Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - FBMC

1. Se trabajará con los datos generados a partir del software AutoSNP para distintas especies disponibles en la página
web http://autosnpdb.appliedbioinformatics.com.au/
2. En la pestaña SEARCH deberá colocar la especie de interés (p. ej. BARLEY (cebada) / WHEAT (trigo)).
3. Seleccione la acción: Search in the Database using Keyword (seleccionar en la base de datos usando palabras claves).
4. Deje las pestañas abiertas por defecto e ingrese a continuación alguna de las siguientes keywords (“defence”, “rubisco”,
“vernalization”, “cold”, “stress”) y presione “GO”.
5. Se indicará debajo si existen contigs que tengan en su descripción esa palabra clave. Observe cuántos contigs aparecen
en cada caso y anote cuántas secuencias formaron ese contig. Especifique SNPs e Indels dentro de cada contig
6. Entre a alguno de los contigs que armó el programa. Presione el “+” ¿Qué se observa en la tabla? ¿Qué información
brinda cada una de las columnas?
7. Mire también el alineamiento y compruebe los SNPs descriptos en la tabla llegando a las posiciones correspondientes
dentro del alineamiento.
El Min. Informative es la cantidad de secuencias que presentan ese mismo polimorfismo.
El dato de Cosegregation se refiere a la cantidad de SNPs o polimorfismos que comparten en mismo patrón de variación.
El dato de Weighted Cosegregation tiene en cuenta si faltan datos como para que se sesgue el resultado de co-segregación.
8. Conociendo esto, ¿Qué SNPs podrían ser verdaderos y cuáles falsos?
9. ¿Por qué en el análisis de ESTs podemos encontrar SNPs falsos?
10. ¿Qué haría Ud para tratar de corroborar/validar si los SNPs encontrados existen en una población perteneciente a la
especie? Describa alguna metodología.
PARTE B: Búsqueda de SSRs en secuencias ESTs de eucaliptos disponibles en GenBank
Objetivos:
- Utilizar una base de datos pública para la obtención de secuencias ESTs disponibles.
- Identificar regiones repetitivas de tipo SSR en las secuen-cias seleccionadas mediante software de libre acceso.
- Analizar los resultados de los SSR obtenidos.
- Asignar función probable a los ESTs que contienen SSR y analizar los datos.
Actividades:
1. Se analizarán los ESTs disponibles en GenBank, ingresando al sitio del NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
2. Se realizará la búsqueda de los ESTs de la especie Eucalyptus tereticornis. Para ello elija la opción “EST” en el campo
SEARCH y en el campo FOR, escriba Eucalyptus tereticornis [orgn]. ¿Cuántos ESTs obtuvo?
3. En el campo SEND TO, elegir la opción “FILE” y luego “FASTA”, seleccionar “create file”. Se guarda automáticamente
el archivo generado.
Se utilizará el archivo .fasta generado para la búsqueda de regiones microsatélites. Ingresar al sitio del Genome Database
for Rosaceae http://www.rosaceae.org/ Elegir TOOLS, SSR.
4. El servidor enviará un correo electrónico a la casilla indicada, con los links a los files generados. El mismo, tendrá el
siguiente formato:
5. Agregar mail y título al proyecto.
6. Ubicar el archivo FASTA con las secuencias de Eucaliptus para hacer el análsis.
7. En el archivo Excel generado, observe los datos estadísticos de los tipos de microsatélites encontrados. ¿Qué tipo de
microsatélite esperaría encontrar en mayor proporción? ¿Por qué? ¿Coinciden los resultados obtenidos con los esperados?
8. Abrir el último archivo .txt (SSR containing sequences), eliminar el encabezado para que sólo queden las secuencias en
formato fasta. Guardar archivo.
9. Se estudiará el nivel de identidad de estas secuencias de ADN con otras secuencias de proteínas depositadas en bases de
datos públicas, mediante BlastX. Para ello vaya hasta el sitio de Arabidopsis: http://www.arabidopsis.org, tools, BLAST.
Abra el archivo .txt bajado del análisis de SSRs, selecciones algunas secuencais y péguelo en el espacio INPUT, elija
BLASTX (query NT, AA db). Abra la pestaña de parameters options y elija “10” en Max Scores y “10” en Max alignments.
Luego RUN BLAST ¿A qué funciones se corresponden los ESTs?
TP Nº 2: Secuenciación por Electroforesis Capilar de Fragmentos Marcados con Partículas Fluorescentes
Docentes: Verónica Nishikamasu, Pablo Vera y Natalia Aguirre Diseño: Andrea Puebla
Las estrategias de secuenciación basadas en el método de terminación de la cadena por incorporación de nucleótidos dideoxi
(ddNTPs) desarrollado por Sanger mas de 30 años atrás han sufrido un proceso de cambio y superación continuo
desde la detección de moléculas radioactivas en geles hasta la actual detección fluorescente mediante secuenciación en paralelo
en microcapilares o las estrategias de secuenciación en fase sólida basada en chips (Tabla 1). La incorporación de
sistemas de detección fluorescerente en la década del 80 permitió el inicio de la secuenciación genómica y la entrada, en la
década del 90, en la era genómica, con los reportes de los primeros genomas completos de E.coli y C. elegans y el inicio del
proyecto Genoma Humano cuyo borrador fue liberado en 2001 y finalizado oficialmente en Abril 2003.
El desarrollo de secuenciadores automáticos basados en electroforesisis capilar, el perfeccionamiento de los sistemas de
detección fluorescentes y el desarrollo de herramientas de análisis de secuencias a gran escala posibilitaron el desarrollo de
estrategias de secuenciación más eficientes con el consiguiente abaratamiento de costos unitarios, y el concomitante desarrollo
de números proyectos de genomas de organismos complejos. Hoy, con la difusión de mas de 1000 genomas completos
de diversos organismos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/genome) y el inicio de otros tantos, con mas de 150 billones
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