Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - FBMC

More documents

Recommendations

Info

Genómica Aplicada Verano 2012 (adaptado de Godge et al., 2007). Preparación de las bacterias para infiltrar 1) Estriar las bacterias portando los distintos plásmidos en una placa de ágar LB conteniendo los antibióticos apropiados. Incubar durante dos días a 28ºC. 2) Inocular con una colonia aislada 3-5 ml de medio de cultivo LB líquido conteniendo los antibióticos apropiados en un tubo de ensayos. Incubar con agitación (200 revoluciones por minuto o r.p.m.) a 28ºC toda una noche (over night O.N.) en un incubador con control de temperatura. Es importante que esta temperatura no supere 28°C porque las agrobacterias pierden el plásmido. 3) Inocular usando 1 ml del cultivo obtenido a 10-15 ml de LB líquido y 20 µM de acetosiringona en un tubo plástico de tipo Falcon® de 50 ml e incubar con agitación (200 r.p.m) O.N. a 28ºC. 4) Centrifugar el cultivo de bacterias durante 15 min a 4.000 r.p.m. en una centrífuga tipo Sorvall y a 4º C. Resuspender las bacterias en Solución de MES. Llevar a OD600=0,8. Incubar las bacterias a temperatura ambiente al menos durante 2 horas (puede ser O.N.). Para las co-infiltraciones se realizan mezclas de partes iguales de las agrobacterias portando los distintos plásmidos. Solución de MES + acetosiringona 100 µM Preparación de MES: Para 1 litro de MES: 2,14 gramos de MES 0,95 gramos de MgCl2 Nota: Al resuspender las bacterias con la solución de MES utilizando el mismo volumen que el de LB utilizado para cultivarlas (en este caso 10 ml) se obtiene una suspensión bacteriana de OD600 ≈ 1. 5) Agroinfiltrar hojas en la cara abaxial con la suspensión bacteriana utilizando una jeringa (ver video en Bazzini et al. 2007) Material Vegetal Plantas de N. benthamiana de aproximadamente un mes de edad. Deben ser plantas saludables en etapa vegetativa de un estado intermedio de desarrollo. Medios, soluciones necesarias y antibióticos necesarios Solución de MES MES (ácido N-morpholinoetanesulfónico) 10 mM MgCI2 10 mM Agua bidestilada Autoclavar la solución (solo si no se va a usar en el momento) Acetosiringona [200 mM] Disolver 40 mg de acetosiringona en 1 ml de dimetil sulfóxido (DMSO). Conservar a -20°C. Preguntas 1. ¿Qué otras técnicas además de VIGS conoce para inducir el PTGS en plantas? 2. ¿Qué ventajas posee VIGS sobre otras técnicas de knock out como el reemplazo alélico? ¿De qué forma puede superarse la redundancia funcional en presencia de familias de genes? 3. ¿La expresión de las construcciones agroinfiltradas es transitoria o estable? 4. Una vez inducido, ¿el VIGS es estable? Referencias Vazquez Rovere, C.; Bazzini, A.; Rodríguez, C.; Almasia, N; Asurmendi, S. Métodos para generar y analizar diversidad. Usos del Silenciamiento génico para el análisis funcional de genes candidatos. En: Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II - V. Echenique, C. Rubinstein, E. Hopp y L. Mroginski (eds), Editorial INTA, 2010, en prensa. Godge, M. R; Purkayastha, A; Dasgupta, I; Kumar, P. P. Virus-induced gene silencing for functional analysis of selected genes. Plant Cell Rep. 2007. Volume 27, Number 2 (209-219). Bazzini A.A, Mongelli V.C, Hopp H.E, Del Vas M, Asurmendi S (2007) A practical approach to the understanding and teaching of RNA silencing in plants. Electronic Journal of Biotechnology 10 (2), 178-190. TP 11: PCR en Tiempo Real Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) El fundamento de la PCR consiste en la multiplicación in vitro de un fragmento de ADN, mediante un proceso denominado amplificación, con el fin de aumentar su concentración hasta obtener una cantidad de copias de ADN que permita ser detectado. Para la reacción se requieren, además del ADN en estudio, los 4 nucleótidos (unidades constitutivas del ADN), una enzima denominada Taq ADN polimerasa, que es la encargada de sintetizar las millones de copias de un mismo fragmento de ADN y por último un par de cebadores (primers en inglés) que Fluorescencia Ciclo de PCR 20
Genómica Aplicada Verano 2012 son pequeñas secuencias de ADN de simple cadena de alrededor de 20 a 30 bases, los cuales se encargan de indicarle a la enzima donde iniciar la síntesis nuevas copias de ADN. La gran especificidad de la PCR se sustenta en la capacidad de los cebadores para reconocer por complementaridad de las bases del ADN a una secuencia particular de ADN y para ello es necesario conocer, al menos parcialmente, la secuencia de ADN de que se quiere detectar para diseñar los primers adecuados. La reacción ocurre en un equipo denominado termociclador que regula los tiempos y temperaturas óptimos para que ocurra la reacción. La reacción tiene tres etapas. Juntas forman un ciclo de PCR. Estos ciclos se repiten de 30 a 50 veces. Cada ciclo consta de: Etapa de desnaturalización, donde se produce separación de las dos cadenas de ADN para obtener el ADN como cadenas simples. Esta etapa ocurre a 94ºC o 95ºC. Etapa de hibridación (annealing en inglés) donde ocurre el reconocimiento por parte de los primers de las secuencias complementarias. Esta etapa se realiza a la temperatura óptima para ese reconocimiento. Dicha temperatura varía de acuerdo al diseño de los primers dentro de un rango que va desde los 50 ºC hasta los 70 ºC. En esta etapa solo de produce la hibridación si el ADN de la muestra que se estudia contiene las secuencias buscadas. Si ellas no están presentes, no habrá unión y por lo tanto, no habrá amplificación. Etapa de elongación, donde ocurre la síntesis de dos nuevas cadenas de ADN a partir de la original, mediante la acción de la enzima ADN Taq polimerasa. Esto se desarrolla a una temperatura de alrededor de 72º C, que es la temperatura óptima de acción de la enzima. Fuente: www.porquebiotecnologia.com.ar La cinética de la PCR tiene 3 momentos o fases: La fase inicial, donde hay pocas moléculas target (ADN) y alta concentración de los reactivos. La fase exponencial, donde la eficiencia de la síntesis de las nuevas cadenas es máxima debido a que hay abundancia de reactivos, de targets y de productos de PCR. En ella la relación entre producto de PCR formado y el número inicial de moléculas de ADN presentes en la muestra es directamente proporcional. La fase de plateau donde los reactivos se agotan y existe un exceso de producto amplificado. Allí la eficiencia de síntesis decae. Dentro de la metodología de PCR hay dos modalidades que son ampliamente utilizadas. Ellas son: PCR en tiempo final y PCR en tiempo real. Ambas se realizan en un equipo denominado termociclador que es el que controla y regula los tiempos y temperaturas óptimos para que ocurra la reacción. La diferencia que presentan estas dos modalidades se halla en la forma y la fase en la cual se produce la detección del producto de amplificación y por lo tanto, el tipo de resultados obtenidos. PCR en tiempo final En la PCR en tiempo final una vez concluida la reacción, los fragmentos amplificados son separados mediante electroforesis en gel y visualizados bajo luz ultravioleta por medio de un colorante fluorescente. Se busca la presencia y/o ausencia de bandas de un determinado peso molecular que se corresponden con el tamaño de los fragmentos amplificado. La lectura del producto de amplificación ocurre en la fase de plateau de la PCR, por lo tanto, el tipo de resultados obtenidos son de tipo cualitativo (ausencia o presencia de la secuencia de interés) o semicuantitativos (en rangos de concentración). Para la obtención de resultados de tipo cuantitativo se realiza el análisis individual de distintos conjuntos de muestras y se tienen en cuenta consideraciones estadísticas para el armado y cantidad de conjuntos a analizar. Fuente: www.porquebiotecnologia.com.ar PCR en tiempo Real La técnica de PCR en Tiempo Real es una alternativa a la PCR convencional que permite la obtención de resultados cuantitativos. La denominación de “tiempo real” se debe a que el ADN amplificado puede ser detectado durante el proceso de PCR y no al final del mismo, como sucede con la PCR convencional. La PCR en tiempo real combina el uso de un termociclador, un sistema de detección de fluorescencia y una computadora. El termociclador tiene acoplado un sistema para la detección de fluorescencia. A medida que transcurre la reacción el equipo toma señales de la fluorescencia generada y las analiza (en "tiempo real"). La señal de fluorescencia recolectada es directamente proporcional a la cantidad de producto de PCR amplificado. Como la lectura de los datos se realiza durante la fase exponencial de la reacción, se obtiene así una cuantificación más adecuada y precisa del producto amplificado. 21
Page 1 and 2: Genómica Aplicada Guía de Trabajo
Page 3 and 4: TP 1: Búsqueda bioinformática de
Page 5 and 6: de pares de bases depositadas en Ge
Page 7 and 8: 4) Electroforesis capilar en secuen
Page 9 and 10: Identificación y caracterización
Page 11 and 12: e. Comparar los motivos conservados
Page 13 and 14: ATAATCTCAATAAATATTTGGATGGAAATCGTGTA
Page 15 and 16: ían ingresado desde Venezuela o di
Page 17 and 18: vas pérdidas de ADN (RD1- 14). El
Page 19: Genómica Aplicada Verano 2012 El t
Page 23 and 24: Genómica Aplicada Verano 2012 El m
Page 25 and 26: Genómica Aplicada Verano 2012 La d
Page 27 and 28: Genómica Aplicada Verano 2012 5) T
Page 29 and 30: Genómica Aplicada Verano 2012 20.2
Page 31 and 32: Genómica Aplicada Verano 2012 na 1
Page 33 and 34: “Results” podremos ver cada met
Page 35 and 36: Genómica Aplicada Verano 2012 Apre
Page 37 and 38: 6) Clickear sobre el nombre del pri
Page 39 and 40: Genómica Aplicada Verano 2012 (may

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - FBMC

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?