“Análisis de la Reacción de la Polimerasa en Cadena para la ...
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UNIVERSIDAD DE CHILE<br />
FACULTAD DE MEDICINA<br />
ESCUELA DE KINESIOLOGÍA<br />
<strong>“Análisis</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>Reacción</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>Polimerasa</strong> <strong>en</strong> Ca<strong>de</strong>na<br />
<strong>para</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> Mycop<strong>la</strong>sma pneumoniae <strong>en</strong> adultos<br />
mayores con neumonía adquirida <strong>en</strong> <strong>la</strong> comunidad”<br />
Y<strong>en</strong>ifer Elizabeth Pino Pino.<br />
Tania Verónica Sa<strong>la</strong>zar Berríos.<br />
2004
<strong>“Análisis</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>Reacción</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>Polimerasa</strong> <strong>en</strong> Ca<strong>de</strong>na <strong>para</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> Mycop<strong>la</strong>sma<br />
Pneumoniae <strong>en</strong> Adultos Mayores con Neumonía Adquirida <strong>en</strong> <strong>la</strong> Comunidad”<br />
Tesis<br />
Entregada a <strong>la</strong><br />
UNIVERSIDAD DE CHILE<br />
En cumplimi<strong>en</strong>to parcial <strong>de</strong> los requisitos<br />
<strong>para</strong> optar al grado <strong>de</strong><br />
LICENCIADO EN KINESIOLOGÍA<br />
FACULTAD DE MEDICINA<br />
por<br />
Y<strong>en</strong>ifer Elizabeth Pino Pino<br />
Tania Verónica Sa<strong>la</strong>zar Berríos<br />
2004<br />
DIRECTOR DE TESIS: Profesor Asociado Dra. María Angélica Martínez Tagle<br />
PATROCINANTE DE TESIS: Profesora Sylvia Ortiz Zúñiga.
FACULTAD DE MEDICINA<br />
UNIVERSIDAD DE CHILE<br />
INFORME DE APROBACION<br />
TESIS DE LICENCIATURA<br />
Se informa a <strong>la</strong> Escue<strong>la</strong> <strong>de</strong> Kinesiología <strong>de</strong> <strong>la</strong> Facultad <strong>de</strong> Medicina que <strong>la</strong> Tesis <strong>de</strong><br />
Lic<strong>en</strong>ciatura pres<strong>en</strong>tada por el candidato:<br />
Y<strong>en</strong>ifer Elizabeth Pino Pino<br />
Tania Verónica Sa<strong>la</strong>zar Berríos<br />
Ha sido aprobada por <strong>la</strong> Comisión Informante <strong>de</strong> Tesis como requisito <strong>de</strong> Tesis <strong>para</strong> optar<br />
al grado <strong>de</strong> Lic<strong>en</strong>ciado <strong>en</strong> Kinesiología, <strong>en</strong> el exam<strong>en</strong> <strong>de</strong> <strong>de</strong>f<strong>en</strong>sa <strong>de</strong> Tesis r<strong>en</strong>dido el:<br />
........................................................................................................................................<br />
DIRECTOR DE TESIS:<br />
Profesor Asociado Dra. María Angélica Martínez .............................................................<br />
COMISION INFORMANTE DE TESIS.<br />
NOMBRE FIRMA<br />
...................................................................................................................................................<br />
...................................................................................................................................................<br />
...................................................................................................................................................<br />
...................................................................................................................................................
A mi madre y a mi tío Waldo, por su apoyo incondicional y por darme siempre <strong>la</strong><br />
fortaleza <strong>para</strong> seguir a<strong>de</strong><strong>la</strong>nte pase lo que pase.<br />
Y<strong>en</strong>ifer<br />
A mis padres, que me han apoyado <strong>en</strong> todo lo que he querido lograr. En especial a mi<br />
madre, que con su <strong>en</strong>tereza siempre me ha ayudado a salir a<strong>de</strong><strong>la</strong>nte.<br />
Tania
Agra<strong>de</strong>cemos a <strong>la</strong> Dra. María Angélica Martínez por permitirnos participar<br />
<strong>en</strong> <strong>la</strong> investigación “Estudio clínico y microbiológico <strong>de</strong> <strong>la</strong>s neumonías<br />
adquiridas <strong>en</strong> <strong>la</strong> comunidad <strong>en</strong> el adulto mayor”, lo cual nos permitió<br />
conocer otros aspectos re<strong>la</strong>cionados con el área <strong>de</strong> <strong>la</strong> salud.<br />
También damos <strong>la</strong>s gracias a <strong>la</strong> Enfermera María Angélica Espinoza, <strong>de</strong>l<br />
Servicio <strong>de</strong> Enfermeda<strong>de</strong>s Respiratorias <strong>de</strong>l Hospital José Joaquín Aguirre y<br />
a todos aquellos que con su opinión aportaron a sacar a<strong>de</strong><strong>la</strong>nte esta Tesis.
INDICE<br />
Resum<strong>en</strong>............................................................................................................................i<br />
Abstract ...........................................................................................................................ii<br />
Abreviaturas...................................................................................................................iii<br />
Introducción.................................................................................................................... 1<br />
Importancia <strong>de</strong>l Problema............................................................................1<br />
Pregunta <strong>de</strong> Investigación.............................................................................4<br />
Marco Teórico.................................................................................................................5<br />
Revisión Bibliográfica...................................................................................5<br />
• Biología <strong>de</strong> los Mycop<strong>la</strong>smas......................................................5<br />
Taxonomía y hábitat<br />
Estructura y fisiología<br />
• Mycop<strong>la</strong>sma pneumoniae.............................................................7<br />
Epi<strong>de</strong>miología<br />
Mecanismos <strong>de</strong> patog<strong>en</strong>icidad<br />
Manifestaciones clínicas<br />
Tratami<strong>en</strong>to<br />
• Diagnóstico <strong>de</strong> infecciones por M. pneumoniae.......................12<br />
Estudio radiológico<br />
Diagnóstico <strong>de</strong> <strong>la</strong>boratorio
Objetivos.......................................................................................................17<br />
• G<strong>en</strong>erales<br />
• Específicos<br />
Hipótesis.......................................................................................................17<br />
Materiales y Métodos....................................................................................................18<br />
Pob<strong>la</strong>ción......................................................................................................18<br />
Muestra.........................................................................................................18<br />
Tipo <strong>de</strong> Estudio............................................................................................18<br />
Procedimi<strong>en</strong>tos.............................................................................................19<br />
Variables.......................................................................................................23<br />
Análisis Estadístico......................................................................................24<br />
Resultados......................................................................................................................25<br />
• Análisis <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>Reacción</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>Polimerasa</strong> <strong>en</strong> Ca<strong>de</strong>na..............25<br />
• Análisis Microbiológico.............................................................29<br />
Discusión........................................................................................................................34<br />
Conclusiones..................................................................................................................37<br />
Proyecciones...................................................................................................................38<br />
Bibliografía....................................................................................................................39<br />
Anexos............................................................................................................................44
LISTA DE TABLAS<br />
Tab<strong>la</strong> I: S<strong>en</strong>sibilidad analítica <strong>en</strong>contrada por diversos autores.........................................25<br />
Tab<strong>la</strong> II: Especificidad analítica <strong>de</strong> <strong>la</strong> PCR con partidores <strong>para</strong> el g<strong>en</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> adhesina P1 y<br />
g<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S <strong>de</strong> M. pneumoniae..............................................................................27<br />
Tab<strong>la</strong> III: Características microbiológicas <strong>de</strong> los diagnósticos <strong>de</strong> <strong>la</strong>boratorio <strong>de</strong> M.<br />
pneumoniae, <strong>en</strong> paci<strong>en</strong>tes con NAC at<strong>en</strong>didos <strong>en</strong> el Hospital Clínico <strong>de</strong> <strong>la</strong> Universidad <strong>de</strong><br />
Chile <strong>en</strong> el periodo compr<strong>en</strong>dido <strong>en</strong>tre Septiembre <strong>de</strong> 2002 y Agosto <strong>de</strong> 2004 ..................30<br />
Tab<strong>la</strong> IV: Muestras positivas <strong>de</strong>tectadas por cada una <strong>de</strong> <strong>la</strong>s técnicas................................32<br />
Tab<strong>la</strong> V: Com<strong>para</strong>ción <strong>de</strong> <strong>la</strong> IFI con PCR <strong>en</strong> paci<strong>en</strong>tes con diagnóstico <strong>de</strong><br />
neumonía...............................................................................................................................47
RESUMEN<br />
A Mycop<strong>la</strong>sma pneumoniae se le atribuye <strong>en</strong>tre un 15 a 20% <strong>de</strong> <strong>la</strong>s neumonías adquiridas<br />
<strong>en</strong> <strong>la</strong> comunidad <strong>en</strong> los adultos mayores. Este estudio, el primero realizado <strong>en</strong> Chile <strong>para</strong><br />
adultos mayores, se hizo <strong>para</strong> conocer <strong>la</strong> frecu<strong>en</strong>cia, mediante <strong>la</strong> técnica <strong>de</strong> <strong>Reacción</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
<strong>Polimerasa</strong> <strong>en</strong> Ca<strong>de</strong>na, <strong>de</strong> Mycop<strong>la</strong>sma pneumoniae <strong>en</strong> este grupo etario y <strong>para</strong> probar <strong>la</strong><br />
s<strong>en</strong>sibilidad y especificidad analítica <strong>de</strong> ésta usando los partidores <strong>para</strong> el g<strong>en</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
adhesina P1 y el g<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S <strong>en</strong> el diagnóstico <strong>de</strong> dicho microorganismo, datos<br />
que no han sido estandarizados, como sí lo son <strong>la</strong>s pruebas diagnósticas <strong>de</strong> Serología. Sin<br />
embargo, <strong>la</strong>s pruebas <strong>de</strong> Serología no cu<strong>en</strong>tan con una s<strong>en</strong>sibilidad lo sufici<strong>en</strong>tem<strong>en</strong>te<br />
bu<strong>en</strong>a, por lo que es necesario aplicar técnicas más s<strong>en</strong>sibles y rápidas <strong>para</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong><br />
Mycop<strong>la</strong>sma pneumoniae como lo es <strong>la</strong> <strong>Reacción</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>Polimerasa</strong> <strong>en</strong> Ca<strong>de</strong>na. Para llevar a<br />
cabo el estudio se tomaron muestras <strong>de</strong> expectoración y <strong>de</strong> sangre a 84 adultos mayores con<br />
neumonía adquirida <strong>en</strong> <strong>la</strong> comunidad, pert<strong>en</strong>eci<strong>en</strong>tes al Hospital Clínico <strong>de</strong> <strong>la</strong> Universidad<br />
<strong>de</strong> Chile, <strong>en</strong>tre Agosto <strong>de</strong> 2002 a Septiembre <strong>de</strong> 2004, a los cuales se les realizó <strong>la</strong> técnica<br />
<strong>de</strong> <strong>Reacción</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>Polimerasa</strong> <strong>en</strong> Ca<strong>de</strong>na <strong>para</strong> ambos g<strong>en</strong>es y <strong>la</strong> técnica <strong>de</strong> Serología<br />
Inmunofluoresc<strong>en</strong>cia Indirecta <strong>para</strong> IgM e IgG. A partir <strong>de</strong> los datos obt<strong>en</strong>idos se <strong>de</strong>terminó<br />
que el porc<strong>en</strong>taje <strong>de</strong> Mycop<strong>la</strong>sma pneumoniae pres<strong>en</strong>te <strong>en</strong> los paci<strong>en</strong>tes con neumonía fue<br />
<strong>de</strong> 8.3%, cifra inferior a <strong>la</strong> citada por <strong>la</strong> literatura y a <strong>la</strong> obt<strong>en</strong>ida mediante <strong>la</strong><br />
complem<strong>en</strong>tación <strong>de</strong> <strong>la</strong>s técnicas <strong>de</strong> <strong>Reacción</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>Polimerasa</strong> <strong>en</strong> Ca<strong>de</strong>na y serología.<br />
Entre ambos partidores no exist<strong>en</strong> difer<strong>en</strong>cias significativas <strong>en</strong> cuanto a su s<strong>en</strong>sibilidad y<br />
especificidad analítica. No obstante, se requiere <strong>de</strong> más estudios que verifiqu<strong>en</strong> <strong>la</strong> calidad<br />
<strong>de</strong> estas técnicas <strong>para</strong> que llegu<strong>en</strong> a estandarizarse y constituir así técnicas <strong>de</strong> diagnóstico<br />
rápido <strong>de</strong> Mycop<strong>la</strong>sma pneumoniae, lo cual contribuiría importantem<strong>en</strong>te a <strong>la</strong> clínica.<br />
i
ABSTRACT<br />
15 to 20% of the pneumonias acquired by the el<strong>de</strong>rly community are attributed to<br />
Mycop<strong>la</strong>sma pneumoniae. This study, the first ever ma<strong>de</strong> in Chile on the el<strong>de</strong>rly, was<br />
<strong>de</strong>veloped to know the frequ<strong>en</strong>cy of Mycop<strong>la</strong>sma pneumoniae in this group using the<br />
polymerase chain reaction, and test the s<strong>en</strong>sitivity and its analytic specificity using starters<br />
to the adhesine P1 g<strong>en</strong>e and 16S rRNA g<strong>en</strong>e in the diagnosis of such microorganism, the<br />
data has not be<strong>en</strong> standarized, unlike the serologic diagnostic tests. However, the serologic<br />
tests do not have a suffici<strong>en</strong>t s<strong>en</strong>sitivity, which makes necessary to apply methods with<br />
better s<strong>en</strong>sitivity and that require less time to <strong>de</strong>tect Mycop<strong>la</strong>sma pneumoniae, like the<br />
polymerase chain reaction. In or<strong>de</strong>r to perform the study, we collected expectoration and<br />
blood samples from 84 el<strong>de</strong>rly pati<strong>en</strong>ts with pneumonia acquired in the community, who<br />
were treated at Hospital Clínico <strong>de</strong> <strong>la</strong> Universidad <strong>de</strong> Chile, during August 2002 to<br />
September 2004, and polymerase chain reaction was performed for both g<strong>en</strong>es and the<br />
serologic method of indirect inmunoflouresc<strong>en</strong>ce for IgM and IgG. The data revealed that<br />
the perc<strong>en</strong>tage of Mycop<strong>la</strong>sma pneumoniae pres<strong>en</strong>ts in pati<strong>en</strong>ts with pneumonia with<br />
Polymerase Chain Reaction was an 8.3%, which is lower than that shown by literature y<br />
also lower to the figure obtained wh<strong>en</strong> combining both methods. There are no significative<br />
differ<strong>en</strong>ces betwe<strong>en</strong> the two starters wh<strong>en</strong> it comes to s<strong>en</strong>sitivity and analytic specificity.<br />
However, we require more studies to verify the quality of these methods so they can be<br />
standarized and that way they can constitute quick diagnostic techniques for Mycop<strong>la</strong>sma<br />
pneumoniae, which would be a great contribution to clinical practice.<br />
ii
ºC: Grados Celsius<br />
cc: C<strong>en</strong>tímetros Cúbicos<br />
dNTP: Desoxirribonucleótido Trifosfato<br />
DNA: Ácido Desoxirribonucleico<br />
EIA: Enzimoinmuno<strong>en</strong>sayo<br />
FC: Fijación <strong>de</strong> Complem<strong>en</strong>to<br />
g: Gramos<br />
IFI: Inmunofluoresc<strong>en</strong>cia Indirecta<br />
IgG: Inmunoglobulina G<br />
IgM :Inmunoglobulina M<br />
IRA: Infecciones Respiratorias Agudas<br />
kpb: Kilopares <strong>de</strong> bases<br />
MDa: Megadalton<br />
min: minutos<br />
NAC: Neumonía Adquirida <strong>en</strong> <strong>la</strong> Comunidad<br />
pb: Pares <strong>de</strong> bases<br />
PBS: Solución Buffer Fosfato<br />
PCR: <strong>Reacción</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>Polimerasa</strong> <strong>en</strong> Ca<strong>de</strong>na<br />
pg: Picogramos.<br />
RNA: Ácido Ribonucleico<br />
rRNA: Ácido Ribonucleico Ribosomal<br />
sem: Semanas<br />
ABREVIATURAS<br />
iii
Taq: Thermus aquaticus<br />
µl: Microlitros<br />
µM: Micromo<strong>la</strong>r<br />
µm: Micrómetros<br />
U: Unidad Enzimática<br />
UV: Ultravioleta<br />
V: Volt<br />
iv
Importancia <strong>de</strong>l Problema<br />
INTRODUCCION<br />
Mycop<strong>la</strong>sma pneumoniae constituye uno <strong>de</strong> los patóg<strong>en</strong>os respiratorios <strong>de</strong> mayor<br />
frecu<strong>en</strong>cia <strong>en</strong> el mundo. Es causa <strong>de</strong> infecciones respiratorias agudas altas y bajas, si<strong>en</strong>do<br />
<strong>la</strong> neumonía una <strong>de</strong> <strong>la</strong>s manifestaciones clínicas más frecu<strong>en</strong>tes. Aunque M. pneumoniae<br />
causa infecciones respiratorias <strong>en</strong> personas <strong>de</strong> todas <strong>la</strong>s eda<strong>de</strong>s, se consi<strong>de</strong>ra que los niños y<br />
los adultos jóv<strong>en</strong>es son los grupos más frecu<strong>en</strong>tem<strong>en</strong>te afectados. Sin embargo, existe<br />
escasa información epi<strong>de</strong>miológica <strong>en</strong> el adulto mayor. El diagnóstico <strong>de</strong> <strong>la</strong>boratorio<br />
oportuno <strong>de</strong> M. pneumoniae es útil <strong>para</strong> confirmar el diagnóstico clínico, lo que pue<strong>de</strong><br />
t<strong>en</strong>er utilidad terapéutica, disminuy<strong>en</strong>do el empleo <strong>de</strong> antimicrobianos inapropiados y<br />
también el impacto epi<strong>de</strong>miológico, al permitir conocer mejor <strong>la</strong> preval<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> <strong>la</strong>s<br />
neumonías atípicas (Lieberman, 1997). No obstante, el diagnóstico <strong>de</strong> M. pneumoniae por<br />
<strong>la</strong>s técnicas clásicas <strong>de</strong> diagnóstico como cultivo y fijación <strong>de</strong>l complem<strong>en</strong>to ti<strong>en</strong>e escaso<br />
r<strong>en</strong>dimi<strong>en</strong>to, lo que ha dificultado su aplicación <strong>en</strong> <strong>la</strong> clínica y el conocimi<strong>en</strong>to <strong>de</strong>l<br />
verda<strong>de</strong>ro impacto que ti<strong>en</strong>e como causa <strong>de</strong> neumonía y otras IRA. Es así como el<br />
ais<strong>la</strong>mi<strong>en</strong>to <strong>de</strong> este ag<strong>en</strong>te infeccioso a través <strong>de</strong> cultivo, aunque es 100% específico, ti<strong>en</strong>e<br />
alre<strong>de</strong>dor <strong>de</strong> 60% <strong>de</strong> s<strong>en</strong>sibilidad y requiere <strong>de</strong> varias semanas <strong>para</strong> obt<strong>en</strong>er resultados,<br />
por lo que no es útil <strong>en</strong> <strong>la</strong> clínica (K<strong>en</strong>ny y Kaiser, 1990).<br />
La reacción <strong>de</strong> fijación <strong>de</strong> complem<strong>en</strong>to ti<strong>en</strong>e baja s<strong>en</strong>sibilidad y requiere muestras<br />
pareadas <strong>de</strong> suero <strong>para</strong> <strong>de</strong>mostrar seroconversión. Su especificidad es limitada, ya que<br />
emplea como antíg<strong>en</strong>o a una mezc<strong>la</strong> <strong>de</strong> glicolípidos <strong>de</strong> membrana, que conduce a <strong>la</strong><br />
producción <strong>de</strong> reacciones falso-positivas (Joklik y cols, 1997).<br />
1
También se ha tratado <strong>de</strong> diagnosticar M. pneumoniae a través <strong>de</strong> <strong>la</strong> búsqueda <strong>de</strong><br />
anticuerpos específicos con técnicas <strong>de</strong> “ELISA” o “Inmunofluoresc<strong>en</strong>cia Indirecta”, <strong>la</strong>s<br />
que permit<strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> IgM e IgG se<strong>para</strong>dam<strong>en</strong>te. Esto ha permitido el diagnóstico<br />
rápido y efici<strong>en</strong>te <strong>de</strong> neumonía <strong>en</strong> niños, mediante <strong>la</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> IgM. No obstante, <strong>la</strong><br />
producción <strong>de</strong> IgM va disminuy<strong>en</strong>do con <strong>la</strong> edad, <strong>de</strong>bido principalm<strong>en</strong>te a <strong>la</strong>s<br />
reinfecciones, lo que obliga a tomar muestras pareadas <strong>de</strong> suero (Sillis, 1990; Jacobs,<br />
1993; Dorigo-Zetsma, 2001). También se ha seña<strong>la</strong>do que <strong>la</strong> capacidad <strong>de</strong> <strong>la</strong> respuesta<br />
inmune humoral es m<strong>en</strong>or <strong>en</strong> adultos mayores, lo que limita <strong>la</strong> utilidad <strong>de</strong> <strong>la</strong> serología<br />
(Dorigo-Zetsma y cols, 2001).<br />
Por <strong>la</strong>s limitaciones que ti<strong>en</strong><strong>en</strong> estas técnicas, es preciso dilucidar procedimi<strong>en</strong>tos<br />
<strong>de</strong> diagnóstico más s<strong>en</strong>sibles y rápidos <strong>para</strong> el diagnóstico <strong>de</strong> M. pneumoniae. La <strong>Reacción</strong><br />
<strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>Polimerasa</strong> <strong>en</strong> Ca<strong>de</strong>na, técnica basada <strong>en</strong> <strong>la</strong> amplificación <strong>de</strong> los ácidos nucleicos,<br />
permite contar con una aproximación difer<strong>en</strong>te <strong>para</strong> i<strong>de</strong>ntificar secu<strong>en</strong>cias <strong>de</strong> DNA <strong>de</strong><br />
ag<strong>en</strong>tes infecciosos. Se caracteriza por poseer una gran s<strong>en</strong>sibilidad y especificidad con<br />
re<strong>la</strong>ción a <strong>la</strong>s otras técnicas antes m<strong>en</strong>cionadas, proporcionando resultados <strong>en</strong> sólo horas,<br />
por lo que ti<strong>en</strong>e un gran pot<strong>en</strong>cial <strong>de</strong> aplicación <strong>para</strong> el diagnóstico <strong>de</strong> microorganismos,<br />
que como M. pneumoniae, crec<strong>en</strong> l<strong>en</strong>tam<strong>en</strong>te <strong>en</strong> medios <strong>de</strong> cultivo.<br />
Exist<strong>en</strong> varios b<strong>la</strong>ncos <strong>para</strong> <strong>la</strong> amplificación <strong>de</strong>l DNA <strong>de</strong> M. pneumoniae, como los<br />
g<strong>en</strong>es <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S y el g<strong>en</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> adhesina P1. Ambos han sido utilizados <strong>para</strong> el<br />
diagnóstico <strong>de</strong> este microorganismo, <strong>de</strong>mostrando t<strong>en</strong>er mayor s<strong>en</strong>sibilidad que el<br />
ais<strong>la</strong>mi<strong>en</strong>to <strong>en</strong> cultivo (Tjhie y cols, 1994; Iev<strong>en</strong> y cols, 1996; Abele-Horn y cols, 1998). Al<br />
com<strong>para</strong>r ambos partidores, Williamson e Iev<strong>en</strong> y cols, <strong>en</strong>contraron resultados discrepantes<br />
<strong>en</strong> cuanto a <strong>la</strong> s<strong>en</strong>sibilidad, el primero afirma haber <strong>en</strong>contrado mayor número <strong>de</strong> muestras<br />
2
positivas con los partidores <strong>para</strong> el g<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S, mi<strong>en</strong>tras que el segundo <strong>en</strong>contró<br />
que los partidores <strong>para</strong> el g<strong>en</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> adhesina P1 son más s<strong>en</strong>sibles.<br />
Debido a <strong>la</strong>s difer<strong>en</strong>cias <strong>en</strong>contradas <strong>en</strong> estos estudios es que nos interesa dilucidar<br />
cual <strong>de</strong> los dos b<strong>la</strong>ncos pres<strong>en</strong>ta mayor precisión <strong>en</strong> el diagnóstico <strong>de</strong> dicho<br />
microorganismo.<br />
3
Pregunta <strong>de</strong> Investigación<br />
¿Cuál es el porc<strong>en</strong>taje <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> Mycop<strong>la</strong>sma pneumoniae <strong>en</strong> adultos mayores<br />
con neumonía adquirida <strong>en</strong> <strong>la</strong> comunidad?<br />
¿Exist<strong>en</strong> difer<strong>en</strong>cias <strong>en</strong>tre <strong>la</strong> técnica <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>Reacción</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>Polimerasa</strong> <strong>en</strong> Ca<strong>de</strong>na que<br />
utiliza como b<strong>la</strong>nco el g<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S y <strong>la</strong> que usa al g<strong>en</strong> P1, <strong>en</strong> cuanto a<br />
s<strong>en</strong>sibilidad analítica y especificidad <strong>para</strong> el diagnóstico <strong>de</strong> Mycop<strong>la</strong>sma pneumoniae <strong>en</strong><br />
muestras respiratorias <strong>de</strong> adultos mayores con neumonía adquirida <strong>en</strong> <strong>la</strong> comunidad?<br />
4
Revisión Bibliográfica<br />
• Biología <strong>de</strong> los Mycop<strong>la</strong>smas<br />
Taxonomía y hábitat:<br />
MARCO TEORICO<br />
Los mycop<strong>la</strong>smas son uno <strong>de</strong> los microorganismos procariotas más pequeños capaces <strong>de</strong><br />
crecer y multiplicarse <strong>en</strong> forma libre. La propiedad singu<strong>la</strong>r que los difer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> <strong>la</strong>s<br />
bacterias clásicas es <strong>la</strong> aus<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> pared celu<strong>la</strong>r. Pert<strong>en</strong>ec<strong>en</strong> a <strong>la</strong> c<strong>la</strong>se Mollicutes (Mollis:<br />
b<strong>la</strong>ndo; Kutis: piel), y <strong>en</strong> lo que a Mycop<strong>la</strong>sma pneumoniae respecta, éste pert<strong>en</strong>ece a <strong>la</strong><br />
familia Mycop<strong>la</strong>smataceae y al or<strong>de</strong>n Mycop<strong>la</strong>smatales (Pinto, 1986). El g<strong>en</strong>oma <strong>de</strong> los<br />
miembros <strong>de</strong> <strong>la</strong> familia Mycop<strong>la</strong>smataceae consiste <strong>en</strong> una molécu<strong>la</strong> circu<strong>la</strong>r <strong>de</strong> DNA <strong>de</strong><br />
doble ca<strong>de</strong>na, <strong>de</strong> 500 MDa (alre<strong>de</strong>dor <strong>de</strong> 750 kpb) distinguiéndose <strong>de</strong>l g<strong>en</strong>oma <strong>de</strong> otras<br />
bacterias por su bajo cont<strong>en</strong>ido <strong>de</strong> guanina y citosina (Joklik y cols.,1997).<br />
Los mycop<strong>la</strong>smas son microorganismos ubicuos que exist<strong>en</strong> como parásitos <strong>en</strong><br />
muchas especies animales y vegetales. Son patóg<strong>en</strong>os oportunistas que causan una amplia<br />
variedad <strong>de</strong> <strong>en</strong>fermeda<strong>de</strong>s infecciosas. En el hombre, M. pneumoniae es el repres<strong>en</strong>tante<br />
más importante, si<strong>en</strong>do <strong>la</strong> causa <strong>de</strong> alre<strong>de</strong>dor <strong>de</strong>l 15-20% <strong>de</strong> <strong>la</strong>s NAC (Foy, 1993). Fue<br />
i<strong>de</strong>ntificado por primera vez <strong>en</strong> el año 1962 como ag<strong>en</strong>te etiológico <strong>de</strong> “neumonía primaria<br />
atípica” <strong>en</strong> humanos (Pinto, 1986).<br />
Estructura y fisiología:<br />
Los mycop<strong>la</strong>smas son célu<strong>la</strong>s pleomórficas ro<strong>de</strong>adas por una membrana celu<strong>la</strong>r que<br />
conti<strong>en</strong>e colesterol. Su tamaño osci<strong>la</strong> <strong>en</strong>tre 0,2 y 0,8 µm <strong>de</strong> diámetro. La replicación es<br />
básicam<strong>en</strong>te por fisión binaria, pero <strong>la</strong> replicación <strong>de</strong>l g<strong>en</strong>oma no necesariam<strong>en</strong>te está<br />
sincronizada con <strong>la</strong> división celu<strong>la</strong>r, lo que origina <strong>la</strong> formación <strong>de</strong> formas fi<strong>la</strong>m<strong>en</strong>tosas.<br />
5
La forma <strong>de</strong> <strong>la</strong> célu<strong>la</strong> <strong>de</strong>p<strong>en</strong><strong>de</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> especie <strong>de</strong> mycop<strong>la</strong>sma, <strong>de</strong> <strong>la</strong> calidad nutricional, <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
presión osmótica <strong>de</strong>l medio <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to y <strong>de</strong> <strong>la</strong> fase <strong>de</strong> crecimi<strong>en</strong>to <strong>de</strong>l cultivo, pero <strong>en</strong><br />
g<strong>en</strong>eral <strong>de</strong>stacan <strong>la</strong>s formas cocoi<strong>de</strong>s ó <strong>la</strong>s formas fi<strong>la</strong>m<strong>en</strong>tosas. Varias especies <strong>de</strong><br />
mycop<strong>la</strong>sma, <strong>en</strong>tre <strong>la</strong>s cuales <strong>de</strong>staca M. pneumoniae, pose<strong>en</strong> una estructura terminal con<br />
un c<strong>en</strong>tro electro<strong>de</strong>nso <strong>de</strong>nominada “tip” que les permite adherirse y colonizar <strong>la</strong>s mucosas<br />
respiratorias <strong>de</strong>l hospe<strong>de</strong>ro.<br />
Este organelo <strong>de</strong> adher<strong>en</strong>cia participa también <strong>en</strong> <strong>la</strong> movilidad por “gliding” ó<br />
<strong>de</strong>slizami<strong>en</strong>to y <strong>en</strong> <strong>la</strong> división celu<strong>la</strong>r. Varias adhesinas <strong>de</strong> naturaleza proteica: HMW 1-3,<br />
P30, P40, P65 y P90, han sido localizadas <strong>en</strong> este organelo junto a <strong>la</strong> proteína principal, P1<br />
(Seto y Miyata,, 2003).<br />
Los mycop<strong>la</strong>smas son uno <strong>de</strong> los grupos bacterianos <strong>de</strong> mayores requerimi<strong>en</strong>tos<br />
nutritivos. Su crecimi<strong>en</strong>to <strong>en</strong> estrecho contacto con <strong>la</strong> célu<strong>la</strong> hospe<strong>de</strong>ra ha contribuido<br />
probablem<strong>en</strong>te a su <strong>de</strong>p<strong>en</strong><strong>de</strong>ncia por una amplia gama <strong>de</strong> nutri<strong>en</strong>tes. Ellos carec<strong>en</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong>s<br />
vías <strong>en</strong>zimáticas que sintetizan purinas y pirimidinas y requier<strong>en</strong> a<strong>de</strong>más colesterol <strong>para</strong> <strong>la</strong><br />
síntesis <strong>de</strong> <strong>la</strong> membrana. Por consigui<strong>en</strong>te, <strong>para</strong> el ais<strong>la</strong>mi<strong>en</strong>to in vitro se requier<strong>en</strong> medios<br />
<strong>de</strong> cultivo complejos como el caldo con infusión <strong>de</strong> corazón <strong>de</strong> buey suplem<strong>en</strong>tado con<br />
suero <strong>de</strong> caballo y extracto <strong>de</strong> levadura.<br />
El cultivo <strong>de</strong> M. pneumoniae es l<strong>en</strong>to, requiri<strong>en</strong>do 3 – 6 semanas <strong>para</strong> dar orig<strong>en</strong> a<br />
colonias visibles al microscopio, lo cual se <strong>de</strong>be a que el tiempo <strong>de</strong> g<strong>en</strong>eración <strong>de</strong>l<br />
microorganismo, 1 a 6 horas, es más <strong>la</strong>rgo que el <strong>de</strong> <strong>la</strong>s bacterias clásicas (Joklik y cols.,<br />
1997).<br />
M. pneumoniae se adsorbe a los eritrocitos <strong>de</strong> varias especies y los aglutina, lo que<br />
permite i<strong>de</strong>ntificar rápidam<strong>en</strong>te <strong>la</strong>s colonias que forma <strong>en</strong> agar.<br />
6
• Mycop<strong>la</strong>sma pneumoniae<br />
Epi<strong>de</strong>miología:<br />
Las infecciones producidas por M. pneumoniae ti<strong>en</strong><strong>en</strong> distribución universal. Las<br />
infecciones se pres<strong>en</strong>tan durante todo el año, con una mayor inci<strong>de</strong>ncia a fines <strong>de</strong>l verano<br />
y durante el otoño. Con intervalos <strong>de</strong> 4 a 6 años se pres<strong>en</strong>tan períodos epidémicos <strong>en</strong> los<br />
cuales <strong>la</strong> inci<strong>de</strong>ncia suele elevarse hasta 5 veces sobre los niveles <strong>en</strong>démicos (Pinto, 1986).<br />
No obstante, <strong>la</strong> diseminación habitualm<strong>en</strong>te es l<strong>en</strong>ta y <strong>la</strong>s verda<strong>de</strong>ras epi<strong>de</strong>mias son raras<br />
excepto <strong>en</strong> pob<strong>la</strong>ciones confinadas <strong>de</strong> personas, grupos <strong>en</strong> que M. pneumoniae es el<br />
responsable <strong>de</strong> <strong>la</strong> mitad <strong>de</strong> <strong>la</strong>s neumonías. La transmisión se produce por vía aérea, a través<br />
<strong>de</strong> gotitas <strong>de</strong> aerosol.<br />
M. pneumoniae ha sido <strong>de</strong>tectado como causa <strong>de</strong> <strong>la</strong>s NAC <strong>en</strong> los adultos <strong>en</strong> un 9-<br />
29%. Existe escasa información epi<strong>de</strong>miológica <strong>en</strong> el adulto mayor ya que tradicionalm<strong>en</strong>te<br />
ha sido consi<strong>de</strong>rado un patóg<strong>en</strong>o respiratorio frecu<strong>en</strong>te <strong>en</strong> niños y adultos m<strong>en</strong>ores <strong>de</strong> 40<br />
años; si<strong>en</strong>do un grupo rara vez afectado los m<strong>en</strong>ores <strong>de</strong> 6 meses, postulándose <strong>la</strong> exist<strong>en</strong>cia<br />
<strong>de</strong> anticuerpos maternos (Pinto, 1986).<br />
Lieberman y cols. investigaron mediante serología <strong>la</strong> etiología bacteriana y viral <strong>de</strong><br />
<strong>la</strong> NAC <strong>en</strong> 346 adultos <strong>en</strong> Israel. M. pneumoniae fue <strong>de</strong>tectado globalm<strong>en</strong>te <strong>en</strong> 38.2% <strong>de</strong><br />
los casos, con valores <strong>de</strong> preval<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> 14.8% y 13.0% <strong>en</strong> adultos <strong>en</strong>tre 55-64 años y <strong>en</strong>tre<br />
65-74 años, respectivam<strong>en</strong>te. A su vez, Dorigo-Zetsma y cols. diagnosticaron a M.<br />
pneumoniae mediante PCR o serología, <strong>en</strong> 12.5% <strong>de</strong> 144 adultos, con un promedio <strong>de</strong><br />
edad <strong>de</strong> 68 años, hospitalizados por NAC <strong>en</strong> Ho<strong>la</strong>nda.<br />
7
Mecanismos <strong>de</strong> patog<strong>en</strong>icidad:<br />
M. pneumoniae ti<strong>en</strong>e predilección por el tracto respiratorio inferior, con <strong>la</strong> invasión<br />
<strong>de</strong>l torr<strong>en</strong>te sanguíneo como un episodio raro, al igual que <strong>la</strong> ext<strong>en</strong>sión a otros tejidos. Aún<br />
no se ha <strong>de</strong>terminado c<strong>la</strong>ram<strong>en</strong>te <strong>en</strong> qué forma p<strong>en</strong>etra <strong>en</strong> el gel <strong>de</strong> mucina que recubre el<br />
epitelio respiratorio, pero se pi<strong>en</strong>sa que su movilidad por <strong>de</strong>slizami<strong>en</strong>to facilita <strong>la</strong><br />
p<strong>en</strong>etración, mi<strong>en</strong>tras que su tamaño diminuto y p<strong>la</strong>sticidad le permit<strong>en</strong> adaptar su forma<br />
<strong>para</strong> conformarse a los contornos <strong>de</strong> <strong>la</strong> superficie <strong>de</strong> <strong>la</strong> célu<strong>la</strong> huésped. (Joklik y cols.,<br />
1997).<br />
Una vez adherido <strong>en</strong> tráquea, bronquios y sus divisiones se manti<strong>en</strong>e <strong>en</strong> forma<br />
epicelu<strong>la</strong>r. La <strong>de</strong>strucción <strong>de</strong>l epitelio respiratorio y <strong>la</strong> parálisis <strong>de</strong> los cilios explica <strong>la</strong> tos<br />
int<strong>en</strong>sa y prolongada que acompaña a los cuadros clínicos. El mecanismo preciso <strong>de</strong>l daño<br />
celu<strong>la</strong>r es <strong>de</strong>sconocido, pero exist<strong>en</strong> evi<strong>de</strong>ncias <strong>de</strong> que tanto el peróxido <strong>de</strong> hidróg<strong>en</strong>o<br />
como el anión superóxido producido por el microorganismo causarían <strong>la</strong> alteración<br />
metabólica y citonecrosis <strong>de</strong> <strong>la</strong>s célu<strong>la</strong>s respiratorias. En una primera etapa <strong>la</strong> cata<strong>la</strong>sa <strong>de</strong>l<br />
huésped contrarrestaría el efecto <strong>de</strong> los radicales oxidativos, pero el progresivo daño por<br />
oxidación produciría una importante lesión, especialm<strong>en</strong>te <strong>de</strong> <strong>la</strong> membrana celu<strong>la</strong>r y <strong>la</strong><br />
consecu<strong>en</strong>te muerte celu<strong>la</strong>r (Pinto, 1986).<br />
Manifestaciones clínicas:<br />
El síndrome clínico más común es <strong>la</strong> traqueobronquitis, <strong>la</strong> cual es responsable <strong>de</strong><br />
alre<strong>de</strong>dor <strong>de</strong>l 70 al 80% <strong>de</strong> <strong>la</strong>s infecciones por mycop<strong>la</strong>smas. La neumonía es <strong>la</strong> segunda<br />
manifestación clínica <strong>en</strong> frecu<strong>en</strong>cia, pres<strong>en</strong>tándose <strong>en</strong> un tercio <strong>de</strong> <strong>la</strong>s personas <strong>en</strong>fermas<br />
(Joklik y cols., 1997). Esta patología ti<strong>en</strong>e especial relevancia, ya que constituye una<br />
importante causa <strong>de</strong> morbi-mortalidad <strong>en</strong> Chile y el mundo (INE, 2000)<br />
8
La Sociedad Chil<strong>en</strong>a <strong>de</strong> Enfermeda<strong>de</strong>s Respiratorias <strong>en</strong> el año 2004, <strong>de</strong>fine a <strong>la</strong><br />
neumonía adquirida <strong>en</strong> <strong>la</strong> comunidad como una <strong>en</strong>fermedad pulmonar <strong>de</strong> orig<strong>en</strong> infeccioso<br />
que afecta principalm<strong>en</strong>te a niños m<strong>en</strong>ores <strong>de</strong> 2 años y ancianos, que según su gravedad<br />
pue<strong>de</strong> llegar a ser mortal y que se adquiere <strong>en</strong> <strong>la</strong> comunidad. Se trata <strong>de</strong> una infección o<br />
inf<strong>la</strong>mación aguda <strong>de</strong>l parénquima pulmonar, que comi<strong>en</strong>za a ll<strong>en</strong>arse <strong>de</strong> líquido y exudado<br />
purul<strong>en</strong>to, lo que interfiere con <strong>la</strong> <strong>en</strong>trega <strong>de</strong> oxíg<strong>en</strong>o a <strong>la</strong> circu<strong>la</strong>ción sanguínea y los<br />
tejidos, afectando el metabolismo celu<strong>la</strong>r.<br />
En cuanto a los ag<strong>en</strong>tes etiológicos <strong>de</strong> <strong>la</strong>s NAC, ellos son posibles <strong>de</strong> i<strong>de</strong>ntificar <strong>en</strong><br />
un porc<strong>en</strong>taje regu<strong>la</strong>r <strong>de</strong> los casos. La mayor parte <strong>de</strong> los estudios publicados coinci<strong>de</strong>n <strong>en</strong><br />
que el Streptococcus pneumoniae es el principal germ<strong>en</strong> involucrado <strong>en</strong> <strong>la</strong>s NAC<br />
(Nie<strong>de</strong>rman y cols., 2001), estando implicado <strong>en</strong> alre<strong>de</strong>dor <strong>de</strong> un tercio <strong>de</strong> los casos <strong>de</strong><br />
NAC. Otro tercio es causado por <strong>la</strong>s bacterias atípicas como M. pneumoniae y Ch<strong>la</strong>mydia<br />
pneumoniae y por virus respiratorios. A<strong>de</strong>más, microorganismos como Haemophilus<br />
influ<strong>en</strong>zae, Moraxel<strong>la</strong> catarrhalis, Staphylococcus aureus, bacilos Gram negativos y<br />
Legionel<strong>la</strong> spp. , se asocian a NAC con m<strong>en</strong>or frecu<strong>en</strong>cia (Cruz M<strong>en</strong>a y Mor<strong>en</strong>o, 1999).No<br />
obstante, <strong>en</strong> no m<strong>en</strong>os <strong>de</strong>l tercio <strong>de</strong> los casos <strong>de</strong> NAC no se ratifica el ag<strong>en</strong>te causal (Ewig,<br />
1997).<br />
La importancia <strong>de</strong> conocer el ag<strong>en</strong>te causal <strong>de</strong> esta patología, se <strong>de</strong>be a que <strong>la</strong> NAC<br />
constituye <strong>la</strong> primera causa <strong>de</strong> muerte por <strong>en</strong>fermeda<strong>de</strong>s infecciosas <strong>en</strong> Chile y el mundo<br />
(Acuña y cols., 1999). Incluso, <strong>en</strong> 1998, el 60,1% <strong>de</strong> <strong>la</strong> mortalidad por causas respiratorias<br />
<strong>en</strong> Chile se <strong>de</strong>bió al diagnóstico <strong>de</strong> neumonía <strong>en</strong> sus difer<strong>en</strong>tes categorías. De estas<br />
categorías diagnósticas, el 97% <strong>de</strong> los casos fatales correspondió a neumonías bacterianas<br />
<strong>en</strong> <strong>la</strong>s que no hubo i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong>l ag<strong>en</strong>te causal <strong>de</strong>l cuadro respiratorio. La baja cifra <strong>de</strong><br />
9
i<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong>l ag<strong>en</strong>te causal confirma <strong>la</strong>s limitaciones <strong>en</strong> los métodos <strong>de</strong> diagnóstico<br />
utilizados masivam<strong>en</strong>te (Valdivia, 2004).<br />
La neumonía causada por M. pneumoniae es habitualm<strong>en</strong>te leve. Luego <strong>de</strong> un<br />
periodo <strong>de</strong> incubación <strong>de</strong> 2 a 3 semanas se produce un comi<strong>en</strong>zo gradual <strong>de</strong> fiebre<br />
mo<strong>de</strong>rada (37.8ºC a 39ºC), malestar g<strong>en</strong>eral, cefalea, mialgias y una tos persist<strong>en</strong>te no<br />
productiva, seca y <strong>en</strong>trecortada, <strong>la</strong> que persiste por 3 a 4 semanas y cuya aus<strong>en</strong>cia <strong>en</strong><br />
forma importante <strong>de</strong>be hacer dudar <strong>de</strong>l diagnóstico. Tales síntomas se dan <strong>en</strong> casi el 90%<br />
al 100% <strong>de</strong> los paci<strong>en</strong>tes (Hammersch<strong>la</strong>g, 1995).<br />
Al exam<strong>en</strong> pulmonar lo más <strong>de</strong>stacable es <strong>la</strong> pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> crepitaciones gruesas<br />
bi<strong>la</strong>terales (75% <strong>de</strong> los casos), roncus y sibi<strong>la</strong>ncias (40% <strong>de</strong> los casos).<br />
El recu<strong>en</strong>to <strong>de</strong> leucocitos periféricos durante los estadios tempranos <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
<strong>en</strong>fermedad pue<strong>de</strong> <strong>en</strong>contrarse <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> límites normales y elevarse a medida que ésta<br />
progresa. Los anticuerpos proporcionan protección contra <strong>la</strong> <strong>en</strong>fermedad alre<strong>de</strong>dor <strong>de</strong> 5<br />
años, <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> los cuales pue<strong>de</strong> haber reinfección (Joklik y cols., 1997).<br />
La proteína P1 constituye <strong>la</strong> principal adhesina <strong>de</strong> M. pneumoniae y a<strong>de</strong>más, un<br />
importante inmunóg<strong>en</strong>o. Los paci<strong>en</strong>tes con neumonía por este microorganismo siempre<br />
<strong>de</strong>sarrol<strong>la</strong>n anticuerpos contra esta proteína, lo que respalda su uso pot<strong>en</strong>cial como vacuna.<br />
Los anticuerpos anti P1 son <strong>de</strong>tectados durante <strong>la</strong> convalec<strong>en</strong>cia tanto <strong>en</strong> forma sérica<br />
como <strong>en</strong> <strong>la</strong>s secreciones respiratorias (Joklik y cols., 1997).<br />
La infección por M. pneumoniae se ha asociado a un sinnúmero <strong>de</strong> manifestaciones<br />
extrapulmonares, tales como manifestaciones hematológicas, <strong>de</strong>rmatológicas, cardiacas y<br />
neurológicas (<strong>en</strong> este último grupo <strong>la</strong> mortalidad llega a un 10% y <strong>la</strong>s secue<strong>la</strong>s son<br />
frecu<strong>en</strong>tes). La pres<strong>en</strong>tación <strong>de</strong> el<strong>la</strong>s se observa <strong>en</strong> un p<strong>la</strong>zo que osci<strong>la</strong> <strong>en</strong>tre 1 y 21 días <strong>de</strong><br />
10
iniciada <strong>la</strong> infección respiratoria. Son g<strong>en</strong>eralm<strong>en</strong>te <strong>de</strong> naturaleza b<strong>en</strong>igna y no <strong>de</strong>jan<br />
secue<strong>la</strong>s (Pinto, 1986).<br />
Tratami<strong>en</strong>to:<br />
En los paci<strong>en</strong>tes jóv<strong>en</strong>es con NAC, sin otras afecciones, pue<strong>de</strong> bastar con <strong>la</strong><br />
administración <strong>de</strong> antibióticos tales como p<strong>en</strong>icilinas, cefalosporinas <strong>de</strong> tercera g<strong>en</strong>eración<br />
y macrólidos. En el tratami<strong>en</strong>to <strong>de</strong> <strong>la</strong> neumonía por M. pneumoniae son los inhibidores <strong>de</strong><br />
<strong>la</strong> síntesis proteica, como <strong>la</strong>s tetraciclinas y <strong>la</strong> eritromicina (activo también sobre otros<br />
patóg<strong>en</strong>os bacterianos atípicos como Ch<strong>la</strong>mydia pneumoniae y Legionel<strong>la</strong> pneumophi<strong>la</strong>),<br />
los que surt<strong>en</strong> efecto <strong>de</strong>bido a que reduc<strong>en</strong> el curso clínico <strong>en</strong> términos <strong>de</strong> fiebre, número<br />
<strong>de</strong> días <strong>de</strong> internación y resolución sobre <strong>la</strong> base <strong>de</strong> <strong>la</strong>s radiografías (Pinto, 1986).<br />
En el hospital, es posible que sean necesarios los tratami<strong>en</strong>tos kinésicos <strong>para</strong> eliminar<br />
secreciones, lo cual contribuye a <strong>la</strong> permeabilización <strong>de</strong> <strong>la</strong> vía aérea, optimizando así <strong>la</strong><br />
llegada <strong>de</strong> oxíg<strong>en</strong>o y por tanto <strong>la</strong> función <strong>de</strong>l macrófago alveo<strong>la</strong>r el cual ha sido<br />
consi<strong>de</strong>rado <strong>la</strong> única célu<strong>la</strong> efici<strong>en</strong>tem<strong>en</strong>te fagocítica que barre <strong>la</strong> superficie alveo<strong>la</strong>r,<br />
creando un fr<strong>en</strong>te <strong>de</strong> <strong>de</strong>f<strong>en</strong>sa contra partícu<strong>la</strong>s inha<strong>la</strong>das y microbios, lo que le da el rol <strong>de</strong><br />
célu<strong>la</strong> efectora (Nathan, 1987). También es necesario <strong>en</strong> algunos casos <strong>la</strong> administración<br />
<strong>de</strong> oxíg<strong>en</strong>o, antibióticos intrav<strong>en</strong>osos y ocasionalm<strong>en</strong>te, se pue<strong>de</strong>n utilizar medicam<strong>en</strong>tos<br />
esteroidales <strong>para</strong> reducir sibi<strong>la</strong>ncias si existe una <strong>en</strong>fermedad pulmonar subyac<strong>en</strong>te. (Acuña<br />
y cols., 1999)<br />
11
• Diagnóstico <strong>de</strong> infecciones por M. pneumoniae<br />
Estudio radiológico:<br />
El patrón radiológico inicial es reticu<strong>la</strong>r e intersticial, más tar<strong>de</strong> se observa una<br />
distribución <strong>en</strong> parches o con compromiso segm<strong>en</strong>tario, especialm<strong>en</strong>te hacia <strong>la</strong>s bases.<br />
(Pinto, 1986).<br />
Diagnóstico <strong>de</strong> <strong>la</strong>boratorio:<br />
En los estadios tempranos <strong>de</strong> <strong>la</strong> infección el diagnóstico <strong>de</strong>be hacerse sobre bases<br />
clínicas, pero <strong>la</strong> confirmación microbiológica permite disminuir los tratami<strong>en</strong>tos<br />
inapropiados, acortar el tiempo e int<strong>en</strong>sidad <strong>de</strong> <strong>la</strong> sintomatología y evitar <strong>la</strong> diseminación<br />
<strong>de</strong> <strong>la</strong> infección a <strong>la</strong> comunidad. No existe una técnica <strong>de</strong> refer<strong>en</strong>cia <strong>para</strong> el diagnóstico <strong>de</strong><br />
M. pneumoniae. Las técnicas clásicas <strong>de</strong> diagnóstico: cultivo y serología mediante fijación<br />
<strong>de</strong>l complem<strong>en</strong>to, ti<strong>en</strong><strong>en</strong> limitaciones <strong>para</strong> ser usadas <strong>en</strong> <strong>la</strong> práctica clínica.<br />
Fijación <strong>de</strong> Complem<strong>en</strong>to: Es una técnica que mi<strong>de</strong> una mezc<strong>la</strong> <strong>de</strong> IgM e IgG. El antíg<strong>en</strong>o<br />
que se dispone comercialm<strong>en</strong>te conti<strong>en</strong>e glicolípidos <strong>de</strong> <strong>la</strong> membrana <strong>de</strong> M. pneumoniae,<br />
los que están re<strong>la</strong>cionados con una variedad <strong>de</strong> microorganismos y tejidos, lo que causa<br />
reacciones inespecíficas y es poco s<strong>en</strong>sible. Dado que suele existir un nivel <strong>de</strong> IgG alto <strong>en</strong><br />
<strong>la</strong> pob<strong>la</strong>ción, producto <strong>de</strong> infecciones anteriores, <strong>la</strong> FC requiere <strong>la</strong> toma <strong>de</strong> muestras<br />
pareadas <strong>de</strong> suero <strong>para</strong> <strong>de</strong>mostrar seroconversión (Jacobs y cols., 1986).<br />
Enzimoinmuno<strong>en</strong>sayo e Inmunofluoresc<strong>en</strong>cia Indirecta: Permit<strong>en</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> IgM e<br />
IgG <strong>en</strong> forma se<strong>para</strong>da, facilitando <strong>la</strong> difer<strong>en</strong>ciación <strong>en</strong>tre una infección activa y una<br />
previa.<br />
12
Luego <strong>de</strong> <strong>la</strong> infección por M. pneumoniae, <strong>la</strong> IgM aparece <strong>en</strong>tre los 7 y 10 días<br />
post infección, permiti<strong>en</strong>do efectuar diagnóstico <strong>de</strong> infección activa <strong>en</strong> una muestra única<br />
<strong>de</strong> suero <strong>en</strong> fase aguda (Jacobs y cols.,1986; Sillis, 1990). La <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> IgM es por ello<br />
un punto fundam<strong>en</strong>tal <strong>en</strong> el diagnóstico oportuno <strong>de</strong> infección por este microorganismo <strong>en</strong><br />
pediatría, con una s<strong>en</strong>sibilidad ≥80% (Waris y cols., 1998). Sin embargo, <strong>en</strong> adultos con<br />
reinfecciones por M. pneumoniae, se <strong>de</strong>tecta IgM con m<strong>en</strong>or frecu<strong>en</strong>cia, ó no se <strong>de</strong>tecta,<br />
lo que reduce su utilidad diagnóstica (Jacobs y cols., 1986; Sillis, 1990). Thacker y<br />
Talkington, <strong>en</strong> un estudio realizado el año 2000, com<strong>para</strong>ron 4 técnicas serológicas<br />
comerciales (tres EIA y una FC) <strong>en</strong> adultos durante un brote <strong>de</strong> infecciones por M.<br />
pneumoniae, <strong>de</strong>mostrando so<strong>la</strong>m<strong>en</strong>te 23-47% <strong>de</strong> s<strong>en</strong>sibilidad <strong>en</strong> aquel<strong>la</strong>s técnicas<br />
específicas <strong>para</strong> IgM, mi<strong>en</strong>tras que <strong>la</strong> combinación <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> IgM e IgG <strong>en</strong> muestras<br />
pareadas <strong>de</strong> suero <strong>en</strong> fase aguda y fase convaleci<strong>en</strong>te permitió mejorar <strong>la</strong> s<strong>en</strong>sibilidad <strong>de</strong><br />
diagnóstico <strong>de</strong> M. pneumoniae a valores <strong>de</strong> 94-99%.<br />
La IFI es una técnica clásica <strong>para</strong> el diagnóstico <strong>de</strong> M. pneumoniae. Consiste <strong>en</strong> una<br />
técnica <strong>de</strong> dos pasos que ti<strong>en</strong>e como objetivo <strong>la</strong> <strong>de</strong>mostración <strong>de</strong> anticuerpos circu<strong>la</strong>ntes <strong>en</strong><br />
el suero <strong>de</strong>l paci<strong>en</strong>te. Para ello se incuba el suero <strong>de</strong>l paci<strong>en</strong>te <strong>en</strong> estudio y posteriorm<strong>en</strong>te<br />
se incuba con anticuerpos marcados con fluoresceína dirigidos contra <strong>la</strong>s<br />
inmunoglobulinas. Es uno <strong>de</strong> los procedimi<strong>en</strong>tos más usados <strong>para</strong> el diagnóstico <strong>de</strong> este<br />
microorganismo <strong>en</strong> nuestro país, pero se emplea poco <strong>en</strong> el extranjero con fines <strong>de</strong><br />
diagnóstico, probablem<strong>en</strong>te, porque es una técnica que requiere personal técnico muy bi<strong>en</strong><br />
<strong>en</strong>tr<strong>en</strong>ado <strong>para</strong> su lectura.<br />
13
Técnicas <strong>de</strong> Amplificación <strong>de</strong> los Ácidos Nucleicos: Son aquel<strong>la</strong>s que permit<strong>en</strong><br />
amplificar secu<strong>en</strong>cias <strong>de</strong> ácidos nucleicos, DNA o RNA, específicos <strong>de</strong> cada<br />
microorganismo. Su aplicación <strong>en</strong> microbiología clínica surge como una necesidad <strong>para</strong><br />
<strong>de</strong>tectar microorganismos <strong>de</strong> difícil crecimi<strong>en</strong>to <strong>en</strong> cultivo, o <strong>de</strong>sarrollo tardío, y don<strong>de</strong> <strong>la</strong>s<br />
técnicas serológicas <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> antíg<strong>en</strong>os y anticuerpos carec<strong>en</strong> <strong>de</strong> sufici<strong>en</strong>te<br />
s<strong>en</strong>sibilidad y especificidad diagnóstica. (Simposio Internacional Infectología Aplicada<br />
<strong>para</strong> el Cono Sur, 1999). Es por los motivos antes m<strong>en</strong>cionados que estas técnicas ti<strong>en</strong><strong>en</strong><br />
un gran pot<strong>en</strong>cial <strong>para</strong> el diagnóstico <strong>de</strong> M. pneumoniae. Incluso <strong>en</strong> el diagnóstico <strong>en</strong><br />
niños, pue<strong>de</strong>n proporcionar resultados <strong>en</strong> sólo 24 horas (Skakni y cols., 1992; Williamson<br />
y cols., 1992; Tjhie y cols., 1994; Iev<strong>en</strong> y cols., 1996; Abele-Horn, y cols., 1998). Han<br />
<strong>de</strong>mostrado ser también útiles <strong>para</strong> el diagnóstico <strong>de</strong> infecciones por M. pneumoniae <strong>en</strong><br />
niños inmunocomprometidos, ó m<strong>en</strong>ores <strong>de</strong> 12 meses, <strong>en</strong> los cuales hay una m<strong>en</strong>or<br />
respuesta inmune humoral a este organismo (Skakni y cols., 1992). En adultos, los<br />
protocolos han sido com<strong>para</strong>dos con el cultivo y <strong>la</strong> serología, <strong>de</strong>mostrando ser más<br />
s<strong>en</strong>sibles que el cultivo y complem<strong>en</strong>tarios a <strong>la</strong> serología (Waring y cols., 2001; Tjhie y<br />
cols., 1994; Petitjean y cols., 2002).<br />
<strong>Reacción</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>Polimerasa</strong> <strong>en</strong> Ca<strong>de</strong>na: Procedimi<strong>en</strong>to dado a conocer <strong>en</strong> Abril <strong>de</strong> 1983 por<br />
Kary Mullis (Lozada, 1997). Es una técnica <strong>para</strong> <strong>la</strong> síntesis "in vitro" <strong>de</strong> secu<strong>en</strong>cias<br />
específicas <strong>de</strong> DNA y se basa <strong>en</strong> <strong>la</strong> capacidad que actualm<strong>en</strong>te se dispone <strong>para</strong> amplificar<br />
un segm<strong>en</strong>to pre<strong>de</strong>terminado <strong>de</strong> DNA, un número tal <strong>de</strong> veces (10 5 a 10 6 ) que es posible<br />
i<strong>de</strong>ntificarlo mediante procedimi<strong>en</strong>tos muy s<strong>en</strong>cillos (Lozada, 1997). Este método permite<br />
<strong>la</strong> amplificación <strong>de</strong> DNA <strong>de</strong> cualquier orig<strong>en</strong>, t<strong>en</strong>i<strong>en</strong>do como requisito <strong>para</strong> su máxima<br />
efici<strong>en</strong>cia y especificidad, conocer previam<strong>en</strong>te <strong>la</strong> secu<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> bases nitrog<strong>en</strong>adas que<br />
14
forman parte total o parcialm<strong>en</strong>te <strong>de</strong> un g<strong>en</strong> específico <strong>de</strong>l ag<strong>en</strong>te que se <strong>de</strong>sea estudiar. El<br />
método es tan s<strong>en</strong>sible que se pue<strong>de</strong>n i<strong>de</strong>ntificar g<strong>en</strong>es específicos <strong>de</strong> célu<strong>la</strong>s individuales<br />
(Lozada , 1997). Para mayores <strong>de</strong>talles <strong>de</strong> <strong>la</strong> técnica dirigirse a anexo.<br />
En lo que a M. pneumoniae respecta, según estudios realizados tanto por Dorigo-<br />
Zetsma y Abele-Horn <strong>en</strong> los años 2001 y 1998 respectivam<strong>en</strong>te, <strong>la</strong> PCR ha resultado t<strong>en</strong>er<br />
mayor s<strong>en</strong>sibilidad que <strong>la</strong> serología <strong>en</strong> inmunocomprometidos y adultos mayores.<br />
Se han <strong>de</strong>sarrol<strong>la</strong>do varios protocolos <strong>de</strong> PCR <strong>para</strong> el diagnóstico <strong>de</strong> este<br />
microorganismo. Lo<strong>en</strong>s y cols, <strong>en</strong> un estudio realizado <strong>en</strong> el año 2003, revisaron <strong>la</strong><br />
literatura disponible con re<strong>la</strong>ción a <strong>la</strong>s técnicas <strong>de</strong> amplificación, observando que muchos<br />
<strong>de</strong> los protocolos <strong>de</strong> PCR empleados no han sido lo sufici<strong>en</strong>tem<strong>en</strong>te evaluados. Por otra<br />
parte, es difícil com<strong>para</strong>r <strong>la</strong> s<strong>en</strong>sibilidad y especificidad <strong>de</strong> <strong>la</strong>s técnicas <strong>de</strong> PCR utilizadas<br />
<strong>en</strong> distintos estudios, ya que exist<strong>en</strong> difer<strong>en</strong>cias <strong>en</strong> <strong>la</strong>s muestras clínicas obt<strong>en</strong>idas, <strong>en</strong> el<br />
protocolo <strong>de</strong> extracción <strong>de</strong> DNA, <strong>en</strong> <strong>la</strong> cantidad <strong>de</strong> temp<strong>la</strong>do incluido ó <strong>en</strong> el b<strong>la</strong>nco <strong>de</strong><br />
amplificación escogido.<br />
Entre los b<strong>la</strong>ncos <strong>de</strong> amplificación <strong>de</strong>l DNA <strong>de</strong> M. pneumoniae utilizados,<br />
<strong>de</strong>stacan el g<strong>en</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> adhesina P1, el g<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S, el factor <strong>de</strong> elongación Tu (tuf)<br />
y secu<strong>en</strong>cias <strong>de</strong> librería génica (Iev<strong>en</strong> y cols., 1996; Thjie y cols.,1994). Dos b<strong>la</strong>ncos <strong>de</strong><br />
amplificación han sido com<strong>para</strong>dos <strong>en</strong>tre sí; el g<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S y el g<strong>en</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> adhesina<br />
P1. El par <strong>de</strong> partidores utilizados reconoc<strong>en</strong> secu<strong>en</strong>cias <strong>de</strong>l g<strong>en</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> adhesina P1 y <strong>de</strong>l<br />
rRNA <strong>de</strong> 16S respectivam<strong>en</strong>te (Iev<strong>en</strong> y cols., 1996; Tjhie y cols., 1994) y g<strong>en</strong>eran<br />
fragm<strong>en</strong>tos <strong>de</strong> amplificación correspondi<strong>en</strong>tes a 209 pb <strong>para</strong> el g<strong>en</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> adhesina P1 y<br />
277 pb <strong>para</strong> el g<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong>16S (Iev<strong>en</strong> y cols, 1996; Tjhie y cols., 1994).<br />
Williamson <strong>en</strong>contró un mayor número <strong>de</strong> muestras positivas con partidores <strong>para</strong> el<br />
g<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S, mi<strong>en</strong>tras que Iev<strong>en</strong> y cols. <strong>en</strong>contraron mayor s<strong>en</strong>sibilidad <strong>de</strong> <strong>la</strong> PCR<br />
15
con partidores <strong>para</strong> el g<strong>en</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> adhesina P1 (Iev<strong>en</strong> y cols., 1996; Williamson y cols.,<br />
1992). Exist<strong>en</strong> v<strong>en</strong>tajas y <strong>de</strong>sv<strong>en</strong>tajas <strong>para</strong> el empleo <strong>de</strong> ambos marcadores molecu<strong>la</strong>res<br />
como b<strong>la</strong>nco <strong>de</strong> amplificación. El g<strong>en</strong> que codifica <strong>para</strong> <strong>la</strong> adhesina P1, está <strong>en</strong> un múltiple<br />
número <strong>de</strong> copias constituy<strong>en</strong>do el 8.5% <strong>de</strong>l g<strong>en</strong>oma y por ello otorga <strong>en</strong> teoría mayor<br />
s<strong>en</strong>sibilidad (Himmelreich y cols., 1996). En lo que respecta al g<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S, se<br />
sabe que los Mycop<strong>la</strong>smatales sólo cu<strong>en</strong>tan con dos operones ribosomales y por lo tanto se<br />
esperaría que este b<strong>la</strong>nco <strong>de</strong> amplificación otorgara a <strong>la</strong> PCR m<strong>en</strong>or confiabilidad.<br />
16
Objetivos<br />
• G<strong>en</strong>erales:<br />
1. Determinar <strong>la</strong> frecu<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> infección por M. pneumoniae <strong>en</strong> muestras respiratorias <strong>de</strong><br />
adultos mayores <strong>de</strong> 60 años o más, con diagnóstico clínico confirmado<br />
radiológicam<strong>en</strong>te <strong>de</strong> NAC, at<strong>en</strong>didos <strong>en</strong> el Hospital Clínico <strong>de</strong> <strong>la</strong> Universidad <strong>de</strong> Chile.<br />
2. Com<strong>para</strong>r <strong>la</strong> s<strong>en</strong>sibilidad y especificidad analítica <strong>de</strong> <strong>la</strong> técnica <strong>de</strong> PCR, con partidores<br />
<strong>para</strong> los g<strong>en</strong>es <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S y <strong>de</strong> <strong>la</strong> adhesina P1 <strong>en</strong> <strong>la</strong> amplificación <strong>de</strong>l DNA <strong>de</strong> M.<br />
pneumoniae.<br />
• Específico:<br />
1. Com<strong>para</strong>r los resultados obt<strong>en</strong>idos <strong>de</strong> <strong>la</strong> técnica <strong>de</strong> PCR, con los obt<strong>en</strong>idos con <strong>la</strong><br />
serología mediante inmunofluoresc<strong>en</strong>cia indirecta <strong>para</strong> el diagnóstico <strong>de</strong> M.<br />
pneumoniae <strong>en</strong> adultos con NAC<br />
Hipótesis<br />
H1: Mycop<strong>la</strong>sma pneumoniae participa <strong>en</strong> <strong>la</strong> etiología <strong>de</strong> 10-15% <strong>de</strong> los casos <strong>de</strong> neumonía<br />
adquirida <strong>en</strong> <strong>la</strong> comunidad <strong>en</strong> paci<strong>en</strong>tes mayores <strong>de</strong> 60 años.<br />
H2 : : La PCR con partidores <strong>para</strong> el g<strong>en</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> adhesina P1 ti<strong>en</strong>e mayor s<strong>en</strong>sibilidad que <strong>la</strong><br />
PCR que utiliza partidores <strong>para</strong> el g<strong>en</strong> rRNA <strong>de</strong> 16S <strong>para</strong> el diagnóstico <strong>de</strong> M. pneumoniae.<br />
17
Pob<strong>la</strong>ción:<br />
Criterios <strong>de</strong> inclusión:<br />
MATERIAL Y METODO.<br />
- Paci<strong>en</strong>tes mayores <strong>de</strong> 60 años, con diagnóstico clínico <strong>de</strong> NAC confirmado mediante<br />
radiología.<br />
- Paci<strong>en</strong>tes at<strong>en</strong>didos <strong>en</strong> el Hospital Clínico Universidad <strong>de</strong> Chile <strong>en</strong>tre Septiembre <strong>de</strong>l<br />
año 2002 y Agosto <strong>de</strong>l año 2004.<br />
- Paci<strong>en</strong>tes que aprobaron el cons<strong>en</strong>timi<strong>en</strong>to informado.<br />
Criterios <strong>de</strong> exclusión:<br />
- Paci<strong>en</strong>tes con inmunocompromiso severo o cáncer <strong>de</strong> orig<strong>en</strong> broncogénico.<br />
Muestra:<br />
84 paci<strong>en</strong>tes.<br />
Correspondió a un muestreo no probabilístico por conv<strong>en</strong>i<strong>en</strong>cia, el que consi<strong>de</strong>ró a<br />
Tipo <strong>de</strong> Estudio:<br />
Según el análisis y el alcance <strong>de</strong> los resultados, este estudio se c<strong>la</strong>sificó como:<br />
Estudio <strong>de</strong> tipo Descriptivo transversal.<br />
18
Procedimi<strong>en</strong>to:<br />
Paci<strong>en</strong>tes: Se incorporaron <strong>en</strong> el estudio 84 paci<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> ambos sexos mayores <strong>de</strong> 60 años,<br />
<strong>en</strong>ro<strong>la</strong>dos <strong>en</strong> los Servicios <strong>de</strong> Urg<strong>en</strong>cia o <strong>de</strong> Medicina <strong>de</strong>l Hospital Clínico <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
Universidad <strong>de</strong> Chile, <strong>en</strong>tre Septiembre <strong>de</strong> 2002 y Agosto <strong>de</strong> 2004.<br />
Muestras Clínicas: Después <strong>de</strong> pres<strong>en</strong>tado el cons<strong>en</strong>timi<strong>en</strong>to informado, <strong>la</strong>s muestras<br />
tomadas consistieron <strong>en</strong> dos tipos:<br />
a) Una muestra <strong>de</strong> <strong>la</strong>vado faríngeo, obt<strong>en</strong>ido mediante <strong>en</strong>juague faríngeo (gargarismo) con<br />
5cc <strong>de</strong> solución <strong>de</strong> Hanks.<br />
b) Una muestra <strong>de</strong> 5 cc <strong>de</strong> sangre v<strong>en</strong>osa sin anticoagu<strong>la</strong>nte. Se trató <strong>de</strong> obt<strong>en</strong>er, una<br />
segunda muestra <strong>de</strong> suero <strong>en</strong> fase convaleci<strong>en</strong>te (4-6 sem <strong>de</strong>spués)<br />
Ambos tipos <strong>de</strong> muestras fueron transportados <strong>de</strong> inmediato y conservadas a – 30ºC<br />
hasta su procesami<strong>en</strong>to.<br />
Serología: Este estudio se efectuó con <strong>la</strong> técnica <strong>de</strong> Inmunofluoresc<strong>en</strong>cia indirecta con el<br />
kit comercial Zeus MR , E.U.A <strong>de</strong> acuerdo a <strong>la</strong>s instrucciones <strong>de</strong>l fabricante. La técnica<br />
consistió <strong>en</strong> efectuar diluciones <strong>de</strong>cimales <strong>de</strong>l suero <strong>en</strong> estudio, <strong>en</strong> solución buffer fosfato<br />
(PBS) <strong>la</strong>s que se aplicaron al portaobjetos cont<strong>en</strong>i<strong>en</strong>do el antíg<strong>en</strong>o <strong>de</strong> M. pneumoniae.<br />
Luego <strong>de</strong> incubar a 35ºC por 60 min. <strong>en</strong> una cámara húmeda, los portaobjetos se <strong>la</strong>varon<br />
dos veces por 5 min. cada vez <strong>en</strong> PBS. Posteriorm<strong>en</strong>te, se retiró el exceso <strong>de</strong> humedad y se<br />
aplicaron los conjugados: anti IgG y anti IgM marcados con isotiocianato <strong>de</strong> fluoresceína.<br />
Luego <strong>de</strong> incubar a 35ºC por 30 min. <strong>en</strong> una cámara húmeda, los portaobjetos se <strong>la</strong>varon<br />
nuevam<strong>en</strong>te dos veces por 5 min. cada uno <strong>en</strong> PBS. Los portaobjetos se analizaron <strong>de</strong><br />
19
inmediato por observación <strong>en</strong> microscopio <strong>de</strong> epifluoresc<strong>en</strong>cia, equipado con filtro B (con<br />
objetivos <strong>de</strong> 20 y 40 X). Se consi<strong>de</strong>ró reacción positiva, a aquel<strong>la</strong> que mostró cúmulos <strong>de</strong><br />
M. pneumoniae, con un patrón <strong>de</strong> fluoresc<strong>en</strong>cia ver<strong>de</strong> bril<strong>la</strong>nte y homogénea. Se<br />
incluyeron sueros controles positivos y negativos <strong>en</strong> cada oportunidad.<br />
Estas pruebas diagnósticas <strong>de</strong> serología son un complem<strong>en</strong>to <strong>para</strong> confirmar el<br />
diagnóstico <strong>de</strong> M. pneumoniae al mom<strong>en</strong>to <strong>de</strong> obt<strong>en</strong>er los resultados <strong>de</strong> <strong>la</strong> PCR.<br />
Criterio Diagnóstico: Se consi<strong>de</strong>ró diagnóstico serológico <strong>de</strong> certeza <strong>de</strong> M. pneumoniae a<br />
<strong>la</strong> <strong>de</strong>mostración <strong>de</strong> un título <strong>de</strong> IgM ≥1:16, o al alza <strong>de</strong> 4 veces <strong>en</strong> el título <strong>de</strong> IgG <strong>en</strong> <strong>la</strong><br />
segunda muestra pareada <strong>de</strong> suero (seroconversión). Se consi<strong>de</strong>ró diagnóstico probable <strong>de</strong><br />
M. pneumoniae a <strong>la</strong> pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> un título único <strong>de</strong> IgG ≥1:128.<br />
<strong>Reacción</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>Polimerasa</strong> <strong>en</strong> Ca<strong>de</strong>na:<br />
Se amplificó el DNA <strong>de</strong> M. pneumoniae con dos pares <strong>de</strong> partidores:<br />
P1A: 5’-GCC ACC CTC GGG GGC AGT CAG-3’<br />
P1B: 5'- GAG TCG GGA TTC CCC GCG GAG G-3'<br />
16S1: 5'- AAG GAC CTG CAA GGG TTC GT -3 '<br />
16S2: 5'- CTC TAG CCA TTA CCT GCT AA-3'<br />
Ambos pares <strong>de</strong> partidores reconoc<strong>en</strong> secu<strong>en</strong>cias <strong>de</strong>l g<strong>en</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> adhesina P1 y <strong>de</strong>l rRNA<br />
<strong>de</strong> 16S respectivam<strong>en</strong>te (Iev<strong>en</strong> 1996, Tjhie 1994). Los partidores g<strong>en</strong>eraron fragm<strong>en</strong>tos <strong>de</strong><br />
amplificación correspondi<strong>en</strong>tes a 209 pb <strong>para</strong> el g<strong>en</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> adhesina P1 y 277 pb <strong>para</strong> el<br />
g<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S (Iev<strong>en</strong> 1996, Tjhie 1994). Las muestras clínicas fueron procesadas<br />
20
mediante el kit comercial <strong>de</strong> extracción <strong>de</strong> DNA, QIAmp Minikit (QIAGEN, USA). Las<br />
amplificaciones fueron efectuadas <strong>en</strong> un volum<strong>en</strong> <strong>de</strong> 50 µl cont<strong>en</strong>i<strong>en</strong>do 2.5 U <strong>de</strong> Taq DNA<br />
polimerasa (BioTools, España), 200 µM <strong>de</strong> cada nucleótido trifosfato, 2.5 mM MgCl2 y 1<br />
µM <strong>de</strong> cada partidor. Los ciclos <strong>de</strong> amplificación consistieron <strong>en</strong> 1 min. <strong>de</strong> <strong>de</strong>naturación a<br />
94ºC, seguido por 40 ciclos <strong>de</strong> 1 min. <strong>de</strong> <strong>de</strong>naturación a 94ºC, 1 min. <strong>de</strong> hibridación a 65ºC<br />
y 1 min. <strong>de</strong> ext<strong>en</strong>sión a 72ºC y un ciclo final <strong>de</strong> 7 min. <strong>de</strong> ext<strong>en</strong>sión a 72ºC. Para <strong>la</strong><br />
amplificación <strong>de</strong>l g<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S <strong>la</strong> temperatura <strong>de</strong> hibridación fue 60ºC. Las<br />
amplificaciones fueron efectuadas <strong>en</strong> un termocic<strong>la</strong>dor MJ Research, Mo<strong>de</strong>lo<br />
MiniCycler MR , USA. Los productos <strong>de</strong> amplificación fueron analizados por electroforesis<br />
<strong>en</strong> geles <strong>de</strong> agarosa al 1.5 %, teñidos con bromuro <strong>de</strong> etidio y visualizados <strong>en</strong> un<br />
transiluminador <strong>de</strong> luz UV. Como patrón <strong>de</strong> peso molecu<strong>la</strong>r se utilizó DNA <strong>la</strong>d<strong>de</strong>r <strong>de</strong> 100<br />
pb.<br />
Criterio diagnóstico: Se consi<strong>de</strong>ró un diagnóstico positivo <strong>de</strong> M. pneumoniae mediante<br />
PCR, a <strong>la</strong> amplificación <strong>de</strong>l DNA <strong>de</strong>l microorganismo con cualquiera <strong>de</strong> los pares <strong>de</strong><br />
partidores utilizados. La <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> DNA <strong>de</strong> M. pneumoniae <strong>en</strong> <strong>la</strong>s muestras<br />
respiratorias fue consi<strong>de</strong>rada diagnóstico probable <strong>de</strong> infección.<br />
Análisis <strong>de</strong> <strong>la</strong> PCR: Se efectuaron los sigui<strong>en</strong>tes controles <strong>de</strong> calidad <strong>de</strong>l proceso <strong>de</strong><br />
amplificación <strong>de</strong>l DNA:<br />
Control positivo: Como control positivo se amplificó el DNA <strong>de</strong> <strong>la</strong> cepa FH <strong>de</strong> M.<br />
pneumoniae, <strong>la</strong> cual fue donada g<strong>en</strong>tilm<strong>en</strong>te por el Prof. Dr. Wolfgang Bredt (Alemania).<br />
21
Control negativo: Como control negativo <strong>de</strong> <strong>la</strong> reacción se incluyó un tubo cont<strong>en</strong>i<strong>en</strong>do<br />
todos los reactivos excepto DNA, por cada 8 muestras <strong>de</strong> DNA sometidas a PCR.<br />
Control <strong>de</strong> calidad <strong>de</strong>l DNA: Para verificar <strong>la</strong> calidad <strong>de</strong>l DNA y <strong>la</strong> aus<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> sustancias<br />
inhibitorias <strong>en</strong> <strong>la</strong>s muestras analizadas, se amplificó un fragm<strong>en</strong>to <strong>de</strong> 326 pb <strong>de</strong>l g<strong>en</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
β-globina humana, previo a <strong>la</strong> amplificación <strong>de</strong>l DNA <strong>de</strong> M. pneumoniae (Tjhie, 1994).<br />
S<strong>en</strong>sibilidad analítica: Para el cálculo <strong>de</strong> <strong>la</strong> s<strong>en</strong>sibilidad analítica <strong>de</strong> <strong>la</strong> PCR, diluciones<br />
seriadas pre<strong>para</strong>das a partir <strong>de</strong> una muestra <strong>de</strong> DNA <strong>de</strong> <strong>la</strong> cepa FH <strong>de</strong> M. pneumoniae, <strong>de</strong><br />
conc<strong>en</strong>tración conocida (3µM), fueron sometidas a PCR, <strong>de</strong>terminando <strong>la</strong> máxima dilución<br />
capaz <strong>de</strong> amplificar.<br />
Especificidad analítica: Para verificar <strong>la</strong> especificidad analítica <strong>de</strong> <strong>la</strong> técnica <strong>de</strong> PCR se<br />
amplificó el DNA <strong>de</strong> los sigui<strong>en</strong>tes microorganismos: Mycop<strong>la</strong>sma g<strong>en</strong>italium,<br />
Mycop<strong>la</strong>sma orale, Mycop<strong>la</strong>sma hominis, Ureap<strong>la</strong>sma spp., Streptococcus pneumoniae,<br />
Streptococcus viridans, Streptococcus pyog<strong>en</strong>es, Haemophilus influ<strong>en</strong>zae, Ch<strong>la</strong>mydia<br />
pneumoniae, Ch<strong>la</strong>mydia trachomatis y Ch<strong>la</strong>mydia psittaci.<br />
22
Variables:<br />
H1: Variable In<strong>de</strong>p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>te: Mycop<strong>la</strong>sma pneumoniae.<br />
Variables Dep<strong>en</strong>di<strong>en</strong>tes: Porc<strong>en</strong>taje <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección.<br />
H2:Variable In<strong>de</strong>p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>te: Partidores <strong>para</strong> el g<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S.<br />
Partidores <strong>para</strong> el g<strong>en</strong> P1.<br />
Variables Dep<strong>en</strong>di<strong>en</strong>tes: S<strong>en</strong>sibilidad y especificidad analítica.<br />
Variables <strong>de</strong> Control: Edad, NAC.<br />
Variables Extrañas: Contaminación <strong>de</strong> muestras respiratorias, consumo <strong>de</strong> antibióticos.<br />
Definición Conceptual:<br />
o M. pneumoniae: Microorganismo patóg<strong>en</strong>o que carece <strong>de</strong> pared celu<strong>la</strong>r.<br />
o Partidores <strong>para</strong> el g<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S: Pareja <strong>de</strong> oligonucleótidos sintetizados <strong>de</strong><br />
manera que sean complem<strong>en</strong>tarios a cada uno <strong>de</strong> los extremos 3´ <strong>de</strong>l g<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA<br />
<strong>de</strong> 16S.<br />
o Partidores <strong>para</strong> el g<strong>en</strong> P1: Pareja <strong>de</strong> oligonucleótidos sintetizados <strong>de</strong> manera que<br />
sean complem<strong>en</strong>tarios a cada uno <strong>de</strong> los extremos 3´ <strong>de</strong>l g<strong>en</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> adhesina P1.<br />
o S<strong>en</strong>sibilidad analítica: Mínima cantidad <strong>de</strong> DNA que <strong>la</strong> técnica <strong>de</strong> PCR es capaz <strong>de</strong><br />
resolver.<br />
o Especificidad: Posibilidad <strong>de</strong> que <strong>la</strong>s técnicas <strong>de</strong> PCR no amplifiqu<strong>en</strong> el DNA <strong>de</strong><br />
otros mycop<strong>la</strong>smas, ni <strong>de</strong> otros microorganismos taxonómicam<strong>en</strong>te re<strong>la</strong>cionados<br />
con el M. pneumoniae ó <strong>de</strong> otros microorganismos que pue<strong>de</strong>n ais<strong>la</strong>rse <strong>de</strong> muestras<br />
respiratorias.<br />
23
Definición Operacional:<br />
o M. pneumoniae: Número <strong>de</strong> muestras respiratorias que lo pres<strong>en</strong>taban.<br />
o Porc<strong>en</strong>taje: Se midió a través <strong>de</strong> una reg<strong>la</strong> <strong>de</strong> tres simple.<br />
o Partidores <strong>para</strong> el g<strong>en</strong> P1: Amplificación <strong>de</strong>l g<strong>en</strong> P1.<br />
o Partidores <strong>para</strong> el g<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S: Amplificación <strong>de</strong>l g<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S<br />
o S<strong>en</strong>sibilidad analítica: Se calcu<strong>la</strong>rá haci<strong>en</strong>do diluciones seriadas <strong>de</strong> una cantidad<br />
conocida <strong>de</strong> DNA puro obt<strong>en</strong>ida <strong>en</strong> el <strong>la</strong>boratorio a partir <strong>de</strong> <strong>la</strong> cepa FH.<br />
o Especificidad: Se midió calcu<strong>la</strong>ndo el porc<strong>en</strong>taje <strong>de</strong>l número <strong>de</strong> microorganismos<br />
amplificados mediante PCR, valor que se resta al 100%.<br />
Análisis Estadístico<br />
La significación estadística <strong>de</strong>l porc<strong>en</strong>taje <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> M. pneumoniae se<br />
<strong>de</strong>tectó con <strong>la</strong> Prueba <strong>de</strong> Distribución Normal <strong>para</strong> proporciones o tasas. Se usó esta prueba<br />
<strong>de</strong>bido a que <strong>la</strong> frecu<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> M. pneumoniae muestra muy pocos casos que se alejan <strong>de</strong>l<br />
promedio teórico. La significación <strong>para</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> M. pneumoniae por PCR, se<br />
estableció <strong>en</strong> p
• Análisis <strong>de</strong> <strong>la</strong> PCR:<br />
RESULTADOS<br />
La amplificación <strong>de</strong>l DNA con los dos tipos <strong>de</strong> partidores tuvo igual s<strong>en</strong>sibilidad,<br />
<strong>de</strong>tectando el mismo número <strong>de</strong> muestras positivas.<br />
La s<strong>en</strong>sibilidad analítica <strong>de</strong> <strong>la</strong> técnica <strong>de</strong> PCR <strong>para</strong> ambos g<strong>en</strong>es fue <strong>la</strong> misma, con<br />
una capacidad <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección mínima <strong>de</strong> 7.4 pg <strong>de</strong> DNA (74 x10 -11 g), lo cual es simi<strong>la</strong>r a lo<br />
<strong>en</strong>contrado por otros autores (Tab<strong>la</strong> I)<br />
A<strong>de</strong>más no se <strong>de</strong>tectaron muestras con efecto inhibitorio <strong>en</strong> <strong>la</strong> reacción <strong>de</strong> PCR <strong>en</strong><br />
ningún microorganismo.<br />
Tab<strong>la</strong> I: S<strong>en</strong>sibilidad analítica <strong>en</strong>contrada por diversos autores.<br />
Autor y Año S<strong>en</strong>sibilidad<br />
Abele-Horn M. y cols.<br />
(1998)<br />
Iev<strong>en</strong> M. y cols.<br />
(1996)<br />
25<br />
analítica (pg)<br />
30<br />
23.68
Con <strong>la</strong> finalidad <strong>de</strong> <strong>de</strong>terminar <strong>la</strong> s<strong>en</strong>sibilidad <strong>de</strong>l método se analizó el DNA <strong>de</strong> M.<br />
pneumoniae utilizando cantida<strong>de</strong>s variables <strong>de</strong> DNA mol<strong>de</strong> <strong>de</strong>s<strong>de</strong> 3 µg hasta 7.4 pg con los<br />
partidores <strong>para</strong> el g<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S (figura 1).<br />
300 pb<br />
1 2 3 4 5 6<br />
Figura 1: Gel <strong>de</strong> agarosa al 1.5%, teñido con 0.5µg/ml <strong>de</strong> bromuro <strong>de</strong> etidio,<br />
mostrando <strong>la</strong> amplificación <strong>de</strong> diluciones <strong>de</strong> DNA <strong>de</strong> <strong>la</strong> cepa FH <strong>de</strong> M. pneumoniae, con<br />
partidores <strong>para</strong> el g<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S. Carril 1: DNA <strong>la</strong>d<strong>de</strong>r 100 pb, Carriles 2-5: M.<br />
pneumoniae, Carril 6: Control negativo<br />
26<br />
277 pb
La especificidad <strong>de</strong> <strong>la</strong> técnica <strong>de</strong> PCR <strong>para</strong> <strong>la</strong> amplificación <strong>de</strong> los g<strong>en</strong>es P1 y <strong>de</strong>l<br />
rRNA <strong>de</strong> 16S resultó ser 100% <strong>para</strong> ambos g<strong>en</strong>es, permiti<strong>en</strong>do <strong>la</strong> amplificación específica<br />
<strong>de</strong>l DNA <strong>de</strong> M. pneumoniae, pero no el <strong>de</strong> otros microorganismos incluidos.<br />
Tab<strong>la</strong> II: Especificidad analítica <strong>de</strong> <strong>la</strong> PCR con partidores <strong>para</strong> el g<strong>en</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
adhesina P1 y g<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S <strong>de</strong> M. pneumoniae.<br />
Bacteria PCR: g<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S PCR: g<strong>en</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> adhesina P1<br />
Haemophilus influ<strong>en</strong>zae - -<br />
Micop<strong>la</strong>sma g<strong>en</strong>italium - -<br />
Mycop<strong>la</strong>sma orale - -<br />
Mycop<strong>la</strong>sma pneumoniae + +<br />
Mycop<strong>la</strong>sma hominis - -<br />
Ureap<strong>la</strong>sma spp - -<br />
Ch<strong>la</strong>mydia trachomatis - -<br />
Clhamydia pneumoniae - -<br />
Clhamydia psittaci - -<br />
Streptococcus pneumoniae - -<br />
Streptococcus pyog<strong>en</strong>es - -<br />
Streptococcus viridans - -<br />
27
200 pb<br />
La Figura 2 muestra <strong>la</strong> especificidad analítica <strong>para</strong> el g<strong>en</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> adhesina P1 :<br />
1 2 3 4 5 6 7 8<br />
Figura 2: Gel <strong>de</strong> agarosa al 1.5%, teñido con 0.5µg/ml <strong>de</strong> bromuro <strong>de</strong> etidio,<br />
mostrando <strong>la</strong> especificidad analítica <strong>para</strong> M. pneumoniae, con partidores <strong>para</strong> el g<strong>en</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
adhesina P1. Carril 1: DNA <strong>la</strong>d<strong>de</strong>r 100 pb, Carril 2: Cepa control FH <strong>de</strong> M. pneumoniae,<br />
Carril 3: Cepa clínica <strong>de</strong> M. pneumoniae, Carril 4: C. trachomatis, Carril 5: C. psiattaci,<br />
Carril 6: C. pneumoniae, Carril 7: M. hominis, Carril 8: M. g<strong>en</strong>italium.<br />
28<br />
209 pb
• Análisis Microbiológico:<br />
M. pneumoniae fue diagnosticado mediante serología o PCR <strong>en</strong> 11 <strong>de</strong> 84 paci<strong>en</strong>tes<br />
(13.1%) con diagnóstico <strong>de</strong> NAC (Tab<strong>la</strong> V). En 8 casos el diagnóstico fue <strong>de</strong> certeza y <strong>en</strong><br />
tres casos probable.<br />
La Tab<strong>la</strong> III muestra los resultados microbiológicos <strong>de</strong> los 11 paci<strong>en</strong>tes <strong>en</strong> los que se<br />
<strong>de</strong>tectó infección por M. pneumoniae. La serología fue positiva <strong>en</strong> 8 paci<strong>en</strong>tes (72.7%),<br />
mi<strong>en</strong>tras que <strong>la</strong> PCR fue positiva <strong>en</strong> 7 paci<strong>en</strong>tes (63.6%).<br />
29
Tab<strong>la</strong> III: Características microbiológicas <strong>de</strong> los diagnósticos <strong>de</strong> <strong>la</strong>boratorio <strong>de</strong> M.<br />
pneumoniae, <strong>en</strong> paci<strong>en</strong>tes con NAC at<strong>en</strong>didos <strong>en</strong> el Hospital Clínico <strong>de</strong> <strong>la</strong> Universidad <strong>de</strong><br />
Chile <strong>en</strong> el periodo compr<strong>en</strong>dido <strong>en</strong>tre Septiembre <strong>de</strong> 2002 y Agosto <strong>de</strong> 2004.<br />
Nº <strong>de</strong> caso PCR1/ PCR2 IgM IgG aguda IgG convalesci<strong>en</strong>te Diagnóstico<br />
8 (+) (-) < 1:64 No se toma 2º suero Probable<br />
13 (+) (-) 1:32 1:128 Certeza<br />
15 (-) (+) (-) (-) Certeza<br />
16 (+) (+) < 1:64 No se toma 2º suero Certeza<br />
17 (+) (-) < 1:64 No se toma 2º suero Probable<br />
18 (+) (+) < 1:64 No se toma 2º suero Certeza<br />
26 (-) (+) < 1:64 No se toma 2º suero Certeza<br />
31 (+) (-) < 1:64 No se toma 2º suero Probable<br />
34 (+) (-) 1:32 1:128 Certeza<br />
67 (-) (-) 1:64 1 :256 Certeza<br />
70 (-) (-) 1:32 1:128 Certeza<br />
30
En <strong>la</strong> Figura 3 se muestran <strong>la</strong>s siete amplificaciones <strong>de</strong>l DNA <strong>de</strong> M. pneumoniae <strong>en</strong><br />
<strong>la</strong>s muestras positivas con partidores <strong>para</strong> el g<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S:<br />
300 pb<br />
Figura 1. Amplificación <strong>de</strong>l g<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S <strong>para</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> M.<br />
pneumoniae <strong>en</strong> muestras <strong>de</strong> <strong>la</strong>vado faríngeo <strong>de</strong> paci<strong>en</strong>tes con NAC. Carril 1: 1-kb<br />
<strong>la</strong>d<strong>de</strong>r, carril 2: control positivo, carril 3*: control negativo, carriles 4-10: muestras<br />
<strong>de</strong> paci<strong>en</strong>tes.<br />
* Si bi<strong>en</strong> este control negativo muestra que el g<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S no se amplicó, <strong>en</strong> el gel<br />
se observa un barrido que indica contaminación <strong>de</strong> esa muestra, lo cual no invalida <strong>la</strong><br />
técnica <strong>de</strong> PCR.<br />
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10<br />
31<br />
277 pb
La serología <strong>en</strong> <strong>la</strong> muestra <strong>de</strong> suero <strong>en</strong> <strong>la</strong> fase aguda fue positiva <strong>en</strong> 4 <strong>de</strong> 11<br />
paci<strong>en</strong>tes por <strong>la</strong> pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> IgM. En sólo 4 paci<strong>en</strong>tes con diagnóstico <strong>de</strong> infección por M.<br />
pneumoniae se obtuvieron muestras con suero <strong>en</strong> fase convaleci<strong>en</strong>te y <strong>la</strong>s cuatro<br />
<strong>de</strong>mostraron seroconversión (Tab<strong>la</strong> IV).<br />
Tab<strong>la</strong> IV: Muestras positivas <strong>de</strong>tectadas por cada una <strong>de</strong> <strong>la</strong>s técnicas.<br />
Técnicas<br />
Diagnósticas<br />
32<br />
Nº <strong>de</strong> Muestras<br />
Positivas<br />
Serología IgM 4<br />
Serología IgG 4<br />
PCR 7<br />
Cabe <strong>de</strong>stacar que los resultados obt<strong>en</strong>idos mediante serología no siempre se<br />
correspondieron con los casos positivos <strong>de</strong>tectados por PCR. Es así como <strong>en</strong> algunos casos<br />
<strong>en</strong> don<strong>de</strong> <strong>la</strong> serología resultó ser positiva, PCR dio negativa. (3 casos) Asimismo <strong>la</strong> PCR<br />
fue positiva <strong>en</strong> tres paci<strong>en</strong>tes con serología negativa. Estos tres casos correspondieron a un<br />
diagnóstico probable <strong>de</strong> infección por M. pneumoniae.
El porc<strong>en</strong>taje <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> M. pneumoniae <strong>en</strong> <strong>la</strong>s muestras respiratorias <strong>de</strong><br />
paci<strong>en</strong>tes con NAC, mediante <strong>la</strong> técnica <strong>de</strong> PCR, fue <strong>de</strong> un 8.3%. mi<strong>en</strong>tras que <strong>la</strong> serología<br />
correspondió a un 9.5%. Al sumar los porc<strong>en</strong>tajes <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> M. pneumoniae mediante<br />
serología y PCR, se obtuvo que el microorganismo estaba pres<strong>en</strong>te <strong>en</strong> un 13.1% ,<br />
porc<strong>en</strong>taje que se acerca más al indicado por <strong>la</strong> literatura. (Figura 4).<br />
16<br />
14<br />
12<br />
10<br />
% <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección<br />
8<br />
6<br />
4<br />
2<br />
0<br />
8,33<br />
9,52<br />
Figura 4: Porc<strong>en</strong>taje <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> M. pneumoniae mediante<br />
dos técnicas diagósticas y su com<strong>para</strong>ción con <strong>la</strong> teoría<br />
33<br />
13,1<br />
PCR Serología Serología +<br />
PCR<br />
Técnicas diagnósticas<br />
15<br />
Serología +<br />
PCR (teórico)
DISCUSION<br />
Los resultados obt<strong>en</strong>idos mediante <strong>la</strong>s técnicas <strong>de</strong> PCR y serología mostraron que<br />
fue posible <strong>de</strong>tectar M. pneumoniae <strong>en</strong> el 13.1% <strong>de</strong> los paci<strong>en</strong>tes con NAC, cifra que es<br />
simi<strong>la</strong>r a <strong>la</strong> obt<strong>en</strong>ida <strong>en</strong> <strong>la</strong> literatura, <strong>la</strong> cual fluctúa <strong>en</strong>tre un 15 y un 20% (Foy, 1993). Esta<br />
disparidad probablem<strong>en</strong>te se <strong>de</strong>ba a que <strong>la</strong> mayoría <strong>de</strong> los paci<strong>en</strong>tes admitidos <strong>en</strong> el estudio<br />
habían recibido antimicrobianos, lo que redujo el r<strong>en</strong>dimi<strong>en</strong>to <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong>l<br />
microorganismo <strong>de</strong> <strong>la</strong> muestra <strong>de</strong> expectoración y por tanto también el resultado obt<strong>en</strong>ido<br />
por PCR. Esto se podría <strong>de</strong>ber a que el uso <strong>de</strong> Levofloxacino inhibe <strong>la</strong> síntesis <strong>de</strong>l DNA al<br />
bloquear a <strong>la</strong> subunidad A <strong>de</strong> <strong>la</strong> DNA girasa (Morejón y cols, 2003). A difer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> lo que<br />
ocurre con <strong>la</strong> Serología, <strong>en</strong> que <strong>la</strong> respuesta inmune <strong>de</strong>l organismo permanece por más<br />
tiempo, ésta no se ve afectada por el consumo <strong>de</strong> fármacos. Para evitar alterar los resultados<br />
<strong>de</strong> <strong>la</strong> técnica <strong>de</strong> PCR por el uso <strong>de</strong> antibióticos se <strong>de</strong>berían tomar <strong>la</strong>s muestras <strong>de</strong><br />
expectoración antes <strong>de</strong> com<strong>en</strong>zar con el tratami<strong>en</strong>to antibiótico o inmediatam<strong>en</strong>te iniciado<br />
el tratami<strong>en</strong>to.<br />
Sin embargo, <strong>en</strong> el 66.7% <strong>de</strong> los casos con M. pneumoniae <strong>de</strong>tectados por PCR, los<br />
paci<strong>en</strong>tes habían consumido Levofloxacino, indicando que el uso <strong>de</strong>l antibiótico previo a <strong>la</strong><br />
toma <strong>de</strong> <strong>la</strong> muestra no es totalm<strong>en</strong>te invalidante <strong>de</strong>l método.<br />
Es importante <strong>de</strong>stacar, que <strong>la</strong> pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> M. pneumoniae se asocia con una bu<strong>en</strong>a<br />
evolución <strong>de</strong> los paci<strong>en</strong>tes, ya que <strong>en</strong> este estudio fue posible <strong>de</strong>tectar que el 88.9% <strong>de</strong> los<br />
paci<strong>en</strong>tes mejoraron, lo que reafirma lo indicado por <strong>la</strong> literatura <strong>en</strong> cuanto a que M.<br />
pneumoniae no se caracteriza por ser letal.<br />
34
Al com<strong>para</strong>r ambas técnicas, serología y PCR, se <strong>en</strong>contraron casos <strong>en</strong> que habían<br />
muestras positivas por PCR mi<strong>en</strong>tras que esas mismas muestras eran negativas con <strong>la</strong><br />
serología. Esto se podría <strong>de</strong>ber a que <strong>la</strong> muestra <strong>de</strong> sangre fue tomada <strong>en</strong> un período <strong>en</strong> que<br />
aún el organismo no había <strong>de</strong>sarrol<strong>la</strong>do una respuesta inmune o que <strong>la</strong> cantidad <strong>de</strong> M.<br />
pneumoniae era insufici<strong>en</strong>te <strong>para</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>tección por serología, lo que está directam<strong>en</strong>te<br />
re<strong>la</strong>cionado con <strong>la</strong> s<strong>en</strong>sibilidad <strong>de</strong> este método. Ambas justificaciones <strong>de</strong>jan <strong>en</strong> c<strong>la</strong>ro que <strong>la</strong><br />
PCR es capaz <strong>de</strong> <strong>de</strong>tectar a este microorganismo aún <strong>en</strong> etapas muy tempranas <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
infección, e incluso cuando el microorganismo está <strong>en</strong> bajas cantida<strong>de</strong>s <strong>en</strong> el organismo,<br />
<strong>de</strong>jando <strong>de</strong> manifiesto su mayor s<strong>en</strong>sibilidad al com<strong>para</strong>r<strong>la</strong> con <strong>la</strong> serología. Por lo tanto,<br />
sería una técnica útil <strong>para</strong> <strong>de</strong>tectar con mayor precisión <strong>la</strong> pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> M. pneumoniae y así<br />
ori<strong>en</strong>tar el diagnóstico.<br />
También hubo casos con muestras serológicas positivas y PCR negativas (4 <strong>de</strong> 11<br />
casos), lo cual se pudo <strong>de</strong>ber al tratami<strong>en</strong>to antibiótico previo que habi<strong>en</strong>do t<strong>en</strong>ido el efecto<br />
farmacológico esperado, evitó <strong>la</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong>l microorganismo.<br />
Los procedimi<strong>en</strong>tos efectuados permitieron <strong>la</strong> com<strong>para</strong>ción <strong>de</strong> <strong>la</strong> técnica <strong>de</strong> PCR <strong>para</strong> el<br />
g<strong>en</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> adhesina P1 y <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S, observándose un igual r<strong>en</strong>dimi<strong>en</strong>to <strong>en</strong> ambas. No<br />
obstante, se han informado v<strong>en</strong>tajas y <strong>de</strong>sv<strong>en</strong>tajas <strong>para</strong> el empleo <strong>de</strong> los distintos partidores<br />
<strong>en</strong> <strong>la</strong> amplificación <strong>de</strong>l DNA <strong>de</strong> M. pneumoniae. El g<strong>en</strong> que codifica <strong>para</strong> <strong>la</strong> adhesina<br />
principal P1, está <strong>en</strong> un múltiple número <strong>de</strong> copias y por ello, esta PCR otorga <strong>en</strong> teoría<br />
mayor confiabilidad. En lo que respecta al g<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S, se sabe que los<br />
Mycop<strong>la</strong>smatales sólo cu<strong>en</strong>tan con dos operones ribosomales y por lo tanto <strong>en</strong> teoría esta<br />
PCR podría t<strong>en</strong>er m<strong>en</strong>or confiabilidad que el g<strong>en</strong> que amplifica <strong>para</strong> <strong>la</strong> adhesina P1. Por<br />
otro <strong>la</strong>do, el g<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S está muy conservado <strong>en</strong> estos microorganismos, por lo<br />
35
que una PCR con partidores que reconoc<strong>en</strong> estos g<strong>en</strong>es sería capaz <strong>de</strong> reconocer todas <strong>la</strong>s<br />
cepas <strong>de</strong>l microorganismo in<strong>de</strong>p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>tem<strong>en</strong>te <strong>de</strong> su ubicación geográfica, mi<strong>en</strong>tras que el<br />
g<strong>en</strong> P1 que codifica una proteína <strong>de</strong> superficie, t<strong>en</strong>dría una mayor variabilidad. A<strong>de</strong>más, <strong>la</strong><br />
visualización <strong>de</strong> los productos <strong>de</strong> <strong>la</strong> PCR <strong>para</strong> el g<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S es muy c<strong>la</strong>ra.<br />
No obstante, pese a que los b<strong>la</strong>ncos <strong>de</strong> amplificación fueron distintos, <strong>la</strong>s condiciones<br />
<strong>en</strong> que se llevó a cabo <strong>la</strong> técnica <strong>de</strong> PCR <strong>para</strong> ambos g<strong>en</strong>es fueron muy simi<strong>la</strong>res lo que<br />
resultó <strong>en</strong> una s<strong>en</strong>sibilidad común <strong>para</strong> los dos b<strong>la</strong>ncos amplificados.<br />
Debido a <strong>la</strong>s discrepancias antes m<strong>en</strong>cionadas, no existe un procedimi<strong>en</strong>to <strong>de</strong> refer<strong>en</strong>cia<br />
<strong>para</strong> el diagnóstico <strong>de</strong> M. pneumoniae, ya que si bi<strong>en</strong> <strong>la</strong> serología es el método difundido<br />
universalm<strong>en</strong>te <strong>para</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> este microorganismo, pres<strong>en</strong>ta una baja s<strong>en</strong>sibilidad y<br />
requiere <strong>de</strong> más tiempo <strong>para</strong> obt<strong>en</strong>er una seroconversión <strong>en</strong> el caso <strong>de</strong> <strong>la</strong> IgG, mi<strong>en</strong>tras que<br />
<strong>en</strong> el caso <strong>de</strong> <strong>la</strong> IgM es una respuesta inmune que <strong>en</strong> los adultos mayores se <strong>en</strong>cu<strong>en</strong>tra<br />
disminuida. Y por otro <strong>la</strong>do <strong>la</strong> PCR aún no ha sido lo sufici<strong>en</strong>tem<strong>en</strong>te reconocida como un<br />
método válido <strong>para</strong> realizar diagnóstico <strong>de</strong> M. pneumoniae.<br />
Si se quisiera obt<strong>en</strong>er datos significativos y extrapo<strong>la</strong>bles a niveles epi<strong>de</strong>miológicos<br />
nacionales <strong>de</strong> preval<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> M. pneumoniae <strong>en</strong> los paci<strong>en</strong>tes con NAC, se <strong>de</strong>bería realizar<br />
un estudio completam<strong>en</strong>te aleatorio y contar con un tamaño muestral <strong>de</strong> 306 paci<strong>en</strong>tes,<br />
consi<strong>de</strong>rando un nivel <strong>de</strong> significación estadística p = 0.04. Sin embargo, esto involucra un<br />
estudio <strong>de</strong> gran<strong>de</strong>s dim<strong>en</strong>siones <strong>en</strong> cuanto a tiempo, recursos humanos y económicos, y<br />
necesariam<strong>en</strong>te involucraría <strong>la</strong> participación <strong>de</strong> más <strong>de</strong> un hospital.<br />
36
CONCLUSIONES<br />
El diagnóstico <strong>de</strong> M. pneumoniae requeriría i<strong>de</strong>alm<strong>en</strong>te el uso combinado <strong>de</strong><br />
técnicas serológicas y <strong>de</strong> PCR simultáneam<strong>en</strong>te <strong>para</strong> mejorar <strong>la</strong> s<strong>en</strong>sibilidad <strong>en</strong> <strong>la</strong> fase<br />
aguda <strong>de</strong> <strong>la</strong> infección.<br />
La PCR con partidores que reconoc<strong>en</strong> el g<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA <strong>de</strong> 16S sería <strong>la</strong> PCR <strong>de</strong><br />
elección <strong>para</strong> este microorganismo.<br />
El uso <strong>de</strong> <strong>la</strong> técnica <strong>de</strong> PCR, como una herrami<strong>en</strong>ta <strong>de</strong> diagnóstico, es válida <strong>para</strong> <strong>la</strong><br />
<strong>de</strong>tección <strong>de</strong> M. pneumoniae. Es importante seña<strong>la</strong>r que el éxito <strong>de</strong> <strong>la</strong> técnica es<br />
<strong>de</strong>p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>te <strong>de</strong>l uso <strong>de</strong> antibióticos antes <strong>de</strong> <strong>la</strong> toma <strong>de</strong> <strong>la</strong> muestra.<br />
37
PROYECCIONES<br />
Los resultados obt<strong>en</strong>idos <strong>en</strong> este estudio, <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> M. pneumoniae <strong>en</strong><br />
paci<strong>en</strong>tes adultos mayores con NAC, podrían ori<strong>en</strong>tarse a <strong>la</strong> realización <strong>de</strong> estudios clínicos<br />
y microbiológicos <strong>en</strong> don<strong>de</strong> se abarque un mayor número <strong>de</strong> muestras respiratorias, <strong>la</strong>s<br />
cuales involucr<strong>en</strong> a un mayor número <strong>de</strong> paci<strong>en</strong>tes y hospitales <strong>para</strong> que así <strong>la</strong> muestra sea<br />
más repres<strong>en</strong>tativa <strong>de</strong> <strong>la</strong> pob<strong>la</strong>ción y se puedan obt<strong>en</strong>er resultados epi<strong>de</strong>miológicos<br />
significativos. A<strong>de</strong>más esto serviría <strong>para</strong> probar si exist<strong>en</strong> periodos <strong>de</strong> variación <strong>en</strong> <strong>la</strong><br />
preval<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> M. pneumoniae.<br />
Es importante <strong>de</strong>stacar que los M. pneumoniae cada día constituye un patóg<strong>en</strong>o más<br />
frecu<strong>en</strong>te <strong>de</strong> NAC, por lo que se hace importante el conocimi<strong>en</strong>to <strong>de</strong> técnicas que<br />
contribuyan a su rápido diagnóstico como <strong>la</strong>s técnicas <strong>de</strong> PCR, lo que lleva a los clínicos a<br />
tomar <strong>de</strong>cisiones más acertadas <strong>en</strong> cuanto al tratami<strong>en</strong>to que seguirán los paci<strong>en</strong>tes con<br />
NAC.<br />
38
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43
Técnica <strong>de</strong> PCR:<br />
ANEXO<br />
Técnica <strong>de</strong> <strong>la</strong>boratorio con <strong>la</strong> que se pue<strong>de</strong>n producir múltiples copias <strong>de</strong> un<br />
fragm<strong>en</strong>to <strong>de</strong> DNA específico. Estos procesos se pue<strong>de</strong>n realizar con equipos comerciales o<br />
con técnicas home ma<strong>de</strong>. Los primeros ti<strong>en</strong><strong>en</strong> <strong>la</strong> v<strong>en</strong>taja <strong>de</strong> poseer todos los compon<strong>en</strong>tes<br />
listos, estandarizados y hasta automatizados, y <strong>la</strong> <strong>de</strong>sv<strong>en</strong>taja es su costo elevado y estar sólo<br />
disponibles <strong>para</strong> algunas <strong>de</strong>terminaciones. En cambio <strong>la</strong>s segundas son aquel<strong>la</strong>s e<strong>la</strong>boradas<br />
por el propio <strong>la</strong>boratorio basándose <strong>en</strong> trabajos bibliográficos previos. Las v<strong>en</strong>tajas son su<br />
costo y versatilidad, pero pue<strong>de</strong>n carecer <strong>de</strong> <strong>la</strong> sufici<strong>en</strong>te estandarización y evaluación<br />
necesarias <strong>para</strong> <strong>la</strong> obt<strong>en</strong>ción <strong>de</strong> resultados válidos y reproducibles. (Simposio Internacional<br />
Infectología Aplicada <strong>para</strong> el Cono Sur, 1999)<br />
Para crear <strong>la</strong> región <strong>de</strong> doble ca<strong>de</strong>na se usan los <strong>de</strong>nominados partidores (primers),<br />
que correspon<strong>de</strong>n a una pareja <strong>de</strong> oligonucleótidos sintetizados <strong>de</strong> manera que sean<br />
complem<strong>en</strong>tarios a los extremos 3’ y 5’ <strong>de</strong>l fragm<strong>en</strong>to <strong>de</strong> DNA que se <strong>de</strong>sea amplificar.<br />
La PCR se basa <strong>en</strong> <strong>la</strong> repetición <strong>de</strong> un ciclo formado por tres etapas:<br />
1ª D<strong>en</strong>aturalización <strong>de</strong>l DNA: Este procedimi<strong>en</strong>to se realiza a 95-97 °C con el propósito <strong>de</strong><br />
se<strong>para</strong>r <strong>la</strong>s hebras <strong>de</strong>l DNA y así permitir <strong>la</strong> obt<strong>en</strong>ción <strong>de</strong> un DNA mol<strong>de</strong>.<br />
2ª Hibridación <strong>de</strong> los partidores: Los partidores se un<strong>en</strong> a <strong>la</strong>s zonas 3’ y 5’<br />
complem<strong>en</strong>tarias al fragm<strong>en</strong>to <strong>de</strong> DNA que se <strong>de</strong>sea amplificar. Para ello se utiliza una<br />
temperatura <strong>de</strong> alineami<strong>en</strong>to que <strong>de</strong>p<strong>en</strong><strong>de</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> composición <strong>de</strong> bases <strong>de</strong> los partidores,<br />
g<strong>en</strong>eralm<strong>en</strong>te <strong>en</strong>tre 50 y 65 °C y durante un min. o más aproximadam<strong>en</strong>te.<br />
44
3ª Ext<strong>en</strong>sión <strong>de</strong>l partidor: En esta etapa se produce <strong>la</strong> síntesis <strong>de</strong> una ca<strong>de</strong>na s<strong>en</strong>cil<strong>la</strong> <strong>de</strong><br />
DNA <strong>en</strong> <strong>la</strong> dirección 5´- 3´ mediante <strong>la</strong> <strong>en</strong>zima DNA polimerasa, <strong>la</strong> cual incorpora los<br />
<strong>de</strong>soxinucleótidos fosfato pres<strong>en</strong>tes <strong>en</strong> el medio sigui<strong>en</strong>do <strong>la</strong> ca<strong>de</strong>na mol<strong>de</strong>. (Mas<strong>en</strong>gi-<br />
Rumopa 2003).<br />
La realización <strong>de</strong> estos 3 pasos, se <strong>de</strong>sarrol<strong>la</strong> <strong>en</strong> pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong>l DNA mol<strong>de</strong> a<br />
amplificar, los dos partidores, los dNTPs y <strong>la</strong> <strong>en</strong>zima DNA polimerasa seleccionada <strong>para</strong> <strong>la</strong><br />
técnica. (Mönckeberg, 1990).<br />
Todo este proceso se lleva a cabo <strong>en</strong> un equipo l<strong>la</strong>mado termocic<strong>la</strong>dor, el cual<br />
realiza los ciclos <strong>en</strong> los tiempos y temperaturas programadas <strong>de</strong> forma exacta. Una vez<br />
completado el primer ciclo, se dispon<strong>en</strong> <strong>de</strong> 2 copias <strong>de</strong> <strong>la</strong> muestra original, al final <strong>de</strong>l<br />
segundo ciclo hay 4 y al final <strong>de</strong>l tercero 8. Si los ciclos se produc<strong>en</strong> un número "n" <strong>de</strong><br />
veces y suponi<strong>en</strong>do que el número <strong>de</strong> copias <strong>de</strong> ADN se duplica <strong>en</strong> cada ciclo, obt<strong>en</strong>emos<br />
una cantidad <strong>de</strong> ADN <strong>de</strong> 2 n , por lo que <strong>la</strong> amplificación se realiza <strong>en</strong> forma <strong>de</strong> progresión<br />
geométrica. Los productos obt<strong>en</strong>idos son <strong>de</strong> dos tipos: "producto corto" y "producto <strong>la</strong>rgo".<br />
El primero ti<strong>en</strong>e una longitud perfectam<strong>en</strong>te <strong>de</strong>finida y conti<strong>en</strong>e exactam<strong>en</strong>te <strong>la</strong> secu<strong>en</strong>cia<br />
que se <strong>de</strong>sea amplificar, g<strong>en</strong>erándose <strong>de</strong> manera expon<strong>en</strong>cial durante <strong>la</strong> reacción. El<br />
producto <strong>la</strong>rgo es el que incorpora <strong>la</strong>s ca<strong>de</strong>nas <strong>de</strong> DNA originales <strong>de</strong> <strong>la</strong> muestra y cuyos<br />
extremos 3´ no están <strong>de</strong>finidos. Sin embargo, al final <strong>de</strong> <strong>la</strong> PCR, <strong>la</strong> cantidad <strong>de</strong>l producto<br />
corto sintetizado es muy superior <strong>en</strong> com<strong>para</strong>ción con el producto <strong>la</strong>rgo.<br />
La <strong>de</strong>tección <strong>de</strong>l producto <strong>de</strong> <strong>la</strong> PCR se realiza normalm<strong>en</strong>te mediante<br />
electroforesis. Dep<strong>en</strong>di<strong>en</strong>do <strong>de</strong>l tamaño <strong>de</strong> <strong>la</strong> amplificación y según <strong>la</strong> resolución que se<br />
<strong>de</strong>see se utilizan difer<strong>en</strong>tes medios como agarosa o poliacri<strong>la</strong>mida. La posterior<br />
45
visualización se pue<strong>de</strong> realizar con bromuro <strong>de</strong> etidio, tinción <strong>de</strong> p<strong>la</strong>ta, fluoresc<strong>en</strong>cia o<br />
radioactividad (Lozada, 1997).<br />
Para que esta técnica pueda llevarse a cabo <strong>de</strong> manera óptima, el DNA no pue<strong>de</strong><br />
estar fragm<strong>en</strong>tado <strong>en</strong> trozos más pequeños <strong>de</strong> lo que queremos amplificar. A<strong>de</strong>más, <strong>la</strong><br />
muestra no <strong>de</strong>be llevar ag<strong>en</strong>tes que<strong>la</strong>ntes, ya que éstos reduc<strong>en</strong> <strong>la</strong> conc<strong>en</strong>tración <strong>de</strong> ión<br />
Mg ++ <strong>en</strong> <strong>la</strong> solución. Tampoco <strong>de</strong>be haber factores que inhiban <strong>la</strong> actividad <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
polimerasa. Otro factor importante es que <strong>la</strong> cantidad <strong>de</strong> <strong>la</strong> muestra <strong>de</strong>be ser sufici<strong>en</strong>te <strong>para</strong><br />
<strong>la</strong> amplificación <strong>de</strong> DNA.<br />
DNA <strong>Polimerasa</strong>: Exist<strong>en</strong> difer<strong>en</strong>tes tipos: Termolábiles: T° óptima <strong>de</strong> 37-42º C, se<br />
<strong>de</strong>snaturalizan con el calor; Termoestables: T° óptima <strong>de</strong> 74 ºC, resiste durante 40-50 a 96<br />
ºC. Actualm<strong>en</strong>te se utiliza <strong>la</strong> Taq polimerasa, <strong>la</strong> cual es una <strong>en</strong>zima termoestable ais<strong>la</strong>da <strong>de</strong><br />
Termus aquaticus (Taq), una bacteria termofílica. Esta <strong>en</strong>zima ha simplificado<br />
<strong>en</strong>ormem<strong>en</strong>te <strong>la</strong> técnica <strong>de</strong> <strong>la</strong> PCR, ya que permitió su automatización.<br />
Deoxinucleósidos trifosfato (dNTPs): Son cuatro: dATP, dGTP, dCTP y dTTP. Se <strong>de</strong>b<strong>en</strong><br />
añadir <strong>en</strong> <strong>la</strong> solución <strong>de</strong> <strong>la</strong> reacción <strong>en</strong> conc<strong>en</strong>traciones iguales. Los dNTPs que<strong>la</strong>n Mg ++ ,<br />
por lo que <strong>la</strong>s conc<strong>en</strong>traciones <strong>de</strong> ambos compon<strong>en</strong>tes <strong>de</strong>b<strong>en</strong> guardar siempre <strong>la</strong> misma<br />
re<strong>la</strong>ción (Lozada, 1997).<br />
Número <strong>de</strong> ciclos: Dep<strong>en</strong><strong>de</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> cantidad <strong>de</strong> ADN que existe <strong>en</strong> <strong>la</strong> muestra una vez que el<br />
resto <strong>de</strong> los factores han sido optimizados.<br />
Contaminación <strong>de</strong> <strong>la</strong> PCR: Como <strong>la</strong> PCR es una técnica muy s<strong>en</strong>sible, es <strong>de</strong> gran<br />
importancia evitar contaminaciones, ya que es posible que DNA no <strong>de</strong>seado (aunque se<br />
<strong>en</strong>cu<strong>en</strong>tre <strong>en</strong> una cantidad muy pequeña) se amplifique y obt<strong>en</strong>gamos un resultado que no<br />
es real. Para evitar <strong>la</strong>s contaminaciones hay que t<strong>en</strong>er <strong>en</strong> cu<strong>en</strong>ta que el lugar físico <strong>de</strong>be ser<br />
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exclusivo <strong>para</strong> realizar <strong>la</strong> PCR, al igual que el instrum<strong>en</strong>tal utilizado. Los reactivos y los<br />
tubos <strong>de</strong>b<strong>en</strong> ser estériles, el manipu<strong>la</strong>dor <strong>de</strong>be usar guantes y se <strong>de</strong>b<strong>en</strong> realizar controles <strong>de</strong><br />
los b<strong>la</strong>ncos (se aña<strong>de</strong> agua <strong>en</strong> lugar <strong>de</strong> DNA).<br />
Tab<strong>la</strong> V: Com<strong>para</strong>ción <strong>de</strong> <strong>la</strong> IFI con PCR <strong>en</strong> paci<strong>en</strong>tes con diagnóstico <strong>de</strong> neumonía.<br />
Nº<br />
I<strong>de</strong>ntificación <strong>de</strong>l<br />
Paci<strong>en</strong>te<br />
Serología PCR Diagnostico<br />
IgM IgG fase IgG fase G<strong>en</strong> <strong>de</strong>l rRNA G<strong>en</strong><br />
aguda convaleci<strong>en</strong>te <strong>de</strong> 16S P1<br />
1 E. V. - - - - - Negativo<br />
2 M. O. - - - - - Negativo<br />
3 C. L. - - - - - Negativo<br />
4 I. S. - - - - - Negativo<br />
5 G. A. - - - - - Negativo<br />
6 M. M. - - - - - Negativo<br />
7 M. M. - - - - - Negativo<br />
8 R. T. -
24 J. S. - - - - - Negativo<br />
25 M. H. - - - - - Negativo<br />
26 L. N. +
60 C. M. - - - - - Negativo<br />
61 R. H. - - - - - Negativo<br />
62 B. O. - - - - - Negativo<br />
63 L. U. - - - - - Negativo<br />
64 F. M. - - - - - Negativo<br />
65 A. C. - - - - - Negativo<br />
66 Ch. F. - - - - - Negativo<br />
67 G. A. - 1: 64 1: 256 - - Certeza<br />
68 Z. B. - - - - - Negativo<br />
69 A. D. - - - - - Negativo<br />
70 D. P. - 1 : 32 1 : 128 - - Certeza<br />
71 M. S. - - - - - Negativo<br />
72 N. P. - - - - - Negativo<br />
73 R. M. - - - - - Negativo<br />
74 M. V. - - - - - Negativo<br />
75 E. F. - - - - - Negativo<br />
76 P. P. - - - - - Negativo<br />
77 M. P. - - - - - Negativo<br />
78 L. N. - - - - - Negativo<br />
79 H. R. - - - - - Negativo<br />
80 R. R. - - - - - Negativo<br />
81 R. S. - - - - - Negativo<br />
82 I. M. - - - - - Negativo<br />
83 O. R. - - - - - Negativo<br />
84 E. H. - - - - - Negativo<br />
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