Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - FBMC

Genómica Aplicada
Verano 2012
gramas con demasiado ruido deben ser eliminados del análisis. Para evaluar la cantidad de ruido, utilizar el valor de
m/z: 355. El valor del ruido debe verse en la zona que no presenta picos y generalmente tiene una intensidad alrededor
de 100. Recordar este valor.
18.5) Otra cosa importante a tener en cuenta son los picos de los estándares de tiempo de retención (RT): alcanos
(m/z: 85) o FAMEs (m/z: 87) (estos últimos son los usados en este TP). Estos compuestos se utilizan para calcular el
índice de retención (es decir el tiempo de retención de un compuesto dentro de la columna cromatográfica corregido o
estandarizado) de cada pico, ya que este dato es necesario a posteriori para la identificación del compuesto correspondiente.
Evaluar que todos los estándares incorporados estén presentes en el cromatograma y la forma de los picos. En
este punto también es necesario tomar nota de los tiempos de inicio y fin de cada uno de los estándares, es decir la
amplitud de la curva, y la intensidad máxima. Esta información la utilizaremos más adelante para calcular los índices
de retención (RI) de cada pico. Es importante considerar la variabilidad que existe a lo largo de la corrida, por ello es
conveniente considerar la amplitud de los picos estándares en distintos cromatogramas.
19) Procesamiento de los datos
El paso siguiente es procesar la información contenida en los cromatogramas que ahora se encuentra en forma de archivo
.cdf. Esta tarea se realiza con el programa TagFinder, brevemente este es un software desarrollado para PC que
opera en lenguaje Java creando distintos espacios de trabajo. En primer lugar el programa “busca” los picos dentro de
los archivos .cdf y convierte la información de los espectros en archivos .txt. Los datos son importados y “sincronizados”,
para ello se identifican los estándares de RT y se calcula el RI de todos los picos. Toda esta información es utilizada
por el programa para buscar “mass spectral tags” o simplemente “tags” (marcas espectrales que „parecen‟ compuestos
químicos) y generar una matriz de datos con los resultados hallados. Finalmente los tags son comparados con
bibliotecas de metabolitos para identificarlos; si bien el resultado de esta comparación lo ofrece el programa, la identificación
final de los compuestos se realiza en forma manual mediante la evaluación de los espectros. A continuación
detallamos una guía práctica de uso para el análisis de los cromatogramas obtenidos en nuestro TP; la información
teórica de los comandos utilizados, así como otras implementaciones del programa pueden consultarse en Luedemann
et al (2008).
19.1) Creación de un nuevo espacio de trabajo (workspace). Para comenzar a trabajar en el TagFinder es necesario
crear un nuevo espacio de trabajo (wsp), que defina los parámetros de nuestro análisis. Para ello crear una carpeta con
el nombre de usuario dentro de la carpeta del TagFinder.
19.2) Abrir el TagFinder, en el menú TAG FINDER, seleccionar la opción “create new workspace” (o bien presio-
nar el icono que tiene una estrellita ). Se abre un cuadro que permite definir los parámetros del nuevo espacio de
trabajo
Crear el wsp en la carpeta correspondiente a cada usuario
20) Búsqueda de picos (obtención de archivos .txt)
20.1) Dentro del wsp abierto, ir al menú TOOLS, seleccionar
“external tools” (o bien presionar el ícono que tiene el
enchufe ). Se abre un cuadro de diálogo Jar Browser seleccionar
“select Jar file”, luego elegir “tagtools” open!. Se
despliega una lista de herramientas:
Seleccionar “cdftools.PeakFinder” Run!.Pregunta si estamos
seguros Yes!
Define el número de decimales del
workspace, depende de los estándares
de RT utilizados: 0 para FAMEs, 2
para Alcanos
Define el rango de masas a analizar,
los valores 70-600 incluyen todas las
masas de interés en este tipo de análisis
Elegir el directorio donde se va a
crear el wsp, p
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