Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - FBMC

Genómica Aplicada
Verano 2012
perdiéndose la información inicial.
22) Sincronización. En este punto toda la información de nuestras muestras está cargada en el programa. Es necesario
ahora identificar los estándares de RT, calcular los RI y finalmente realizar la búsqueda de los tags.
22.1) Búsqueda de los estándares de RT: En el menú TICALC, seleccionar “Time Standard Finder Panel”, se abrirá
una ventana nueva, con una pequeña barra de herramientas… seleccionar el icono “abrir” ( ), buscar la carpeta
“exemplary files” dentro de la carpeta TagFinder- y abrir el archivo “rt search peak picking” adecuado según el sistema
RT utlizado (FAMEs).
22.2) La lista se cargará en la ventana, esta contiene el nombre del compuesto; la información de las masas únicas de
estos compuestos (m/z: 87 o 85) y su intensidad; la escala de intensidad, los RT de inicio y final de cada pico y el valor
de RI (Time Index) de cada uno. Este último dato es utilizado para calcular los RI de todos los tags de nuestra
muestra, estandarizarlos, para luego poder compararlos con las bibliotecas de metabolitos y lograr su identificación
(esta lista puede crearla cada usuario, para más información consultar a Luedemann et al, 2008).
Ahora debemos ajustar los valores de RT e intensidad de cada pico, a los que hallamos en nuestra corrida. Para esto
necesitamos la información que tomamos cuando analizamos los cromatogramas (los tiempos e intensidades de los
estándares). Reemplazar los tiempos de la tabla por los que cada uno midió en sus cromatogramas (utilizar los menores
y mayores valores medidos para cada pico). La intensidad observada en el CromaTOF, debe ser igual al producto
entre la intensidad de la masa específica y la escala de intensidad (es decir si el pico C8:0:1000 tiene una intensidad de
100.000, entonces “intensity scale” debe ser =100, -100x1000=100.000).Es importante que la intensidad elegida corresponda
al cromatograma que tiene MENOR intensidad para ese pico, ya que el programa buscará los picos que estén
por encima del valor indicado (recuerden que debían tomar los valores a partir de varios cromatogramas). Una
vez corregida la información, el programa debe identificar los estándares en nuestros datos; de a uno por vez. Para
esto:
-seleccionar una fila (es recomendable ir en orden!) y presionar el ícono . La operación demora unos segundos y el
resultado aparece en la parte de abajo de nuestra ventana… deberíamos obtener tantos picos como muestras estemos
analizando, y encontrar TODAS las muestras. Los resultados completos pueden verse en la solapa que dice “results”
(VER FIGURA SIGUIENTE).
Si el programa identifica menos muestras, es probable que el pico faltante tenga una intensidad menor a la elegida o
esté por fuera del rango de tiempo que hemos definido. Si aparece más de un pico para cada muestra, es probable que
hayamos sido demasiado flexibles con nuestros valores. En cualquier caso, identificar en qué muestra se produjo el
error y volver a analizar ese cromatograma para identificar el problema, corregir la tabla y volver a buscar los picos,
hasta obtener el resultado esperado.
Una vez obtenidos todos los resultados, debemos volcarlos en una
nueva tabla que contiene los datos de “nuestros” estándares. Armar
primero la tabla en la solapa “Time Points”, presionando el
ícono (“Init RP set”); luego seleccionar los datos obtenidos
en la solapa “Results” y presionar , revisar que los datos se
cargaron en la tabla, mirando nuevamente la solapa “Time
Points”. Repetir TODA la operación para cada uno de los estándares.
Una vez completa toda la tabla debemos guardarla, presionar
y salvar el archive con el nombre deseado en el wsp
(usualmente elegimos “rt found peak” y el nombre del experimento).
23) Cálculo del RI: Con los datos de RT obtenidos vamos a calcular los RI. En el menú TICALC seleccionar “Time
Index Calculation”, (nos pregunta si estamos seguros: YES), y luego debemos seleccionar el archivo que acabamos de
crear rt search peak… (o el nombre que hayan elegido) OPEN! Esta operación demora unos segundos y no se genera
ningún archivo visible!
24) Anotación de las muestras
En este paso debemos poner la información sobre nuestras muestras, para que el programa las llame como nosotros
queremos. Este paso puede hacerse en este momento o antes. Es necesario generar un archivo .txt al que llamaremos
“samplelist”. Para crearlo, armar una tabla en Excel con los números de cromatogramas en la primera columna (que
llamaremos RAWNAME), número de réplica o nombre de la muestra en la columna siguiente (SAMPLETEXT) y los
pesos frescos en la última (FW expresados en gramos). Es importante no formatear este archivo y guardarlo como .txt
(texto con tabulaciones), abrirlo y borrar los espacios de más que quedan al final (esto genera errores de lectura del
archivo!).
En el menú SAMPLES, seleccionar “Sample Group Annotator” (nos pregunta si estamos seguros: YES!) se abre una
ventana, con la lista de nombres de las columnas, elegir primero RAWNAME (o el que hayamos usado para la colum-
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