Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) - FBMC

Genómica Aplicada
Verano 2012
El término VIGS (silenciamiento génico inducido por virus, por su sigla en inglés) se aplica a la técnica que emplea
virus recombinantes a fin de disminuir la expresión génica de un gen endógeno (knock down) como alternativa al clásico
método de reemplazo alélico (knock out). La construcción de vectores
virales que portan en su genoma insertos derivados de secuencias génicas
vegetales permite silenciar específicamente la secuencia endógena homóloga
al inserto introducido en el vector viral. VIGS es una metodología que no
requiere de transgénesis por lo tanto es rápida y versátil, siendo ideal para
estudios de genómica funcional, incluso a gran escala. Su mayor ventaja y
desventaja radica en que el nivel de silenciamiento puede ser variable (a
veces el silenciamiento total del gen es una desventaja) y que depende de la
especie a utilizar (Vázquez Rovere et al. 2010).
La técnica de VIGS ha sido comúnmente ensayada en la especie de tabaco
salvaje Nicotiana benthamiana ya que es altamente susceptible a infecciones
virales y permite estudiar eficientemente el silenciamiento génico. El virus
de mosaico del tabaco (TMV, por sus siglas en inglés) fue el primer virus de
ARN utilizado como vector de silenciamiento. Mediante transcriptos de
TMV recombinante portando una secuencia del gen de la fitoeno desaturasa
(phytoene desaturase o PDS) producidos in vitro e inoculados en plantas de
N. benthamiana se logra silenciar exitosamente la expresión de PDS (Godge
et al. 2007).
Fig 1: Vía biosintética de carotenos en plantas. A la izquierda, el arroz dorado
Objetivo
Mostrar el silenciamiento génico inducido por virus (VIGS) del gen endógeno de fitoeno desaturasa (PDS) mediante
agroinfiltración de hojas de N. benthamiana con TRV recombinante. El gen PDS codifica para una enzima involucrada
en la biosíntesis de carotenos (importantes nutracéuticos precursores de vitamina A) y es uno de los genes utilizados
para desarrollar el arroz dorado, ver figura 1). Su falta de expresión da como resultado la ausencia de pigmentación.
Metodología de VIGS
El sistema de vectores de VIGS basados en el virus TRV (Tobacco rattle virus) utiliza cDNA del genoma de ARN
bipartito del TRV. El primer segmento genómico (RNA1) posee la RNA polimerasa RNA dependiente (RdRP) bajo el
control del promotor CaMV 35S y la proteína de movimiento (MP) así como una proteína de 16 kDa y una ribozima.
El segundo segmento genómico (RNA2) tiene un sitio de clonado múltiple río abajo del gen de la proteína de cápside
(CP) -también bajo el control del promotor CaMV 35S-, y una ribozima. El cDNA de ambos segmentos se introduce
en cassettes flanqueados por los bordes izquierdo y derecho de T-DNA, y son luego clonados en vectores binarios e
introducidos en Agrobacterium tumefaciens. Cultivos independientes de agrobacterias (uno con RNA1 y el otro con
RNA2 conteniendo la secuencia del gen objetivo –target-) son mezclados en una proporción 1:1 y utilizados para
agroinfiltrar hojas de N. benthamiana. Las células infectadas pueden sintetizar partículas virales completas y causar
dispersión sistémica del virus, desde el sitio de infiltración hacia las hojas superiores de la planta en crecimiento, disparando
el mecanismo de defensa de la planta que suprime tanto la replicación viral como la expresión del gen endógeno
target. Entre 3 y 4 semanas luego de la agroinfiltración, los fenotipos producidos por silenciamiento del gen
target pueden ser observados (Figura 2) (Godge et al. 2007).
Figura 2: Representación esquemática de las
etapas involucradas en VIGS con vectores
basados en TRV. Se identifica un gen candidato,
por ejemplo a partir de un pool de cDNA.
El gen es clonado en el vector basado en
RNA2 que contiene el gen de la proteína de
cápside viral (CP) bajo el control de un promotor
constitutivo. Por otra parte, el cassette
basado en el RNA1 viral (conteniendo los
genes para RdRP, MP, etc.) es clonado en otro
sistema de expresión T-DNA. Estos dos vectores
binarios (RNA1 y RNA2) son introducidos
en bacterias de Agrobacterium independientes.
Ambos cultivos de Agrobacterium son mezclados
con una relación 1:1 y son agroinfiltrados
en hojas de N. benthamiana. La infiltración de
vectores de VIGS lleva a la infección sistémica
de la planta y a la aparición de síntomas específicos.
Entre 3 y 4 semanas luego de la agroinfiltración,
los fenotipos producidos por silenciamiento
del gen target pueden ser observados
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