Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - FBMC

Genómica Aplicada
Verano 2012
Trabajo Práctico 13: Perfiles metabólicos por cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de
masas (GC-MS) en tubérculos de papa.
Diseñado y enseñado por Mariana López, Fernando Carrari y Laura Kamenetzky
Bases y principios:
Los perfiles metabólicos obtenidos por distintas técnicas de separación (cromatografía líquida –LC- y gaseosa –GCen
sus diferentes variantes) y análisis (espectrometría de masas –MS- y resonancia magnética nuclear –NMR-) están
siendo ampliamente utilizados en estudios detallados y sistemáticos, denominados “aproximación dirigida” y “no
dirigida” respectivamente (por targeted and non-targeted approaches en inglés) para la resolución de problemas en
biología vegetal (Fernie et al, 2004). La obtención de muestras biológicas para el análisis de sus perfiles metabólicos,
como cualquier otra técnica que involucre la identificación y cuantificación de metabolitos, requiere la inactivación
inmediata del metabolismo de modo de evitar efectos de su manipulación sobre el mismo. La inhibición rápida del
metabolismo se logra mediante la disminución brusca de la temperatura ( -60°C) por inmersión de las muestras en N2
líquido. A su vez, los procedimientos posteriores de extracción requieren el uso de materiales (tales como tubos plásticos
o de vidrio) de alta calidad y pureza de modo de prevenir fuentes de eventuales contaminaciones. Además, dado
que una de las aplicaciones comunes de estas técnicas es la comparación del estado metabólico de organismos frente a
perturbaciones ambientales y/o a cambios en la constitución genética de los mismos, una necesidad básica es la consideracion
de controles tanto de los materiales “per se” como de las condiciones en las que las muestras son extraídas y
procesadas. Finalmente, la aplicación de algoritmos estadísticos a los datos obtenidos requiere la determinación del
grado de variación dentro de la población de muestras a ser analizadas.
A efectos explicativos, en este trabajo práctico nos concentraremos en un ejemplo de muestreo, acondicionamiento y
extracción de tubérculos de plantas de papa (Solanum tuberosum) para la obtención y posterior análisis de perfiles
metabólicos. Los mismos serán obtenidos mediante separación de los extractos vegetales en un cromatógrafo gaseoso
(Agilent) acoplado a un espectrómetro de masas en tiempo de vuelo (LECO Pegasus III). El momento del día para el
muestreo debe ser cuidadosamente controlado. Como regla general, la mitad del periodo de luz es el más indicado
debido a que numerosos reportes en la literatura dan cuenta de los ritmos diurnos en los cambios en la composición
metabólica de plantas. El otro punto importante a tener en cuenta es el estado fenológico de las plantas y los órganos a
muestrear. Una vez que los discos de tubérculos fueron muestreados, se debe registrar la masa exacta de la muestra y
congelarla inmediatamente. Las muestras deben mantenerse a la temperatura indicada durante todo el proceso de extracción.
Para este trabajo práctico, la cantidad de tejido a procesar será de aproximadamente 120 mg (peso fresco). La
muestra debe ser homogenizada en N2 líquido, las enzimas inactivadas mediante el agregado de metanol y al mismo
tiempo deben agregarse estándares internos (en concentraciones conocidas) no presentes en la muestra a analizar. La
extracción se realiza luego, calentando la muestra a 70°C con agitación constante. Si bien este protocolo puede aplicarse
a la obtención tanto de la fase polar como apolar, a los efectos de este trabajo práctico, los pasos siguientes se
concentran en la obtención de la fase polar. Mediante un paso de extracción con agua, las alícuotas de la fase polar son
concentradas y liofilizadas para su posterior derivatización.
La derivatización consiste en la modificación de las moléculas a fin de disminuir su polaridad y permitir la volatilización
de las mismas al momento de su sepración en fase gaseosa. Existen varios métodos y reactivos derivatizantes.
Entre los más usados para esta aplicación, el MSTFA (N-metil-N-trimetilsililtrifluoroacetamida) ha demostrado ser
uno de los más reactivos en reemplazar los hidrógenos lábiles de un amplio rango de compuestos polares por grupos
sililos y el hidroxicloruro de metoxiamina es usado en un segundo paso de derivatización a fin de proteger grupos aldehídos
y cetonas de las moléculas presentes en la matriz.
Los extractos así preparados son inmediatamente inyectados en el cromatógrafo acoplado al espectrómetro de masas.
Tanto las condiciones de corrida (tiempo, rampa de temperaturas, frecuencia de captura de datos, etc) como las especificaciones
de flujo de gas y columnas cromatográficas deben ser puestas a punto para cada aplicación particular. En
este sentido, en los últimos años se dispone de softwares específicos diseñados por los fabricantes de espectrómetros
(ChromaTOF) que controlan toda la operación, así como de programas de computación especialmente diseñados que
facilitan el procesamiento posterior de los datos (Lisec et al, 2006, Luedemann et al, 2008). A su vez, la disponibilidad
de colecciones de espectros de masas en bases de datos de acceso público (ver por ejemplo: The Golm Metabolome
DataBase) permite la rápida evaluación de los datos adquiridos.
Desarrollo del Trabajo Práctico
Preparación de extractos
1) Muestras discos de tubérculos de papa de plantas crecidas en invernáculo, registrar su masa exacta y colocarlos en
tubos epp de 2 ml. Congelarlos inmediatamente en N2 líquido. NOTA: EL N2 LIQUIDO SOLO SERÁ MANIPU-
LADO POR LOS DOCENTES A CARGO.
2) Homogeneizar la muestra en mortero con N2 líquido hasta obtener un polvo fino.
3) Agregar 1,4 ml de metanol (100 %) previamente enfriado y mantenido en hielo.
4) Agregar 60 µl de ribitol (concentración stock de 0.2 mg/ml en H20 bi-destilada calidad HPLC)
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