Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - FBMC

Genómica Aplicada
Verano 2012
son pequeñas secuencias de ADN de simple cadena de alrededor de 20 a 30 bases, los cuales se encargan de indicarle
a la enzima donde iniciar la síntesis nuevas copias de ADN.
La gran especificidad de la PCR se sustenta en la capacidad de los cebadores para reconocer por complementaridad de
las bases del ADN a una secuencia particular de ADN y para ello es necesario conocer, al menos parcialmente, la secuencia
de ADN de que se quiere detectar para diseñar los primers adecuados. La reacción ocurre en un equipo denominado
termociclador que regula los tiempos y temperaturas óptimos para que ocurra la reacción. La reacción tiene
tres etapas. Juntas forman un ciclo de PCR. Estos ciclos se repiten de 30 a 50 veces. Cada ciclo consta de:
Etapa de desnaturalización, donde se produce separación de las dos cadenas de ADN para obtener el ADN como
cadenas simples. Esta etapa ocurre a 94ºC o 95ºC.
Etapa de hibridación (annealing en inglés) donde ocurre el reconocimiento por parte de los primers de las secuencias
complementarias. Esta etapa se realiza a la temperatura
óptima para ese reconocimiento. Dicha temperatura varía de
acuerdo al diseño de los primers dentro de un rango que va
desde los 50 ºC hasta los 70 ºC. En esta etapa solo de produce
la hibridación si el ADN de la muestra que se estudia
contiene las secuencias buscadas. Si ellas no están presentes,
no habrá unión y por lo tanto, no habrá amplificación.
Etapa de elongación, donde ocurre la síntesis de dos
nuevas cadenas de ADN a partir de la original, mediante la
acción de la enzima ADN Taq polimerasa. Esto se desarrolla
a una temperatura de alrededor de 72º C, que es la temperatura
óptima de acción de la enzima.
Fuente: www.porquebiotecnologia.com.ar
La cinética de la PCR tiene 3 momentos o fases:
La fase inicial, donde hay pocas moléculas target (ADN) y alta concentración de los reactivos.
La fase exponencial, donde la eficiencia de la síntesis de las nuevas cadenas es máxima debido a que hay abundancia
de reactivos, de targets y de productos de PCR. En ella la relación entre producto de PCR formado y el número
inicial de moléculas de ADN presentes en la muestra es directamente proporcional.
La fase de plateau donde los reactivos se agotan y existe un exceso de producto amplificado. Allí la eficiencia de
síntesis decae.
Dentro de la metodología de PCR hay dos modalidades que son ampliamente utilizadas. Ellas son: PCR en tiempo
final y PCR en tiempo real. Ambas se realizan en un equipo denominado termociclador que es el que controla y regula
los tiempos y temperaturas óptimos para que ocurra la reacción. La diferencia que presentan estas dos modalidades se
halla en la forma y la fase en la cual se produce la detección del producto de amplificación y por lo tanto, el tipo de
resultados obtenidos.
PCR en tiempo final
En la PCR en tiempo final una vez concluida la reacción, los fragmentos amplificados son separados mediante electroforesis
en gel y visualizados bajo luz ultravioleta por medio de un colorante fluorescente. Se busca la presencia y/o
ausencia de bandas de un determinado peso molecular que se corresponden con el tamaño de los fragmentos amplificado.
La lectura del producto de amplificación ocurre en la fase de plateau de la PCR, por lo tanto, el tipo de resultados
obtenidos son de tipo cualitativo (ausencia o presencia de la secuencia de interés) o semicuantitativos (en rangos
de concentración). Para la obtención de resultados de
tipo cuantitativo se realiza el análisis individual de
distintos conjuntos de muestras y se tienen en cuenta
consideraciones estadísticas para el armado y cantidad
de conjuntos a analizar.
Fuente: www.porquebiotecnologia.com.ar
PCR en tiempo Real
La técnica de PCR en Tiempo Real es una alternativa
a la PCR convencional que permite la obtención de
resultados cuantitativos. La denominación de “tiempo real” se debe a que el ADN amplificado puede ser detectado
durante el proceso de PCR y no al final del mismo, como sucede con la PCR convencional. La PCR en tiempo real
combina el uso de un termociclador, un sistema de detección de fluorescencia y una computadora. El termociclador
tiene acoplado un sistema para la detección de fluorescencia. A medida que transcurre la reacción el equipo toma señales
de la fluorescencia generada y las analiza (en "tiempo real"). La señal de fluorescencia recolectada es directamente
proporcional a la cantidad de producto de PCR amplificado. Como la lectura de los datos se realiza durante la
fase exponencial de la reacción, se obtiene así una cuantificación más adecuada y precisa del producto amplificado.
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