista Chapingo, serie Horticultura 1:45-57. México.<br />
7. Smith, R.H. and R.E. Noris. 1983. In vitro propagation African Violet chimeras.<br />
HortScience 18(4):436-437.<br />
8. Star, N.D. and B.G. Cumming. 1976. In vitro propagation of Saintpaulia ionantha<br />
Wendl. HortScience 11:204-206.<br />
9. Lebowitz, R. J. 1995. Micropropagation of African Violet. In Plant Biothecnology. A<br />
Laboratory Manual. WCB Wm. C. Brown Publishers. Dubuque, Iowa; Melbourne,<br />
Australia; Oxford, England.<br />
Manual elaborado por Jesús Agustín Badillo Corona, María <strong><strong>de</strong>l</strong> Carmen Oliver Salvador, Karen Gisela Moreno Guerrero,<br />
Verónica Pacheco González y Hernán Cortés Arroyo<br />
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Instituto Politécnico Nacional<br />
Unidad Profesional Interdisciplinaria <strong>de</strong> Biotecnología<br />
Laboratorio <strong>de</strong> Cultivo <strong>de</strong> Tejidos<br />
Práctica 5. Regeneración <strong>de</strong> plantas completas a partir <strong>de</strong> explantes <strong>de</strong> hojas <strong>de</strong><br />
Nicotiana tabacum<br />
Introducción.<br />
Para po<strong>de</strong>r regenerar una planta completa en <strong>cultivo</strong> <strong>de</strong> tejido in vitro, es necesario<br />
proveer al tejido <strong>de</strong> los requerimientos nutricionales y factores ambientales necesarios,<br />
tales como el medio <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong>, vitaminas, reguladores <strong><strong>de</strong>l</strong> crecimiento vegetal, pH,<br />
temperatura, etc. De particular importancia son los reguladores <strong><strong>de</strong>l</strong> crecimiento vegetal,<br />
ya que <strong>de</strong> éstos <strong>de</strong>pen<strong>de</strong> la respuesta que tendrá el tejido in vitro. En 1962, Murashige y<br />
Skook realizaron experimentos con la planta <strong><strong>de</strong>l</strong> tabaco y con ello marcaron la pauta para<br />
<strong>de</strong>terminar los requerimientos para po<strong>de</strong>r regenerar la planta completa <strong><strong>de</strong>l</strong> tabaco a partir<br />
<strong>de</strong> explantes <strong>de</strong> hojas. Actualmente, la regeneración <strong>de</strong> cualquier planta completa en<br />
<strong>cultivo</strong> <strong>de</strong> <strong>tejidos</strong> in vitro es <strong>de</strong> particular interés para la Ingeniería genética <strong>de</strong> plantas ya<br />
que este paso ha sido <strong>de</strong>cisivo para llevar a cabo modificaciones genéticas <strong>de</strong> plantas<br />
utilizando Agrobacterium tumefaciens (Práctica 6) y bombar<strong>de</strong>o <strong>de</strong> micropartículas.<br />
OBJETIVO GENERAL<br />
Familiarizar al alumno con las técnicas utilizadas para el <strong>cultivo</strong> <strong>de</strong> explantes <strong>de</strong> la planta<br />
<strong><strong>de</strong>l</strong> tabaco y regenerar la planta completa.<br />
MATERIALES:<br />
BIOLOGICO<br />
Plantas <strong>de</strong> tabaco crecidas en condiciones <strong>de</strong> asepsia. Utilizar las obtenidas en la práctica<br />
MATERIAL DE LABORATORIO (por cada equipo)<br />
2 cajas <strong>de</strong> Petri<br />
Bisturí, navajas <strong>de</strong> bisturí y pinzas <strong>de</strong> disección<br />
EQUIPOS<br />
Campana <strong>de</strong> flujo laminar<br />
Autoclave<br />
Potenciómetro<br />
Manual elaborado por Jesús Agustín Badillo Corona, María <strong><strong>de</strong>l</strong> Carmen Oliver Salvador, Karen Gisela Moreno Guerrero,<br />
Verónica Pacheco González y Hernán Cortés Arroyo<br />
21
Balanza analítica<br />
Instituto Politécnico Nacional<br />
Unidad Profesional Interdisciplinaria <strong>de</strong> Biotecnología<br />
Laboratorio <strong>de</strong> Cultivo <strong>de</strong> Tejidos<br />
REACTIVOS<br />
Etanol al 70%<br />
Frascos “Gerber” con Medios <strong>de</strong> Murashige y Skoog (MS) preparados en la Práctica 2.<br />
(Ver Anexo I para la composición <strong>de</strong> las soluciones patrón <strong>de</strong> sustancias orgánicas e<br />
inorgánicas).<br />
PROCEDIMIENTO<br />
1. En una campana <strong>de</strong> flujo laminar, abrir los frascos en los que se germinaron las<br />
semillas <strong>de</strong> tabaco.<br />
2. Con un bisturí, cortar hojas jóvenes <strong>de</strong> la planta <strong><strong>de</strong>l</strong> tabaco. Las hojas que mas<br />
rápido y mejor regeneran son las jóvenes pero en teoría hojas <strong>de</strong> cualquier edad<br />
son útiles.<br />
3. Colocar las hojas en una caja <strong>de</strong> Petri y realizar cortes <strong>de</strong> 1 x 1 cm. Cortar el<br />
tejido vascular principal y eliminar. Las hojas se manipulan mejor si se colocan<br />
con el envés hacía arriba.<br />
4. Colocar los cortes (3-4 por frasco) en medio MS semi-sólido suplementado con<br />
1.0 mg/L <strong>de</strong> BAP y 0.1 mg/L <strong>de</strong> ANA.<br />
5. Realizar observaciones cada semana. El tejido se expan<strong>de</strong> y luego forma brotes<br />
pasando por un periodo casi imperceptible <strong>de</strong> callo.<br />
6. Si a las 4 semanas no han surgido brotes, transferir el tejido a medio fresco.<br />
7. Cuando hayan surgido brotes y éstos hayan crecido <strong>de</strong> 2-3 cm, transferirlos a<br />
medio MS semi-sólido, con vitaminas B5 y SIN REGULADORES DEL<br />
CREIMIENTO VEGETAL, para que formen raíces.<br />
Requisitos para el reporte escrito.<br />
• Incluir fotos <strong><strong>de</strong>l</strong> <strong>de</strong>sarrollo <strong><strong>de</strong>l</strong> tejido.<br />
• Explicar si es posible utilizar explantes <strong>de</strong> otros <strong>tejidos</strong> (tallo, hojas, polen, etc)<br />
• ¿Cómo se llama a la regeneración que no pasa por tejido calloso?<br />
• ¿Qué otras especies son capaces <strong>de</strong> formar una planta completa a partir <strong>de</strong><br />
explantes <strong>de</strong> hojas?<br />
Manual elaborado por Jesús Agustín Badillo Corona, María <strong><strong>de</strong>l</strong> Carmen Oliver Salvador, Karen Gisela Moreno Guerrero,<br />
Verónica Pacheco González y Hernán Cortés Arroyo<br />
22
Bibliografía<br />
Instituto Politécnico Nacional<br />
Unidad Profesional Interdisciplinaria <strong>de</strong> Biotecnología<br />
Laboratorio <strong>de</strong> Cultivo <strong>de</strong> Tejidos<br />
1. Murashige, T. And Skoog, 1962. A revised medium of rapid growth and bioassays<br />
with tobacco tissue. Physiol.Plantarum. 15:473-497.<br />
Manual elaborado por Jesús Agustín Badillo Corona, María <strong><strong>de</strong>l</strong> Carmen Oliver Salvador, Karen Gisela Moreno Guerrero,<br />
Verónica Pacheco González y Hernán Cortés Arroyo<br />
23
Anexo I<br />
Instituto Politécnico Nacional<br />
Unidad Profesional Interdisciplinaria <strong>de</strong> Biotecnología<br />
Laboratorio <strong>de</strong> Cultivo <strong>de</strong> Tejidos<br />
Formulación <strong>de</strong> medios <strong>de</strong> <strong>cultivo</strong><br />
Medio <strong>de</strong> Knop<br />
Sustancia mg/L<br />
MgSO4 • 7H2O 200<br />
KNO3<br />
KH2PO4<br />
Ca(NO3) • 4H2O *CaCl2<br />
Manual elaborado por Jesús Agustín Badillo Corona, María <strong><strong>de</strong>l</strong> Carmen Oliver Salvador, Karen Gisela Moreno Guerrero,<br />
Verónica Pacheco González y Hernán Cortés Arroyo<br />
200<br />
200<br />
800 *374<br />
Agar 6000<br />
pH 5.5<br />
Medio <strong>de</strong> Murashige y Skoog (1962)<br />
Macronutrientes Concentración final mg/L g (para un stock 10X en 1L)<br />
NH4NO3 1650 16.5<br />
KNO3 1900 19.0<br />
CaCl2 • H2O 440 4.4<br />
MgSO4 • 2H2O 370 3.7<br />
KH2PO4 170 1.7<br />
NaH2PO4 • H2O 85 0.85<br />
Micronutrientes mg/L mg (para un stock 100X en 100 mL)<br />
KI 0.83 83<br />
H3BO3 6.2 620<br />
MnSO4 • 4H2O 22.3 2203<br />
ZnSO4 • 4H2O 8.6 860<br />
24
Instituto Politécnico Nacional<br />
Unidad Profesional Interdisciplinaria <strong>de</strong> Biotecnología<br />
Laboratorio <strong>de</strong> Cultivo <strong>de</strong> Tejidos<br />
NaMoO5 • 2H2O 0.25 25<br />
CuSO4 • 5H2O 0.025 25<br />
CoCl2 • 6H2O 0.025 25<br />
Na2EDTA • 2H2O 37.2 3720<br />
FeSO2 • 7H2O 27.8 2780<br />
Murashige y Skoog (micronutrientes) No cat. Sigma M0519 1L (Stock 10X)<br />
Se recomienda preparar por separado los stocks para macronutrientes, micronutrientes y<br />
Na2EDTA • 2H2O y FeSO2 • 7H2O. Es importante verificar la cantidad <strong>de</strong> moléculas <strong>de</strong><br />
agua que contiene el compuesto, en caso <strong>de</strong> tener más o menos moléculas <strong>de</strong> agua, es<br />
necesario hacer el ajuste.<br />
Compuestos<br />
Orgánicos<br />
Murashige & Skoog<br />
(1962) mg/L<br />
Ácido nicotínico 0.5 0.5<br />
Piridoxina•HCl 0.5 0.5<br />
Tiamina•HCl 0.1 0.1<br />
Glicina 2.0 2.0<br />
Mioinositol 100<br />
*MS Vitamin solution (1000X) 50 ml No cat Sigma M3900<br />
Sacarosa 20 g/L<br />
Agar-agar o agar bacteriológico 6.0 g/L<br />
pH 5.8<br />
*MS Vitaminas<br />
1000X mg/mL<br />
Manual elaborado por Jesús Agustín Badillo Corona, María <strong><strong>de</strong>l</strong> Carmen Oliver Salvador, Karen Gisela Moreno Guerrero,<br />
Verónica Pacheco González y Hernán Cortés Arroyo<br />
25
Instituto Politécnico Nacional<br />
Unidad Profesional Interdisciplinaria <strong>de</strong> Biotecnología<br />
Laboratorio <strong>de</strong> Cultivo <strong>de</strong> Tejidos<br />
ANEXO II<br />
GLOSARIO<br />
Apical: zona extrema <strong><strong>de</strong>l</strong> tallo que le proporciona crecimiento en longitud al mismo.<br />
Aséptico: libre <strong>de</strong> gérmenes contaminantes.<br />
Axial: zona comprendida entre el eje <strong>de</strong> un tallo o rama y una hoja.<br />
Callogénesis: proceso en el que a partir <strong>de</strong> un explante se genera una masa amorfa <strong>de</strong><br />
células llamada callo.<br />
Cámara <strong>de</strong> flujo laminar: aparato que proporciona en su interior un ambiente<br />
totalmente estéril, necesario para la manipulación <strong><strong>de</strong>l</strong> material aséptico (tejido y medios<br />
<strong>de</strong> <strong>cultivo</strong>).<br />
Catalogación: método utilizado para <strong>de</strong>terminar si una planta tiene o no virus.<br />
Clon: elemento <strong>de</strong> un grupo <strong>de</strong> individuos propagados asexualmente a partir <strong>de</strong> un solo<br />
organismo, <strong><strong>de</strong>l</strong> cual conservan las características genéticas.<br />
Embriogénesis somática: proceso en el cual se forman, a partir <strong>de</strong> un explante,<br />
embriones asexuales, los cuales dan origen a plantas completamente <strong>de</strong>sarrolladas.<br />
Explante: pequeña porción <strong><strong>de</strong>l</strong> tejido vegetal que funciona como generador <strong>de</strong> nuevas<br />
plantas en el <strong>cultivo</strong> in vitro.<br />
Fito-hormonas: compuestos químicos que actúan, en muy bajas concentraciones,<br />
regulando el crecimiento <strong>de</strong> los <strong>tejidos</strong> vegetales.<br />
Fito-patógenos: microorganismos que actúan en forma dañina en las plantas.<br />
Hibridación: cruza entre dos organismos <strong>de</strong> varieda<strong>de</strong>s o especies diferentes.<br />
Híbrido: organismo obtenido por la hibridación.<br />
In vitro: técnicas <strong>de</strong> reproducción artificial en condiciones <strong>de</strong> <strong>laboratorio</strong>.<br />
Meristemo: estructura localizada en diferentes zonas <strong>de</strong> la planta a partir <strong><strong>de</strong>l</strong> cual se<br />
forman todos los órganos <strong>de</strong> la misma.<br />
Manual elaborado por Jesús Agustín Badillo Corona, María <strong><strong>de</strong>l</strong> Carmen Oliver Salvador, Karen Gisela Moreno Guerrero,<br />
Verónica Pacheco González y Hernán Cortés Arroyo<br />
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Instituto Politécnico Nacional<br />
Unidad Profesional Interdisciplinaria <strong>de</strong> Biotecnología<br />
Laboratorio <strong>de</strong> Cultivo <strong>de</strong> Tejidos<br />
Organogénesis somática: proceso en el cual se forman órganos (raíces, tallos, etc.) a<br />
partir <strong><strong>de</strong>l</strong> explante.<br />
Plántulas: plantas pequeñas en proceso <strong>de</strong> <strong>de</strong>sarrollo.<br />
Manual elaborado por Jesús Agustín Badillo Corona, María <strong><strong>de</strong>l</strong> Carmen Oliver Salvador, Karen Gisela Moreno Guerrero,<br />
Verónica Pacheco González y Hernán Cortés Arroyo<br />
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