Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - FBMC

Genómica Aplicada
Verano 2012
El material de partida es cDNA sintetizado a partir ARN por RT-PCR. Generalmente entre un 10 al 30% del ARN
templado es transcripto reversamente a cDNA. Sin embargo el volumen de cDNA (de la reacción de RT) no debe
exceder el 10% del volumen final de la PCR en tiempo real.
Girasol: ARN de las líneas HA89 y RHA 801 a distintos tiempos post inoculación.
Papa: ARN líneas transgénicas sobre las que se quiere evaluar expresión
o silenciamiento del gen endógeno
PCR
en punto final
Diseño de primers
PCR
en tiempo real
Longitud 18-30 nucleotidos
Contenido
de GC
GIRASOL PAPA
Actina1 Actina upper
Oxox (oxalato oxidasa) Actina lower
EF 502 (LTP) Snakin Upper y
Lower
Número de ciclos
Por lo general los programas de PCR tienen de 35
a 45 ciclos, pudiéndose extender hasta 55 ciclos. Sin embargo, llevar a cabo tantos ciclos aumenta la posibilidad de
formación de productos inespecíficos. Esto llevará a una inadecuada cuantificación ya que con el método de SYBR
Green no es posible diferenciar los aporte a la señal de fluorescencia generada por los distintos productos (sean estos
específicos o inespecíficos).
Por otro lado, se puede observar si los productos generados son inespecíficos mediante el análisis de las curvas de
melting. Generalmente los productos inespecíficos formados presentan temperaturas de fusión (Tm), menores a la del
producto específico.
Generación de curvas estándar
Para generar una curva estándar se recomienda utilizar al menos 5 concentraciones distintas de la secuencia a detectar.
La concentración de la muestra desconocida debe caer dentro del rango de trabajo. Si la concentración es mayor a este
rango, se recomienda repetir el análisis realizando diluciones de la muestra para que se encuentre dentro del rango de
linealidad. Los estándares deben poseer el mismo sitio de unión al primer, la misma secuencia entre los sitios de unión
al primer, y las mismas secuencias río arriba y río abajo de la secuencia a amplificar que la muestra a ser cuantificada.
Si las muestras incógnita son ARN los estándares deben ser concentraciones conocidas de ARN, mientras que si son
cDNA o ADN pueden ser ADN plasmídico, fragmentos de PCR o ADN genómico.
Controles
Dada la alta sensibilidad de la técnica de PCR, es necesario siempre descartar la ausencia de contaminación. Para ello
se utilizan controles negativos para el control de contaminación de reactivos o de la matriz a analizar, así como para
chequear la ausencia de falsos positivos productos de reacciones inespecíficas. Para ello, se utilizarán como controles
de la reacción de PCR:
Control negativo de PCR. Este control contiene todos los componentes de la reacción excepto el templado (ADN o
cDNA). Este control debe dar negativo (ausencia de amplificación). Se lo utiliza para descartar la contaminación en
los reactivos utilizados.
Control de RT. Este control contiene todos los componentes de la reacción pero en lugar de templado (ADN o
cDNA) tiene ARN. Este control debe dar negativo (ausencia de amplificación). Se lo utiliza para detectar en el ARN
que fue utilizado como templado para la síntesis de cDNA por RT-PCR, la presencia de contaminación con ADN.
PROTOCOLO
40-60%
Tm= 2ºC x (nº de [ A+T] + 4ºC x ( nº de[ C+G] )
Tm La temperatura óptima de annealing debe ser unos
grados por debajo de la Tm (+/- 5ºC)
Longitud ideal del producto entre 100-150 pb.
Evitar complementariedad de 2 o mas bases en los
extremo 3´ de los pares de primers para reducir la
formación de dímeros.
Evitar seguidillas de 3 o más Guaninas en el extre-
Secuencia
mo 3´.
Evitar que el extremo 3´ termine con Timina ya que
tienen una alta tolerancia a los missmatch.
Evitar la complementariedad de secuencias dentro
de la secuencia del primer y entre los pares de primer.
Componentes
Volumen
para una
muestra
Concentración final
2x QuantiTect 10 µl 1X
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