Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - FBMC

TP 1: Búsqueda bioinformática de microsatélites y SNPs en secuencias funcionales depositadas en bases de datos:
Aplicaciones en especies vegetales. Diseño: Corina Fusari – Cintia Acuña
Participan como docentes: Máximo Rivarola, Pamela Villalba, Jeremías Zubrzycky, Carla Filippi, Cintia Acuña
Introducción
Uno de los desafíos de la biología contemporánea es la caracterización funcional y la identificación de las variantes alélicas
que afectan la expresión fenotípica de caracteres agronómicos de interés. Por su parte, los motivos que definen estas variantes
alélicas emergen como una nueva generación de marcadores, conocidos como marcadores funcionales, que constituyen
un complemento contundente a los marcadores neutros como microsatélites (SSR) y AFLPs para alcanzar el ligamiento
completo entre éstos y los fenotipos expresados (Andersen y Lubberstedt 2003).
La secuenciación completa de los genomas de especies modelo o parcial de especies de interés a través de iniciativas como
la secuenciación de transcriptos conocidos como ESTs (Expressed Sequence Tags) y, más recientemente, isotigs, RNAseq o
secuencias genómicas de una sola lectura conocidas como GSS (Genome Survey Sequences), ha generado una rápida acumulación
de información biológica que es depositada en bases de datos genómicas y es fácilmente accesible a través de
Internet. Esta información, que deriva en muchos casos de la caracterización de líneas elite de una misma especie, de especies
de un mismo género o distintas fuentes relacionadas, constituye el recurso que permite sistematizar el desarrollo de los
SNPs, que en general pueden estar presentes dentro o cerca de genes que afectan la variación fenotípica para un determinado
carácter (Brookes, 1999).
En general la identificación de polimorfismos por nucleótido simple (SNPs) o de pequeñas inserciones/deleciones (Indels)
se ve favorecida por la abundancia, ubicuidad y dispersión de este tipo de polimorfismos presente en los genomas y en el
caso de las plantas cultivadas, también por la disponibilidad de líneas endocriadas que facilitan la tarea de asociación entre
haplotipos de un gen candidato definidos por un grupo de SNPs con fenotipos determinados, debido a que en estos materiales
la cantidad de desequilibrios de ligamiento (LD) se ve aumentado por los procesos de presión de selección que han atravesado
(Rafalski, 2002).
La tecnología de SNPs evidencia un gran potencial para la caracterización de las formas alélicas que controlan procesos
biológicos complejos como la resistencia a los estreses biológicos y ambientales que afectan la productividad de los cultivos.
Estos procesos son muy heterogéneos y de naturaleza poligénica, por lo cual es importante a su vez, tratar de caracterizar
otros polimorfismos con probable impacto sobre la expresión de determinado fenotipo. Estudios recientes sobre LD en
poblaciones humanas avalan la ventaja del análisis de haplotipos basados en SNPs más que el uso de SNPs aislados para
estudios de genética de asociación (Remington y colaboradores, 2001).
Los microsatélites (repeticiones en tandem de mono, di, tri, tetra o pentanucleótidos) son herramientas muy útiles como
marcadores genotípicos debido a que son relativamente abundantes, multialélicos (hipervariables con respecto al número de
repeticiones), heredados en forma estable, y codominantes (se distinguen los alelos de un locus), permitiendo distinguir
materiales estrechamente relacionados. Desde el punto de vista metodológico, son fáciles de detectar mediante PCR, requiriendo
poca cantidad de ADN para el análisis y poco equipamiento.
En principio, se creía que los microsatélites eran marcadores neutros ubicados en secuencias fundamentalmente intergénicas
no codificantes y se desconocía su función específica. Sin embargo, recientemente se han encontraron microsatélites dentro
de genes, los cuales proporcionaron información útil para el estudio de las posibles funciones de los mismos en el genoma
de los organismos.
Diversos estudios mostraron la presencia de SSR dentro de secuencias expresadas (ESTs e isotigs) y en los genes incluyendo
las regiones codificantes para proteínas, las no codificantes (extremos 3'-UTRs y 5'-UTRs) e intrones. Se demostró que
la distribución de los SSR no es azarosa, encontrándose mayormente en regiones UTRs e intrones. Los datos indican que las
extensiones y/o las contracciones de SSR en regiones codificantes para la proteína pueden llevar a un aumento o a una pérdida
de función del gen debido a cambios en los marcos de lectura o la amplificación de mRNA “tóxico”. Las variaciones
en el número de repeticiones de los SSRs en extremos 5'-UTRs podrían regular la expresión de los genes afectando a la
transcripción y traducción. Las extensiones de SSR en extremos 3'-UTR causan un desplazamiento de la transcripción, produciendo
moléculas de mRNA expandidas, que se pueden acumular como focos nucleares y pueden modificar el “splicing”
y, posiblemente, interrumpir otras funciones celulares. Por último, los SSRs en intrones pueden afectar a la transcripción del
gen, al splicing del mRNA o a la exportación al citoplasma.
Todos estos efectos causados por extensiones o contracciones de SSR dentro de genes pueden llevar eventualmente a cambios
fenotípicos, los cuales están sujetos a una presión selectiva más fuerte que otras regiones genómicas debido a su importancia
funcional. Estos SSRs pueden proporcionar una base molecular para la adaptación rápida a los cambios ambientales
en organismos procariotas y eucariotas (Li et al., 2004).
PARTE A: Búsqueda de SNPs en Girasol
Objetivos
- Utilizar el programa AutoSNP como herramientas bioin-formáticas para detectar SNPs dentro de un conjunto de secuencias
depositadas en GeneBank.
- Identificar los datos pedidos y archivos pedidos por el programa y los datos arrojados luego de que corra.
- Analizar los datos obtenidos.
- Identificar los sitios variables dentro del conjunto de individuos para cada región, clasificarlos y asignarles función.
Actividades
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