Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - FBMC

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Genómica Aplicada Verano 2012 bres de los metabolitos y sus intensidades); copiar los datos de cada muestra (los pesos frescos deberían aparecer debajo del número de muestra) y ubicar los datos del ribitol en la primera fila. La estandarización se realiza: dividiendo el valor de intensidad de cada metabolito por la intensidad del ribitol y multiplicando por el peso fresco de la muestra (valor estandarizado = intensidad/int. Ribitol/ FW). 27.7) Una vez que todos los valores han sido estandarizados, se procede al análisis estadístico de los datos, calculando la media y desviación estándar para cada muestra, y relativizando el nivel de cada metabolito al control. Recordar que la aproximación propuesta en este trabajo NO permite la cuantificación absoluta de los compuestos, sino relativa al control. Para obtener valores absolutos, es necesario realizar una curva patrón –con concentraciones conocidas del/los compuesto/s que se desea cuantificar. 27.8) Finalmente puede utilizarse algún estadístico (una prueba de comparación de punto a punto --un test de Student- ) para evaluar las diferencias entre el control y las muestras. Bibliografia recomendada: Carrari F, Baxter C, Usadel B, Urbanczyk-Wochniak E, Zanor MI, Nunes-Nesi A, Nikiforova V, Centeno D, Ratzka A, Pauly M, Sweetlove L, Fernie AR. 2006. Integrated Analysis of Metabolite and Transcript Levels Reveals the Metabolic Shifts that Underlie Tomato Fruit Development and Highlight Regulatory Aspects of Metabolic Network Behavior. Plant Physiology 142(4):1380-1396. Fernie AR, Trethewey RN, Krotzky AJ and Willmitzer L. (2004). Metabolite profiling: from diagnostics to systems biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology 5: 1-7. Lisec J, Schauer N, Kopka J, Willmitzer L, Fernie AR. (2006). Gas chromatography mass spectrometry–based metabolite profiling in plants. Nature Protocols 1: 387-396. Luedemann A, Strassburg K, Erban A, Kopka J (2008) TagFinder for the quantitative analysis of gas chromatography - mass spectrometry (GC-MS) based metabolite profiling experiments. Bioinformatics 24:732–737 Schauer N, Semel Y, Roessner U, Gur A, Balbo I, Carrari F, Pleban T, Perez-Melis A, Bruedigam C, Kopka J, Willmitzer L, Zamir D,. Fernie AR. 2006. Comprehensive metabolic profiling and phenotyping of interspecific introgression lines for tomato improvement. Nature Biotechnology 24(4): 447-454 Trabajo Práctico 13: Hacia la biología de sistemas: integración de datos transcriptómicos y metabólicos para el estudio de rutas metabólicas mediante redes neuronales Docentes: Laura Kamenetzky y Mariana López Diseñado por. Laura Kamenetzky Introducción La gran cantidad de datos que se generan con las tecnologías “ómicas” requiere contar con herramientas para la integración y análisis de datos heterogéneos (genómicos, transcriptómicos, metabolómicos, fenotípicos, fenómicos, entre otros). La correlación resultante de la integración de este tipo de datos se interpreta, desde un punto de vista biológico, como una regulación coordinada entre elementos de diferente origen (por ej transcriptos y metabolitos). Para la integración se utilizan métodos de agrupamiento (clustering) donde se exploran los datos desde el punto de vista de la existencia o no de relaciones y éstos se clasifican en clases. Existen diversos métodos de agrupamiento aplicables en el área biológica, uno de los más usados es el agrupamiento jerárquico (hierarchical cluster, HC). Con este método los resultados son representados en forma de dendograma que muestra las relaciones entre los datos generados por una matriz de distancia. En cambio, para resultados obtenidos con algoritmos de tipo no-jerárquico, se calculan primero las distancias a partir de un número predeterminado de grupos y luego se van colocando de forma iterativa los datos en los diferentes grupos hasta minimizar la dispersión interna de cada uno. El algoritmo más representativo de este tipo de agrupación es el de k-media. Para mejorar el desempeño de los algoritmos mencionados, se ha propuesto otro tipo de métodos como son los basados en técnicas de inteligencia computacional y en particular las redes neuronales artificiales del tipo mapas autoorganizativos (SOM del ingles Self-Organizing Maps) (Kohonen, 1982). Estos métodos han probado ser adecuados para manejar grandes dimensiones como las que se generan a partir de un alto volumen de datos y evidenciar, al mismo tiempo, patrones de relaciones ocultas en los datos (Hiraí el al., 2004). Especialmente en cuanto a la integración de datos de diferentes tipos, recientemente se ha propuesto un modelo para la agrupación y visualización de transcriptos y metabolitos en frutos de tomate de diferentes líneas de introgresión (IL) (Stegmayer et al., 2009). Asimismo se ha desarrollado un software (Milone et al., 2010) que permite utilizar este modelo facilitando la obtención de clusters (o neuronas) y a su vez permite visualizar los agrupamientos de manera de extraer la máxima información de este tipo de datos (anotación de genes, rutas metabólicas, entre otros). En este trabajo práctico se emplearán como datos de entrada los perfiles transcripcionales y metabólicos obtenidos a partir de frutos de tomate de 21 líneas de introgresión (IL). Las ILs fueron obtenidas utilizando como parentales a la especie cultivada Solanum lycopersicum y la especie silvestre Solanum pennelli (Eshed and Zamir, 1995). Estas ILs contienen, en homocigosis, un segmento de cromosoma de la especie silvestre en el fondo genético de la especie cultivada. Si se comparan estas líneas con el parental puede inferirse que los cambios son producto de la región introgresada. Los perfiles metabólicos se obtuvieron mediante la técnica de GC-MS. Los datos de expresión de genes se obtuvieron del laboratorio colaborador del Dr. Jim Giovanonni (Boyce Thompson Institute) utilizando la plataforma de TOM2 (http://ted.bti.cornell.edu/cgi-bin/TFGD/array/array_fabrication.cgi) que consiste en microarreglos de 12860 clones EST que representan ~8,500 loci independientes de tomate. Los datos fueron filtrados por calidad de cada spot siguiendo la metodología propuesta por Polanski and Kimmel (2007). Objetivo 34
Genómica Aplicada Verano 2012 Aprender a usar una herramienta bioinformática que sirva para integrar y ayudar a interpretar biológicamente los datos generados por las X-ómicas. En este ejemplo, los datos de transcriptómica y los de metabolómica provienen de frutos de tomate de una población de líneas introgresadas caracterizada genéticamente. Desarrollo del trabajo práctico Instalación del software. El software de integración de datos OmeSom v2.0 corre bajo otro programa. Seguir las instrucciones de instalación siguientes: 1) Se utilizará el programa MATLAB en versión académica, ver (7). Las instrucciones de instalación y uso se resumen en esta guía. Si desean ver información detallada del MATLAB se puede bajar un manual del programa desde (8). Luego de arrancar el programa setup aparece una ventana para elegir la forma de instalación: En la opcion “custom” desmarcar todo, dejar solo: -Matlab Distributed…… -Matlab … -Bioinformatics Toolbox -Signal Processing toolbox -Neural Networktoolbox -Statistics toolbox Copiar las carpetas de uso provistas por los docentes del omeSOM en la carpeta MATLAB. Uso del software 1) Abrir el programa MATLAB (doble click en el icono) 2) En el panel escibir: c:\archivosdeprograma\MATLAB\omesom….. (directorio de uso del MATLAB) 3) Se habilita un cursor en la ventana “COMMAND WINDOW”, escribir: >>omesom 4) Desplegar la ventana del menu IL-SOM model Abrir la solapa IL-SOM Model, clickear en “Create” Seleccionar el file omesom….data [Este file contiene los datos normalizados y relativizados al parental control (S. lycopersicum cultivado) de todos los metabolitos y transcriptos detectados. En total son 1159 transcriptos y 70 metabolitos provenientes de 21 ILs.] Aparece en la pantalla: 4.1) Elegir un mapa de dimensión 10 y la opción “patrones invertidos” (CLICKEAR DIRECTAMENTE OK). Que significa esta opción para este tipo de datos. ¿Por qué es interesante analizarlos? En la región inferior de la pantalla aparece el tiempo de ejecución “Training” en el panel de abajo a la derecha Training: 0/ 30 s Training: 1/ 39 s Training: 1/ 43 s …………………….. Training: 51/ 51 s Cuando termina aparece la opción neighborhood [press Enter for 0]: Apretar Enter 35
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