Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - FBMC

Genómica Aplicada
Verano 2012
Esta metodología, siempre que sea adecuadamente diseñada y puesta a punto, permite obtener una mayor sensibilidad
y especificidad. Dado que la amplificación y la detección ocurren al mismo tiempo, el análisis es más rápido que en la
PCR en punto final. Además, como no es necesario, manipular los productos de PCR se reduce la posibilidad de contaminación
con estos productos. Entre las desventajas que presenta frente a la PCR en punto final se pueden señalar su
mayor costo, tanto en el equipo como en los reactivos utilizados, así como la complejidad del diseño de los primers y
sondas, que en muchos casos resultan más exigentes. Para la medición de la fluorescencia dos son las modalidades
más utilizadas: las sondas fluorescentes y los agentes intercalantes de ADN.
Las sondas son secuencias de oligonucleótidos que reaccionan por complementariedad de bases con un pequeño
fragmento de la secuencia a amplificar. Estas sondas están marcadas con moléculas que emiten fluorescencia cuando
se produce la amplificación específica. Las sondas se colocan en la reacción de PCR junto con los otros reactivos y
solamente se detecta fluorescencia, si la secuencia de interés está presente en la muestra y hay amplificación.
Entre las ventajas de estas sondas podemos mencionar la alta especificidad de la reacción, debido a que sólo se genera
fluorescencia si la reacción específica de la PCR ha ocurrido y la posibilidad de detectar y cuantificar múltiples targets
en una única reacción de PCR mediante el uso de varias sondas distintas en la misma reacción.
Entre las desventajas que presentan podemos señalar el diseño de las sondas que deben resultar específicas y no interferir
con los primers; la necesidad de sintetizar una sonda distinta para cada target que se quiere detectar; y por último
el mayor costo de la PCR debido a la incorporación de estas moléculas marcadas.
Existen distintos modelos de sondas. Las más utilizadas son las sondas de hidrólisis (sondas Taqman). Además se
pueden mencionar las sondas conformacionales (Molecular beacons, Scorpions, donde lo marcado son los primers) y
las sondas de hibridación.
El otro formato ampliamente utilizado son los agentes intercalantes de ADN. El más empleado es el SYBR Green.
El SYBR Green es una molécula que presenta la característica de no emitir fluorescencia cuando se encuentra en solución.
En presencia de ADN doble cadena, el SYBR Green se intercala entre las cadenas de ADN emitiendo así una
señal fluorescente. Este fluorocromo se agregar a la reacción de PCR junto con los otros reactivos. Si en la reacción de
PCR hay amplificación, el SYBR Green se une al ADN de doble cadena recién sintetizado en cada ciclo y va generando
un aumento en la señal de fluorescencia que es proporcional a la cantidad de producto generado durante la amplificación.
Hay que tener en cuenta que esta reactivo no es específico de una secuencia determinada y por lo tanto se intercala con
el ADN doble cadena que puede corresponder tanto a productos de amplificación específicos como inespecíficos. Para
evitar la generación de señal inespecífica, que llevará a resultados equivocados, es muy importante la optimización de
la reacción de PCR de manera tal de evitar la formación de los productos inespecíficos.
Entre las ventajas que presenta con respecto a las sondas se pueden mencionar que es un método más económico dado
que no necesita la síntesis de sondas marcadas. Por otro lado, puede ser utilizado para la detección y cuantificación de
diferentes secuencias sin necesidad de sintetizar sondas diseñadas específicamente para ello.
Entre las desventajas en comparación con las sondas fluorescentes podemos mencionar su menor especificidad y el
hecho de que no permite la cuantificación de diferentes targets en una única PCR.
Si bien generalmente se menciona que la especificidad es menor a la que se obtiene utilizando sondas fluorescentes, se
puede lograr alta especificidad. Para ello algunas de las estrategias a utilizar son:
La optimización de la reacción de PCR para la amplificación de un único producto, asegurándose la ausencia de
productos inespecíficos.
El análisis de los productos de amplificación a través de la lectura de la temperatura de fusión (melting point).
Esta temperatura (Tm) es aquella en la cual la mitad de las cadenas de ADN están como doble cadena y la otra mitad
está desnaturalizadas. Es propia y específica de cada producto de amplificación, dado que dependen del tamaño del
producto amplificado y de la composición de las bases del mismo. Para llevar a cabo este análisis, al final de la PCR
se programa el equipo para realizar un paso más. Este consiste en aumentar la temperatura muy despacio desde una
temperatura baja (60ºC) a una temperatura alta (95ºC). Durante todo el proceso se monitorea constantemente la fluorescencia
generada y esta señal es recolectada por el equipo. A bajas temperaturas todos los productos de PCR están
en la conformación de doble cadena, por lo tanto el SYBR Green se une a ellos y la emisión de fluorescencia es alta. A
altas temperaturas, los productos se encuentran desnaturalizados resultando en un rápido descenso en la señal de fluorescencia.
Al llegar a la temperatura de fusión, se produce un brusco descenso en la señal de fluorescencia. Este descenso es
detectado por el equipo y graficado. Así, se obtiene un gráfico de fluorescencia en función de la temperatura, donde se
observa un pico (la primera derivada de este gráfico) que corresponde a la temperatura de fusión del producto. Si la
reacción ha sido puesta a punto de manera adecuada, solo se espera ver la presencia de un pico que corresponde al
producto de interés.
Trabajo Práctico - Consideraciones generales
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