Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - FBMC

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Genómica Aplicada Verano 2012 perdiéndose la información inicial. 22) Sincronización. En este punto toda la información de nuestras muestras está cargada en el programa. Es necesario ahora identificar los estándares de RT, calcular los RI y finalmente realizar la búsqueda de los tags. 22.1) Búsqueda de los estándares de RT: En el menú TICALC, seleccionar “Time Standard Finder Panel”, se abrirá una ventana nueva, con una pequeña barra de herramientas… seleccionar el icono “abrir” ( ), buscar la carpeta “exemplary files” dentro de la carpeta TagFinder- y abrir el archivo “rt search peak picking” adecuado según el sistema RT utlizado (FAMEs). 22.2) La lista se cargará en la ventana, esta contiene el nombre del compuesto; la información de las masas únicas de estos compuestos (m/z: 87 o 85) y su intensidad; la escala de intensidad, los RT de inicio y final de cada pico y el valor de RI (Time Index) de cada uno. Este último dato es utilizado para calcular los RI de todos los tags de nuestra muestra, estandarizarlos, para luego poder compararlos con las bibliotecas de metabolitos y lograr su identificación (esta lista puede crearla cada usuario, para más información consultar a Luedemann et al, 2008). Ahora debemos ajustar los valores de RT e intensidad de cada pico, a los que hallamos en nuestra corrida. Para esto necesitamos la información que tomamos cuando analizamos los cromatogramas (los tiempos e intensidades de los estándares). Reemplazar los tiempos de la tabla por los que cada uno midió en sus cromatogramas (utilizar los menores y mayores valores medidos para cada pico). La intensidad observada en el CromaTOF, debe ser igual al producto entre la intensidad de la masa específica y la escala de intensidad (es decir si el pico C8:0:1000 tiene una intensidad de 100.000, entonces “intensity scale” debe ser =100, -100x1000=100.000).Es importante que la intensidad elegida corresponda al cromatograma que tiene MENOR intensidad para ese pico, ya que el programa buscará los picos que estén por encima del valor indicado (recuerden que debían tomar los valores a partir de varios cromatogramas). Una vez corregida la información, el programa debe identificar los estándares en nuestros datos; de a uno por vez. Para esto: -seleccionar una fila (es recomendable ir en orden!) y presionar el ícono . La operación demora unos segundos y el resultado aparece en la parte de abajo de nuestra ventana… deberíamos obtener tantos picos como muestras estemos analizando, y encontrar TODAS las muestras. Los resultados completos pueden verse en la solapa que dice “results” (VER FIGURA SIGUIENTE). Si el programa identifica menos muestras, es probable que el pico faltante tenga una intensidad menor a la elegida o esté por fuera del rango de tiempo que hemos definido. Si aparece más de un pico para cada muestra, es probable que hayamos sido demasiado flexibles con nuestros valores. En cualquier caso, identificar en qué muestra se produjo el error y volver a analizar ese cromatograma para identificar el problema, corregir la tabla y volver a buscar los picos, hasta obtener el resultado esperado. Una vez obtenidos todos los resultados, debemos volcarlos en una nueva tabla que contiene los datos de “nuestros” estándares. Armar primero la tabla en la solapa “Time Points”, presionando el ícono (“Init RP set”); luego seleccionar los datos obtenidos en la solapa “Results” y presionar , revisar que los datos se cargaron en la tabla, mirando nuevamente la solapa “Time Points”. Repetir TODA la operación para cada uno de los estándares. Una vez completa toda la tabla debemos guardarla, presionar y salvar el archive con el nombre deseado en el wsp (usualmente elegimos “rt found peak” y el nombre del experimento). 23) Cálculo del RI: Con los datos de RT obtenidos vamos a calcular los RI. En el menú TICALC seleccionar “Time Index Calculation”, (nos pregunta si estamos seguros: YES), y luego debemos seleccionar el archivo que acabamos de crear rt search peak… (o el nombre que hayan elegido) OPEN! Esta operación demora unos segundos y no se genera ningún archivo visible! 24) Anotación de las muestras En este paso debemos poner la información sobre nuestras muestras, para que el programa las llame como nosotros queremos. Este paso puede hacerse en este momento o antes. Es necesario generar un archivo .txt al que llamaremos “samplelist”. Para crearlo, armar una tabla en Excel con los números de cromatogramas en la primera columna (que llamaremos RAWNAME), número de réplica o nombre de la muestra en la columna siguiente (SAMPLETEXT) y los pesos frescos en la última (FW expresados en gramos). Es importante no formatear este archivo y guardarlo como .txt (texto con tabulaciones), abrirlo y borrar los espacios de más que quedan al final (esto genera errores de lectura del archivo!). En el menú SAMPLES, seleccionar “Sample Group Annotator” (nos pregunta si estamos seguros: YES!) se abre una ventana, con la lista de nombres de las columnas, elegir primero RAWNAME (o el que hayamos usado para la colum- 30
Genómica Aplicada Verano 2012 na 1)OK!; luego SAMPLETEXT OK! En la parte inferior de la ventana nos dirá si la anotación de las muestras fue correcta o hubo algún error. Para verificar los datos, seleccionar “Sample Annotator Panel” del menú SAMPLES; debe aparecer la lista que creamos (los pesos frescos no se verán aquí, pero aparecen en la tabla final!). Si la información es correcta, salvar la tabla presionando . Aunque no se muestre ningun mensaje, los datos se han salvado!. La anotación puede generar muchos errores, sobre todo si se arrastran formatos del Excel en el archivo de texto; por eso es MUY recomendable hacer la lista ANTES de empezar con el TagFinder y tenerla guardada en la carpeta que utilizaremos como wsp, verificar que no haya espacios de más. De todos modos si no logramos anotar los archivos como queremos, el programa utiliza los números de cromatogramas para indicar las muestras, ¡el resto de la información tendremos que volver a escribirla! 25) Búsqueda de los “tags” (Tag Finder): Ahora realizamos la búsqueda de “tags” (o “datos espectrales”) con similitud con compuestos cuyos espectros son conocidos. Para esto debemos definir los parámetros de búsqueda y agrupamiento de los datos. Toda la información sobre el significado de los parámetros puede consultarse en Luedemann et al (2008). Para definir los parámetros, seleccionar “Settings” del menú TAGFINDER, o presionar el ícono del lápiz ( ). Utilizaremos los valores que se indican en las siguientes figuras, que surgen de experiencias previas con datos generados en nuestro (y otros) laboratorio/s. PARÁMETROS BUSQUEDA DE TAGS Es el parámetro más importante en la búsqueda de tags; define el ancho –en tiempo- de los picos. El valor sugerido ha dado los mejores resultados en nuestra experiencia Número de réplicas del experimento 31
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