Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - FBMC

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1. Se trabajará con los datos generados a partir del software AutoSNP para distintas especies disponibles en la página web http://autosnpdb.appliedbioinformatics.com.au/ 2. En la pestaña SEARCH deberá colocar la especie de interés (p. ej. BARLEY (cebada) / WHEAT (trigo)). 3. Seleccione la acción: Search in the Database using Keyword (seleccionar en la base de datos usando palabras claves). 4. Deje las pestañas abiertas por defecto e ingrese a continuación alguna de las siguientes keywords (“defence”, “rubisco”, “vernalization”, “cold”, “stress”) y presione “GO”. 5. Se indicará debajo si existen contigs que tengan en su descripción esa palabra clave. Observe cuántos contigs aparecen en cada caso y anote cuántas secuencias formaron ese contig. Especifique SNPs e Indels dentro de cada contig 6. Entre a alguno de los contigs que armó el programa. Presione el “+” ¿Qué se observa en la tabla? ¿Qué información brinda cada una de las columnas? 7. Mire también el alineamiento y compruebe los SNPs descriptos en la tabla llegando a las posiciones correspondientes dentro del alineamiento. El Min. Informative es la cantidad de secuencias que presentan ese mismo polimorfismo. El dato de Cosegregation se refiere a la cantidad de SNPs o polimorfismos que comparten en mismo patrón de variación. El dato de Weighted Cosegregation tiene en cuenta si faltan datos como para que se sesgue el resultado de co-segregación. 8. Conociendo esto, ¿Qué SNPs podrían ser verdaderos y cuáles falsos? 9. ¿Por qué en el análisis de ESTs podemos encontrar SNPs falsos? 10. ¿Qué haría Ud para tratar de corroborar/validar si los SNPs encontrados existen en una población perteneciente a la especie? Describa alguna metodología. PARTE B: Búsqueda de SSRs en secuencias ESTs de eucaliptos disponibles en GenBank Objetivos: - Utilizar una base de datos pública para la obtención de secuencias ESTs disponibles. - Identificar regiones repetitivas de tipo SSR en las secuen-cias seleccionadas mediante software de libre acceso. - Analizar los resultados de los SSR obtenidos. - Asignar función probable a los ESTs que contienen SSR y analizar los datos. Actividades: 1. Se analizarán los ESTs disponibles en GenBank, ingresando al sitio del NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 2. Se realizará la búsqueda de los ESTs de la especie Eucalyptus tereticornis. Para ello elija la opción “EST” en el campo SEARCH y en el campo FOR, escriba Eucalyptus tereticornis [orgn]. ¿Cuántos ESTs obtuvo? 3. En el campo SEND TO, elegir la opción “FILE” y luego “FASTA”, seleccionar “create file”. Se guarda automáticamente el archivo generado. Se utilizará el archivo .fasta generado para la búsqueda de regiones microsatélites. Ingresar al sitio del Genome Database for Rosaceae http://www.rosaceae.org/ Elegir TOOLS, SSR. 4. El servidor enviará un correo electrónico a la casilla indicada, con los links a los files generados. El mismo, tendrá el siguiente formato: 5. Agregar mail y título al proyecto. 6. Ubicar el archivo FASTA con las secuencias de Eucaliptus para hacer el análsis. 7. En el archivo Excel generado, observe los datos estadísticos de los tipos de microsatélites encontrados. ¿Qué tipo de microsatélite esperaría encontrar en mayor proporción? ¿Por qué? ¿Coinciden los resultados obtenidos con los esperados? 8. Abrir el último archivo .txt (SSR containing sequences), eliminar el encabezado para que sólo queden las secuencias en formato fasta. Guardar archivo. 9. Se estudiará el nivel de identidad de estas secuencias de ADN con otras secuencias de proteínas depositadas en bases de datos públicas, mediante BlastX. Para ello vaya hasta el sitio de Arabidopsis: http://www.arabidopsis.org, tools, BLAST. Abra el archivo .txt bajado del análisis de SSRs, selecciones algunas secuencais y péguelo en el espacio INPUT, elija BLASTX (query NT, AA db). Abra la pestaña de parameters options y elija “10” en Max Scores y “10” en Max alignments. Luego RUN BLAST ¿A qué funciones se corresponden los ESTs? TP Nº 2: Secuenciación por Electroforesis Capilar de Fragmentos Marcados con Partículas Fluorescentes Docentes: Verónica Nishikamasu, Pablo Vera y Natalia Aguirre Diseño: Andrea Puebla Las estrategias de secuenciación basadas en el método de terminación de la cadena por incorporación de nucleótidos dideoxi (ddNTPs) desarrollado por Sanger mas de 30 años atrás han sufrido un proceso de cambio y superación continuo desde la detección de moléculas radioactivas en geles hasta la actual detección fluorescente mediante secuenciación en paralelo en microcapilares o las estrategias de secuenciación en fase sólida basada en chips (Tabla 1). La incorporación de sistemas de detección fluorescerente en la década del 80 permitió el inicio de la secuenciación genómica y la entrada, en la década del 90, en la era genómica, con los reportes de los primeros genomas completos de E.coli y C. elegans y el inicio del proyecto Genoma Humano cuyo borrador fue liberado en 2001 y finalizado oficialmente en Abril 2003. El desarrollo de secuenciadores automáticos basados en electroforesisis capilar, el perfeccionamiento de los sistemas de detección fluorescentes y el desarrollo de herramientas de análisis de secuencias a gran escala posibilitaron el desarrollo de estrategias de secuenciación más eficientes con el consiguiente abaratamiento de costos unitarios, y el concomitante desarrollo de números proyectos de genomas de organismos complejos. Hoy, con la difusión de mas de 1000 genomas completos de diversos organismos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/genome) y el inicio de otros tantos, con mas de 150 billones Página 4 de 40
de pares de bases depositadas en GenBank, estamos transitando la era post genómica, iniciada a mediados de la década del 2000. Actualmente el énfasis esta puesto no solo en la secuenciación de genomas de especies aun no descifrados total o parcialmente sino en la resecuenciación de genomas conocidos, para la identificación de variantes alélicas asociadas a diversidad fenotípica, en distintas especies de importancia económica, con importantes avances para el genoma humano (The International HapMap Consortium, 2003, 2005; The ENCODE Project Consortium, 2004). Esto es posible gracias al desarrollo de diferentes tecnologías e instrumental en continuo proceso de actualización (ver ej. en Tabla 1). La secuenciación capilar con equipos como el Applied Biosystems Incorporated (ABI) 3130 que se utilizará en esta práctica, permite la lectura simultánea de distintas muestras (16, para este equipo), con muy buena resolución y lecturas largas de hasta 800 bp, utilizando distintos fluoróforos. Los fluoróforos mas comúnmente usados son los basados en el colorante rodamina (R110, REG, TAMRA and ROX) que son excitados a una longitud de onda de 488 nm y emiten fluorescencia a distintas longitudes de onda (Figura 1a). ABI desarrolló un sistema de terminadores llamados “Big Dye terminators” que son utilizados en la secuenciación automática (Figura 1b) Figura 1 Parte A: Ensayo de secuenciación de ADN con Terminadores fluorescentes y secuenciador automático Objetivo: Cuantificar ADN por fotometría y fluorometría (Spectra Max Gemini EM) Realizar una reacción de secuenciación de ADN utilizando diferentes templados (plásmidos, productos de PCR y BAC/COS). Purificar por precipitación las reacciones de secuenciación. Preparar las muestras manualmente y con estación de trabajo para análisis en secuenciador automático. Realizar la electroforesis capilar de los productos de secuenciación en secuenciador automático (Genetic Analyzer 3130xl, Applied Biosystems) Materiales: ADN (distintos templados). Iniciadores universales y específicos para cada templado particular. Fluoróforo para cuantificación por fluorometría (Hoechst en buffer TNE) ADN control de timo de ternera para la curva estándar. Kit de secuenciación con terminadores fluorescentes (Big Dye Terminador v3.1, Applied Biosystems). EDTA 125 mM, etanol absoluto y etanol 70% para precipitación. Formamida HiDi. Polímero comercial para la electroforesis capilar de fragmentos de ADN. Buffer con EDTA para electroforesis capilar. Equipamiento: Espectrofotómetro: Nanodrop ND-1000 (Thermo scientific). Espectrofluorómetro: Spectra Max Gemini EM. Termociclador de 96 pocillos: GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems) Sistemas automatizados para manejo de líquidos: Biomek FX (Beckman Coulter). Secuenciador automático de 16 capilares: Genetic Analyzer 3130xl (Applied Biosystems) Equipamiento general de biología molecular Actividades 1) Cuantificación de ADN Tipo de templados y concentración requerida: cc 350 300 250 200 150 100 50 0 Cuant HOECHST - SEQ#08y09 - 20/01/2009 y = 0,2591x R 2 = 0,9954 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 F Curva Std Promedio [cc] F 15 19 27 106 57 193 116 428 150 542 215 842 305 1197 Templado Concentración Productos de PCR 100-200 pb 5 ng/ul 200-500 pb 15 ng/ul 500-1000 pb 30 ng/ul 1000-2000 pb 60 ng/ul mayor a 2000 pb 75 ng/ul ADN doble cadena 200 ng/ul ADN simple cadena 100 ng/ul BAC/Cósmidos 200 ng/ul Página 5 de 40
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