Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - FBMC

1. Preparar la master mix para el total de las muestras
necesarias
*concentración de magnesio 2,5 mM MgCl2
2. Mezclar con cuidado la master mix y pipetar el volumen
adecuado dentro de los capilares de PCR.
3. Agregar el volumen de templado (≤ 1µg/reacción) en
cada capilar. Tapar los capilares y centrifugar a 3000
rpm durante aproximadamente 10 segundos.
Genómica Aplicada
Verano 2012
SYBR Green PCR
master MIX*
Primer F variable 0.5mM
Primer R variable 0.5 mM
H2O RNAsa-Free variable -
Templado variable ≤ 1µg/reaccion
Volumen Total 20 µl
4. Colocar los capilares en el carrusel y colocar el carrusel en el termociclador comenzando por la posición 1.
5. Seleccionar el programa de corrida
6. Poner los capilares en el rotor y comenzar la corrida de PCR.
7. Una vez finalizada la corrida de PCR realizar el análisis de los datos obtenidos.
8. Analizar la curva de melting para cada muestra.
Paso
Activación inicial de
Tiempo Temperat. Rampa Comentarios
PCR
Ciclo de 3 pasos
15 min. 95ºC 20ºC/seg Activación de la HotStart ADN polimerasa
Desnaturalización 15 seg 94ºC 20ºC/seg
Anillado
Extensión
Número de ciclos
Curva de Melting point
20-30seg 50-60ºC
10-30seg
35-55
ciclos
95ºC
60 ºC
95 ºC
40 ºC
72ºC
0 seg.
15 seg.
0 seg.
30 seg.
20ºC/seg
20ºC/seg
20ºC/seg
20ºC/seg
0,1ºC/seg
Entre 5º a 8ºC por debajo de la Tm de los primers
Llevar a cabo toma de datos. El tiempo de extensión depende
del largo del producto de amplificación. Generalmente,
se utiliza 5 seg cada 100 pb, con un mínimo de 10
seg de tiempo de extensión
El número exacto de ciclos depende del límite de detección
a alcanzar
Llevar a cabo la toma de datos de fluorescencia continuamente
TP 12 Interactómica: estudio de las interacciones proteína-proteína
Docentes: Laura Klepp y Laura Kamenetzky Diseñado por Laura Klepp y Esteban Hopp
Permite estudiar, a gran escala, la interacción entre proteínas como parte del proceso de transducción de señales y de
redes de interacción de proteínas.
Las interacciones entre proteínas son importantes, por ejemplo, para la señalización al interior de la célula de señales
procedentes del exterior. Este proceso, llamado transducción de señales, juega un papel fundamental en procesos biológicos
y enfermedades (ej. cáncer). En bacterias, tienen un papel preponderante en la interacción genotipo-ambiente
mediante el cual las células reaccionan ante estímulos ambientales. También son importantes en la determinación de
virulencia de cepas patogénicas. Las proteínas pueden interactuar formando un complejo o pueden transportar a otra
proteína desde el citoplasma al núcleo (en bacterias hacia el espacio extracelular) o viceversa (en el caso de las importinas
de los poros nucleares) o pueden interactuar con otra proteína para modificarla (por ejemplo, una proteína kinasa
puede fosforilar a una proteína objetivo). En definitiva, las interacciones proteína-proteína tienen una importancia
capital en prácticamente todos los procesos en una célula viva.
La técnica denominada sistema de dos híbridos o sistema del doble híbrido se utiliza para detectar interacciones entre
proteínas y ha sido especialmente útil para estudios a gran escala ya que permite analizar grandes conjuntos de proteínas
en un único experimento global. La más común de las técnicas de doble híbrido es la que se realiza en levaduras,
pero la de bacterias presenta otras ventajas (sencillez, costos, etc.) y resulta más apropiada para estudiar interacción de
proteínas procarióticas. Existen otras técnicas similares en protoplastos de plantas y células de mamíferos.
Principio
El sistema se basa en la reconstitución de la actividad de adenilato ciclasa (1) mediada por interacción entre 2 subunidades
artificialmente diseñadas. Para esto se aprovecha las características de la enzima de Bordetella pertussis (2) que
está conformada por 2 fragmentos complementarios, llamados T25 y T18 (ver Figura 1A), que no son activas cuando
están físicamente separadas (Figura 1B). Cuando estos 2 fragmentos se fusionan covalentemente a 2 polipéptidos capaces
de reconocerse entre sí (interactuantes) que llamaremos X e Y, la heterodimerización de estas proteínas de fusión
(también llamadas híbridas o quiméricas) resulta en la complementación funcional entre T25 y T18 (Figura 1C)
y, por lo tanto, en la síntesis de cAMP. El cAMP producido por la enzima quimérica reconstituida se une a la proteína
activadora por catabolito, CAP (también llamada CRP). El complejo cAMP/CAP es un regulador pleiotrópico de la
transcripción en E. coli y en particular del operón lactosa o del operón maltosa (Figura 1D) lo cual permite distinguirlas
en medios selectivos o conteniendo indicadores. Figura 1:
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