Departamento de Física Teórica, Atómica y Óptica - Quantalab ...

3.7 Medidas del contenido de clorofila.
Nuestro objetivo es la evaluación de la capacidad de la inversión de los modelos
PROSPECT y SAILH para darnos unas estimaciones correctas de parámetros biofísicos
de la vegetación. Necesitamos, por tanto, contar con medidas de estos mismos
parámetros. En esta sección se presenta el protocolo y las medidas de contenido de
clorofila de las hojas de cebada realizas en la campaña del 2002. Las medidas han sido
llevadas a cabo en colaboración con el Departamento de Producción Vegetal y
Silvopascicultura de la Escuela Técnica Superior de Ingenierías Agrarias de la
Universidad de Valladolid (Campus de Palencia).
El protocolo utilizado se ha basado en el descrito por Ramos (2000). En él, el
contenido de clorofila se determina en extracto vegetal con una disolución de acetona al
80%. La preparación de la muestra se realiza pesando 0.1 g de hoja. A continuación esta
es macerada en un mortero junto con 2 ml de acetona pura al 80% (v/v). El tejido se ha
de moler hasta que no se consiga apreciar restos de la hoja a fin de extraer de las células
la práctica totalidad de la clorofila. A continuación se agregan otros 10 ml de acetona.
Se transfiere cuidadosamente la disolución a un embudo provisto de un disco de papel
filtro y se deja filtrar durante unos minutos. En el papel filtro ha de quedar un residuo
sólido carente de clorofila. La concentración se determina a partir de la medida de
absorbancia de la disolución, la cual se obtiene mediante un espectrofotómetro. En
nuestro caso se ha utilizado el modelo UV/VIS V-530 de Jasco (1995).
Este equipo está diseñado para medir el espectro de transmitancia de
disoluciones. El rango de funcionamiento es de 190 nm a 1100 nm, empleando dos
lámparas, una de deuterio entre 190 y 350 nm y otra halógena entre 330 y 1100 nm. En
nuestro caso sólo estamos interesados en el visible, por lo que sólo se ha usado la
lámpara halógena. La luz de las lámparas ilumina la rendija de entrada de un
monocromador, que selecciona la luz en función de la longitud de onda. Éste está
diseñado siguiendo la configuración del círculo de Rowland, utilizando como medio
dispersivo una red holografía cóncava de 1200 líneas/mm. Para evitar órdenes
superiores de difracción se antepone una serie de filtros a la entrada del monocromador.
Una vez obtenida luz monocromática se divide en dos haces mediante una lámina
separadora, conduciéndolos hacia dos cubetas de cuarzo que contienen: la muestra a
medir y una referencia, habitualmente el disolvente empleado en la muestra. La luz
incide sobre dos fotodiodos de silicio. La transmitancia de la muestra se obtiene
realizando el cociente entre la señal medida después de atravesar la cubeta con la
muestra respecto de la señal medida después de atravesar la cubeta con el disolvente.
Así mismo, se puede definir la absorbancia como el logaritmo decimal de este mismo
cociente con signo negativo.
A = − ( I / I )
(3-10)
log10 0
Para la realización de nuestras medidas, la cubeta destinada a la muestra se ha
llenado con el extracto de clorofila y la de referencia con acetona al 80%. A partir de
estos valores de absorbancia obtenidos, el contenido de clorofila se calcula mediante la
ecuación (3-11) (Arnon, 1949; Bruinsma, 1963).
[ Ca b ] = 8. 02A663
− 20.
21A645
+ (3-11)
65