Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - FBMC

Genómica Aplicada
Verano 2012
La detección de la interacción in vivo entre 2 proteínas
de interés requiere de la co-expresión de
estas proteínas como fusiones de los fragmentos
T25 y T18 en bacterias E. coli que carecen de actividad
de adenilato ciclasa endógena por deleción
de un nucleótido del gen correspondiente (∆cya).
Esto se consigue usando 2 vectores compatibles,
uno expresando la T25 (pKT25 o pKNT25) y el
otro expresando la fusión T18 (pUT18 o pUT18C).
Las bacterias se cotransforman con 2 plásmidos
recombinantes y plaquean sobre medios con indicadores
para revelar el fenotipo Cya + (Figura 2)
resultante de complementar y así revertir la deleción del gen cromosómico. La eficiencia de complementación entre 2
proteínas híbridas se visualiza a través de la detección de actividad β-galactosidasa (entre otros métodos posibles).
Figura 2:
Este procedimiento puede escalarse y robotizarse para el
paneo (prospección) a gran escala de proteínas que puedan
interactuar con una molécula señalizadora importante, como
por ejemplo, un factor de transcripción (ver Figura 3):
Procedimiento: Células competentes de E. coli
BTH101 (cya -) serán co-transformadas con los plásmidos
anzuelo (X-pKT25) y presa (Y-pUT18). En paralelo,
se llevaran a cabo los controles indicados en la tabla
1. Los plásmidos put18-Zip y pKT25-Zip contienen
proteínas capaces de interactuar y constituyen el control positivo del sistema.
Tabla
Tubo Plasmidos
1 X-pKT25 + Y-pUT18
2 X-pKT25 + pUT18 (control -)
3 pKT25 + Y-pUT18 (control -)
4 pKT25 + pUT18 (control -)
5 pKT25-Zip + pUT18-Zip (control +)
La transformación se realizará incubando en hielo 50 μl de células
competentes con 50 ng de cada plásmido durante 30 minutos.
Luego se incubara a 42°C durante 2 minutos e inmediatamente se
resuspenderán las células en 200 μl de medio LB. Se mantendrá
la mezcla en agitación a 37°C durante 30 minutos para permitir
la expresión de la resistencia a los respectivos antibióticos. La
selección de clones dobles transformantes se llevará a cabo en
medio LB conteniendo ampicilina (100 µg/ml) y kanamicina (50 µg/ml). Además, se le agregará X-Gal (5-bromo-4chloro-3-indolyl-b-D-galactopyranoside,
40 μg/ml en dimetil formamida) e IPTG (Isopropil-1-tio-β-D-galactósido,
1mM) a dicho medio con el objetivo de poder visualizar los clones con proteínas interactuantes.
Luego de 24 hs de incubación a 37°C se medirá la afinidad de la interacción contando el número de colonias
azules crecidas en dicho medio.
Hay dos maneras de detectar los clones que presentan interacciones, uno es seleccionar en medio mínimo suplementado
con lactosa con los antibióticos y con X-gal (no es tan necesario), el otro es plaquear los transformantes en medio
LB con los antibióticos y con X-gal. El primer método tiene la ventaja de ser selectivo y solo crecen los clones donde
hay interacción (en teoría) y el segundo tiene la ventaja de ser mas rápido (las colonias aparecen antes) pero a veces
dan un poco de coloración los controles negativos.
Preguntas: a) ¿Por qué el genotipo de bacterias debe ser ∆cya?
b) En el TP, la cuantificación de la afinidad de la interacción se cuantificó, contando el número de colonias azules. Es
esto correcto ¿qué significado tiene el número obtenido? ¿cómo corregiría esta situación?
c) ¿Considera que un resultado positivo con este sistema resulta totalmente conclusivo para demostrar una interacción?
Y un resultado negativo ¿es una indicación concluyente de la falta de interacción?
d) ¿Qué otro método se le ocurre que podría servir para detectar interacción positiva entre las 2 proteínas híbridas?
e) El genotipo de la bacteria utilizada en el TP es el siguiente: E. coli BTH101 (F- cya-99, Str r ). ¿Qué significan las
siglas?
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