Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - FBMC

Genómica Aplicada
Verano 2012
5) Transferir el homogenato a un tubo de vidrio de 10 ml (Schott GL14).
6) Incubar el homogenato durante 15 minutos a 70°C.
7) Agregar 1,5 ml de H20 bi-destilada calidad HPLC.
8) Centrifugar 15 minutos a 4000 rpm
9) Transferir una alicuota de 200 µl a un tubo epp de 2 ml y desecar los extractos en un desecador de vacio (tipo speed
vac) con rotación durante por lo menos 8 horas (aquí termina el primer día de práctico).
10) Al retirar los tubos, inyectar Argón para desplazar el Oxígeno y cerrarlos inmediatamente para evitar posibles
reacciones.
Derivatización de los extractos
11) Agregar 60 µl del primer derivatizante (hidroxicloruro de metoxiamina) preparado inmediatamente antes de uso
(30 mg/ml disuelto en piridina). NOTA: ESTA PARTE SERÁ DEMOSTRATIVA, LOS DERIVATIZANTES
SOLO PODRÁN SER MANIPULADOS POR LOS DOCENTES A CARGO.
12) Incubar con agitación constante a 37°C durante 2 horas.
13) Agregar 120 µl del segundo derivatizantes (MSTFA: N-metil-N-trimetilsililtrifluoroacetamida)
14) Agregar 10 µl de una solución de estándares de tiempo de retención (FAMES: fatty acid methyl esters).
15) Incubar con agitación constante a 37°C durante 30 minutos.
16) Inyectar en el GC-MS.
Análisis y procesamiento de los cromatogramas. Obtención de perfiles metabólicos.
Los datos obtenidos al final del análisis en el GC-MS se encuentran en forma de cromatograma, es decir un gráfico
que representa en el eje de las ordenadas la intensidad de la corriente iónica total (TIC) o de una relación m/z definida
vs el tiempo de corrida en el eje de las abscisas. Cada cromatograma corresponde a una de las muestras analizadas y se
encuentra en archivos (.peg) que sólo pueden visualizarse utilizando el programa ChromaTOF (Leco Instruments). La
obtención de los perfiles metabólicos de cada muestra implica individualizar los picos que forman el cromatograma e
identificar a qué compuesto corresponde cada uno. Esa tarea, si bien puede hacerse a mano, se ve facilitada por la utilización
de programas de computación específica y su desarrollo constituye una de las sub-areas de los que se denomina
“metabolómica“. Existen numerosos programas que han sido utilizados para obtener perfiles metabólicos (ChromaTOF,
MassLab, etc) mediatne algoritmos diferentes, pero el software TagFinder (Luedemann et al., 2008) ha sido
específicamente desarrollado para la obtención de perfiles metabólicos vegetales en aproximaciones “no dirigidas“.
17) Análisis de los cromatogramas
El primer paso para la obtención de los perfiles metabólicos es analizar la calidad de los cromatogramas obtenidos,
corregirlos y exportalos en un formato adecuado para el análisis con el TagFinder.
En este primer paso es necesario:
17.1) Importar los archivos .peg a analizar en el programa ChromaTOF. Para ello crear una nueva carpeta (utilizar el
nombre del experimento) dentro del directorio “Acquired Samples“. Dentro de la carpeta presionar el botón derecho
del mouse y seleccionar “Import“, elegir todos los archivos a importar y abrir.
17.2) Para visualizar mejor los cromatogramas hay que procesarlos –en este momento además, se exportan en el
formato adecuado para su análisis en el TagFinder. Seleccionar todos los cromatogramas dentro de la carpeta y presionar
botón derecho del mouse, elegir la opción“process data” (se abre una ventana donde aparecen todos los archivos
marcados), aceptar (OK) y elegir “peg to cdf” en la ventana nueva que se abre (OK). Esta opción convierte los archivos
.peg en .cdf (formato de TagFinder), corrige la línea de base de los cromatogramas (baseline correction) y suaviza
el trazado de los picos.
17.3) Otra herramienta que posee el ChromaTOF y que reulta útil para evaluar la calidad de los cromatogramas, es
la visualización de los espectros de cada pico. Para ello, seleccionar nuevamente todos los cromatogramas y elegir
dentro de process data “Afe methods“. Este procesamiento no afecta los archivos que analizaremos con el TagFinder
(.cdf) sólo permite la observación de los espectros.
18) Evaluación de la calidad de los cromatogramas:
18.1) Mirar el TIC del cromatograma y algunas masas específicas de compuestos conocidos, por ejemplo azúcares
(m/z: 307, 160, 361 para fructosa, glucosa y sacarosa respectivamente), citrato (m/z: 273), ácido fosfórico (m/z: 299) u
otras. Para modificar la masa que queremos visualizar hacer click en el recuadro que dice TIC debajo del cromatograma
y escribir la o las masas de interés (pueden visualizarse varias a la vez).
18.2) Mirar la forma de los picos (tanto en TIC como para las masas específicas), estos tienen que tener aspecto de
curvas gaussiana. Aumentar con el mouse algunos picos y ver su forma. Cuando el ápice de los picos está deformado
indica que ese compuesto está saturado dentro de la muestra. En el caso en que los picos presenten formas no gausianas
(picos divididos, por ej.) eliminar estos cromatogramas del análisis.
18.3) Al hacer click sobre el trazado de un pico podemos visualizar el espectro en ese punto, los espectros que definen
cada pico son los que se encuentran en el ápice del mismo, es decir donde la intensidad es máxima.
18.4) Es necesario, además, evaluar la cantidad de ruido que tiene un cromatograma, muchas veces hay factores
ajenos a la muestra que generan demasiado ruido, dificultando la identificación de la señal verdadera. Los cromato-
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