“Análisis de la Reacción de la Polimerasa en Cadena para la ...

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA DE KINESIOLOGÍA
“Análisis de la Reacción de la Polimerasa en Cadena
para la detección de Mycoplasma pneumoniae en adultos
mayores con neumonía adquirida en la comunidad”
Yenifer Elizabeth Pino Pino.
Tania Verónica Salazar Berríos.
2004

“Análisis de la Reacción de la Polimerasa en Cadena para la detección de Mycoplasma
Pneumoniae en Adultos Mayores con Neumonía Adquirida en la Comunidad”
Tesis
Entregada a la
UNIVERSIDAD DE CHILE
En cumplimiento parcial de los requisitos
para optar al grado de
LICENCIADO EN KINESIOLOGÍA
FACULTAD DE MEDICINA
por
Yenifer Elizabeth Pino Pino
Tania Verónica Salazar Berríos
2004
DIRECTOR DE TESIS: Profesor Asociado Dra. María Angélica Martínez Tagle
PATROCINANTE DE TESIS: Profesora Sylvia Ortiz Zúñiga.

FACULTAD DE MEDICINA
UNIVERSIDAD DE CHILE
INFORME DE APROBACION
TESIS DE LICENCIATURA
Se informa a la Escuela de Kinesiología de la Facultad de Medicina que la Tesis de
Licenciatura presentada por el candidato:
Yenifer Elizabeth Pino Pino
Tania Verónica Salazar Berríos
Ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito de Tesis para optar
al grado de Licenciado en Kinesiología, en el examen de defensa de Tesis rendido el:
........................................................................................................................................
DIRECTOR DE TESIS:
Profesor Asociado Dra. María Angélica Martínez .............................................................
COMISION INFORMANTE DE TESIS.
NOMBRE FIRMA
...................................................................................................................................................
...................................................................................................................................................
...................................................................................................................................................
...................................................................................................................................................

A mi madre y a mi tío Waldo, por su apoyo incondicional y por darme siempre la
fortaleza para seguir adelante pase lo que pase.
Yenifer
A mis padres, que me han apoyado en todo lo que he querido lograr. En especial a mi
madre, que con su entereza siempre me ha ayudado a salir adelante.
Tania

Agradecemos a la Dra. María Angélica Martínez por permitirnos participar
en la investigación “Estudio clínico y microbiológico de las neumonías
adquiridas en la comunidad en el adulto mayor”, lo cual nos permitió
conocer otros aspectos relacionados con el área de la salud.
También damos las gracias a la Enfermera María Angélica Espinoza, del
Servicio de Enfermedades Respiratorias del Hospital José Joaquín Aguirre y
a todos aquellos que con su opinión aportaron a sacar adelante esta Tesis.

INDICE
Resumen............................................................................................................................i
Abstract ...........................................................................................................................ii
Abreviaturas...................................................................................................................iii
Introducción.................................................................................................................... 1
Importancia del Problema............................................................................1
Pregunta de Investigación.............................................................................4
Marco Teórico.................................................................................................................5
Revisión Bibliográfica...................................................................................5
• Biología de los Mycoplasmas......................................................5
Taxonomía y hábitat
Estructura y fisiología
• Mycoplasma pneumoniae.............................................................7
Epidemiología
Mecanismos de patogenicidad
Manifestaciones clínicas
Tratamiento
• Diagnóstico de infecciones por M. pneumoniae.......................12
Estudio radiológico
Diagnóstico de laboratorio

Objetivos.......................................................................................................17
• Generales
• Específicos
Hipótesis.......................................................................................................17
Materiales y Métodos....................................................................................................18
Población......................................................................................................18
Muestra.........................................................................................................18
Tipo de Estudio............................................................................................18
Procedimientos.............................................................................................19
Variables.......................................................................................................23
Análisis Estadístico......................................................................................24
Resultados......................................................................................................................25
• Análisis de la Reacción de la Polimerasa en Cadena..............25
• Análisis Microbiológico.............................................................29
Discusión........................................................................................................................34
Conclusiones..................................................................................................................37
Proyecciones...................................................................................................................38
Bibliografía....................................................................................................................39
Anexos............................................................................................................................44

LISTA DE TABLAS
Tabla I: Sensibilidad analítica encontrada por diversos autores.........................................25
Tabla II: Especificidad analítica de la PCR con partidores para el gen de la adhesina P1 y
gen del rRNA de 16S de M. pneumoniae..............................................................................27
Tabla III: Características microbiológicas de los diagnósticos de laboratorio de M.
pneumoniae, en pacientes con NAC atendidos en el Hospital Clínico de la Universidad de
Chile en el periodo comprendido entre Septiembre de 2002 y Agosto de 2004 ..................30
Tabla IV: Muestras positivas detectadas por cada una de las técnicas................................32
Tabla V: Comparación de la IFI con PCR en pacientes con diagnóstico de
neumonía...............................................................................................................................47

RESUMEN
A Mycoplasma pneumoniae se le atribuye entre un 15 a 20% de las neumonías adquiridas
en la comunidad en los adultos mayores. Este estudio, el primero realizado en Chile para
adultos mayores, se hizo para conocer la frecuencia, mediante la técnica de Reacción de la
Polimerasa en Cadena, de Mycoplasma pneumoniae en este grupo etario y para probar la
sensibilidad y especificidad analítica de ésta usando los partidores para el gen de la
adhesina P1 y el gen del rRNA de 16S en el diagnóstico de dicho microorganismo, datos
que no han sido estandarizados, como sí lo son las pruebas diagnósticas de Serología. Sin
embargo, las pruebas de Serología no cuentan con una sensibilidad lo suficientemente
buena, por lo que es necesario aplicar técnicas más sensibles y rápidas para la detección de
Mycoplasma pneumoniae como lo es la Reacción de la Polimerasa en Cadena. Para llevar a
cabo el estudio se tomaron muestras de expectoración y de sangre a 84 adultos mayores con
neumonía adquirida en la comunidad, pertenecientes al Hospital Clínico de la Universidad
de Chile, entre Agosto de 2002 a Septiembre de 2004, a los cuales se les realizó la técnica
de Reacción de la Polimerasa en Cadena para ambos genes y la técnica de Serología
Inmunofluorescencia Indirecta para IgM e IgG. A partir de los datos obtenidos se determinó
que el porcentaje de Mycoplasma pneumoniae presente en los pacientes con neumonía fue
de 8.3%, cifra inferior a la citada por la literatura y a la obtenida mediante la
complementación de las técnicas de Reacción de la Polimerasa en Cadena y serología.
Entre ambos partidores no existen diferencias significativas en cuanto a su sensibilidad y
especificidad analítica. No obstante, se requiere de más estudios que verifiquen la calidad
de estas técnicas para que lleguen a estandarizarse y constituir así técnicas de diagnóstico
rápido de Mycoplasma pneumoniae, lo cual contribuiría importantemente a la clínica.
i

ABSTRACT
15 to 20% of the pneumonias acquired by the elderly community are attributed to
Mycoplasma pneumoniae. This study, the first ever made in Chile on the elderly, was
developed to know the frequency of Mycoplasma pneumoniae in this group using the
polymerase chain reaction, and test the sensitivity and its analytic specificity using starters
to the adhesine P1 gene and 16S rRNA gene in the diagnosis of such microorganism, the
data has not been standarized, unlike the serologic diagnostic tests. However, the serologic
tests do not have a sufficient sensitivity, which makes necessary to apply methods with
better sensitivity and that require less time to detect Mycoplasma pneumoniae, like the
polymerase chain reaction. In order to perform the study, we collected expectoration and
blood samples from 84 elderly patients with pneumonia acquired in the community, who
were treated at Hospital Clínico de la Universidad de Chile, during August 2002 to
September 2004, and polymerase chain reaction was performed for both genes and the
serologic method of indirect inmunoflourescence for IgM and IgG. The data revealed that
the percentage of Mycoplasma pneumoniae presents in patients with pneumonia with
Polymerase Chain Reaction was an 8.3%, which is lower than that shown by literature y
also lower to the figure obtained when combining both methods. There are no significative
differences between the two starters when it comes to sensitivity and analytic specificity.
However, we require more studies to verify the quality of these methods so they can be
standarized and that way they can constitute quick diagnostic techniques for Mycoplasma
pneumoniae, which would be a great contribution to clinical practice.
ii

ºC: Grados Celsius
cc: Centímetros Cúbicos
dNTP: Desoxirribonucleótido Trifosfato
DNA: Ácido Desoxirribonucleico
EIA: Enzimoinmunoensayo
FC: Fijación de Complemento
g: Gramos
IFI: Inmunofluorescencia Indirecta
IgG: Inmunoglobulina G
IgM :Inmunoglobulina M
IRA: Infecciones Respiratorias Agudas
kpb: Kilopares de bases
MDa: Megadalton
min: minutos
NAC: Neumonía Adquirida en la Comunidad
pb: Pares de bases
PBS: Solución Buffer Fosfato
PCR: Reacción de la Polimerasa en Cadena
pg: Picogramos.
RNA: Ácido Ribonucleico
rRNA: Ácido Ribonucleico Ribosomal
sem: Semanas
ABREVIATURAS
iii

Taq: Thermus aquaticus
µl: Microlitros
µM: Micromolar
µm: Micrómetros
U: Unidad Enzimática
UV: Ultravioleta
V: Volt
iv

Importancia del Problema
INTRODUCCION
Mycoplasma pneumoniae constituye uno de los patógenos respiratorios de mayor
frecuencia en el mundo. Es causa de infecciones respiratorias agudas altas y bajas, siendo
la neumonía una de las manifestaciones clínicas más frecuentes. Aunque M. pneumoniae
causa infecciones respiratorias en personas de todas las edades, se considera que los niños y
los adultos jóvenes son los grupos más frecuentemente afectados. Sin embargo, existe
escasa información epidemiológica en el adulto mayor. El diagnóstico de laboratorio
oportuno de M. pneumoniae es útil para confirmar el diagnóstico clínico, lo que puede
tener utilidad terapéutica, disminuyendo el empleo de antimicrobianos inapropiados y
también el impacto epidemiológico, al permitir conocer mejor la prevalencia de las
neumonías atípicas (Lieberman, 1997). No obstante, el diagnóstico de M. pneumoniae por
las técnicas clásicas de diagnóstico como cultivo y fijación del complemento tiene escaso
rendimiento, lo que ha dificultado su aplicación en la clínica y el conocimiento del
verdadero impacto que tiene como causa de neumonía y otras IRA. Es así como el
aislamiento de este agente infeccioso a través de cultivo, aunque es 100% específico, tiene
alrededor de 60% de sensibilidad y requiere de varias semanas para obtener resultados,
por lo que no es útil en la clínica (Kenny y Kaiser, 1990).
La reacción de fijación de complemento tiene baja sensibilidad y requiere muestras
pareadas de suero para demostrar seroconversión. Su especificidad es limitada, ya que
emplea como antígeno a una mezcla de glicolípidos de membrana, que conduce a la
producción de reacciones falso-positivas (Joklik y cols, 1997).
1

También se ha tratado de diagnosticar M. pneumoniae a través de la búsqueda de
anticuerpos específicos con técnicas de “ELISA” o “Inmunofluorescencia Indirecta”, las
que permiten la detección de IgM e IgG separadamente. Esto ha permitido el diagnóstico
rápido y eficiente de neumonía en niños, mediante la detección de IgM. No obstante, la
producción de IgM va disminuyendo con la edad, debido principalmente a las
reinfecciones, lo que obliga a tomar muestras pareadas de suero (Sillis, 1990; Jacobs,
1993; Dorigo-Zetsma, 2001). También se ha señalado que la capacidad de la respuesta
inmune humoral es menor en adultos mayores, lo que limita la utilidad de la serología
(Dorigo-Zetsma y cols, 2001).
Por las limitaciones que tienen estas técnicas, es preciso dilucidar procedimientos
de diagnóstico más sensibles y rápidos para el diagnóstico de M. pneumoniae. La Reacción
de la Polimerasa en Cadena, técnica basada en la amplificación de los ácidos nucleicos,
permite contar con una aproximación diferente para identificar secuencias de DNA de
agentes infecciosos. Se caracteriza por poseer una gran sensibilidad y especificidad con
relación a las otras técnicas antes mencionadas, proporcionando resultados en sólo horas,
por lo que tiene un gran potencial de aplicación para el diagnóstico de microorganismos,
que como M. pneumoniae, crecen lentamente en medios de cultivo.
Existen varios blancos para la amplificación del DNA de M. pneumoniae, como los
genes del rRNA de 16S y el gen de la adhesina P1. Ambos han sido utilizados para el
diagnóstico de este microorganismo, demostrando tener mayor sensibilidad que el
aislamiento en cultivo (Tjhie y cols, 1994; Ieven y cols, 1996; Abele-Horn y cols, 1998). Al
comparar ambos partidores, Williamson e Ieven y cols, encontraron resultados discrepantes
en cuanto a la sensibilidad, el primero afirma haber encontrado mayor número de muestras
2

positivas con los partidores para el gen del rRNA de 16S, mientras que el segundo encontró
que los partidores para el gen de la adhesina P1 son más sensibles.
Debido a las diferencias encontradas en estos estudios es que nos interesa dilucidar
cual de los dos blancos presenta mayor precisión en el diagnóstico de dicho
microorganismo.
3

Pregunta de Investigación
¿Cuál es el porcentaje de detección de Mycoplasma pneumoniae en adultos mayores
con neumonía adquirida en la comunidad?
¿Existen diferencias entre la técnica de la Reacción de la Polimerasa en Cadena que
utiliza como blanco el gen del rRNA de 16S y la que usa al gen P1, en cuanto a
sensibilidad analítica y especificidad para el diagnóstico de Mycoplasma pneumoniae en
muestras respiratorias de adultos mayores con neumonía adquirida en la comunidad?
4

Revisión Bibliográfica
• Biología de los Mycoplasmas
Taxonomía y hábitat:
MARCO TEORICO
Los mycoplasmas son uno de los microorganismos procariotas más pequeños capaces de
crecer y multiplicarse en forma libre. La propiedad singular que los diferencia de las
bacterias clásicas es la ausencia de pared celular. Pertenecen a la clase Mollicutes (Mollis:
blando; Kutis: piel), y en lo que a Mycoplasma pneumoniae respecta, éste pertenece a la
familia Mycoplasmataceae y al orden Mycoplasmatales (Pinto, 1986). El genoma de los
miembros de la familia Mycoplasmataceae consiste en una molécula circular de DNA de
doble cadena, de 500 MDa (alrededor de 750 kpb) distinguiéndose del genoma de otras
bacterias por su bajo contenido de guanina y citosina (Joklik y cols.,1997).
Los mycoplasmas son microorganismos ubicuos que existen como parásitos en
muchas especies animales y vegetales. Son patógenos oportunistas que causan una amplia
variedad de enfermedades infecciosas. En el hombre, M. pneumoniae es el representante
más importante, siendo la causa de alrededor del 15-20% de las NAC (Foy, 1993). Fue
identificado por primera vez en el año 1962 como agente etiológico de “neumonía primaria
atípica” en humanos (Pinto, 1986).
Estructura y fisiología:
Los mycoplasmas son células pleomórficas rodeadas por una membrana celular que
contiene colesterol. Su tamaño oscila entre 0,2 y 0,8 µm de diámetro. La replicación es
básicamente por fisión binaria, pero la replicación del genoma no necesariamente está
sincronizada con la división celular, lo que origina la formación de formas filamentosas.
5

La forma de la célula depende de la especie de mycoplasma, de la calidad nutricional, de la
presión osmótica del medio de crecimiento y de la fase de crecimiento del cultivo, pero en
general destacan las formas cocoides ó las formas filamentosas. Varias especies de
mycoplasma, entre las cuales destaca M. pneumoniae, poseen una estructura terminal con
un centro electrodenso denominada “tip” que les permite adherirse y colonizar las mucosas
respiratorias del hospedero.
Este organelo de adherencia participa también en la movilidad por “gliding” ó
deslizamiento y en la división celular. Varias adhesinas de naturaleza proteica: HMW 1-3,
P30, P40, P65 y P90, han sido localizadas en este organelo junto a la proteína principal, P1
(Seto y Miyata,, 2003).
Los mycoplasmas son uno de los grupos bacterianos de mayores requerimientos
nutritivos. Su crecimiento en estrecho contacto con la célula hospedera ha contribuido
probablemente a su dependencia por una amplia gama de nutrientes. Ellos carecen de las
vías enzimáticas que sintetizan purinas y pirimidinas y requieren además colesterol para la
síntesis de la membrana. Por consiguiente, para el aislamiento in vitro se requieren medios
de cultivo complejos como el caldo con infusión de corazón de buey suplementado con
suero de caballo y extracto de levadura.
El cultivo de M. pneumoniae es lento, requiriendo 3 – 6 semanas para dar origen a
colonias visibles al microscopio, lo cual se debe a que el tiempo de generación del
microorganismo, 1 a 6 horas, es más largo que el de las bacterias clásicas (Joklik y cols.,
1997).
M. pneumoniae se adsorbe a los eritrocitos de varias especies y los aglutina, lo que
permite identificar rápidamente las colonias que forma en agar.
6

• Mycoplasma pneumoniae
Epidemiología:
Las infecciones producidas por M. pneumoniae tienen distribución universal. Las
infecciones se presentan durante todo el año, con una mayor incidencia a fines del verano
y durante el otoño. Con intervalos de 4 a 6 años se presentan períodos epidémicos en los
cuales la incidencia suele elevarse hasta 5 veces sobre los niveles endémicos (Pinto, 1986).
No obstante, la diseminación habitualmente es lenta y las verdaderas epidemias son raras
excepto en poblaciones confinadas de personas, grupos en que M. pneumoniae es el
responsable de la mitad de las neumonías. La transmisión se produce por vía aérea, a través
de gotitas de aerosol.
M. pneumoniae ha sido detectado como causa de las NAC en los adultos en un 9-
29%. Existe escasa información epidemiológica en el adulto mayor ya que tradicionalmente
ha sido considerado un patógeno respiratorio frecuente en niños y adultos menores de 40
años; siendo un grupo rara vez afectado los menores de 6 meses, postulándose la existencia
de anticuerpos maternos (Pinto, 1986).
Lieberman y cols. investigaron mediante serología la etiología bacteriana y viral de
la NAC en 346 adultos en Israel. M. pneumoniae fue detectado globalmente en 38.2% de
los casos, con valores de prevalencia de 14.8% y 13.0% en adultos entre 55-64 años y entre
65-74 años, respectivamente. A su vez, Dorigo-Zetsma y cols. diagnosticaron a M.
pneumoniae mediante PCR o serología, en 12.5% de 144 adultos, con un promedio de
edad de 68 años, hospitalizados por NAC en Holanda.
7

Mecanismos de patogenicidad:
M. pneumoniae tiene predilección por el tracto respiratorio inferior, con la invasión
del torrente sanguíneo como un episodio raro, al igual que la extensión a otros tejidos. Aún
no se ha determinado claramente en qué forma penetra en el gel de mucina que recubre el
epitelio respiratorio, pero se piensa que su movilidad por deslizamiento facilita la
penetración, mientras que su tamaño diminuto y plasticidad le permiten adaptar su forma
para conformarse a los contornos de la superficie de la célula huésped. (Joklik y cols.,
1997).
Una vez adherido en tráquea, bronquios y sus divisiones se mantiene en forma
epicelular. La destrucción del epitelio respiratorio y la parálisis de los cilios explica la tos
intensa y prolongada que acompaña a los cuadros clínicos. El mecanismo preciso del daño
celular es desconocido, pero existen evidencias de que tanto el peróxido de hidrógeno
como el anión superóxido producido por el microorganismo causarían la alteración
metabólica y citonecrosis de las células respiratorias. En una primera etapa la catalasa del
huésped contrarrestaría el efecto de los radicales oxidativos, pero el progresivo daño por
oxidación produciría una importante lesión, especialmente de la membrana celular y la
consecuente muerte celular (Pinto, 1986).
Manifestaciones clínicas:
El síndrome clínico más común es la traqueobronquitis, la cual es responsable de
alrededor del 70 al 80% de las infecciones por mycoplasmas. La neumonía es la segunda
manifestación clínica en frecuencia, presentándose en un tercio de las personas enfermas
(Joklik y cols., 1997). Esta patología tiene especial relevancia, ya que constituye una
importante causa de morbi-mortalidad en Chile y el mundo (INE, 2000)
8

La Sociedad Chilena de Enfermedades Respiratorias en el año 2004, define a la
neumonía adquirida en la comunidad como una enfermedad pulmonar de origen infeccioso
que afecta principalmente a niños menores de 2 años y ancianos, que según su gravedad
puede llegar a ser mortal y que se adquiere en la comunidad. Se trata de una infección o
inflamación aguda del parénquima pulmonar, que comienza a llenarse de líquido y exudado
purulento, lo que interfiere con la entrega de oxígeno a la circulación sanguínea y los
tejidos, afectando el metabolismo celular.
En cuanto a los agentes etiológicos de las NAC, ellos son posibles de identificar en
un porcentaje regular de los casos. La mayor parte de los estudios publicados coinciden en
que el Streptococcus pneumoniae es el principal germen involucrado en las NAC
(Niederman y cols., 2001), estando implicado en alrededor de un tercio de los casos de
NAC. Otro tercio es causado por las bacterias atípicas como M. pneumoniae y Chlamydia
pneumoniae y por virus respiratorios. Además, microorganismos como Haemophilus
influenzae, Moraxella catarrhalis, Staphylococcus aureus, bacilos Gram negativos y
Legionella spp. , se asocian a NAC con menor frecuencia (Cruz Mena y Moreno, 1999).No
obstante, en no menos del tercio de los casos de NAC no se ratifica el agente causal (Ewig,
1997).
La importancia de conocer el agente causal de esta patología, se debe a que la NAC
constituye la primera causa de muerte por enfermedades infecciosas en Chile y el mundo
(Acuña y cols., 1999). Incluso, en 1998, el 60,1% de la mortalidad por causas respiratorias
en Chile se debió al diagnóstico de neumonía en sus diferentes categorías. De estas
categorías diagnósticas, el 97% de los casos fatales correspondió a neumonías bacterianas
en las que no hubo identificación del agente causal del cuadro respiratorio. La baja cifra de
9

identificación del agente causal confirma las limitaciones en los métodos de diagnóstico
utilizados masivamente (Valdivia, 2004).
La neumonía causada por M. pneumoniae es habitualmente leve. Luego de un
periodo de incubación de 2 a 3 semanas se produce un comienzo gradual de fiebre
moderada (37.8ºC a 39ºC), malestar general, cefalea, mialgias y una tos persistente no
productiva, seca y entrecortada, la que persiste por 3 a 4 semanas y cuya ausencia en
forma importante debe hacer dudar del diagnóstico. Tales síntomas se dan en casi el 90%
al 100% de los pacientes (Hammerschlag, 1995).
Al examen pulmonar lo más destacable es la presencia de crepitaciones gruesas
bilaterales (75% de los casos), roncus y sibilancias (40% de los casos).
El recuento de leucocitos periféricos durante los estadios tempranos de la
enfermedad puede encontrarse dentro de límites normales y elevarse a medida que ésta
progresa. Los anticuerpos proporcionan protección contra la enfermedad alrededor de 5
años, después de los cuales puede haber reinfección (Joklik y cols., 1997).
La proteína P1 constituye la principal adhesina de M. pneumoniae y además, un
importante inmunógeno. Los pacientes con neumonía por este microorganismo siempre
desarrollan anticuerpos contra esta proteína, lo que respalda su uso potencial como vacuna.
Los anticuerpos anti P1 son detectados durante la convalecencia tanto en forma sérica
como en las secreciones respiratorias (Joklik y cols., 1997).
La infección por M. pneumoniae se ha asociado a un sinnúmero de manifestaciones
extrapulmonares, tales como manifestaciones hematológicas, dermatológicas, cardiacas y
neurológicas (en este último grupo la mortalidad llega a un 10% y las secuelas son
frecuentes). La presentación de ellas se observa en un plazo que oscila entre 1 y 21 días de
10

iniciada la infección respiratoria. Son generalmente de naturaleza benigna y no dejan
secuelas (Pinto, 1986).
Tratamiento:
En los pacientes jóvenes con NAC, sin otras afecciones, puede bastar con la
administración de antibióticos tales como penicilinas, cefalosporinas de tercera generación
y macrólidos. En el tratamiento de la neumonía por M. pneumoniae son los inhibidores de
la síntesis proteica, como las tetraciclinas y la eritromicina (activo también sobre otros
patógenos bacterianos atípicos como Chlamydia pneumoniae y Legionella pneumophila),
los que surten efecto debido a que reducen el curso clínico en términos de fiebre, número
de días de internación y resolución sobre la base de las radiografías (Pinto, 1986).
En el hospital, es posible que sean necesarios los tratamientos kinésicos para eliminar
secreciones, lo cual contribuye a la permeabilización de la vía aérea, optimizando así la
llegada de oxígeno y por tanto la función del macrófago alveolar el cual ha sido
considerado la única célula eficientemente fagocítica que barre la superficie alveolar,
creando un frente de defensa contra partículas inhaladas y microbios, lo que le da el rol de
célula efectora (Nathan, 1987). También es necesario en algunos casos la administración
de oxígeno, antibióticos intravenosos y ocasionalmente, se pueden utilizar medicamentos
esteroidales para reducir sibilancias si existe una enfermedad pulmonar subyacente. (Acuña
y cols., 1999)
11

• Diagnóstico de infecciones por M. pneumoniae
Estudio radiológico:
El patrón radiológico inicial es reticular e intersticial, más tarde se observa una
distribución en parches o con compromiso segmentario, especialmente hacia las bases.
(Pinto, 1986).
Diagnóstico de laboratorio:
En los estadios tempranos de la infección el diagnóstico debe hacerse sobre bases
clínicas, pero la confirmación microbiológica permite disminuir los tratamientos
inapropiados, acortar el tiempo e intensidad de la sintomatología y evitar la diseminación
de la infección a la comunidad. No existe una técnica de referencia para el diagnóstico de
M. pneumoniae. Las técnicas clásicas de diagnóstico: cultivo y serología mediante fijación
del complemento, tienen limitaciones para ser usadas en la práctica clínica.
Fijación de Complemento: Es una técnica que mide una mezcla de IgM e IgG. El antígeno
que se dispone comercialmente contiene glicolípidos de la membrana de M. pneumoniae,
los que están relacionados con una variedad de microorganismos y tejidos, lo que causa
reacciones inespecíficas y es poco sensible. Dado que suele existir un nivel de IgG alto en
la población, producto de infecciones anteriores, la FC requiere la toma de muestras
pareadas de suero para demostrar seroconversión (Jacobs y cols., 1986).
Enzimoinmunoensayo e Inmunofluorescencia Indirecta: Permiten la detección de IgM e
IgG en forma separada, facilitando la diferenciación entre una infección activa y una
previa.
12

Luego de la infección por M. pneumoniae, la IgM aparece entre los 7 y 10 días
post infección, permitiendo efectuar diagnóstico de infección activa en una muestra única
de suero en fase aguda (Jacobs y cols.,1986; Sillis, 1990). La detección de IgM es por ello
un punto fundamental en el diagnóstico oportuno de infección por este microorganismo en
pediatría, con una sensibilidad ≥80% (Waris y cols., 1998). Sin embargo, en adultos con
reinfecciones por M. pneumoniae, se detecta IgM con menor frecuencia, ó no se detecta,
lo que reduce su utilidad diagnóstica (Jacobs y cols., 1986; Sillis, 1990). Thacker y
Talkington, en un estudio realizado el año 2000, compararon 4 técnicas serológicas
comerciales (tres EIA y una FC) en adultos durante un brote de infecciones por M.
pneumoniae, demostrando solamente 23-47% de sensibilidad en aquellas técnicas
específicas para IgM, mientras que la combinación de detección de IgM e IgG en muestras
pareadas de suero en fase aguda y fase convaleciente permitió mejorar la sensibilidad de
diagnóstico de M. pneumoniae a valores de 94-99%.
La IFI es una técnica clásica para el diagnóstico de M. pneumoniae. Consiste en una
técnica de dos pasos que tiene como objetivo la demostración de anticuerpos circulantes en
el suero del paciente. Para ello se incuba el suero del paciente en estudio y posteriormente
se incuba con anticuerpos marcados con fluoresceína dirigidos contra las
inmunoglobulinas. Es uno de los procedimientos más usados para el diagnóstico de este
microorganismo en nuestro país, pero se emplea poco en el extranjero con fines de
diagnóstico, probablemente, porque es una técnica que requiere personal técnico muy bien
entrenado para su lectura.
13

Técnicas de Amplificación de los Ácidos Nucleicos: Son aquellas que permiten
amplificar secuencias de ácidos nucleicos, DNA o RNA, específicos de cada
microorganismo. Su aplicación en microbiología clínica surge como una necesidad para
detectar microorganismos de difícil crecimiento en cultivo, o desarrollo tardío, y donde las
técnicas serológicas de detección de antígenos y anticuerpos carecen de suficiente
sensibilidad y especificidad diagnóstica. (Simposio Internacional Infectología Aplicada
para el Cono Sur, 1999). Es por los motivos antes mencionados que estas técnicas tienen
un gran potencial para el diagnóstico de M. pneumoniae. Incluso en el diagnóstico en
niños, pueden proporcionar resultados en sólo 24 horas (Skakni y cols., 1992; Williamson
y cols., 1992; Tjhie y cols., 1994; Ieven y cols., 1996; Abele-Horn, y cols., 1998). Han
demostrado ser también útiles para el diagnóstico de infecciones por M. pneumoniae en
niños inmunocomprometidos, ó menores de 12 meses, en los cuales hay una menor
respuesta inmune humoral a este organismo (Skakni y cols., 1992). En adultos, los
protocolos han sido comparados con el cultivo y la serología, demostrando ser más
sensibles que el cultivo y complementarios a la serología (Waring y cols., 2001; Tjhie y
cols., 1994; Petitjean y cols., 2002).
Reacción de la Polimerasa en Cadena: Procedimiento dado a conocer en Abril de 1983 por
Kary Mullis (Lozada, 1997). Es una técnica para la síntesis "in vitro" de secuencias
específicas de DNA y se basa en la capacidad que actualmente se dispone para amplificar
un segmento predeterminado de DNA, un número tal de veces (10 5 a 10 6 ) que es posible
identificarlo mediante procedimientos muy sencillos (Lozada, 1997). Este método permite
la amplificación de DNA de cualquier origen, teniendo como requisito para su máxima
eficiencia y especificidad, conocer previamente la secuencia de bases nitrogenadas que
14

forman parte total o parcialmente de un gen específico del agente que se desea estudiar. El
método es tan sensible que se pueden identificar genes específicos de células individuales
(Lozada , 1997). Para mayores detalles de la técnica dirigirse a anexo.
En lo que a M. pneumoniae respecta, según estudios realizados tanto por Dorigo-
Zetsma y Abele-Horn en los años 2001 y 1998 respectivamente, la PCR ha resultado tener
mayor sensibilidad que la serología en inmunocomprometidos y adultos mayores.
Se han desarrollado varios protocolos de PCR para el diagnóstico de este
microorganismo. Loens y cols, en un estudio realizado en el año 2003, revisaron la
literatura disponible con relación a las técnicas de amplificación, observando que muchos
de los protocolos de PCR empleados no han sido lo suficientemente evaluados. Por otra
parte, es difícil comparar la sensibilidad y especificidad de las técnicas de PCR utilizadas
en distintos estudios, ya que existen diferencias en las muestras clínicas obtenidas, en el
protocolo de extracción de DNA, en la cantidad de templado incluido ó en el blanco de
amplificación escogido.
Entre los blancos de amplificación del DNA de M. pneumoniae utilizados,
destacan el gen de la adhesina P1, el gen del rRNA de 16S, el factor de elongación Tu (tuf)
y secuencias de librería génica (Ieven y cols., 1996; Thjie y cols.,1994). Dos blancos de
amplificación han sido comparados entre sí; el gen del rRNA de 16S y el gen de la adhesina
P1. El par de partidores utilizados reconocen secuencias del gen de la adhesina P1 y del
rRNA de 16S respectivamente (Ieven y cols., 1996; Tjhie y cols., 1994) y generan
fragmentos de amplificación correspondientes a 209 pb para el gen de la adhesina P1 y
277 pb para el gen del rRNA de16S (Ieven y cols, 1996; Tjhie y cols., 1994).
Williamson encontró un mayor número de muestras positivas con partidores para el
gen del rRNA de 16S, mientras que Ieven y cols. encontraron mayor sensibilidad de la PCR
15

con partidores para el gen de la adhesina P1 (Ieven y cols., 1996; Williamson y cols.,
1992). Existen ventajas y desventajas para el empleo de ambos marcadores moleculares
como blanco de amplificación. El gen que codifica para la adhesina P1, está en un múltiple
número de copias constituyendo el 8.5% del genoma y por ello otorga en teoría mayor
sensibilidad (Himmelreich y cols., 1996). En lo que respecta al gen del rRNA de 16S, se
sabe que los Mycoplasmatales sólo cuentan con dos operones ribosomales y por lo tanto se
esperaría que este blanco de amplificación otorgara a la PCR menor confiabilidad.
16

Objetivos
• Generales:
1. Determinar la frecuencia de infección por M. pneumoniae en muestras respiratorias de
adultos mayores de 60 años o más, con diagnóstico clínico confirmado
radiológicamente de NAC, atendidos en el Hospital Clínico de la Universidad de Chile.
2. Comparar la sensibilidad y especificidad analítica de la técnica de PCR, con partidores
para los genes del rRNA de 16S y de la adhesina P1 en la amplificación del DNA de M.
pneumoniae.
• Específico:
1. Comparar los resultados obtenidos de la técnica de PCR, con los obtenidos con la
serología mediante inmunofluorescencia indirecta para el diagnóstico de M.
pneumoniae en adultos con NAC
Hipótesis
H1: Mycoplasma pneumoniae participa en la etiología de 10-15% de los casos de neumonía
adquirida en la comunidad en pacientes mayores de 60 años.
H2 : : La PCR con partidores para el gen de la adhesina P1 tiene mayor sensibilidad que la
PCR que utiliza partidores para el gen rRNA de 16S para el diagnóstico de M. pneumoniae.
17

Población:
Criterios de inclusión:
MATERIAL Y METODO.
- Pacientes mayores de 60 años, con diagnóstico clínico de NAC confirmado mediante
radiología.
- Pacientes atendidos en el Hospital Clínico Universidad de Chile entre Septiembre del
año 2002 y Agosto del año 2004.
- Pacientes que aprobaron el consentimiento informado.
Criterios de exclusión:
- Pacientes con inmunocompromiso severo o cáncer de origen broncogénico.
Muestra:
84 pacientes.
Correspondió a un muestreo no probabilístico por conveniencia, el que consideró a
Tipo de Estudio:
Según el análisis y el alcance de los resultados, este estudio se clasificó como:
Estudio de tipo Descriptivo transversal.
18

Procedimiento:
Pacientes: Se incorporaron en el estudio 84 pacientes de ambos sexos mayores de 60 años,
enrolados en los Servicios de Urgencia o de Medicina del Hospital Clínico de la
Universidad de Chile, entre Septiembre de 2002 y Agosto de 2004.
Muestras Clínicas: Después de presentado el consentimiento informado, las muestras
tomadas consistieron en dos tipos:
a) Una muestra de lavado faríngeo, obtenido mediante enjuague faríngeo (gargarismo) con
5cc de solución de Hanks.
b) Una muestra de 5 cc de sangre venosa sin anticoagulante. Se trató de obtener, una
segunda muestra de suero en fase convaleciente (4-6 sem después)
Ambos tipos de muestras fueron transportados de inmediato y conservadas a – 30ºC
hasta su procesamiento.
Serología: Este estudio se efectuó con la técnica de Inmunofluorescencia indirecta con el
kit comercial Zeus MR , E.U.A de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La técnica
consistió en efectuar diluciones decimales del suero en estudio, en solución buffer fosfato
(PBS) las que se aplicaron al portaobjetos conteniendo el antígeno de M. pneumoniae.
Luego de incubar a 35ºC por 60 min. en una cámara húmeda, los portaobjetos se lavaron
dos veces por 5 min. cada vez en PBS. Posteriormente, se retiró el exceso de humedad y se
aplicaron los conjugados: anti IgG y anti IgM marcados con isotiocianato de fluoresceína.
Luego de incubar a 35ºC por 30 min. en una cámara húmeda, los portaobjetos se lavaron
nuevamente dos veces por 5 min. cada uno en PBS. Los portaobjetos se analizaron de
19

inmediato por observación en microscopio de epifluorescencia, equipado con filtro B (con
objetivos de 20 y 40 X). Se consideró reacción positiva, a aquella que mostró cúmulos de
M. pneumoniae, con un patrón de fluorescencia verde brillante y homogénea. Se
incluyeron sueros controles positivos y negativos en cada oportunidad.
Estas pruebas diagnósticas de serología son un complemento para confirmar el
diagnóstico de M. pneumoniae al momento de obtener los resultados de la PCR.
Criterio Diagnóstico: Se consideró diagnóstico serológico de certeza de M. pneumoniae a
la demostración de un título de IgM ≥1:16, o al alza de 4 veces en el título de IgG en la
segunda muestra pareada de suero (seroconversión). Se consideró diagnóstico probable de
M. pneumoniae a la presencia de un título único de IgG ≥1:128.
Reacción de la Polimerasa en Cadena:
Se amplificó el DNA de M. pneumoniae con dos pares de partidores:
P1A: 5’-GCC ACC CTC GGG GGC AGT CAG-3’
P1B: 5'- GAG TCG GGA TTC CCC GCG GAG G-3'
16S1: 5'- AAG GAC CTG CAA GGG TTC GT -3 '
16S2: 5'- CTC TAG CCA TTA CCT GCT AA-3'
Ambos pares de partidores reconocen secuencias del gen de la adhesina P1 y del rRNA
de 16S respectivamente (Ieven 1996, Tjhie 1994). Los partidores generaron fragmentos de
amplificación correspondientes a 209 pb para el gen de la adhesina P1 y 277 pb para el
gen del rRNA de 16S (Ieven 1996, Tjhie 1994). Las muestras clínicas fueron procesadas
20

mediante el kit comercial de extracción de DNA, QIAmp Minikit (QIAGEN, USA). Las
amplificaciones fueron efectuadas en un volumen de 50 µl conteniendo 2.5 U de Taq DNA
polimerasa (BioTools, España), 200 µM de cada nucleótido trifosfato, 2.5 mM MgCl2 y 1
µM de cada partidor. Los ciclos de amplificación consistieron en 1 min. de denaturación a
94ºC, seguido por 40 ciclos de 1 min. de denaturación a 94ºC, 1 min. de hibridación a 65ºC
y 1 min. de extensión a 72ºC y un ciclo final de 7 min. de extensión a 72ºC. Para la
amplificación del gen del rRNA de 16S la temperatura de hibridación fue 60ºC. Las
amplificaciones fueron efectuadas en un termociclador MJ Research, Modelo
MiniCycler MR , USA. Los productos de amplificación fueron analizados por electroforesis
en geles de agarosa al 1.5 %, teñidos con bromuro de etidio y visualizados en un
transiluminador de luz UV. Como patrón de peso molecular se utilizó DNA ladder de 100
pb.
Criterio diagnóstico: Se consideró un diagnóstico positivo de M. pneumoniae mediante
PCR, a la amplificación del DNA del microorganismo con cualquiera de los pares de
partidores utilizados. La detección de DNA de M. pneumoniae en las muestras
respiratorias fue considerada diagnóstico probable de infección.
Análisis de la PCR: Se efectuaron los siguientes controles de calidad del proceso de
amplificación del DNA:
Control positivo: Como control positivo se amplificó el DNA de la cepa FH de M.
pneumoniae, la cual fue donada gentilmente por el Prof. Dr. Wolfgang Bredt (Alemania).
21

Control negativo: Como control negativo de la reacción se incluyó un tubo conteniendo
todos los reactivos excepto DNA, por cada 8 muestras de DNA sometidas a PCR.
Control de calidad del DNA: Para verificar la calidad del DNA y la ausencia de sustancias
inhibitorias en las muestras analizadas, se amplificó un fragmento de 326 pb del gen de la
β-globina humana, previo a la amplificación del DNA de M. pneumoniae (Tjhie, 1994).
Sensibilidad analítica: Para el cálculo de la sensibilidad analítica de la PCR, diluciones
seriadas preparadas a partir de una muestra de DNA de la cepa FH de M. pneumoniae, de
concentración conocida (3µM), fueron sometidas a PCR, determinando la máxima dilución
capaz de amplificar.
Especificidad analítica: Para verificar la especificidad analítica de la técnica de PCR se
amplificó el DNA de los siguientes microorganismos: Mycoplasma genitalium,
Mycoplasma orale, Mycoplasma hominis, Ureaplasma spp., Streptococcus pneumoniae,
Streptococcus viridans, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae, Chlamydia
pneumoniae, Chlamydia trachomatis y Chlamydia psittaci.
22

Variables:
H1: Variable Independiente: Mycoplasma pneumoniae.
Variables Dependientes: Porcentaje de detección.
H2:Variable Independiente: Partidores para el gen del rRNA de 16S.
Partidores para el gen P1.
Variables Dependientes: Sensibilidad y especificidad analítica.
Variables de Control: Edad, NAC.
Variables Extrañas: Contaminación de muestras respiratorias, consumo de antibióticos.
Definición Conceptual:
o M. pneumoniae: Microorganismo patógeno que carece de pared celular.
o Partidores para el gen del rRNA de 16S: Pareja de oligonucleótidos sintetizados de
manera que sean complementarios a cada uno de los extremos 3´ del gen del rRNA
de 16S.
o Partidores para el gen P1: Pareja de oligonucleótidos sintetizados de manera que
sean complementarios a cada uno de los extremos 3´ del gen de la adhesina P1.
o Sensibilidad analítica: Mínima cantidad de DNA que la técnica de PCR es capaz de
resolver.
o Especificidad: Posibilidad de que las técnicas de PCR no amplifiquen el DNA de
otros mycoplasmas, ni de otros microorganismos taxonómicamente relacionados
con el M. pneumoniae ó de otros microorganismos que pueden aislarse de muestras
respiratorias.
23

Definición Operacional:
o M. pneumoniae: Número de muestras respiratorias que lo presentaban.
o Porcentaje: Se midió a través de una regla de tres simple.
o Partidores para el gen P1: Amplificación del gen P1.
o Partidores para el gen del rRNA de 16S: Amplificación del gen del rRNA de 16S
o Sensibilidad analítica: Se calculará haciendo diluciones seriadas de una cantidad
conocida de DNA puro obtenida en el laboratorio a partir de la cepa FH.
o Especificidad: Se midió calculando el porcentaje del número de microorganismos
amplificados mediante PCR, valor que se resta al 100%.
Análisis Estadístico
La significación estadística del porcentaje de detección de M. pneumoniae se
detectó con la Prueba de Distribución Normal para proporciones o tasas. Se usó esta prueba
debido a que la frecuencia de M. pneumoniae muestra muy pocos casos que se alejan del
promedio teórico. La significación para la detección de M. pneumoniae por PCR, se
estableció en p

• Análisis de la PCR:
RESULTADOS
La amplificación del DNA con los dos tipos de partidores tuvo igual sensibilidad,
detectando el mismo número de muestras positivas.
La sensibilidad analítica de la técnica de PCR para ambos genes fue la misma, con
una capacidad de detección mínima de 7.4 pg de DNA (74 x10 -11 g), lo cual es similar a lo
encontrado por otros autores (Tabla I)
Además no se detectaron muestras con efecto inhibitorio en la reacción de PCR en
ningún microorganismo.
Tabla I: Sensibilidad analítica encontrada por diversos autores.
Autor y Año Sensibilidad
Abele-Horn M. y cols.
(1998)
Ieven M. y cols.
(1996)
25
analítica (pg)
30
23.68

Con la finalidad de determinar la sensibilidad del método se analizó el DNA de M.
pneumoniae utilizando cantidades variables de DNA molde desde 3 µg hasta 7.4 pg con los
partidores para el gen del rRNA de 16S (figura 1).
300 pb
1 2 3 4 5 6
Figura 1: Gel de agarosa al 1.5%, teñido con 0.5µg/ml de bromuro de etidio,
mostrando la amplificación de diluciones de DNA de la cepa FH de M. pneumoniae, con
partidores para el gen del rRNA de 16S. Carril 1: DNA ladder 100 pb, Carriles 2-5: M.
pneumoniae, Carril 6: Control negativo
26
277 pb

La especificidad de la técnica de PCR para la amplificación de los genes P1 y del
rRNA de 16S resultó ser 100% para ambos genes, permitiendo la amplificación específica
del DNA de M. pneumoniae, pero no el de otros microorganismos incluidos.
Tabla II: Especificidad analítica de la PCR con partidores para el gen de la
adhesina P1 y gen del rRNA de 16S de M. pneumoniae.
Bacteria PCR: gen del rRNA de 16S PCR: gen de la adhesina P1
Haemophilus influenzae - -
Micoplasma genitalium - -
Mycoplasma orale - -
Mycoplasma pneumoniae + +
Mycoplasma hominis - -
Ureaplasma spp - -
Chlamydia trachomatis - -
Clhamydia pneumoniae - -
Clhamydia psittaci - -
Streptococcus pneumoniae - -
Streptococcus pyogenes - -
Streptococcus viridans - -
27

200 pb
La Figura 2 muestra la especificidad analítica para el gen de la adhesina P1 :
1 2 3 4 5 6 7 8
Figura 2: Gel de agarosa al 1.5%, teñido con 0.5µg/ml de bromuro de etidio,
mostrando la especificidad analítica para M. pneumoniae, con partidores para el gen de la
adhesina P1. Carril 1: DNA ladder 100 pb, Carril 2: Cepa control FH de M. pneumoniae,
Carril 3: Cepa clínica de M. pneumoniae, Carril 4: C. trachomatis, Carril 5: C. psiattaci,
Carril 6: C. pneumoniae, Carril 7: M. hominis, Carril 8: M. genitalium.
28
209 pb

• Análisis Microbiológico:
M. pneumoniae fue diagnosticado mediante serología o PCR en 11 de 84 pacientes
(13.1%) con diagnóstico de NAC (Tabla V). En 8 casos el diagnóstico fue de certeza y en
tres casos probable.
La Tabla III muestra los resultados microbiológicos de los 11 pacientes en los que se
detectó infección por M. pneumoniae. La serología fue positiva en 8 pacientes (72.7%),
mientras que la PCR fue positiva en 7 pacientes (63.6%).
29

Tabla III: Características microbiológicas de los diagnósticos de laboratorio de M.
pneumoniae, en pacientes con NAC atendidos en el Hospital Clínico de la Universidad de
Chile en el periodo comprendido entre Septiembre de 2002 y Agosto de 2004.
Nº de caso PCR1/ PCR2 IgM IgG aguda IgG convalesciente Diagnóstico
8 (+) (-) < 1:64 No se toma 2º suero Probable
13 (+) (-) 1:32 1:128 Certeza
15 (-) (+) (-) (-) Certeza
16 (+) (+) < 1:64 No se toma 2º suero Certeza
17 (+) (-) < 1:64 No se toma 2º suero Probable
18 (+) (+) < 1:64 No se toma 2º suero Certeza
26 (-) (+) < 1:64 No se toma 2º suero Certeza
31 (+) (-) < 1:64 No se toma 2º suero Probable
34 (+) (-) 1:32 1:128 Certeza
67 (-) (-) 1:64 1 :256 Certeza
70 (-) (-) 1:32 1:128 Certeza
30

En la Figura 3 se muestran las siete amplificaciones del DNA de M. pneumoniae en
las muestras positivas con partidores para el gen del rRNA de 16S:
300 pb
Figura 1. Amplificación del gen del rRNA de 16S para la detección de M.
pneumoniae en muestras de lavado faríngeo de pacientes con NAC. Carril 1: 1-kb
ladder, carril 2: control positivo, carril 3*: control negativo, carriles 4-10: muestras
de pacientes.
* Si bien este control negativo muestra que el gen del rRNA de 16S no se amplicó, en el gel
se observa un barrido que indica contaminación de esa muestra, lo cual no invalida la
técnica de PCR.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
31
277 pb

La serología en la muestra de suero en la fase aguda fue positiva en 4 de 11
pacientes por la presencia de IgM. En sólo 4 pacientes con diagnóstico de infección por M.
pneumoniae se obtuvieron muestras con suero en fase convaleciente y las cuatro
demostraron seroconversión (Tabla IV).
Tabla IV: Muestras positivas detectadas por cada una de las técnicas.
Técnicas
Diagnósticas
32
Nº de Muestras
Positivas
Serología IgM 4
Serología IgG 4
PCR 7
Cabe destacar que los resultados obtenidos mediante serología no siempre se
correspondieron con los casos positivos detectados por PCR. Es así como en algunos casos
en donde la serología resultó ser positiva, PCR dio negativa. (3 casos) Asimismo la PCR
fue positiva en tres pacientes con serología negativa. Estos tres casos correspondieron a un
diagnóstico probable de infección por M. pneumoniae.

El porcentaje de detección de M. pneumoniae en las muestras respiratorias de
pacientes con NAC, mediante la técnica de PCR, fue de un 8.3%. mientras que la serología
correspondió a un 9.5%. Al sumar los porcentajes de detección de M. pneumoniae mediante
serología y PCR, se obtuvo que el microorganismo estaba presente en un 13.1% ,
porcentaje que se acerca más al indicado por la literatura. (Figura 4).
16
14
12
10
% de detección
8
6
4
2
0
8,33
9,52
Figura 4: Porcentaje de detección de M. pneumoniae mediante
dos técnicas diagósticas y su comparación con la teoría
33
13,1
PCR Serología Serología +
PCR
Técnicas diagnósticas
15
Serología +
PCR (teórico)

DISCUSION
Los resultados obtenidos mediante las técnicas de PCR y serología mostraron que
fue posible detectar M. pneumoniae en el 13.1% de los pacientes con NAC, cifra que es
similar a la obtenida en la literatura, la cual fluctúa entre un 15 y un 20% (Foy, 1993). Esta
disparidad probablemente se deba a que la mayoría de los pacientes admitidos en el estudio
habían recibido antimicrobianos, lo que redujo el rendimiento de detección del
microorganismo de la muestra de expectoración y por tanto también el resultado obtenido
por PCR. Esto se podría deber a que el uso de Levofloxacino inhibe la síntesis del DNA al
bloquear a la subunidad A de la DNA girasa (Morejón y cols, 2003). A diferencia de lo que
ocurre con la Serología, en que la respuesta inmune del organismo permanece por más
tiempo, ésta no se ve afectada por el consumo de fármacos. Para evitar alterar los resultados
de la técnica de PCR por el uso de antibióticos se deberían tomar las muestras de
expectoración antes de comenzar con el tratamiento antibiótico o inmediatamente iniciado
el tratamiento.
Sin embargo, en el 66.7% de los casos con M. pneumoniae detectados por PCR, los
pacientes habían consumido Levofloxacino, indicando que el uso del antibiótico previo a la
toma de la muestra no es totalmente invalidante del método.
Es importante destacar, que la presencia de M. pneumoniae se asocia con una buena
evolución de los pacientes, ya que en este estudio fue posible detectar que el 88.9% de los
pacientes mejoraron, lo que reafirma lo indicado por la literatura en cuanto a que M.
pneumoniae no se caracteriza por ser letal.
34

Al comparar ambas técnicas, serología y PCR, se encontraron casos en que habían
muestras positivas por PCR mientras que esas mismas muestras eran negativas con la
serología. Esto se podría deber a que la muestra de sangre fue tomada en un período en que
aún el organismo no había desarrollado una respuesta inmune o que la cantidad de M.
pneumoniae era insuficiente para la detección por serología, lo que está directamente
relacionado con la sensibilidad de este método. Ambas justificaciones dejan en claro que la
PCR es capaz de detectar a este microorganismo aún en etapas muy tempranas de la
infección, e incluso cuando el microorganismo está en bajas cantidades en el organismo,
dejando de manifiesto su mayor sensibilidad al compararla con la serología. Por lo tanto,
sería una técnica útil para detectar con mayor precisión la presencia de M. pneumoniae y así
orientar el diagnóstico.
También hubo casos con muestras serológicas positivas y PCR negativas (4 de 11
casos), lo cual se pudo deber al tratamiento antibiótico previo que habiendo tenido el efecto
farmacológico esperado, evitó la detección del microorganismo.
Los procedimientos efectuados permitieron la comparación de la técnica de PCR para el
gen de la adhesina P1 y del rRNA de 16S, observándose un igual rendimiento en ambas. No
obstante, se han informado ventajas y desventajas para el empleo de los distintos partidores
en la amplificación del DNA de M. pneumoniae. El gen que codifica para la adhesina
principal P1, está en un múltiple número de copias y por ello, esta PCR otorga en teoría
mayor confiabilidad. En lo que respecta al gen del rRNA de 16S, se sabe que los
Mycoplasmatales sólo cuentan con dos operones ribosomales y por lo tanto en teoría esta
PCR podría tener menor confiabilidad que el gen que amplifica para la adhesina P1. Por
otro lado, el gen del rRNA de 16S está muy conservado en estos microorganismos, por lo
35

que una PCR con partidores que reconocen estos genes sería capaz de reconocer todas las
cepas del microorganismo independientemente de su ubicación geográfica, mientras que el
gen P1 que codifica una proteína de superficie, tendría una mayor variabilidad. Además, la
visualización de los productos de la PCR para el gen del rRNA de 16S es muy clara.
No obstante, pese a que los blancos de amplificación fueron distintos, las condiciones
en que se llevó a cabo la técnica de PCR para ambos genes fueron muy similares lo que
resultó en una sensibilidad común para los dos blancos amplificados.
Debido a las discrepancias antes mencionadas, no existe un procedimiento de referencia
para el diagnóstico de M. pneumoniae, ya que si bien la serología es el método difundido
universalmente para la detección de este microorganismo, presenta una baja sensibilidad y
requiere de más tiempo para obtener una seroconversión en el caso de la IgG, mientras que
en el caso de la IgM es una respuesta inmune que en los adultos mayores se encuentra
disminuida. Y por otro lado la PCR aún no ha sido lo suficientemente reconocida como un
método válido para realizar diagnóstico de M. pneumoniae.
Si se quisiera obtener datos significativos y extrapolables a niveles epidemiológicos
nacionales de prevalencia de M. pneumoniae en los pacientes con NAC, se debería realizar
un estudio completamente aleatorio y contar con un tamaño muestral de 306 pacientes,
considerando un nivel de significación estadística p = 0.04. Sin embargo, esto involucra un
estudio de grandes dimensiones en cuanto a tiempo, recursos humanos y económicos, y
necesariamente involucraría la participación de más de un hospital.
36

CONCLUSIONES
El diagnóstico de M. pneumoniae requeriría idealmente el uso combinado de
técnicas serológicas y de PCR simultáneamente para mejorar la sensibilidad en la fase
aguda de la infección.
La PCR con partidores que reconocen el gen del rRNA de 16S sería la PCR de
elección para este microorganismo.
El uso de la técnica de PCR, como una herramienta de diagnóstico, es válida para la
detección de M. pneumoniae. Es importante señalar que el éxito de la técnica es
dependiente del uso de antibióticos antes de la toma de la muestra.
37

PROYECCIONES
Los resultados obtenidos en este estudio, de detección de M. pneumoniae en
pacientes adultos mayores con NAC, podrían orientarse a la realización de estudios clínicos
y microbiológicos en donde se abarque un mayor número de muestras respiratorias, las
cuales involucren a un mayor número de pacientes y hospitales para que así la muestra sea
más representativa de la población y se puedan obtener resultados epidemiológicos
significativos. Además esto serviría para probar si existen periodos de variación en la
prevalencia de M. pneumoniae.
Es importante destacar que los M. pneumoniae cada día constituye un patógeno más
frecuente de NAC, por lo que se hace importante el conocimiento de técnicas que
contribuyan a su rápido diagnóstico como las técnicas de PCR, lo que lleva a los clínicos a
tomar decisiones más acertadas en cuanto al tratamiento que seguirán los pacientes con
NAC.
38

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and PCR-gene amplification for detection of the mycoplasma: problems and clinical
correlation. Epidemiol Infect. 109: 519-37.
43

Técnica de PCR:
ANEXO
Técnica de laboratorio con la que se pueden producir múltiples copias de un
fragmento de DNA específico. Estos procesos se pueden realizar con equipos comerciales o
con técnicas home made. Los primeros tienen la ventaja de poseer todos los componentes
listos, estandarizados y hasta automatizados, y la desventaja es su costo elevado y estar sólo
disponibles para algunas determinaciones. En cambio las segundas son aquellas elaboradas
por el propio laboratorio basándose en trabajos bibliográficos previos. Las ventajas son su
costo y versatilidad, pero pueden carecer de la suficiente estandarización y evaluación
necesarias para la obtención de resultados válidos y reproducibles. (Simposio Internacional
Infectología Aplicada para el Cono Sur, 1999)
Para crear la región de doble cadena se usan los denominados partidores (primers),
que corresponden a una pareja de oligonucleótidos sintetizados de manera que sean
complementarios a los extremos 3’ y 5’ del fragmento de DNA que se desea amplificar.
La PCR se basa en la repetición de un ciclo formado por tres etapas:
1ª Denaturalización del DNA: Este procedimiento se realiza a 95-97 °C con el propósito de
separar las hebras del DNA y así permitir la obtención de un DNA molde.
2ª Hibridación de los partidores: Los partidores se unen a las zonas 3’ y 5’
complementarias al fragmento de DNA que se desea amplificar. Para ello se utiliza una
temperatura de alineamiento que depende de la composición de bases de los partidores,
generalmente entre 50 y 65 °C y durante un min. o más aproximadamente.
44

3ª Extensión del partidor: En esta etapa se produce la síntesis de una cadena sencilla de
DNA en la dirección 5´- 3´ mediante la enzima DNA polimerasa, la cual incorpora los
desoxinucleótidos fosfato presentes en el medio siguiendo la cadena molde. (Masengi-
Rumopa 2003).
La realización de estos 3 pasos, se desarrolla en presencia del DNA molde a
amplificar, los dos partidores, los dNTPs y la enzima DNA polimerasa seleccionada para la
técnica. (Mönckeberg, 1990).
Todo este proceso se lleva a cabo en un equipo llamado termociclador, el cual
realiza los ciclos en los tiempos y temperaturas programadas de forma exacta. Una vez
completado el primer ciclo, se disponen de 2 copias de la muestra original, al final del
segundo ciclo hay 4 y al final del tercero 8. Si los ciclos se producen un número "n" de
veces y suponiendo que el número de copias de ADN se duplica en cada ciclo, obtenemos
una cantidad de ADN de 2 n , por lo que la amplificación se realiza en forma de progresión
geométrica. Los productos obtenidos son de dos tipos: "producto corto" y "producto largo".
El primero tiene una longitud perfectamente definida y contiene exactamente la secuencia
que se desea amplificar, generándose de manera exponencial durante la reacción. El
producto largo es el que incorpora las cadenas de DNA originales de la muestra y cuyos
extremos 3´ no están definidos. Sin embargo, al final de la PCR, la cantidad del producto
corto sintetizado es muy superior en comparación con el producto largo.
La detección del producto de la PCR se realiza normalmente mediante
electroforesis. Dependiendo del tamaño de la amplificación y según la resolución que se
desee se utilizan diferentes medios como agarosa o poliacrilamida. La posterior
45

visualización se puede realizar con bromuro de etidio, tinción de plata, fluorescencia o
radioactividad (Lozada, 1997).
Para que esta técnica pueda llevarse a cabo de manera óptima, el DNA no puede
estar fragmentado en trozos más pequeños de lo que queremos amplificar. Además, la
muestra no debe llevar agentes quelantes, ya que éstos reducen la concentración de ión
Mg ++ en la solución. Tampoco debe haber factores que inhiban la actividad de la
polimerasa. Otro factor importante es que la cantidad de la muestra debe ser suficiente para
la amplificación de DNA.
DNA Polimerasa: Existen diferentes tipos: Termolábiles: T° óptima de 37-42º C, se
desnaturalizan con el calor; Termoestables: T° óptima de 74 ºC, resiste durante 40-50 a 96
ºC. Actualmente se utiliza la Taq polimerasa, la cual es una enzima termoestable aislada de
Termus aquaticus (Taq), una bacteria termofílica. Esta enzima ha simplificado
enormemente la técnica de la PCR, ya que permitió su automatización.
Deoxinucleósidos trifosfato (dNTPs): Son cuatro: dATP, dGTP, dCTP y dTTP. Se deben
añadir en la solución de la reacción en concentraciones iguales. Los dNTPs quelan Mg ++ ,
por lo que las concentraciones de ambos componentes deben guardar siempre la misma
relación (Lozada, 1997).
Número de ciclos: Depende de la cantidad de ADN que existe en la muestra una vez que el
resto de los factores han sido optimizados.
Contaminación de la PCR: Como la PCR es una técnica muy sensible, es de gran
importancia evitar contaminaciones, ya que es posible que DNA no deseado (aunque se
encuentre en una cantidad muy pequeña) se amplifique y obtengamos un resultado que no
es real. Para evitar las contaminaciones hay que tener en cuenta que el lugar físico debe ser
46

exclusivo para realizar la PCR, al igual que el instrumental utilizado. Los reactivos y los
tubos deben ser estériles, el manipulador debe usar guantes y se deben realizar controles de
los blancos (se añade agua en lugar de DNA).
Tabla V: Comparación de la IFI con PCR en pacientes con diagnóstico de neumonía.
Nº
Identificación del
Paciente
Serología PCR Diagnostico
IgM IgG fase IgG fase Gen del rRNA Gen
aguda convaleciente de 16S P1
1 E. V. - - - - - Negativo
2 M. O. - - - - - Negativo
3 C. L. - - - - - Negativo
4 I. S. - - - - - Negativo
5 G. A. - - - - - Negativo
6 M. M. - - - - - Negativo
7 M. M. - - - - - Negativo
8 R. T. -

24 J. S. - - - - - Negativo
25 M. H. - - - - - Negativo
26 L. N. +

60 C. M. - - - - - Negativo
61 R. H. - - - - - Negativo
62 B. O. - - - - - Negativo
63 L. U. - - - - - Negativo
64 F. M. - - - - - Negativo
65 A. C. - - - - - Negativo
66 Ch. F. - - - - - Negativo
67 G. A. - 1: 64 1: 256 - - Certeza
68 Z. B. - - - - - Negativo
69 A. D. - - - - - Negativo
70 D. P. - 1 : 32 1 : 128 - - Certeza
71 M. S. - - - - - Negativo
72 N. P. - - - - - Negativo
73 R. M. - - - - - Negativo
74 M. V. - - - - - Negativo
75 E. F. - - - - - Negativo
76 P. P. - - - - - Negativo
77 M. P. - - - - - Negativo
78 L. N. - - - - - Negativo
79 H. R. - - - - - Negativo
80 R. R. - - - - - Negativo
81 R. S. - - - - - Negativo
82 I. M. - - - - - Negativo
83 O. R. - - - - - Negativo
84 E. H. - - - - - Negativo
49