Replicación del DNA en Eucariotes

Eucariotas

REPLICACIÓN DEL DNA EN
EUCARIONTES
Es similar a la de los procariontes, es decir, semi-conservadora,
semi-discotinua y bidireccional.
Existe una hebra conductora y una hebra retrasada con
fragmentos de Okazaki.
Se inicia en ORI (puede haber unos 100 o más orígenes a la vez)
El proceso es mucho mejor regulado y más complejo por estar
estrictamente adecuado al ciclo celular.
Entre las diferencia, se comienza con las polimerasas, son más
complejas, y además, la polimerasa de la hebra continua es
diferente a la de la hebra discontinua. De la hebra continua se
encarga la polimerasa δ y de la discontinua, la α.
Las helicasas difieren en estructura, las primasas se encuentran
adosadas a la ADN-pol α.
El resto del proceso es muy parecido.
El RNA cebador es retirado por el complejo de reparación de la
célula.

En los eucariotas, el DNA se encuentra bloqueado por Histonas y otras proteínas nucleares
(formando cromatina) y es por lo tanto imposible que pueda ser replicado sin mecanismos
especiales de regulación. En los eucariotas, por lo tanto, para que la replicación pueda
siquiera iniciar, la cromatina debe ser primero re-estructurada.

En los eucariotas la replicación del DNA se realiza
exclusivamente durante la fase S del ciclo celular
La cromatina menos condensada (eucromatina), se replica
temprano, mientras que los genes en la cromatina
condensada (heterocromatina) se replican tarde
Secuencias bien definidas en el DNA de un eucariota sencillo,
como la levadura, funcionan como Orígenes de Replicación.
En los mamíferos las secuencias de DNA que especifican el
Origen de Replicación han sido hasta ahora difíciles de
identificar
Una vez que la nueva cadena abandona la horquilla de
replicación, el DNA se reestructura formando nuevamente
nucleosomas
Se requiere un complejo especial, la Telomerasa, para
replicar los extremos finales de los cromosomas
La longitud del telómero, es regulada por la célula y por el
organismo

Ciclo Celular

Más compleja y más lenta que en procariotas por el mayor
tamaño y complejidad del genoma
Múltiples orígenes de replicación. Cada uno representa
una unidad de replicación (replicón) bidireccional
La replicación se encuentra regulada de acuerdo con el
ciclo celular. La Síntesis de DNA está limitada a la fase S,
y coordinada con la división celular (mitosis)
- Los eucariotas poseen cinco DNA polimerasas
› – α, inicia la síntesis
› – β, función de reparación
› – γ, replicación del genoma mitocondrial
› – δ, elongación
› – ε, papel desconocido

Existen por lo menos 15 DNA polimerasas, pero las más
importantes son cinco:
Pol α (también llamada Primasa): una subunidad pequeña (Pri S)
funciona como Primasa (sintetiza el RNA cebador), la subunidad mayor,
con la actividad de polimerasa de la Pol α, alarga el cebador utilizando
desoxinucleótidos trifosfatos. Después de agregar unos 20 nucleótidos
se separa y el resto del alargamiento es realizado por la Pol ε (en la
hebra conductora) y por la Pol δ (en la hebra retrasada).
Pol β: Esta implicada en la reparación del DNA, en la supresión de
bases y en el rellenado de espacios dejados en la hebra retrasada.
Pol γ: Replica y repara el DNA mitocondrial.
Pol δ: Altamente procesiva y con actividad de exonucleasa 3'→5‘ para
corregir errores. Es la polimerasa que se encarga, probablemente, de la
replicación de la hebra retrasada.
Pol ε: Altamente procesiva y con actividad de exonucleasa 3'→5‘ para
corregir errores. Es la polimerasa que se encarga , probablemente, de
la replicación de la hebra conductora.

Identidad Incierta
• Numerosas polimerasas participan en la replicación de las hebras
conductora y retardada del DNA genómico.
• Aunque han pasado 50 años desde el descubrimiento y la descripción de
la primera DNA polimerasa en eucariotas, la identidad de las polimerasas
más importante en la síntesis de las hebras conductora y retrasada sigue
siendo incierta.
• La replicación del DNA en eucariotas requiere de la Polimerasa α para
iniciar la síntesis en el origen y para sintetizar los cebadores que inician la
replicación en los fragmentos de Okazaki en la hebra retardada,
permitiendo que las DNA polimerasas δ (pol δ) y ε (pol ε) realicen el resto
de la elongación de la cadena. Pol δ está implicada en la replicación de la
hebra retrasada.
• Aunque la identidad de la(s) polimerasa(s) que replican la hebra
conductora permanece en duda, la evidencia reciente indica que es la pol
ε la que realiza este proceso.
• Esta evidencia refuerza la certeza de que las actividades de exonucleasa
de pol δ y pol ε son las que participan en la edición de los errores
cometidos durante el apareamiento de bases en cada una de las hebras.

El Origen de la Replicación
Los orígenes de replicación son los puntos fijos, situados en la doble hélice
de DNA, a partir de los cuales se lleva cabo la replicación, que avanza de
forma secuencial formando estructuras con forma de horquilla.
La cantidad de DNA que se puede sintetizar a partir de un único origen de
replicación se denomina replicón o unidad funcional de replicación.
El genoma bacteriano es un replicón único circular.
En organismos
eucarióticos, la replicación
del DNA se inicia en
múltiples orígenes a la vez
(hay uno cada 20 kb
aproximadamente), es
decir, hay multitud de
replicones.

Orígenes de la replicación del DNA
Todos los sitios que marcan en el DNA el origen para la
replicación, requieren dos componentes centrales:
1) Uno o más sitios de fijación específicos para la proteína, o
complejo proteico (ORC), de reconocimiento del origen, que se
ha llamado Secuencia de Replicación Autónoma (RAS)
2) Una secuencia más o menos larga de DNA que pueda
desenrollarse con facilidad, llamada Elemento para Desenrollar
el DNA (DNA-unwinding element, DUE). Esta secuencia DUE no
es una secuencia específica, pero debe tener una composición
de nucleótidos que le dé una baja temperatura de fusión.
El desenrollamiento del DNA se inicia en el DUE, y una vez
producido, la síntesis de DNA puede iniciarse en cada una
de las hebras de DNA resultantes.
Componentes adicionales auxiliares para este proceso son
indispensables, e incluyen uno o más sitios para factores
de transcripción que faciliten la fijación de otras proteínas
complementarias así como la aceleración del
desenrollamiento del DNA, pero que no son indispensables
para el reconocimiento del origen.

Complejo de Pre-replicación
Un Complejo de Pre-replicación (pre-RC) es un complejo
proteico que se estructura en el punto de origen de la replicación
(Ori) durante la fase de inciación de la replicación del DNA.
En los eucariotes, el pre-RC esta compuesto de los siguientes
factores :
Un complejo de seis subunidades llamado Complejo de Reconocimiento
del Origen (ORC) que se fija a las secuencias de la doble hebra de DNA
que señalan el origen.
Dos proteínas reguladoras llamadas Cdc6 y Cdt1 que son reclutadas por
el ORC.
Las MCMs o proteínas minicromosomales de mantenimiento
(Minichromosome Maintenance proteins), un complejo proteico que tal
vez corresponde a la helicasa en eucariotes y que desplaza al Cdt1.
Todos estos factores se ensamblan en los orígenes de
reduplicación durante la fase G1 del ciclo celular.
Una vez que estas proteínas estén ensambladas y la célula pase
de la fase G1 a la fase S, las MCMs son fosforiladas y se incia
realmente la replicación.

ORC
En la levadura, se demostró inicialmente que un complejo
proteico, formado or 6 subunidades diferentes, conocido
como ORC (origin-recognition complex) se fija
selectivamente a la Secuencia de Replicación Autónoma
(ARS) en un mecanismo dependiente de ATP.
Este complejo, ORC, permanece unido al sitio de origen,
ARS, durante todo el ciclo celular, incluyendo la mitosis, y
durante la replicación se asocia con otras proteínas, un
evento que dispara la iniciación de la replicación del DNA.
Células de levadura con mutaciones en cualquiera de las
seis proteínas que forman el ORC son incapaces de
dividirse.
Todas las células eucariotas expresan homólogos de
estas proteínas, atestiguando su importancia esencial en
la iniciación de la replicación del DNA en estos
organismos.

En relación con el progreso del ciclo celular

Complejo de Iniciación en Eucariotes
a) El ORC (Complejo de
reconocimiento del origen) es el
primer elemento reclutado en el
origen de replicación.
b) El ORC recluta al Cdc6 y al Cdt1.
c) El ORC, Cdc6 y Cdt1 juntos, fijan a
los hexámeros proteicos de
mantenimiento (Mcm)2–7 en el
punto de origen, lo cual permite
que se actúe para iniciar la
replicación.
d) Los complejos competentes de
Iniciación son probablemente
formados por el ensamble,
espalda con espalda, de dos
complejos de Mcm2–7.
e) Puesto que el ORC es asimétrico,
esto debe requerir el ensamble de
un segundo complejo ORC para
cargar las Mcm2–7 en la dirección
opuesta.

MCM
MCM es una familia de seis proteínas (Mcm 2–7, pesos
moleculares de 101, 91, 97, 82, 93, y 81 kDa).
Todas las proteínas del complejo MCM son esenciales durante
el progreso de la horquilla de replicación y por lo mismo son
esenciales para la viabilidad celular en todos los eucariotas.
Además de formar normalmente el hétero hexámero, se ha
encontrado, tanto in vivo como in vitro, que las subunidades
pueden combinarse independientemente para formar varios
complejos diferentes.
Se ha confirmado que un complejo dimérico, formado por dos
hétero trímeros de las subunidades Mcm 4, 6, 7, contiene las
actividades de fijación al DNA de hebra sencilla, de ATPasa
dependiente del DNA y, sobre todo, de la DNA Helicasa
responsable de la fusión del DNA en eucariontes.
Por el contrario las subunidades Mcm 2 o el dímero Mcm 3, 5
poseen actividad inhibidora de la Helicasa.
Esto nos habla de una cuidadosa regulación del proceso.

Las diferencias de altura entre los
escalones implican la presencia de
factores de regulación. Las partes
del complejo ya agregadas se
indican con figuras más suaves
El complejo de reconocimiento ORC se fija al origen de replicación al final de la mitosis. Esto permite la fijación
posterior del Cdc18 (CDC6 en los mamíferos) y del Cdt1. Estas proteínas reclutan al complejo proteico MCM que
funcionaran como Helicasa para desenrrollar las dos hebras del DNA. Queda así formado el complejo de prereplicación
(pre-RC). Varios otros factores se fijan a este complejo.
La fosforilación (flechas) de algunos de estos factores por la Ciclina- cinasa (CDK) o por la Hsk1 (Cdc-7 cinasa 1) y
su subunidad reguladora, Dfp1, parece ser un paso previo a la fijación del Cdc45 en el complejo de origen.
La unión de la proteína Cdc45 en el origen completa la formación del complejo de pre-iniciación (pre-IC).
Una vez formado el complejo de pre-iniciación todo está listo para la unión de la Primasa y la DNA Polimerasa que
realizarán la replicación del DNA en la fase S del ciclo celular.
Al mismo tiempo el complejo Hsk1-Dfp1 fosforila la MCM y activa su función de Helicasa .

La fosforilación del complejo MCM ocurre al iniciarse la fase S
del ciclo celular y se produce por el reclutamiento de la Cdc7-
Dfb4 cinasa al complejo de origen.
La fosforilación del complejo MCM provoca un cambio de
conformación del complejo que resulta en la fusión del DNA en
el sitio de origen.
Se postula que este cambio conformacional convierte el
complejo MCM inactivo en una Helicasa activa, cuya estructura
anular se une topológicamente al DNA.
La activación y disociación del complejo MCM-Helicasa y del
Mcm10, debida a la fosforilación inducida por Cdc45, inicia la
fusión del DNA y permite el reclutamiento de la primasa, la RPA
y la DNA Polimerasa para inicar realmente la replicación del
DNA.

Durante la transición Mitosis-Fase G1, el ORC fijo al DNA recluta a CDC6 y CDT1, lo cual propicia la fijación
del complejo de la Helicasa que consiste del complejo MCM 2-7. Esto resulta en la formación del complejo
llamado de pre-replicación (Pre-RC).
El Pre-RC recluta nuevos factores, incluyendo CDC45, SLD2-3, DPB11, el complejo GINS (SLS1, y PSR1-3) y el
MCM10 para formar el complejo de pre-Iniciación (Pre-IC).
La iniciación misma requiere ahora la fosforilación de algunas de estas proteínas.

Proteína de Replicación A (RPA)
RPA (también llamada Factor de Replicación A, RFA)
corresponde, en los eucariotes, a las proteínas unidoras,
estabilizadoras, del DNA de hebra sencilla, SSB.
Es un hétero trímero proteico, cuyos componentes son
todos ellos esenciales para los eucariotes.
Este complejo proteico, RPA o SSB, es un componente
esencial en todos los sistemas de replicación, procariotes
y eucariotes.
Estas proteínas recubren el DNA de hebra sencilla por
detrás de la Helicasa, protegiéndolo del ataque por
exonucleasas e impidiendo que vuelva a formar hebras
dobles entre las bases componentes.
La RPA estimula la actividad de la DNA Polimerasa
creando un sustrato uniforme para su actividad y parece
desempeñar un papel importante en la coordinación de la
síntesis de DNA en la hebra retardada.

El complejo de reconocimiento del origen (ORC) recluta a la Cdc6, al complejo llamado
de mantenimiento de minicromosomas (Mcm) y al factor Cdt1, para formar el Complejo
de Pre-Replicación (pre-RC). El factor Cdc28, asociado a las ciclinas Clb5 y Clb6, que se
sintetizan en la fase S del ciclo celular, promueve la fijación de la cinasa Cdc45 (no
ilustrada), la cual es esencial para la iniciación de la replicación, y de la Proteína de
Replicación A (RPA), tampoco ilustrada en el diagrama. Clb5–Cdc28 y Clb6–Cdc28
fosforilan la proteína de replicación Sld2, lo cual permite el reclutamiento, dependiente
de la acción del factor Dpb11, de la Polimerasa al origen de iniciación. La subunidad
Dpb2 de la Polimerasa es también fosforilada por la acción del complejo ciclina/Cdk.
Pol2 es la subunidad catalítica de la Polimerasa, que también comprende las
subunidades Dpb2–4.

DNA Primasa
Las DNA polimerasas en eucariotes también requieren de
cortos segmentos de RNA que actúen como cebadores.
En eucariotes, la DNA Primasa es parte de un complejo
tetraunitario (pesos moleculares 180, 68, 58 y 48 kDa), el
complejo Pol α/Primasa. Dos de estas subunidades, p48 y
p58, son requeridas para la actividad de Primasa, siendo
P48 la subunidad catalítica.
La Primasa sintetiza segmentos cortos de RNA (8–12
nucleótido) que son alargados por la Pol α hasta unos 30
nucleótidos, formando fragmentos pre-Okazaki.
Estos híbridos de RNA-DNA son reconocidos por el
complejo accesorio de la polimerasa (RFC) para iniciar la
síntesis procesiva de DNA por la polimerasa replicativa
(Pol δ o Pol ε).
En la hebra retrasada, la actividad de la Pol α/Primasa es
requerida para la iniciación de la síntesis de cada uno de
los fragmentos de Okazaki.

Inicio de la Replicación del DNA en eucariotes
Unión de la Primasa y síntesis del RNA
cebador. Después se une la DNA Pol α y
sintetiza un corto segmento de DNA,
llamado DNA iniciador (iDNA)
El factor de Replicación (RFC) se asocia al
DNA y ayuda a la DNA Polimerasa, δ o ε, a
fijarse adecuadamente a la hebra molde de
DNA
Se posiciona la DNA polimerasa adecuada
(Pol δ para la síntesis de la hebra retrasada,
y posiblemente Pol ε para la síntesis de la
hebra conductora) y después se carga la
abrazadera deslizante que asegurara su
procesividad
Se inicia el alargamiento de la nueva
cadena de DNA, catalizada por la
Polimerasa δ (en el caso de la hebra
retrasada)

Antígeno Nuclear de Proliferación
Celular (PCNA)
PCNA, la abrazadera deslizante en eucariotes, es un homotrímero
proteico de forma anular de 29 kDa.
Después de su ensamblaje, por la actividad de la RFC, alrededor
del cebador, tanto en la hebra conductora como en la retrasada,
PCNA se asocia con las polimerasas δ ó ε para iniciar la síntesis
procesiva del DNA.
Estudios in vitro han demostrado que una vez ensamblada
alrededor de la cadena de DNA, PCNA puede deslizarse
libremente en cualquier dirección.
Aunque PCNA no posee actividad enzimática, además de su papel
en el aumento de la procesividad de ambas polimerasas actúa
como un factor regulador importante en la replicación.
Varias proteínas que inhiben la síntesis de DNA, operan por medio
de su interacción con el PCNA impidiendo su asociación con las
polimerasas.
Al terminan la síntesis de cada fragmento de Okazaki, PCNA se
desenlaza de la polimerasa y permanece rodeando a la doble
cadena de DNA.

FACTOR de REPLICATION C (RFC)
El RFC representa en los eucariotes, el complejo proteico
encargado de estructurar la abrazadera (PCNA) alrededor
del DNA. Es un hétero pentámero, cuyas cinco
subunidades son indispensables para realizar su actividad.
El RFC reconoce el extremo 3’ del pre-fragmento de
Okazaki y, mediante la hidrólisis del ATP, ensmabla el
PCNA alrededor de la doble cadena de DNA
Se ha demostrado que el RFC, junto con el RPA, ejerce un
papel cono disparador en el proceso que elimina del DNA el
complejo Pol α/Primase, permitiendo así el ensamblaje del
PCNA.
Además de su papel como ensamblador de la abrazadera,
se ha demostrado que el RFC también debe actuar como
su desensamblador, es decir en la descarga del PCNA de
su posición alrededor del DNA.

Síntesis de la Hebra Conductora
La hebra conductora es sintetizada continuamente
Se inicia con un solo cebador de RNA (primer) que es sintetizado,
según la especie, por una RNA polimerasa o por la Primasa.
Una vez que la Helicasa y la Polimerasa son cargadas sobre el
molde de DNA, teóricamente, pueden permanecer unidas a éste
hasta terminar la síntesis completa del cromosoma.
La subunidad τ del cargador de la Abrazadera conecta la
holoenzima de la Polimerasa con la Helicasa.
La velocidad de síntesis de la Polimerasa, cuando se encuentra
fija en la horquilla de replicación junto con la Helicasa, es mucho
mayor que cuando ambas enzimas trabajan de manera aislada.
Aunque la síntesis de la hebra conductora es extremadamente
procesiva, la evidencia reciente indica que, en bacterias, la
horquilla de replicación se detiene antes de la síntesis completa
del cromosoma y debe ser re-ensamblada.

La Primasa sintetiza segmentos cortos de RNA
(8–12 nucleótido) que son alargados por la Pol α
hasta unos 30 nucleótidos, formando fragmentos
pre-Okazaki.
El RFC representa en los
eucariotes, el complejo proteico
encargado de estructurar la
abrazadera (PCNA) alrededor
del DNA.
Pol α
primasa
RFA (Replicator Factor A) es homólogo
a las SSB, proteínas de unión al DNA de
hebra simple
Mcm 4,6,7 hétero trímero, parte del
complejo MCM, contiene la actividad
de DNA Helicasa, y la actividad de
ATPasa dependiente de DNA.
Pol δ o Pol ε

Síntesis de la Hebra Retrasada
Puesto que la hebra retrasada es construida por la unión
de varios segmentos cortos, existe un ciclo de reacciones
necesarias para iniciar, alargar y reunir cada uno de los
fragmentos recién sintetizados con el resto de la cadena.
Puesto que la hebra retrasada y la hebra conductora son
sintetizadas por la misma estructura retenida sobre el
DNA molde por las abrazaderas, este ciclo de reacciones
debe estar muy bien coordinada, no solamente entre ellas
mismas, sino con las reacciones de síntesis de la hebra
conductora.
El ciclo de reacciones que son necesarias para la síntesis
de la hebra retrasada se completan en tiempos muy
breves, pocos segundos, a causa de que cada fragmento
esta formado por 1000–3000 bases, y la replicación se
realiza a 400–1000 bases/segundo.

La síntesis de cada fragmento de Okazaki termina cuando la DNA pol se encuentra con el
cebador de RNA unido al extremo 5’ del fragmento anterior de DNA

Eliminación del Cebador
Elongación del fragmento para rellenar con DNA el hueco
Unión de los extremos resultantes para dar una hebra continua

Polimerasa δ – Polimerasa ε
Tanto Pol δ como Pol ε son polimerasas indispensables para la
replicación del DNA en eucariotes.
Sin embargo, su función específica en la horquilla de
replicación se desconoce con precisión hasta este momento.
Tanto Pol δ como Pol ε requieren del PCNA (abrazadera o
clamp) para catalizar la síntesis procesiva del DNA en
presencia de concentraciones salinas fisiológicas.
Sin embargo a concentraciones iónicas bajas, solo la Pol ε
puede actuar alargando las cadenas de DNA después de
construído el cebador
Experimentos tanto in vivo como in vitro indican que en el
sistema de replicación libre de células del Xenopus, ambas
polimerasas, δ y ε, son indispensables para efectuar la
replicación
Estudios de la frecuencia de mutaciones en S. cerevisiae
sugieren que la actividad correctora de cada una de las
enzimas actúa en hebras de DNA diferentes
Obviamente se requieren estudios mas pormenorizados para
determinar las funciones de cada una de estas polimerasas.

Topoisomerasas
Todas nuestras células poseen dos tipos de
topoisomerasas capaces de relajar la tensión helicoidal
del ADN.
Curiosamente, sus mecanismos de acción son muy
distintos:
la topoisomerasa 1, corta sólo una de las dos hebras del ADN.
La hebra intacta actúa entonces como pivote y el ADN rota
axialmente. Su actividad no depende de ATP.
la topoisomerasa 2, corta simultáneamente las dos hebras del
ADN y permite cruzar -a través de dicho corte- a otra doble
hélice de ADN. Este efecto de la Topoisomerasa 2 requiere la
inversión de energía producida por la hidrólisis del ATP. Con
este mecanismo, las hebras de ADN se comportan como
"cadenas fantasma", ya que un segmento de ADN puede
"atravesar" a otro como si no estuviera gracias a una "puerta"
temporal abierta por la topoisomerasa 2. La topoisomerasa 2
hace desaparecer de este modo -uno a uno- todos los nudos y
entrecruzamientos del ADN generados por la tensión helicoidal.

DNA Girasa
La DNA girasa es una de las topoisomerasas de
DNA que actúa durante la replicación del ADN para
reducir la tensión molecular causada por el
superenrollamiento. La DNA girasa produce cortes
de doble cadena y después los une.
La DNA girasa, como topoisomerasa, tiene una
función muy importante en la modulación del estado
topológico del DNA, pues regula su estructura
superhelicoidal.
A diferencia de la DNA girasa, la topoisomerasa 1
corta solo una de las dos cadenas de la doble hélice
del DNA; y actúa en la transcripción del DNA.
Mientras, la DNA girasa (o topoisomerasa 2) corta
ambas cadenas del DNA para aliviar el
superenrrollamiento, y actúa durante la replicación
del DNA.

Las moléculas ADN doble hélice lineal tienen problemas para replicar sus
extremos, ya que las ADN polimerasas necesitan un extremo 3' OH al que ir
añadiendo nucleótidos.
Uno de los extremos de cada hélice (el extremo 5') se puede copiar sin
problemas debido a que viene cebado desde atrás, sin embargo, el extremo
contrario (extremo 3') no podría replicarse ya que no puede ser cebado desde
atrás.
Como consecuencia quedaría un corto segmento al final sin copiarse y se iría
acortando el ADN por ese extremo en cada ronda de replicación.
Problemas de replicación de los
extremos

Telómeros
En un cromosoma existen dos tipos de DNA : el DNA
codificante, que constituye los genes, es decir, porciones
del cromosoma donde se encuentra la información que
codifica las proteínas y los ácidos ribonucleicos que
desempeñan funciones dentro de la célula, disperso entre
una gran cantidad de DNA no codificante.
Entre el DNA no codificante se encuentran el que forma
los telómeros de los cromosomas.
Los telómeros juegan un importante papel en la vida de
las células ya que mantienen la integridad de las
terminaciones de los cromosomas impidiendo que se
enmarañen y adhieran unos con otros, ayudan a que los
cromosomas homólogos se emparejen y entrecrucen
durante la profase de la meiosis.
Los telómeros humanos y murinos contienen hasta 2.000
veces repetida la secuencia 5' TTAGGG 3'

Telómeros
A diferencia de los organismos procariotas que tienen un genoma
circular, los organismos eucariotas poseen cromosomas lineales en
los cuales se presenta el problema de su acortamiento durante la
replicación debido a que al eliminar el cebador de los fragmentos de
Okazaki del extremo 5' de la cadena retardada del telómero del nuevo
cromosoma lineal se produce un hueco que no puede ser rellenado
por acción de la DNA polimerasa, puesto que solo funcionan en
dirección 5' - 3' y necesitan un extremo 3'–OH, y en el final del
cromosoma no hay espacio para regenerar el RNA cebador necesario
para donar el extremo 3'–OH y completar la síntesis del último
fragmento de Okazaki.
De esta manera, en las células somáticas ya maduras se acortan los
telómeros a razón de 100 a 150 nucleótidos en cada proceso
replicativo.
La telomerasa (TERT) es una transcriptasa reversa que sintetiza DNA
a partir de un molde de RNA. Se trata de una ribonucleoproteina que,
en el ser humano, contiene en su molécula la secuencia AAUUCCC
capaz de crear e insertar los fragmentos TTAAGGG que se pierden en
cada division.

Telómeros y Telomerasa
Los extremos de los cromosomas lineales no pueden ser
replicados por ninguno de los mecanismos vistos hasta ahora.
Ello es debido a que el RNA cebador situado en el extremo 5'
de la hebra retrasada, cuando ya ha sido completada su
síntesis, no puede ser reemplazado por DNA, ya que no existe
el mecanismo necesario para ello.
Para replicar las secuencias de DNA de los extremos de los
cromosomas eucarióticos, es decir, los telómeros, se requiere
un procedimiento diferente
El DNA telomérico posee una secuencia poco corriente, que
consta de hasta mil o más repeticiones en tándem de una
sencilla secuencia rica en G, dependiente de especie, situada
en la hebra del extremo 3', al final del cromosoma.
Así, por ejemplo, el protozoo ciliado Tetrahymena, tiene la
secuencia telomérica repetida TTGGGG, mientras que en el
hombre, y en general en los vertebrados, es TTAGGG.

Las moléculas ADN doble hélice lineal tienen problemas para replicar sus
extremos, ya que las ADN polimerasas necesitan un extremo 3' OH al que ir
añadiendo nucleótidos.
Uno de los extremos de cada hélice (el extremo 5') se puede copiar sin
problemas debido a que viene cebado desde atrás, sin embargo, el extremo
contrario (extremo 3') no podría replicarse ya que no puede ser cebado desde
atrás.
Como consecuencia quedaría un corto segmento al final sin copiarse y se iría
acortando el ADN por ese extremo en cada ronda de replicación.
Problemas de replicación de los
extremos

Telomerasa
El DNA telomérico se sintetiza a través de un mecanismo único.
La enzima que sintetiza la hebra rica en G del DNA telomérico se
llama telomerasa.
La telomerasa de Tetrahymena, por ejemplo, añade repeticiones en
tándem de la secuencia telomérica TTGGGG al extremo 3' de
cualquier oligonucleótido telomérico rico en G, independientemente
de cualquier molde exógeno añadido.
Ello se dedujo a partir del descubrimiento de que las telomerasas
son ribonucleoproteínas, cuyos RNAs componentes contienen un
segmento que es complementario de la secuencia telomérica
repetida.
Al parecer, esta secuencia actúa como molde en una reacción del
tipo transcriptasa inversa que sintetiza la secuencia telomérica
Una vez terminada la síntesis de una secuencia, la Telomerasa se
transloca hacia el nuevo extremo 3' del DNA y repite el proceso,
tantas veces como sea necesario.

Telomerasa
La telomerasa es una enzima que se encarga de la adición de
desoxirribonucleótidos a los extremos de los telómeros, pero dicha
adición está dirigida por una secuencia de ribonucleótidos o RNA,
por lo que podemos decir que se trata de una transcriptasa
inversa de características especiales. Hablamos de una
ribonucleoproteína que siempre sintetiza la misma secuencia de
DNA.
La telomerasa está formada por dos componentes:
Componente ribonucleotídico: se trata de la porción de RNA de la
telomerasa (también llamado TR o TERC, de telomerase RNA component)
que se encuentra totalmente integrado en la enzima. Según las especies,
éste puede ser de entre 146 a 1544 nucleótidos de longitud. La secuencia
molde del telómero suele tener una longitud de entre 9 y 28 nucleótidos y es
características de cada especie.
Componente proteico: es la parte de la enzima que contiene la capacidad
transcriptasa inversa (TRT o TERT de telomerase reverse transcriptase);
invierte el curso normal (DNA hacia RNA) y va del RNA al DNA. La
transcriptasa inversa de virus y todas las DNA polimerasas necesitan un
cebador para sintetizar DNA, sin embargo, la telomerasa no necesita dicho
cebador.

Síntesis de telómeros por la telomerasa.
a) La telomerasa se une al telómero;
b) La telomerasa alarga los extremos de la
cadena 3’;
c) La telomerasa se transloca;
d) La DNA polimerasa sintetiza la cadena
retrasada.
e) Se estima que cada telómero humano
pierde unas 100 pares de bases de DNA
telomérico en cada replicación. Esto
representa unos 16 fragmentos
TTAAGGG.

Telómeros
Los telómeros son cruciales en la vida de la célula. Ellos son
necesarios para la duplicación completa del cromosoma, los protegen
de las nucleasas, evitan que los extremos del cromosoma se fusionen
entre sí y facilitan la interacción del cromosoma con la envoltura nuclear.
Los telómeros de las células humanas contienen la secuencia
5'TTAGGG3’, que se repite aproximadamente 2000 veces.
5 '... ..TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG..... 3 '
3 '... ..AATCCC AATCCC AATCCC AATCCC A..... 5 '
La cadena rica en guanosina corre en dirección 5' a 3', extendiéndose
12 a 15 nucleótidos más allá de la cadena rica en citosina, formando un
apéndice en una de las cadena en cada extremo del cromosoma.
Este desnivel se mantiene de generación en generación por medio de
una enzima especial, la telomerasa, que agrega nuevas unidades al
extremo 3' de la cadena rica en guanosina.
La telomerasa es una ribonucleoproteína con actividad de transcriptasa
inversa, la cual provee un molde de AAUCCC que guía la inserción de la
secuencia TTAGGG en tantas repeticiones como sea necesario.
Las células con telomerasa activa pueden compensar el acortamiento
de los telómeros durante la duplicación del ADN.

* La secuencia de la molécula molde de RNA puede variar en las diferentes especies
*
La telomerasa muestra un
patrón de expresión particular y
sólo se encuentra activa, en las
células madre embrionarias, en
las células madre del adulto ,
células germinales y células
tumorales. Mientras que en las
células somáticas que son las
que constituyen la mayor parte
de los tejidos diferenciados se
encuentra inactiva.
El gene de la telomerasa no se expresa en las células somáticas y cada vez que la célula se divide -
debido al mecanismo de replicación del DNA - los telómeros se acortan. Así, con cada división mitótica
los telómeros resultan cada vez más cortos, se ha postulado que este acortamiento del telómero afecta
la estabilidad de los cromosomas impidiendo que las células puedan dividirse en forma indefinida.
Cuando la célula ya no puede dividirse más debido a sus telómeros acortados, muere.
Algunos investigadores opinan que este límite al número de divisiones celulares que una célula puede
realizar es una forma de protección contra el cáncer.